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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Murilo Racy Soares
Análise de variantes do gene CDKN1C e
pré-eclâmpsia
Ribeirão Preto
2010
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Murilo Racy Soares
Análise de variantes do gene CDKN1C e
pré-eclâmpsia
Dissertação apresentada ao
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
para obtenção do Título de Mestre em
Biologia da Reprodução.
Área de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia
Orientadora: Profa. Dra. Ester Silveira Ramos
Ribeirão Preto
2010
AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO
E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto/USP
Soares, Murilo Racy. Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsia / Murilo Racy Soares;
orientadora: Profa Dra Ester Silveira Ramos. - Ribeirão Preto, 2010.
104p. il.; 30 cm.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-graduação em Biologia da Reprodução), Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Orientadora: Ramos, Ester Silveira
Título em inglês: Variation assay of CDKN1C gene and pre-eclampsia.
1. Imprinting genômico. 2. gene CDKN1C. 3. síndromes hipertensivas gestacionais. 4. pré-eclâmpsia. 5. polimorfismos. 6. variantes.
FOLHA DE APROVAÇÂO Murilo Racy Soares Análise de variantes do gene CDKN1C e pré-eclâmpsia.
Área de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do Título de Mestre em Biologia da Reprodução.
Área de Concentração: Ginecologia e Obstetrícia Aprovado em ____/____/_____
Banca examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição___________________________ Assinatura__________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição___________________________ Assinatura__________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição___________________________ Assinatura__________________
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a toda minha família, especialmente aos meus pais Ademilson e Elisabet que
sempre fizeram tudo por mim e pelo amor incondicional.
A minha orientadora, Profa. Dra. Ester Silveira Ramos pela dedicação, confiança,
oportunidade, paciência e por ter sempre acreditado em mim.
Ao Prof. Dr. Geraldo Duarte pelos grandes ensinamentos e sabedoria e por permitir que
esse trabalho fosse feito.
A Francielle Marques Araujo por ter coletado todas as amostras e tornar esse trabalho real e
possível. Obrigado Fran!
A todo o Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP, em especial as “meninas” da
secretaria e a todos os professores que tive a honra de conhecer.
Ao Departamento de Genética da FMRP pelo fundamental apoio.
A TODOS os professores, funcionários, alunos (os que já passaram e os aqui presentes) e
amigos do BLOCO C.
A todos os amigos da minha vida dentro e fora da universidade.
A Carla Martins Kaneto, ao Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, a Cristiane Ayres
Ferreira e a Adriana Marques pela disponibilidade e a realização dos seqüenciamentos no
Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática (LGMB) da FMRP-USP e na Fundação
Hemocentro da FMRP-USP. Muito obrigado!
A Profa. Dra. Maria Helena de Souza Goldman e a Dra. Andréa Carla Quiapim pela
realização dos seqüenciamentos no Laboratório De Biologia Molecular de Plantas (LBMP)
da FFCLRP-USP.
A Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), aos demais funcionários do
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia e do Departamento de Genética da FMRP-USP
que colaboraram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
As agências financiadoras e de fomento à pesquisa CNPq, CAPES, FAEPA e
principalmente a FAPESP.
A todos que participaram de qualquer forma contribuindo para o meu crescimento
profissional e pessoal.
Este trabalho foi desenvolvido com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (processo número: 2007/01911-6), do Conselho Nacional de Desenvolvimento de Pesquisa (CNPq), da Fundação de Amparo ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FAEPA) e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
RESUMO
A pré-eclâmpsia (PE) caracteriza-se pelo aumento da pressão arterial e proetinúria,
após 20 semanas de gestação, sendo comum em primigestas e nos extremos da vida
reprodutiva feminina. A sua etiologia é desconhecida, mas há evidências da predisposição
genética no desenvolvimento da PE e vários estudos que dizem respeito a genes candidatos
têm sido realizados. O gene CDKN1C (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C), também
denominado P57Kip2, sofre marcação (imprinting) genômica e está mapeado no cromossomo
11p15.5 em humanos. O CDKN1C possui um importante papel na inibição da proliferação
do trofoblasto. Estudos em camundongos mostraram que alterações da PE talvez sejam
induzidas por perda de expressão deste gene. O presente trabalho verificou a associação de
PE com variantes do gene CDKN1C. Foram selecionadas 75 pacientes que apresentaram
PE, quatro mulheres com diagnóstico de eclâmpsia, 42 com hipertensão arterial crônica
(HAC), 66 com diagnóstico de hipertensão gestacional (HG) e 162 gestantes como grupo
controle. Também foram incluídos 302 indivíduos (204 mulheres não grávidas e 98 homens)
da população geral. Após extração do DNA de sangue periférico, foram utilizadas técnicas
de Biologia Molecular [Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Polimorfismo
Conformacional de Fita Simples (SSCP) e seqüenciamento automático] para o estudo do
genótipo das pacientes e controles. Foram encontradas quatro novas variantes do gene
CDKN1C humano (uma em uma mulher do grupo controle da população geral, duas em
portadoras de HAC e uma no grupo controle). As variantes do gene CDKN1C não se
mostraram bons marcadores para o desenvolvimento de pré-eclâmpsia, mas os resultados
sinalizam para um papel em casos de hipertensão arterial crônica. Este é o primeiro estudo
populacional em larga escala do gene CDKN1C na população brasileira.
ABSTRACT
Pre-eclampsia (PE) is characterized by hypertension associated with proteinuria, after
20 weeks gestation, with higher risk on the extremes of maternal reproductive life. The
etiology is unknown, but there are evidences that genetics predisposition is involved in the
development of PE. Studies with candidate genes have been realized to associate the
epidemiologic data and to establish a heritance model. The CDKN1C (cyclin-dependent
kinase inhibitor 1C) gene, also called P57Kip2, is located on 11p15.5 region in human
chromosome and is able to suffer genomic imprinting. Studies using animal models (mice)
showed that alterations in PE might be induced by loss of expression of this gene. The
present study associated the CDKN1C variations with PE. Blood samples of 75 women with
PE and 162 pregnant controls patients were collected. Additionaly, four eclamptic women, 42
pregnant women diagnosed with cronic arterial hypertension and 66 diagnosed with
gestacional hypertension were included in the studied cohort. We also analyzed 302 healthy
subjects (204 females and 98 males) of the general population. After the DNA extraction
from peripheral blood, PCR, Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) and
automatic genome sequencing were used to analyze the genotypes of the patient and
controls. Four new variants of CDKN1C gene (one mutation in the control group of pregnant
women, one in a female from the general population and two variants in two distinct women
with cronic arterial hypertension). The variants of of CDKN1C gene did not seem to set a
marker to development of pre-eclampsia, but the results shows that this gene may play a key
role in cases of cronic arterial hypertension. This is the first large-scale population study of
the CDKN1C gene in Brazilian population.
ABREVIATURAS E SIGLAS
% - porcentagem
°C – Graus Celsius
A - adenina
AGAR - Ambulatório de Gestação de Alto Risco
AIG – adequado para a idade gestacional
C - citosina
cm - centímetros
CDKN1C - Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1C (inibidor de quinase dependente de ciclina 1C)
CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CONEP - Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
DNA - Deoxyribonucleic Acid (ácido desoxirribonucléico)
dNTP - desoxinucleotídeo trifosfatado
E – eclâmpsia
EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético
FFCLRP – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
FMRP – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
G - guanina
g - grama
GIG – grande para a idade gestacional
H19 - gene supressor tumoral
HAC - hipertensão arterial crônica
HCFMRP - Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
HCl - ácido clorídrico
HG – hipertensão gestacional
IG – idade gestacional
IGF2 - Insulin-like growth factor 2 (fator de crescimento semelhante à
insulina 2)
KCl - Cloreto de potássio
kg – quilograma
KvLQT1 – K+ channel voltage-gated Long QT1 (canal de potássio QT1
LBMP - Laboratório de Biologia Molecular de Plantas
LGMB - Laboratório de Genética Molecular e Bioinformática
LIT1 - long QT intronic transcript 1
M – molar
mA – miliampere
MgCl2 – Cloreto de Magnésio
miRNA – micro RNA
ml – miliitro
mM – milimolar
múltiplos de g - força da gravidade
NaCl – cloreto de sódio
ng – nanogramas
NHBPEP - National High Blood Pressure Education Program
OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man
p - braço curto do cromossomo
pb – pares de bases
PC – parto cesárea
PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
PE – pré-eclâmpsia
pH - potencial hidrogeniônico
PIG – pequeno para a idade gestacional
PN – parto normal
PSA – Persulfato de amônia
q - braço longo do cromossomo
RN – recém-nascido
RNA - Ribonucleic Acid (ácido ribonucléico)
RPM – rotações por minuto
SBW - Síndrome de Beckwith-Wiedemann
SHG - síndromes hipertensivas gestacionais
SNP – Single Nucleotide Polymorphism (polimorfismo de nucleotídeo único)
SSCP – Single Strand Conformational Polymorphism (polimorfismo conformacional de fita
simples)
T - timina
TBE - tris/borato EDTA
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
U - uracila
USP – Universidade de São Paulo
UTR - untranslated region (região não traduzida)
V – Volts
W – watts
μg – micrograma
μl – microlitro
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Hipótese de Graves. 26
Figura 02 Fragmento de interesse do gene CDKN1C humano. 37
Figura 03 Seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano. 38
Figura 04 Imagem de gel de poliacrilamida com a padronização dos primers específicos
para a PCR das regiões do intron 1 e do exon 2.
40
Figura 05 Imagem de gel de SSCP com a padronização dos primers específicos da região
dos Primers 1.
46
Figura 06 Imagem de gel de SSCP com a padronização dos primers específicos da região
dos Primers 2.
47
Figura 07 Imagem de gel de SSCP com a padronização dos primers específicos da região
dos Primers 3.
48
Figura 08 Imagem de gel de SSCP com a amostra 789 (grupo controle) com padrão de
migração das bandas alterado para a região dos Primers 1.
53
Figura 09 Imagem de gel de SSCP com a amostra 236 (grupo controle da população
geral) com padrão de migração das bandas alterado para a região dos Primers
1.
54
Figura 10 Imagem de gel de SSCP com as amostras 484 e 859 (grupo HAC) com padrão
de migração das bandas alterado para a região dos Primers 2.
55
Figura 11 Imagem de gel de SSCP com as amostras 236, 484, 789 e 859 com padrão de
migração das bandas inalterado para a região dos Primers 3.
56
Figura 12 Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da
amostra 789 referente aos Primers 1.
57
Figura 13 Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank
e a amostra 789 do grupo controle.
58
Figura 14 Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da
amostra 236 referente aos Primers 1.
59
Figura 15 Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank
e a amostra 236 do grupo controle da população geral.
60
Figura 16 Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento das
amostras 484 e 859 referentes aos Primers 2.
61
Figura 17 Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank
e a amostra 484 do grupo HAC.
62
Figura 18 Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank
e a amostra 859 do grupo HAC.
62
Figura 19 Seqüência referência de aminoácidos do gene CDKN1C humano do banco de
dados do programa GenBank e seqüência de aminoácidos polimórfica.
64
Figura 20 Seqüência referência do gene CDKN1C humano do banco de dados do
programa GenBank e seqüência com polimorfismos descritos em banco de
dados.
66
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Sub-divisão da casuística segundo o diagnóstico. 34
Tabela 02 Caracterização quanto ao sexo de um segundo grupo controle constituído por
homens e mulheres não grávidas saudáveis, da população geral.
34
Tabela 03 Seqüências de primers obtidas para análise molecular do gene CDKN1C. 37
Tabela 04 Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 1 e
Primers 2 do gene CDKN1C humano.
42
Tabela 05 Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 3 do gene
CDKN1C humano.
43
Tabela 06 Condições das amostras, do gel e da corrida de eletroforese padronizadas para
a técnica de PCR-SSCP referentes às regiões de interesse dos Primers 1,
Primers 2 e Primers 3.
45
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 16
1.1 Classificação de síndromes hipertensivas gestacionais 18
1.2 Pré-eclâmpsia 19
1.3 Genética e pré-eclâmpsia 23
1.4 Imprinting genômico e pré-eclâmpisa 25
1.5 Região cromossômica 11p15.5 e o gene CDKN1C 27
2. OBJETIVOS
30
2.1 Objetivo geral 31
2.2 Objetivos específicos 31
3. MATERIAL E MÉTODOS
32
3.1 Casuística 33
3.2 Análise molecular 35
3.2.1 Coleta de sangue periférico 35
3.2.2 Extração de DNA genômico 35
3.2.3 Seleção e validação dos primers 36
3.2.4 Identificação da seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano 38
3.2.5 Reação em cadeia da polimerase 38
3.2.6 Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (SSCP) 43
3.2.7 Seqüenciamento automático de nucleotídeos 49
3.2.8 Identificação in silico de polimorfismos e variantes no gene CDKN1C humano
50
3.3 Análise estatística 51
4. RESULTADOS
52
4.1 Reação em cadeia da polimerase e Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (PCR-SSCP)
53
4.2 Seqüenciamento automático de nucleotídeos e alinhamento de seqüências 57
4.2.1 Primers 1 57
4.2.2 Primers 2 61
4.3 Seqüência de aminoácidos 64
4.4 Pesquisa de SNPs em banco de dados 65
4.4.1 Programa BLAST SNP Sequence e RepeatMasker Open-3.0 65
4.5 Análise estatística 67
5. DISCUSSÃO
70
6. CONCLUSÕES
77
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
79
8. ANEXOS
88
Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) 89
Anexo B – Ofício referente à aprovação do TCLE pelo CEP do HCFMRP-USP 90
Anexo C – Parecer do CONEP referente ao projeto de pesquisa 91
9. APÊNDICES
92
Apêndice A – Grupo de pacientes com PE/E, HAC, HG e grupo controle 93
Apêndice B – Grupo controle da população geral 99
I. INTRODUÇÃO
Algumas estimativas indicam que 600.000 mulheres vão a óbito anualmente devido a
causas relacionadas à gravidez e 99% dessas mortes ocorrem em países em
desenvolvimento, ou seja, países onde vivem 85% da população mundial (ALTMAN et al.,
2002; WHO, 2007). Somente as síndromes hipertensivas gestacionais (SHG) são
responsáveis por 50.000 mortes por ano, tornando-as a segunda causa mais comum de
mortalidade em países industrializados (RATH & FISCHER 2009). Mesmo com esses altos
índices, poucos progressos têm sido alcançados para salvar a vida dessas mulheres
(UNITED NATIONS, 2008).
Nos Estados Unidos da América, a taxa de mortalidade materna devida às SHG
atinge de 6 a 8% das gestantes (LEEMAN & FONTAINE, 2008; MAGEE et al., 2009)
chegando a uma média de 16% em países desenvolvidos (KHAN et al., 2006). No Brasil
este índice é de aproximadamente 26%, taxa semelhante à do restante da América Latina e
do Caribe, colocando a hipertensão como a principal causa de mortalidade materna, sendo
importante observar que de acordo com a região brasileira estudada essa taxa pode chegar
até 40% (KHAN et al., 2006; DULEY et al., 2009; KALE & COSTA, 2009). No Brasil,
doenças hipertensivas são as principais causa de morte materna e constituem grave
problema de Saúde Pública (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).
1.1 - Classificação de síndromes hipertensivas gestacionais (SHG)
A classificação e o manejo das SHG são referidas em consenso por protocolos
internacionais (REY et al., 1997; BROWN et al., 2000; LOWER et al., 2009; MAGEE et al.,
2008). A classificação mais utilizada foi apresentada em 2000 pelo National High Blood
Pressure Education Program (NHBPEP), onde foram estabelecidos os critérios descritos a
seguir:
a) Hipertensão Arterial Crônica (HAC): definida como hipertensão de qualquer
etiologia, precedendo a gestação ou diagnosticada antes da vigésima semana de gestação.
Hipertensão diagnosticada pela primeira vez durante a gestação e que persiste no pós-parto
é também classificada como hipertensão arterial crônica. A hipertensão é definida quando a
pressão sistólica é ≥140 mmHg e/ou a pressão diastólica ≥90 mmHg;
b) Pré-eclâmpsia/Eclâmpsia (PE/E): A PE é uma síndrome específica do ciclo
gravídico-puerperal que surge após a vigésima semana de gestação. É determinada por
aumento da pressão sanguínea (pressão sistólica/diastólica ≥ 140/90 mmHg) acompanhada
por proteinúria. Sua caracterização é determinada em pacientes normotensas antes da
vigésima semana de gestação. A proteinúria (proteína na urina) é considerada significativa
para diagnóstico de PE quando for ≥ 300mg em urina de 24 horas, na ausência de infecção
urinária, sangue e corpos cetônicos. De forma geral, esta medida corresponde a valor ≥ 300
mg/litro em amostra isolada de urina ou ao valor quantitativo de 1+ em urina tipo 1.
Caracteriza-se como eclâmpsia a ocorrência de convulsões não atribuídas a outras causas,
em pacientes com PE. Presença de edema e do acréscimo de 30/15 mmHg nas pressões
sistólica/diastólica não fazem parte dos critérios diagnósticos da PE nesta nova
classificação, mas são considerados indicativos de cuidados, principalmente na presença de
proteinúria. O edema foi excluído dessa nova classificação porque ocorre em muitas
mulheres com gravidez normal;
c) Hipertensão arterial crônica com pré-eclâmpsia sobreposta: diagnóstico baseado
no aumento da pressão arterial e do aparecimento de proteinúria maior que 300mg/24horas.
A sobreposição do processo específico da gestação com a HAC previamente instalada é
uma complicação cujo prognóstico materno-fetal é potencialmente pior do que qualquer das
duas complicações isoladamente;
d) Hipertensão gestacional (HG): a elevação da pressão arterial na segunda metade
da gestação, mas sem desenvolvimento de proteinúria é considerada hipertensão
gestacional. Este diagnóstico inespecífico pode ser temporário. A finalização deste
diagnóstico pode ser realizada somente após 12 semanas do término da gravidez, sendo
também denominada de hipertensão transitória da gravidez. Se a hipertensão persistir, a
paciente é considerada hipertensa crônica.
1.2 - Pré-eclâmpsia
A pré-eclâmpsia (PE) continua um dos maiores problemas obstétricos mundiais
(ROBERTS, 2000), mesmo após seus primeiros relatos datarem de mais de 2000 anos
(CHESLEY, 1978) e ter sido reconhecida clinicamente desde os tempos de Hipócrates
(KANASAKI & KALLURI, 2009).
A PE é uma doença multissistêmica, de causa desconhecida, sendo exclusiva na
gravidez humana, possuindo incidência na população estimada em 10% e constituindo uma
das maiores causas de morte materna e fetal nos países desenvolvidos e em
desenvolvimento (SAFTLAS et al., 1990; SIBAI et al., 2005; KHAN et al., 2006; DULEY et al.,
2009; MAGEE et al., 2009).
A PE pode ser classificada em PE de início precoce ou Tipo I (antes da trigésima
quarta semana de gestação), PE de início tardio ou Tipo II (após a trigésima quarta semana
de gestação), bem como a PE pode ocorrer durante ou após o trabalho de parto (PRIDJIAN
& PUSCHETT, 2002). Além da classificação, a PE pode ser dividida, de acordo critérios
diagnósticos, em subtipos: leve, severa e sobreposta, (SIBAI et al., 2008).
Os critérios de diagnóstico da PE e de seus subtipos são discrepantes entre os
estudos publicados, resultando em insignificantes avanços nos métodos de projeção,
prevenção, manejo e não confirmando marcadores para o diagnóstico da PE e seus
subtipos (SIBAI et al., 2008).
De maneira prática e geral, a PE é comum em primigestas e nos extremos da vida
reprodutiva feminina (antes dos 18 e depois dos 35 anos de idade) (SAFTLAS et al., 1990;
SIBAI et al., 2005). Caracterizada por achados clínicos e laboratoriais heterogêneos, a PE
pode manifestar-se tanto no acometimento predominantemente materno como fetal, ou
ainda em ambos na condição de síndrome materno-fetal (MAGEE et al., 2008; SIBAI et al.,
2008).
Na forma materna da PE, os importantes sinais, sintomas e mecanismos que podem
ser destacados nessa gravidez de alto risco são: hipertensão (de etiologia ainda
desconhecida, causa complicações materno-fetais), disfunção endotelial (remodelamento da
artéria espiral devido à invasão superficial do trofoblasto), proteinúria (lesões glomerulares
renais conhecidas como endoteliose glomerular), errônea adaptação imune aos antígenos
paternos e resposta inflamatória sistêmica exacerbada. Mulheres com vários fatores de
riscos (doença cardiovascular ou microvascular pré-existente, doenças renais ou
trombofilias) estão sujeitas a sofrer complicações consideráveis. Já na forma fetal a restrição
do crescimento intra-uterino se dá quase que exclusivamente devido à disfunção placentária
que acarreta um fornecimento alterado de sangue para a placenta (aterosclerose
placentária), levando ao pequeno crescimento intra-uterino e precipitando o nascimento pré-
termo (SIBAI et al., 2008; DULEY et al., 2009; KANASAKI & KALLURI, 2009).
Apesar das numerosas pesquisas relacionadas à etiologia, biologia, patogênese e
patofisiologia da PE (ROBERTS & LAIN, 2002; VON DADELSZEN et al., 2002; ROBERTS &
GAMMILL, 2005; STEPAN et al., 2006; GOLDMAN-WOHL & YAGEL, 2007; FURUYA et al.,
2008), essa doença continua sendo uma incógnita, o que acaba conferindo à PE a
denominação de “doença das teorias” (BROUGHTON PIPKIN & RUBIN, 1994;
SCHLEMBACH, 2003) e de “doença de dois estágios” (REDMAN & SARGENT, 2005;
ROBERTS & HUBEL, 2009).
Nesta última, o primeiro estágio ocorreria na primeira metade da gestação (15 a 16
semanas de gravidez) com a reduzida perfusão placentária, que resultaria na liberação de
fatores de reconhecimento imunológico materno do feto derivados da placenta, que levariam
a mudanças patofisiológicas sistêmicas maternas (segundo estágio) durante a segunda
metade da gravidez. Este modelo não abrange todos os aspectos das várias alterações
pertinentes à PE, mas foca em uma opção de modelo de mecanismo de comprovada
importância (REDMAN & SARGENT, 2005).
Embora a presença da placenta seja fundamental para o desenvolvimento da PE e a
sua resolução seja a expulsão da placenta (HAWFIELD & FREEDMAN, 2009), a PE não
ocorre naturalmente em outros animais placentários, inclusive em primatas superiores
(WINN et al., 2009). Modelos animais são pouco eficientes para servirem para o estudo da
PE devido em grande parte à incompetência e à dificuldade de apresentarem o espectro
completo da doença humana, possibilitando apenas o estudo de características isoladas
(PODJARNY et al., 2004).
A origem da PE consistiria de quatro principais componentes: adaptação imune
deficiente; isquemia placentária; estresse oxidativo e predisposição genética. Uma
combinação destes fatores decidiria se uma mulher grávida estaria destinada a desenvolver
a PE e sua severidade (WILSON et al., 2003).
A PE talvez resulte de uma resposta imune materna deficiente e anormal aos
antígenos paternos. O mecanismo no qual essa má adaptação imune está relacionada a
disfunção endotelial celular na PE permanece obscura, mas há indícios que as células
imunes ativadas na decídua possam liberar mediadores que atuam nas células endoteliais.
As evidências para o envolvimento dessa resposta imunológia anormal, estão baseadas em
estudo epidemiológicos onde se observou que: o risco de PE diminui após a primeira
gestação; o efeito protetor da multipariedade é perdido com a mudança de parceiro; aborto
ou transfusão sanguínea protege contra PE; inseminação artificial de doadores e doação de
oócitos levam a um aumento no risco de PE; exposição ao sêmen aumentada (como por
exemplo período do relacionamento com o parceiro ou uso de contraceptivo oral) pode ser
um fator protetor (WILSON et al., 2003).
A hipótese da isquemia placentária na PE se deve inicialmente à invasão
trofoblástica e subseqüente remodelamento da artéria espiralada deficiente, resultando na
diminuição do diâmetro da mesma. Esta resposta é devida ao aumento da demanda
vascular na gravidez, levando ao déficit de suprimento de sangue à placenta (VAN BECK &
PEETERS, 1998; DEKKER & SIBAI, 1998; DEKKER & SIBAI, 1999).
Outra hipótese é a de que o estresse oxidativo gerado na placenta hipóxica é
transferido à circulação sistêmica, resultando em dano oxidativo nas células endoteliais
vasculares de todo o organismo (ROBERTS, 2000; ROBERTS & COOPER, 2001). A
interação de componentes maternos, particularmente neutrófilos e lipídios susceptíveis à
oxidação, com células placentárias e fatores derivados da placenta induzem o estresse
oxidativo que causa a referida disfunção celular e manifestações clínicas da PE (WILSON et
al., 2003; REDMAN & SARGENT, 2009).
Diversos estudos mostram que células fetais livres presentes no sangue materno têm
valor preditivo, apesar de restrito, como biomarcadores para gestações pré-eclâmpticas
entre 17 e 25 semanas de gestação. Vários autores detectaram um número até cinco vezes
maior de células fetais livres em mulheres com PE quando comparadas ao grupo controle
(GRILL et al., 2009).
Evidências de componentes genéticos na PE vêm da observação do relevante
aumento entre mães, filhas, irmãs e avós de mulheres que tiveram PE (WILSON et al.,
2003), como veremos a seguir.
Em mulheres com baixo ou elevado risco de desenvolver PE, um dos
componentes/mecanismos observados isoladamente não explica a PE e suas variações.
Essa dificuldade se deve em grande parte à heterogeneidade da doença e aos complexos e
diversos mecanismos em que ela está envolvida. Contudo as pesquisas atuais devem ser
dirigidas à avaliação desses diversos mecanismos assim como às vias que são comuns a
eles (MAGEE et al., 2008; KANASAKI & KALLURI, 2009).
1.3 – Genética e pré-eclâmpsia
CHESLEY et al. (1961) foram os primeiros a descrever de forma consistente a
influência familial na PE. Eles relataram um acentuado aumento na incidência da doença na
primeira gravidez de irmãs e filhas de mulheres eclâmpticas, quando comparada à da
população controle. A contribuição genética na PE também foi observada em outros estudos
onde foi constatado o aumento da ocorrência da doença entre mães, filhas, irmãs e netas de
mulheres que tiveram PE (SERRANO et al., 2006).
O papel genético na PE é amplamente aceito, mas o padrão de herança ainda é
assunto de debate (MIM número 189800, disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim).
COOPER & LISTON (1979) não chegaram a conclusões sobre a heterogeneidade genética,
o papel do genótipo materno e o genótipo fetal e a possível interação entre ambos os
genótipos.
Em um estudo de populações homogêneas, foi observado que padrões de heranças
recessiva e dominante poderiam explicar os dados obtidos a partir da análise de filhos e
filhas de mães que tiveram pré-eclâmpsia severa e eclâmpsia (ARNGRIMSSON et al.,
1990). Alguns pesquisadores sugeriram isoladamente que a susceptibilidade para PE pode
ser herdada por meio de um gene autossômico recessivo (materno) ou um gene dominante
com penetrância incompleta. Por outro lado, outros autores propuseram que a
susceptibilidade à PE é devida a uma complexa interação entre dois ou mais genes
maternos, fatores ambientais e genótipo fetal/paterno (MORGAN et al., 1999; WILSON et al,
2003). O gene ou os genes envolvidos nos riscos para PE talvez dependam, pelo menos em
parte, das características da população estudada (etnia, idade materna na gestação).
Nenhum estudo foi capaz de separar os efeitos de fatores genéticos maternos e
fetais dos fatores ambientais. CNATTINGIUS et al., (2004) afirmam que os fatores genéticos
são os responsáveis por mais da metade da contribuição para o desenvolvimento da pré-
eclâmpsia, e ainda, que os genes maternos contribuem mais que os genes fetais.
Em um estudo familial com gestantes atendidas no Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRPUSP)
realizado pela equipe da Profa. Dra. Ester Silveira Ramos, foi verificado por meio de análise
estatística que pacientes brasileiras com PE/E apresentam maior número de parentes de
primeiro-grau (mãe/irmã) com PE/E quando comparadas a gestantes com HG e à população
controle (ARAUJO et al., 2007). Estes resultados estão de acordo com a literatura e
pesquisas de outros países (CARR et al., 2005).
Diversos estudos sugerem um componente fetal (paterno) para susceptibilidade à
PE. A associação entre a doença e anormalidades cromossômicas fetais confirma uma
contribuição fetal para a etiologia (BOYD et al., 1987). O risco de desenvolver PE é
aumentado em mulheres com molas hidatiformes completas, que são de origem paterna
(DEVRIENDT, 2005). O pequeno, mas significativo, aumento estatístico da incidência entre
noras de casos índices e a observação de uma maior freqüência de gravidez com PE em
crianças cuja avó paterna apresentava histórico de PE durante a gravidez do pai dessa
criança colaboram com a idéia do risco da contribuição paterno/fetal (WILSON et al., 2003).
A influência do genótipo fetal na PE tem levado à hipótese de um modelo combinado
de transmissão. COOPER et al. (1988) relataram um aumento na incidência da PE em
mulheres nascidas de uma gravidez eclâmptica quando comparadas com mulheres
nascidas de uma gravidez normal, mas com irmã ou irmão nascidos de uma gravidez
eclâmptica. LISTON & KILPATRICK (1991) concluíram, por meio de um estudo baseado no
modelo de herança mendeliana, que mãe e feto deveriam expressar o mesmo gene
recessivo para o desenvolvimento de PE. ESPLIN et al. (2001) chegaram a um resultado
semelhante.
BERENDS et al. (2008) analisando conjunto de famílias, consangüinidade e os
efeitos de origem dos pais, estabeleceu que a co-segregação observada na PE e na
restrição de crescimento intra-uterina comprova uma etiologia genética comum.
Já SKJAERVEN et al. (2005) afirmaram que os genes maternos e fetais que foram
maternalmente ou paternalmente herdados podem desencadear a PE. CHAPPELL &
MORGAN (2006) enumeraram genes candidatos para serem estudados como marcadores
que podem contribuir de forma significativa para um melhor entendimento da PE, entre eles,
genes que são regulados por mecanismos epigenéticos.
1.4 - Imprinting genômico e pré-eclâmpsia
O imprinting genômico é um tipo de marcação epigenética do genoma parental de
um organismo diplóide de acordo com a sua respectiva origem, onde apenas um dos alelos
herdados (materno ou paterno) é expresso de uma forma específica para o tecido e estágio
do desenvolvimento (WALTER & PAULSEN, 2003).
Neste caso, a cópia dos genes de um dos pais é expressa, enquanto a outra é
silenciada. As duas cópias parentais do gene marcado dividem informação genética igual. O
não silenciamento de um alelo necessariamente pré-determina que qualquer função
relacionada àquele gene seja agora dependente de uma simples cópia ativa (MURPHY &
JIRTLE, 2003).
HALL (1990) sugeriu que o imprinting talvez sirva para proteger as fêmeas da
proliferação descontrolada do trofoblasto durante a gravidez. Na Hipótese de Graves (Figura
1), é sugerido que para um gene hipotético E, a expressão normal de um alelo materno (EM)
que sofre imprinting paterno (o alelo materno é expresso) é necessária para invasão
trofoblástica e estabelecimento da placentação normal. Devido à sua origem parental, o
alelo materno EM deve ser expresso no feto, mas se esse alelo materno herdado da mãe é
mutado (eM) ou está ausente no feto, a PE é induzida no organismo materno. Com isso,
mães com PE que segregam o alelo mutante eM têm um padrão de expressão da PE que
dependerá do alelo materno herdado pelo feto. Uma mulher será afetada somente se gerar
um feto com o alelo materno mutado (eM). Dessa forma, uma mulher afetada deve ser
heterozigota (EMeM) e deve passar o alelo mutante eM para seu feto (EPeM) (Figura 1). É
importante ressaltar que um feto heterozigoto (ePEM), que recebeu o alelo mutante (eP) do
pai, iniciará o processo de placentação normal e não causará efeito adverso na mãe, desde
que o alelo paterno esteja inativo (“marcado”). Pode-se concluir que essa variação dos
alelos maternos e o seu padrão de herança no feto teriam um efeito importante no fator de
risco do desenvolvimento da PE (GRAVES, 1998).
Figura 1: Hipótese de Graves em que o gene E sofre imprinting paterno (materno ativado), a
mãe é heterozigota (EMeM) e o genótipo paterno (neste exemplo EPEP) é irrelevante
(modificado de GRAVES, 1998).
GENÓTIPO MATERNO
EMe
M
GENÓTIPO PATERNO
EPE
P
GAMETAS
EP
EP
EM e
M
EME
P e
ME
P FERTILIZAÇÃO
GESTAÇÃO
1/2 NORMAL
1/2 PRÉ-ECLÃMPSIA
O seqüenciamento de 17 genes em uma região crítica em 10q22 revelou variações
nucleotídicas que foram utilizadas para estudos de ligação de famílias de pacientes com PE
na população holandesa. Esta região apresenta vários genes que sofrem imprinting,
homologia com as regiões 2p12 e 9p13 (também descritas como ligadas à PE), homologia
com uma região em camundongos ligada à pressão sanguínea e uma possível influência da
origem parental, uma vez que, em famílias holandesas com PE, o alelo compartilhado entre
os afetados era sempre o materno (VAN DIJK et al., 2005).
Em um amplo artigo de revisão, NEJATIZADEH et al. (2008) ressaltam a importância
cada vez maior dos fenômenos epigenéticos para a compreensão dos fatores que levam e
conduzem à PE e que estudos em larga escala incluindo gestantes afetadas e seus filhos
são essenciais para o estudo das bases gênicas e multifatoriais da PE.
1.5 - Região cromossômica 11p15.5 e o gene CDKN1C
O gene cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (CDKN1C), também denominado,
P57Kip2, possui quatro exons, é marcado paternalmente e foram encontradas três variantes
de transcritos codificando duas isoformas (isoforma A – longa e isoforma B - curta) para este
gene (disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/).
O gene CDKN1C codifica um inibidor de quinase dependente de ciclina, está
envolvido na regulação do ciclo celular, apresenta ação de supressão tumoral e localiza-se
entre um grupo de genes marcados mapeados no cromossomo 11p15.5 em humanos (LAM
et al., 1999). A mais nova função atribuída à proteína P57Kip2 inclui a organização do
citoesqueleto celular (PATERAS et al., 2009).
A 11p15.5, importante região relacionada à regulação gênica e desenvolvimento
celular, é dividida em dois domínios gênicos regulados por imprinting, sendo um telomérico,
controlado pela ICR1 (imprinting control region 1) onde se encontra a região
diferencialmente metilada (DMR) H19DMR, os genes IGF2 (insulin-like growth factor-2) e
H19, e outro centromérico, controlado pela ICR2 (imprinting control region 2), onde estão
mapeados a KvDMR, os genes CDKN1C, KvLQT1 (K+Channel voltage-gated Long QT 1) e
LIT1 (Long Intronic Transcript 1 ou KvLQT1AS) (ENGEL et al., 2000; MAHER & REIK, 2000).
A expressão do gene CDKN1C é conhecida em diferentes tipos de tecidos, como células
sanguíneas mononucleadas (KOCZAN et al., 2005), células do fibroblasto (DIAZ-MEYER et
al., 2003) e tecido placentário (BOURQUE et al., 2010).
Em humanos, alterações da região 11p15.5 acarretam o desenvolvimento de
neoplasias e a síndrome de Beckwith–Wiedemann (SBW), que é caracterizada por
hipercrescimento e está associada com o aumento do risco de alguns tumores infantis
(MAHER & REIK, 2000). Os portadores de SBW com perda da região materna, envolvendo
o gene CDKN1C mostram uma proliferação anormal do trofoblasto que é freqüentemente
associada com PE (MCCOWAN & BECROFT, 1994).
Existem algumas mutações de CDKN1C associadas principalmente aos casos
familiais de SBW. LAM, et al. (1999) verificaram mutações no gene CDKN1C em 70
portadores de SBW e confirmaram a importância das alterações nesse gene para o
diagnóstico da síndrome. LEW et al. (2004), analisando portadores de SBW, descreveram
uma mutação em um sítio de splicing (processamento) no intron 3 do gene CDKN1C. Os
autores relataram que esta mutação intrônica, que foi herdada maternalmente, era
responsável pela SBW naqueles portadores analisados e que esta mutação estava
diretamente relacionada com a eficiência do splicing, mas não afetava a quantidade final de
RNA mensageiro transcrito.
Analisando 200 portadores de SBW, COOPER et al. (2005) encontraram 130
indivíduos com alterações nos centros controladores de imprinting na região 11p15.5 e 16
indivíduos com mutações do CDKN1C, o que aumenta a importância deste gene na
caracterização da etiologia da SBW.
Variações no sitio promotor proximal e na região codante dos genes CDKN1C e
CDK4 também foram encontradas e relacionadas com casos de diabetes tipo 2. As análises
nas mutações desses dois genes em 62 pacientes resultaram na descoberta de sete
variantes do CDKN1C (NIELSEN et al., 2005). Os autores concluíram que as variações
encontradas no gene CDKN1C também podem contribuir nas variações individuais do peso
ao nascimento. Já RODRIGUEZ et al. (2007) encontraram correlação positiva entre
polimorfismo do CDKN1C e o risco de infarto do miocárdio e aterosclerose.
Durante o desenvolvimento embrionário e fetal, os genes paternalmente expressos
tendem a favorecer a utilização mais intensa de fontes maternas para potencializar o
crescimento fetal, onde uma parcela dos genes maternalmente expressos parece suprimir o
crescimento fetal. Experimentos com modelos animais knockout demonstraram o papel que
os genes IGF2 (paternalmente expresso) e o CDKN1C (maternalmente expresso) possuem
na regulação do suprimento de nutrientes através da placenta (REIK et al., 2003).
TAKAHASHI et al. (2000), utilizando camundongos, estudaram os níveis de expressão de
IGF2 e H19 na placenta de embriões com deficiência de CDKN1C, mas não houve diferença
baseada nos genótipos.
O CDKN1C parece ter um importante papel na inibição da proliferação do trofoblasto.
Em camundongos, alterações típicas da PE talvez sejam induzidas por proliferação do
trofoblasto resultante da perda de expressão do gene CDKN1C. Fêmeas de camundongos
prenhes portadoras de deleções heterozigotas do gene CDKN1C desenvolveram quadro
semelhante à PE com uma seqüência de eventos placentários e alterações clínicas
similares às dos humanos (KANAYAMA et al., 2002). Em outro experimento, KNOX &
BAKER (2007), utilizando camundongos knockout para o gene CDKN1C, constataram falha
no desenvolvimento da placenta.
A complexidade do processo envolvido e o fato de ser um fenômeno materno-fetal
torna a pesquisa das bases moleculares da PE uma tarefa difícil. É possível que o simples
fenótipo da PE deva ser dividido em diferentes subgrupos nos níveis genético e bioquímico.
Estudos futuros auxiliarão na elucidação e criação de medidas preventivas dessa doença.
II. OBJETIVOS
2.1 - Objetivo geral
Verificar a ocorrência de variantes do gene CDKN1C em mulheres com síndromes
hipertensivas gestacionais (SHG) com especial ênfase em PE/E.
2.2 - Objetivos específicos
Detectar variantes do gene CDKN1C por meio de polimorfismo conformacional de fita
simples (SSCP) e seqüenciamento automático;
Verificar a distribuição das variantes do gene CDKN1C entre as pacientes com SHG
e na população controle;
Verificar a possibilidade de utilização do gene CDKN1C como marcador de
predisposição à SHG, em especial da PE/E.
III. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Casuística
As pacientes foram recrutadas durante sua internação na enfermaria do Ambulatório
de Gestação de Alto Risco (AGAR) do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP (HCFMRP-USP),
onde foi apresentado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo A),
previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HCFMRP-USP,
Processo HCRP n° 4628/2004 (Anexo B), e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
(CONEP n°1351/2004) (Anexo C).
Foram selecionadas pacientes com diagnóstico de PE, eclâmpsia (E), hipertensão
gestacional (HG) e hipertensão arterial crônica (HAC), segundo os critérios do National High
Blood Pressure Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy
(NHBPEP, 2000). Foram excluídos os casos de PE/E sobreposta à HC, gemeralidade,
malformações fetais, diabetes, doença vascular, trombose, câncer e outras doenças
crônicas maternas.
O grupo controle foi composto por mulheres da população geral, internadas ou que
passaram por internação na mesma enfermaria, voluntárias, que possuíam pelo menos um
filho(a) vivo(a), sem história de PE/E durante a gravidez (ou em parentes de primeiro grau),
sadias, sem hipertensão e/ou proteinúria maior do que 300mg/24 horas, com idade similar à
do grupo principal (+/- 5 anos) e sem relação de parentesco com o grupo de estudo.
Portanto do total de amostras de sangue coletadas, 75 eram de portadoras de PE,
quatro de eclâmpsia, 66 de HG, 42 de HAC e 162 pacientes do grupo controle (Tabela 1).
Tabela 1: Sub-divisão da casuística segundo o diagnóstico.
População Número de Pacientes
Portadoras de pré-eclâmpsia 75
Portadoras de eclampsia 04
Portadoras de hipertensão gestacional 66
Portadoras de hipertensão arterial crônica 42
Grupo controle 162
Total 349
Todas as amostras coletadas e a análise dos prontuários foram realizadas pela aluna
de doutorado do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP, Francielle
Marques Araujo, sob orientação e supervisão da Profa. Dra. Ester Silveira Ramos do
Departamento de Genética da FMRP-USP e do Prof. Dr. Geraldo Duarte do Departamento
de Ginecologia e Obstetrícia da FMRP-USP.
Adicionalmente, foi acrescentado um segundo grupo controle, composto por 302
indivíduos (204 do sexo feminino não grávidas e 98 do sexo masculino) saudáveis da
população geral com idades entre 18 e 35 anos como um segundo grupo controle (Tabela 2).
Tabela 2: Caracterização quanto ao sexo de um segundo grupo controle constituído por homens e mulheres não grávidas saudáveis, da população geral.
População Número de Indivíduos
Sexo feminino 98
Sexo masculino 204
Total 302
3.2 - Análise molecular
As análises moleculares foram realizadas no Laboratório do Grupo de Epigenética e
Reprodução do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
USP. O seqüenciamento automático foi realizado no Laboratório de Genética Molecular e
Bioinformática (LGMB) do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto – USP e no Laboratório de Biologia Molecular de Plantas (LBMP) do Departamento de
Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.
3.2.1 - Coleta de sangue periférico
Após leitura e assinatura do TCLE (Anexo A) por parte de cada doadora, foram
coletados 5-10 ml de sangue venoso periférico em tubos estéreis, a vácuo, contendo EDTA.
3.2.2 - Extração de DNA genômico
O DNA genômico de todas as amostras coletadas foi extraído por meio de
precipitação salina (NaCl) por meio de método modificado de OLERUP & ZETTERQUIST
(1992). Ao volume de 1,0ml de sangue periférico foi adicionado 0,5ml de Tampão de Lise
[Sacarose 0,32M; Tris HCl 12mM (pH 7,5); MgCl2 5,0M; Triton X 1,0%] em microtubos de
1,5ml. As amostras foram centrifugadas a 16000 g por 20 segundos, o sobrenadante
descartado e o procedimento repetido com adição de 1,0ml de Tampão de Lise até a
obtenção de pellet branco. O pellet foi ressuspendido em 80μl de Tampão de Proteinase K
(5X) [NaCl 0,375M; EDTA (pH8,0) 0,12 M], 8,0μl de proteinase K (20ng/ml), 10μl de SDS
20% e 283,3μl de água destilada e deionizada e incubado à 55°C por 16 horas. Foram
adicionados 120μl de NaCl 5M e após agitação por 15 segundos a amostra foi centrifugada
a 16000 g por 8 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo de 1,5ml,
onde foi adicionado 1,0ml de etanol à 20°C, homogeneizado por inversão manual e
centrifugado por 10 minutos à 16000 g a uma temperatura de 4°C. O sobrenadante foi
descartado e o pellet restante desidratado. O pellet foi ressuspendido em 50μl de água
destilada e deionizada.
3.2.3 - Seleção e validação dos primers
Para obtermos a seqüência específica dos três pares de primers utilizados, foi
realizado um estudo preliminar in silico da região de interesse do gene CDKN1C utilizando-
se o banco de dados do programa GenBank (GENBANK, 2008), sob identificação de acesso
D64137.
Após conferirmos a região de interesse do gene CDKN1C, o desenho dos primers
para a região dos intron 1 e exon 2 foram obtidos de acordo com a posição física
NC_000011 de 2906424 a 2906314. As seqüências de primers denominadas de Primers 1
(seqüência sense: 5’ – TCTTCTCGCTGTCCTCTCCT – 3’ e antisense: 5’-
CGCCCCACCTGCACCGTCT – 3’) e Primers 2 (seqüência sense: 5’ –
GAACCGCTGGGATTACGAC – 3’ e antisense: 5’- GAGCCAGGACCGGGACT – 3’) foram
construídas em consenso com os primers descritos por LEW et al. (2004) originando
amplicons de 348 e 293 pares de bases (pb) respectivamente (Tabela 3) (Figura 2).
Neste estudo in silico, sob o mesmo número de acesso D64137 e a mesma
localização física do gene CDKN1C (NC_000011 de 2906424 a 2906314), as seqüências de
primers denominadas de Primers 3 (seqüência sense: 5’ – CTGCCTAGTGTCCCGGTC – 3’
e antisense: 5’- CGCGCTGCCCCTGGTTC – 3’, amplicon de 297 pb) foram identificadas a
partir das seqüências de aminoácidos de interesse descritos por NIELSEN et al. (2005).
Para isso, transpusemos estas seqüências de aminoácidos para a forma de códons e em
seguida alinhamos as seqüências de nucleotídeos para identificar as seqüências específicas
da região de interesse, possibilitando desenhar e validar as seqüências referente ao Primers
3 neste estudo (Tabela 3) (Figura 2).
Tabela 3: Seqüências de primers obtidas para análise molecular do gene CDKN1C.
Nome do primer
Seqüência Amplicon Posição física
Primers 1
sense: 5’ – TCTTCTCGCTGTCCTCTCCT – 3’
antisense: 5’- CGCCCCACCTGCACCGTCT – 3’
348 pb intron 1 + exon 2
(2906424-2906772)
Primers 2
sense: 5’ – GAACCGCTGGGATTACGAC – 3’
antisense: 5’- GAGCCAGGACCGGGACT – 3’
293 pb exon 2
(2906254-2906546)
Primers 3
sense: 5’ – CTGCCTAGTGTCCCGGTC – 3’
antisense: 5’- CGCGCTGCCCCTGGTTC – 3’
297 pb exon 2
(2906020-2906314)
tcttctcgctgtcctctcctctctcgtgcccgcgtttgcgcagccccgggccatgtccgacgcgtccctccgca
gCACATCCACGATGGAGCGTCTTGTCGCCCGTGGGACCTTCCCAGTACTAGTGCGCACCAGCGCCT
GCCGCAGCCTCTTCGGGCCGGTGGACCACGAGGAGCTGAGCCGCGAGCTGCAGGCCCGCCTGGC
CGAGCTGAACGCCGAGGACCAGAACCGCTGGGATTACGACTTCCAGCAGGACATGCCGC
TGCGGGGCCCTGGACGCCTGCAGTGGACCGAAGTGGACAGCGACTCGGTGCCCGCGTTCTACCGC
GAGACGGTGCAGGTGGGGCGCTGCCGCCTGCTGCTGGCGCCGCGGCCCGTCGCGGTCG
CGGTGGCTGTCAGCCCGCCCCTCGAGCCGGCCGCTGAGTCCCTCGACGGCCTCGAGGAGGCGCC
GGAGCAGCTGCCTAGTGTCCCGGTCCCGGCCCCGGCGTCCACCCCGCCCCCAGTCCCGGTCCTGGCTCCAGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGTCGCGGCTCCGGTCGCGGCTCCG
GTCGCGGTCGCGGTCCTGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGGCCCCGGCTCCAGTCGCGGCCCCGGCCCCAGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCCGCCCCGGCCCCGG
CCCCGGACGCGGCGCCTCAAGAGAGCGCCGAGCAGGGCGCGAACCAGGGGCAGCGCG
Figura 2. Fragmento de interesse com posição física NC_000011 de 2906424 a 2906314 da seqüência 5’-3’ do gene CDKN1C humano obtido sob identificação D64137 do banco de dados do programa GenBank. Em letras minúsculas, em negrito e em itálico está representada parte da seqüência do intron 1 e em letras maiúsculas parte da seqüência do exon 2. Na cor amarela estão representadas as seqüências de primers que geram um amplicon de 348 pb (Primers 1) e flanqueiam região do intron 1 e exon 2. As seqüências de primers que flanqueiam o exon 2 estão na cor rosa (Primers 2 - amplicon de 293 pb) e na cor vermelha (Primers 3 - amplicon de 297 pb).
3.2.4 - Identificação da seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano
Em outro estudo in silico, obtivemos a seqüência de aminoácidos a partir da
seqüência codificadora do gene CDKN1C humano (sob o mesmo número de acesso
D64137) utilizado o banco de dados dos programas GenBank (GENBANK, 2008) e UniProt
(disponível em http://www.uniprot.org/) (Figura 3).
MSDASLRSTSTMERLVARGTFPVLVRTSACRSLFGPVDHEELSRELQARLAELNAEDQNRWDYDFQQDMPLRGPGRLQWTEVDSDSVPAFYRETVQVGRCRLLLAPRPVAVAVAVSPPLEPAAESLDGLEEAPEQLPSVPVPAPASTPPPVPVLAPAPAPAPAPVAAPVAAPVAVAVLAPAPAPAPAPAPAPAPVAAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAAPQESAEQGANQGQRGQEPLADQLHSGISGRPAAGTAAASANGAAIKKLSGPLISDFFAKRKRSAPEKSSGDVPAPCPSPSAAPGVGSVEQTPRKRLR
Figura 3. Sequência de aminoácidos do gene CDKN1C humano.
3.2.5 – Reação em Cadeia da Polimerase
Para a amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês
Polymerase Chain Reaction), as amostras de DNA genômico extraído do sangue periférico
(template) tiveram suas concentrações auferidas em espectrofotômetro e foram diluídas
para a concentração de 100 ng/μl utilizando água destilada e deionizada.
A PCR foi realizada em um termociclador eletrônico, seguindo protocolos descritos
em INNIS et al. (1990) e seguindo instruções do fabricante dos primers e da enzima DNA
Polimerase (Taq DNA Polymerase Recombinant e Platinum® Pfx DNA Polymerase ambas
Invitrogen®).
Os produtos de PCR durante a padronização foram visualizados em gel de
poliacrilamida (8%) corado com nitrato de prata e revelado com carbonato de sódio. Optou-
se pela padronização em gel de poliacrilamida devido à nitidez e a fidelidade de visualização
de bandas dessa metodologia quando comparada à metodologia de visualização por meio
de gel de agarose (2%) corado com brometo de etídio.
Todos os géis de poliacrilamida foram corados com nitrato de prata e revelados com
carbonato de sódio utilizando o seguinte protocolo: o gel foi retirado da placa e colocado em
repouso em solução de etanol 10% por no mínimo dez minutos. Foi retirada toda solução de
etanol 10% e adicionada solução de ácido nítrico 1,54% e deixado em agitador (shaker) por
3 minutos. Após agitação, foi retirada toda solução de ácido nítrico e feita lavagem com
água destilada e deionizada para que em seguida fosse aplicada solução de nitrato de prata
0,2% e o gel agitado por 20 minutos. Toda solução de nitrato de prata foi retirada e lavada
três vezes com água destilada e deionizada. Após a lavagem, foi aplicada a solução de
carbonato de sódio acrescida de 108 μl de formaldeído e agitada até atingir a coloração
desejada. Para encerrar a reação de coloração foi aplicada solução de ácido acético 5%.
As PCRs para as seqüências dos Primers 1, Primers 2 e Primers 3, que
compreendem a região do intron 1 e do exon 2 do gene CDKN1C humano (Figura 4), foram
padronizadas conforme demonstram as bandas únicas presentes na altura de 348 pb, 293
pb e 297 pb, respectivamente. A eficiência da reação pode ser comprovada por meio da
intensidade e nitidez das bandas e principalmente por meio da ausência de bandas
inespecíficas derivadas de pareamento errôneo dos primers ao DNA template.
A ausência de bandas inespecíficas nos controles negativos demonstrou que não
houve contaminação.
Figura 4. Imagem de gel de poliacrilamida onde é observado o marcador (ladder) de 100 pb seguido de três amostras-controle utilizadas para a padronização dos primers específicos para a PCR das regiões do intron 1 e do exon 2 compreendendo amplicons de 348 pb (Primers 1), 293 pb (Primers 2) e 297 pb (Primers 3).
200 pb -
300 pb -
100 pb -
LADDER Primer Primer Primer 1 2 3
348 pb -
293 pb - 297 pb -
Para amplificação por PCR da região de interesse dos Primers 1, a padronização
final das condições para cada amostra teve o meio de reação (mix) composto por: 18,80 µl
de água destilada e deionizada, 2,5 µl de Buffer (tampão) [10X: 200 mM tris-HCl; 500 mM
KCl], 1,0 µl de MgCl2: [50 mM], 0,5 µl de dNTP [10 mM], 0,5 µl de primer sense [10 pmoles],
0,5 µl de primer anti-sense [10 pmoles], 0,2 µl de Taq DNA Polymerase (Invitrogen®) [5 U/µl]
e como template 1µl de DNA [100 ng/ µl] (Tabela 4). A ciclagem ou programa do
termociclador eletrônico programável (modelo Biometra T-Gradient®), independentemente
do número de amostras foi: denaturação inicial 94°C por 5 minutos, 35 ciclos de 94°C por 30
segundos, 65°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, extensão final de 72°C por 10
minutos e 10°C por 5 minutos para finalizar e inativar a reação.
Na amplificação por PCR da região de interesse dos Primers 2, foi otimizada para
cada amostra o meio de reação composto por: 19,30 µl de água destilada e deionizada, 2,5
µl de Buffer (tampão) [10X: 200 mM tris-HCl; 500mM KCl], 0,5 µl de MgCl2: [50 mM], 0,5 µl
de dNTP [10 mM], 0,5 µl de primer sense [10 pmoles], 0,5 µl de primer anti-sense [10
pmoles], 0,2 µl de Taq DNA Polymerase (Invitrogen®) [5 U/µl] e como template 1 µl de DNA
[100 ng/ µl] (Tabela 4). O programa do termociclador (modelo Biometra T-Gradient®)
utilizado foi: denaturação inicial 94°C por 5 minutos, 35 ciclos de 94°C por 45 segundos,
57°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, extensão final de 72°C por 10 minutos e
10°C por 5 minutos finalizando a reação.
Tabela 4: Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 1 e Primers 2 do gene CDKN1C humano.
Reagentes utilizados Volume de reagentes por amostra
Primers 1 Primers 2
Água destilada e deionizada 18,80 µl 19,30 µl
Tampão 2,5 µl [10X: 200 mM tris-HCl; 500mM KCl],
2,5 µl [10X: 200 mM tris-HCl; 500mM KCl],
MgCl2 1,0 µl [50 mM] 0,5 µl [50 mM]
dNTP 0,5 µl [10 mM], 0,5 µl [10 mM]
primer sense 0,5 µl [10 pmoles] 0,5 µl [10 pmoles]
primer anti-sense 0,5 µl [10 pmoles] 0,5 µl [10 pmoles]
Taq DNA Polymerase Recombinant (Invitrogen®)
0,2 µl [5 U/µl] 0,2 µl [5 U/µl]
DNAg molde 1 µl de DNA [100 ng/ µl] 1 µl de DNA [100 ng/ µl]
Devido a características específicas da região de interesse dos Primers 3,
flanqueando uma pequena região repetitiva, a padronização da PCR se mostrou um pouco
mais complicada no que tange à especificidade da reação, uma vez que era comum o
aparecimento de bandas inespecíficas. Para solucionar esse problema foi necessária a
utilização de enzima DNA polimerase high-fidelity com atividade exonuclease 3’ – 5’
(proofreading), de maior especificidade no pareamento dos primers e maior fidelidade na
síntese de novas cópias do template durante a reação. Portanto, essa reação foi
padronizada e otimizada utilizando-se para cada reação: 1,25 µl de Buffer Platinum PFX
[10X: Sulfato de Amônia concentração não divulgada], 0,25 µl de MgSO4 Platinum PFX [50
mM], 0,25 µl de dNTP [10 mM], 0,25 µl de primer sense [10 pmoles], 0,25 µl de primer anti-
sense, 9,65 µl de água destilada e deionizada, 0,1 µl de Platinum® Pfx DNA Polymerase
(Invitrogen®) [2,5 U/µl]e 0,5µl de DNA [100 ng/ µl] de template (Tabela 5).
Tabela 5: Reagentes utilizados para a PCR da região de interesse dos Primers 3 do gene CDKN1C humano.
Reagentes utilizados Volume de reagentes por amostra
(Primer 3)
Água destilada e deionizada 9,65 µl
Buffer Platinum PFX 1,25 µl [10X],
MgSO4 Platinum PFX 0,25 µl [50 mM]
dNTP 0,25 µl [10 mM],
primer sense 0,25 µl [10 pmoles]
primer anti-sense 0,25 µl [10 pmoles]
Platinum® Pfx DNA Polymerase (Invitrogen®)
0,1 µl [2,5U/µl]
DNAg molde 0,5 µl de DNA [100 ng/ µl]
A reação referente aos Primers 3 também foi realizada em termociclador eletrônico
(modelo Biometra T-Gradient®), onde as condições ideais foram: denaturação inicial 94°C
por 3 minutos, 40 ciclos de 94°C por 20 segundos, 66°C por 30 segundos e 68°C por 15
segundos, extensão final de 68°C por 5 minutos e 10°C por 5 minutos finalizando a reação.
As três reações foram padronizadas utilizando-se temperatura inicial de denaturação,
ciclagens de três passos (composta por temperatura de denaturação, temperatura de
annealing ou de pareamento dos primers e temperatura de extensão ou síntese ou
polimerização), temperatura de extensão final e temperatura de inativação ou finalização.
3.2.6 – Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (SSCP)
Na técnica de polimorfismo conformacional de fita simples (ou SSCP do inglês Single
Strand Conformational Polymorphism), após a corrida eletroforética, quando existe uma
variante do gene, é possível observar alteração no padrão de migração das bandas que
pode ser devido à variação de apenas um nucleotídeo, seja essa variação do tipo frameshift
ou troca de bases (bases púricas e/ou pirimídicas). Portanto, a presença de apenas uma
base alterada no fragmento amplificado pela PCR modifica a interação intramolecular, que
pode induzir a uma mudança na conformação estrutural terciária adquirida pela fita simples
de DNA que poderá ser detectada por meio de diferenças na mobilidade migratória no gel.
(NOLL & COLLINS, 1987; HONGYO et al., 1993).
Na corrida do gel para SSCP é comum ocorrer a formação de heteroduplex, que
consiste em uma molécula de DNA (fita-dupla) híbrida formada pelas fitas simples de dois
alelos distintos, que também pode ser utilizada como referência no padrão de migração do
produto de PCR no gel.
Durante a corrida do gel de SSCP não é necessária a utilização de marcador de
pares de bases (ladder) como padrão para obtenção do padrão de migração tendo em vista
que devido à conformação estrutural tridimensional, os fragmentos denaturados (fita simples
de DNA) migram no gel de forma muito mais lenta que os fragmentos de fita dupla que estão
presentes no ladder e dos que são provenientes do produtos de PCR que naturalmente se
renaturam (voltam a formar dupla fita) após o aquecimento, mesmo com a presença de
tampão denaturante. O ladder nesta técnica é utilizado para verificar a integridade do gel e
auxiliar como controle de coloração no protocolo usado para corar o gel de poliacrilamida.
Para a realização da técnica de PCR-SSCP, previamente as amostras foram
submetidas à amplificação da PCR com os respectivos primers flanqueando as regiões de
interesse, sendo os produtos submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose 2%
corado com brometo de etídio para se verificar a presença do fragmento amplificado.
Posteriormente o material considerado de boa qualidade era submetido à corrida em gel de
SSCP. As amostras de baixa qualidade tinham a PCR refeita até apresentarem padrão de
banda satisfatório para serem submetidas a técnica de screening.
O SSCP foi verificado por meio de corrida eletroforética em géis de poliacrilamida
10% não denaturante (cada gel composto por 14.600 µl de água destilada e deionizada,
10.200 µl de poliacrilamida, 3.000 µl de TBE - tris/borato EDTA 10X, 450 µl de persulfato de
amônia – PSA e 22,5 µl do catalítico TEMED) e tampão de corrida composto por TBE
(tris/borato EDTA) 1X. Na padronização das amostras a serem aplicadas no gel, foram
utilizados diferentes volumes de produto de PCR e diferentes volumes de solução
denaturante (loading buffer) específica (impede a renaturação da dupla-fita de DNA)
composta por 0,015 g de azul de bromofenol, 0,015 g de xileno-cianol, 200 µl de EDTA 0,5M
pH 8,0 e 9,75 ml de formamida deionizada.
Em microtubos de 200 µl foram misturados e homogeneizados os corretos volumes
de produto de PCR e tampão denaturante formando o mix do SSCP. Estes mix foram
aquecidos em termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita de DNA por 5 minutos
e rapidamente foram aplicados no gel e submetidos à corrida eletroforética. De forma geral,
nesta padronização primeiramente foram observadas características específicas de cada
produto amplificado [quantidade de bases de adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina
(G), comprimento do amplicon e eficiência da PCR previamente padronizada] para em
seguida serem observadas as características secundárias da padronização como o tempo
da corrida do gel e a tensão (Volts - V), corrente (mili-Ampéres - mA) e a potência (watts -
W) elétrica utilizadas (Tabela 6).
Tabela 6: Condições das amostras, do gel e da corrida de eletroforese padronizadas para a técnica de PCR-SSCP referentes às regiões de interesse dos Primers 1, Primers 2 e Primers 3.
Condições das amostras e do gel de eletroforese de SSCP
Produto de PCR da região de interesse
Primer 1 Primer 2 Primer 3
Volume de produto de PCR por amostra
8 l 5 l 6 l
Volume de tampão denaturante por amostra
2 l 2 l 5 l
Volume total do gel e concentração de poliacrilamida
28.272,5 l [10%] 28.272,5 l [10%] 28.272,5 l [10%]
Volume do tampão de corrida TBE (tris/borato EDTA) 1X
2.000 ml 2.000 ml 2.000 ml
Tensão (V), corrente (mA) e potência (W) elétrica da corrida
do gel
130V, 30mA, 30W 100V, 40mA, 40W 80V, 40mA, 40W
Tempo de corrida do gel 24 horas 23 horas 17 horas
Temperatura de corrida do gel 5°C 5°C 5°C
As amostras para a corrida de gel SSCP para os Primers 1 (amplicon de 348 pb)
foram otimizadas utilizando-se um total de 8 μl de produto de PCR adicionado de 2 μl de
tampão denaturante (volume final de mix de 10 μl) com as amostras sendo aquecidas em
termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita de DNA por 5 minutos e subseqüente
aplicação no gel. A corrida eletroforética foi realizada com tampão TBE (tris/borato EDTA)
1X com tempo de corrida de 24 horas a 130 volts, 30 mili-Ampéres e 30 watts. Após a
corrida do gel em temperatura controlada (aproximadamente 5°C), o mesmo foi corado com
nitrato de prata e revelado com carbonato de sódio para permitir a visualização das bandas
(Tabela 6 e Figura 5).
Figura 5. Imagem de gel de SSCP com um ladder de 1000pb seguido de oito amostras-controle (1-8) utilizadas para a padronização dos primers específicos da região dos Primers 1, onde não ocorreu alteração no padrão de migração das bandas. O ladder de 1000 pb foi utilizado apenas para verificar a integridade do gel, uma vez que ele não serve de padrão para a migração de bandas do gel de SSCP.
Na Figura 4 não se observa diferença no padrão de migração, demonstrando que os
controles utilizados na padronização da técnica possuem as seqüências de nucleotídeos do
amplicon de 348 pb (Primer 1) semelhantes entre si.
LADDER 01 02 03 04 05 06 07 08
5000 pb -
6000 pb -
Para o amplicon da região dos Primers 2 (amplicon de 293 pb) utilizou-se um total de
5 μl de produto de PCR adicionado de 2 μl de tampão denaturante (volume final de mix de 7
μl) com as amostras aquecidas em termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita
de DNA por 5 minutos. A corrida eletroforética foi realizada com tampão TBE (tris/borato
EDTA) 1X a 100 volts, 40 mili-Ampéres e 40 watts com tempo de corrida de 23 horas
(Tabela 6 e Figura 6).
Figura 6. Imagem de um gel de SSCP com um ladder de 1000pb seguido de oito amostras-controle utilizadas para a padronização dos primers específicos da região do Primer 2 onde não ocorreu alteração no padrão de migração das bandas. O ladder de 1000 pb foi utilizado apenas para verificar a integridade do gel, uma vez que ele não serve de padrão para a migração de bandas do gel de SSCP.
Na Figura 5 não se observa diferença no padrão de migração, demonstrando que os
controles utilizados na padronização da técnica possuem as seqüências de nucleotídeos do
amplicon de 293 pb (Primer 2) iguais.
3000 pb -
4000 pb - LADDER 01 02 03 04 05 06 07 08
Semelhantemente à PCR-SSCP dos Primers 1 e Primers 2, para o amplicon da
região dos Primers 3 (de 297 pb) utilizou-se 6 μl de produto de PCR adicionado de 5 μl de
tampão denaturante (volume final de mix de 11 μl) com as amostras igualmente aquecidas
em termociclador a 94°C para a denaturação da dupla-fita de DNA por 5 minutos. A corrida
eletroforética foi realizada com tampão TBE (tris/borato EDTA) 1X com tempo de corrida de
17 horas a 80 volts, 40 mili-Ampéres e 40 watts (Tabela 6 e Figura 7).
Figura 7. Imagem de um gel de SSCP com um ladder de 1000pb seguido de oito amostras-controle utilizadas para a padronização dos primers específicos da região do Primer 3 onde não ocorreu alteração no padrão de migração das bandas. O ladder de 1000 pb foi utilizado apenas para verificar a integridade do gel, uma vez que ele não serve de padrão para a migração de bandas do gel de SSCP.
Na Figura 6 não se observa diferença no padrão de migração, demonstrando que os
controles utilizados na padronização da técnica possuem as seqüências de nucleotídeos do
amplicon de 297 pb (Primer 3) semelhantes.
Todas as amostras teste que apresentaram padrão de migração diferente dos
demais foram submetidas a no mínimo cinco novas PCRs para excluir a possibilidade da
variável ter sido criada amplificação por PCR (erro na síntese da nova fita por parte da
enzima DNA polimerase) ou durante o preparo e execução da técnica de SSCP e para
permitir a reprodutibilidade da técnica confirmando que realmente em determinada amostra
havia um novo e diferente padrão de migração de bandas. Estas amostras que
apresentaram novo padrão de migração, ao serem detectadas, imediatamente passavam a
3000 pb -
4000 pb - LADDER 01 02 03 04 05 06 07 08
fazer parte de todos os géis de SSCP seguintes, servindo como um novo padrão e controle
para o restante das amostras que estavam sendo estudadas por meio da técnica de PCR-
SSCP. É importante ressaltar que em todos os géis de SSCP havia uma amostra do padrão
predominante que era repetida no gel seguinte.
3.2.7 – Seqüenciamento automático de nucleotídeos
Após a detecção do padrão de migração alterado por SSCP, as amostras alteradas e
os controles foram submetidos a uma nova PCR e tiveram seus produtos amplificados
corridos em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, onde tiveram suas bandas na
posição de seus respectivos amplicons retiradas do gel e purificadas com o kit de
purificação Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit® (GE Healthcare) seguindo
os protocolos do fabricante.
Concluído o processo de purificação, estas amostras seguiram os protocolos da
reação de seqüenciamento automático de nucleotídeos utilizados para o seqüenciador
automático ABI Prism 3130 Genetic Analyzer fazendo-se uso do kit de seqüenciamento ABI
Prism Big Dye Terminator v3.0® (Applied Biosystems) de acordo com os protocolos do
fabricante.
A reação de precipitação da reação de seqüenciamento foi realizada por meio do
seguinte protocolo: foi adicionado 80µl de álcool isopropílico 65% ao produto final de cada
amostra da reação de seqüenciamento, homogeneizado e colocado em repouso ao abrigo
da luz por no mínimo 1 hora. As amostras foram centrifugadas a 16.000 g por 30 minutos à
temperatura ambiente. O próximo passo foi a retirada de todo o álcool isopropílico da
amostras para ser adicionado 250µl de etanol 70 % e centrifugado a 16.000 g por 15
minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, todo o etanol foi removido para as
amostras serem secadas, ao abrigo da luz, em placa aquecedora (termoplaca, termociclador
ou estufa estéril) a 37°C por 15 minutos. As amostras foram ressuspendidas em 10µl de Hi-
Di Formamide® (Applied Biosystems) antes de serem colocadas no seqüenciador.
Na reação de seqüenciamento, os primers sense e anti-sense de cada par (Primers 1,
Primers 2 e Primers 3) foram adicionados separadamente em cada amostra com a
finalidade de obtermos as seqüências de nucleotídeos das fitas simples de forma separada,
para em seguida por meio de programas de bioinformática Mult Alin (CORPET, F. 1988) e
GeneRunner (versão 3.05 – sob licença livre da Hastings Software, 1994) unirmos e
alinharmos às seqüências das fitas simples complementares.
Para detectar a qualidade da reação analisando os cromatogramas referentes ao
seqüenciamento de cada fita simples, foi utilizado o software Finch TV (versão 1.4.0 – sob
licença livre da Geospiza Inc., 2004-2006).
3.2.8 - Identificação in silico de variantes no gene CDKN1C humano
A presença de polimorfismos descritos e seqüências repetitivas foi realizada por meio
dos programas BLAST SNP Sequence (disponível em
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), International HapMap Project (disponível em:
http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en) e RepeatMasker Open-3.0 (SMIT et al., 1996)
disponível em http://repeatmasker.org). Outras variantes para o gene CDKN1C humano
também foram pesquisadas na literatura.
3.3 – Análise estatística
Para o cálculo das freqüências alélica e genotípica, utilizou-se o procedimento GLM
do software SAS (SAS - Statistical Analysis System, 2003) com p<0,05 sendo considerado
significativo.
O Teste Exato de Fisher (two tails, p<0,05 significativo) foi utilizado para observar
variações entre os grupos estudados (PE, eclâmpsia, HG, HC e grupo controle), os dados
dos prontuários das pacientes (peso do recém nascido em relação à idade gestacional,
idade materna) e os genótipos encontrados.
O teste de comparação de médias (Teste de Tukey com p<0,05 significativo) foi
utilizado para comparar a média dos valores obtidos a partir dos dados dos prontuários
também utlizando-se o software SAS.
O número de pacientes por grupo, média de idade das pacientes e média da idade
gestacional foram calculados com o auxílio do software Microsoft® Excel.
IV. RESULTADOS
4.1- Reação em cadeia da polimerase e Polimorfismo Conformacional de Fita
Simples (PCR-SSCP)
De todas as amostras analisadas para o gene CDKN1C por meio da técnica de PCR-
SSCP, quatro apresentaram variação no padrão de migração durante a corrida eletroforética.
Para a região de análise dos Primers 1 (amplicon de 348 pb), foram detectadas
alterações do padrão de migração das bandas do gel de SSCP em uma amostra do grupo
controle (1/162), de número 789 do registro de DNA do laboratório (Figura 8); e de uma
amostra do grupo controle da população geral (1/302) de registro número 236 (Figura 9).
Figura 8. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon dos PCR-SSCP dos Primers 1. Nota-se a alteração no padrão de migração da amostra 789 (grupo controle). O padrão de migração das bandas das amostras 795, 844 e 852 (grupo controle) foi considerado como predominante.
795 789 844 852
Figura 9. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon dos PCR-SSCP dos Primers 1. Nota-se a alteração no padrão de migração da amostra 236 (grupo controle da população geral). O padrão de migração das bandas das amostras 234, 235 e 237 (também do grupo controle da população geral) foi considerado como predominante.
234 235 236 237
Na região de interesse dos Primers 2 (amplicon de 293 pb), foi detectada alteração
do padrão de migração das bandas do gel de SSCP em duas amostras, sendo ambas do
grupo das portadoras de HAC (2/42) e que possuíam os números de DNA 484 e 859 (Figura
10).
Figura 10. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon da região dos Primers 2. Nota-se a alteração no padrão de migração das bandas das amostras 484 e 859 (grupo das portadoras de HAC). O padrão de migração das amostras 413 e 240 (grupo das portadoras de HAC) foi considerado como normal (predominante).
Todas as amostras restantes analisadas sob as condições de PCR-SSCP para os
Primers 1, Primers 2 apresentaram padrão de migração normal, ou considerado
predominante.
413 484 859 240
Na região de interesse dos Primers 3 (amplicon de 297 pb), não foi detectada
alteração do padrão de migração das bandas do gel de SSCP, portanto, todas as amostras
apresentaram mesmo padrão de migração de bandas (Figura 11).
Figura 11. Imagem de um gel de SSCP com quatro amostras mostrando o padrão de migração das bandas para o amplicon da região dos Primers 3. Não foi possível notar alteração no padrão de migração das bandas das amostras 236 (grupo controle da população geral), 484 e 859 (grupo das portadoras de HAC) e 789 (grupo controle). Este padrão de migração foi considerado como normal (predominante).
236 484 789 859
4.2- Seqüenciamento automático de nucleotídeos e alinhamento de seqüências
4.2.1 – Primers 1
A amostra 789 do grupo controle, após ter sido submetida ao seqüenciamento
automático de nucleotídeos, apresentou uma alteração do tipo troca de bases (inversão)
pirimídicas, confirmado a alteração encontrada no gel de SSCP (Figura 8). Um nucleotídeo
C (citosina) foi substituído por um nucleotídeo T (timina) em um de seus alelos, conferindo a
esta amostra o genótipo de heterozigota para a o polimorfismo +275C/T do gene CDKN1C
humano (Figura 12).
Figura 12. Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da amostra 789 referente aos Primers 1, onde é possível observar os picos sobrepostos (seta) indicando a presença de duas bases sobrepostas localizadas na mesma posição, consistindo em alelos heterozigotos.
Na posição 184 do amplicon dos Primers 1, ou INVS+275C/T do gene CDKN1C
humano, a seqüência referência do banco de dados do programa GenBank (identificação de
acesso D64137) possui uma base C nesta posição, conforme podemos observar no
alinhamento das seqüencias nucleotídicas entre a seqüência referência e a amostra 789
proveniente da reação de seqüenciamento, promovidas por meio do programa de
bioinformática Mult Alin (CORPET, F. 1988) (Figura 13).
Figura 13. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 789 do grupo controle. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 1.
A amostra 236 do grupo controle da população geral, apresentou uma alteração do
tipo troca de bases (inversão) púricas, confirmado a alteração encontrada no gel de SSCP
(Figura 9). Um nucleotídeo A (adenina) foi substituído por um nucleotídeo G (guanina) em
um de seus alelos, conferindo a esta amostra o genótipo de heterozigota para a o
polimorfismo +317A/G do gene CDKN1C humano (Figura 14).
Figura 14. Imagem parcial do cromatograma com o resultado do seqüenciamento da amostra 236 referente aos Primers 1, onde é possível observar os picos sobrepostos (seta) indicando a presença de duas bases sobrepostas localizadas na mesma posição, consistindo em alelos heterozigotos.
Na posição 225 do amplicon dos Primers 1, ou INVS+317A/G do gene CDKN1C
humano, a seqüência referência do banco de dados do programa GenBank (identificação de
acesso D64137) possui uma base G nesta posição, conforme podemos observar no
alinhamento das seqüencias nucleotídicas entre a seqüência referência e a amostra 236
proveniente da reação de seqüenciamento, promovidas por meio do programa de
bioinformática Mult Alin (CORPET, F. 1988) (Figura 15).
Figura 15. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 236 do grupo controle da população geral. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 1.
As amostras 484 e 859, pertencentes ao grupo HAC, que apresentaram variação na
corrida eletroforética do SSCP (Figura 10) em relação aos Primers 2, também foram
submetidas ao seqüenciamento automático de nucleotídeos utilizando-se os Primers 1,
mesmo após o resultado de PCR-SSCP dessas amostras terem sido semelhantes ao
padrão predominante. Estas amostras apresentaram seqüencias nucleotídicas idênticas às
da seqüência referência do banco de dados do programa GenBank (Figura 2, Figura 13 e
Figura 15).
Dessa forma, com exceção das amostras 789 e 236, todas as amostras analisadas
possuem genótipo CC para o polimorfismo +275C/T e genótipo AA para o polimorfismo
+317A/G do gene CDKN1C humano.
4.2.2 – Primers 2
As amostras 484 e 859 do grupo HAC, após serem submetidas ao seqüenciamento
automático de nucleotídeos, também apresentaram inversão de bases, confirmado as
alterações encontradas no gel de SSCP (Figura 10).
Na amostra 484 foi detectada a troca de um nucleotídeo C por G, ou seja, houve a
inversão de uma base pirimídica por uma púrica na posição +495C/G. Na amostra 859 foi
encontrada a troca de um nucleotídeo C por T (inversão de bases pirimídicas) na posição
+498C/T. As alterações singulares a cada amostra conferiram a elas genótipo heterozigoto
para seus respectivos polimorfismos (Figura 16).
Figura 16. Imagem parcial dos cromatogramas com os resultados do seqüenciamento das amostras 484 (A) e 859 (B) referentes aos Primers 2. Em ambas amostras é possível observar os picos sobrepostos (seta) indicando a presença de duas bases sobrepostas localizadas na mesma posição, consistindo alelos heterozigotos.
Na amostra 484, na posição 179 do amplicon dos Primers 2, ou INVS+495C/G do
gene CDKN1C humano, a seqüência referência do banco de dados do programa GenBank
(identificação de acesso D64137) possui uma base C nesta posição (Figura 17); já a
amostra 859, na posição 182 do amplicon dos Primers 2, ou INVS+498C/T, a seqüência
A B
referência também possui uma base C nesta posição (Figura 18), como podemos observar
no alinhamento das seqüencias nucleotídicas feitas pelo programa Mult Alin (CORPET, F.
1988).
Figura 17. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 484 do grupo HAC. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 2.
Figura 18. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos da seqüência referência GenBank e a amostra 859 do grupo HAC. A seqüência “F” é proveniente do primer sense 5’-3’ e “R” do primer anti-sense, ambas dos Primers 2.
A amostra 789, pertencente ao grupo controle, que apresentou variação na corrida
eletroforética do SSCP (Figura 8) em relação aos Primers 1, também foi submetida ao
seqüenciamento automático de nucleotídeos utilizando-se os Primers 2, apesar de seu
resultado de PCR-SSCP ter sido semelhante ao padrão predominante. Esta amostra
apresentou seqüencias nucleotídicas iguais às da seqüência referência do banco de dados
do programa GenBank (Figura 2 e Figura 17 ou Figura 18).
Esses dados nos permitem concluir, com exceção das amostras 484 e 859, que
todas as amostras analisadas possuem genótipo CC para os polimorfismos +495C/G e
+498C/T do gene CDKN1C humano.
As amostras 494 e 592 do grupo controle também foram seqüenciadas utilizando-se
os Primers 1, Primers 2 e Primers 3, e apresentaram suas seqüencias nucleotídicas
idênticas às da seqüência referência do banco de dados do programa GenBank,
confirmando e corroborando com os nossos achados por meio da técnica de PCR-SSCP e
seqüenciamento automático de nucleotídeos.
Adicionalmente, para serem utilizados como seqüência referência e auxiliar na
confirmação da seqüência das amostras do grupo controle, foram seqüenciados dois
indivíduos normais do sexo masculino, que apresentaram suas seqüencias nucleotídicas
idênticas às da seqüência referência do banco de dados do programa GenBank para os os
Primers 1, Primers 2 e Primers 3.
4.3 - Seqüência de aminoácidos
Com as alterações nucleotídicas detectadas após o seqüenciamento e a análise por
bioinformática, foi possível por meio do programa gene GeneRunner, simular in silico as
alterações encontradas na seqüência de nucleotídeos na seqüência de aminoácidos.
Pudemos observar que os polimorfismos +275C/T, +317A/G, +495C/G e +498C/T,
em um dos alelos, promovem alteração da seqüência de aminoácidos ao longo da cadeia
polipeptídica (ou estrutura primária). O polimorfismo +275C/T promove a troca do
aminoácido R (arginina – Arg) por C (cisteína – Cis), +317A/G promove a troca de Q
(glutamina - Gln) por R (arginina – Arg), +495C/G promove a troca de P (prolina – Pro) por A
(alanina – Ala) e +498C/T a troca de L (leucina – Leu) por F (fenilalanina – Fen) (Figura 19).
A) Seqüência referência:
MSDASLRSTSTMERLVARGTFPVLVRTSACRSLFGPVDHEELSRELQARLAE
LNAEDQNRWDYDFQQDMPLRGPGRLQWTEVDSDSVPAFYRETVQVGRCRL
LLAPRPVAVAVAVSPPLEPAAESLDGLEEAPEQLPSVPVPAPASTPPPVPVLA
PAPAPAPAPVAAPVAAPVAVAVLAPAPAPAPAPAPAPAPVAAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAAPQESAEQGANQGQRGQEPLADQLHSGISGRPAAGTAAASANGAAIKKLSGPLISDFFAKRKRSAPEKSSGDVPAPCPSPSAAPGVGSVEQTPRKRLR B) Seqüência polimórfica:
MSDASLRSTSTMERLVARGTFPVLVRTSACRSLFGPVDHEELSCELQARLAE
LNAEDRNRWDYDFQQDMPLRGPGRLQWTEVDSDSVPAFYRETVQVGRCRL
LLAPRPVAVAVAVSPAFEPAAESLDGLEEAPEQLPSVPVPAPASTPPPVPVLA
PAPAPAPAPVAAPVAAPVAVAVLAPAPAPAPAPAPAPAPVAAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAAPQESAEQGANQGQRGQEPLADQLHSGISGRPAAGTAAASANGAAIKKLSGPLISDFFAKRKRSAPEKSSGDVPAPCPSPSAAPGVGSVEQTPRKRLR
Figura 19. Seqüência de aminoácidos do gene CDKN1C humano. (A) Seqüência referência do banco de dados do programa GenBank; (B) Seqüência de aminoácidos polimórfica obtida a partir dos polimorfismos encontrados e análise in silico. Na cor rosa está representada a troca de Arg>Cis, na cor azul a troca de Gln>Arg, na cor verde a troca de Pro>Ala e em vermelho a troca de Leu>Fen.
4.4 - Pesquisa de SNPs em banco de dados
4.4.1 - Programa BLAST SNP Sequence e RepeatMasker Open-3.0
A pesquisa de polimorfismos únicos de troca de base (SNP – Single Nucleotide
Polymorphism) utilizando o Programa BLAST SNP Sequence, nos forneceu as seguintes
alterações: um frameshift, do tipo inserção de base, de uma citosina na região do intron 1 e
a troca de bases únicas no exon 2 representadas pelas letras R (pode ser adenina ou
guanina), W (adenina ou timina) e Y (citosina ou timina). Utilizando o programa
RepeatMasker Open-3.0, foi identificada uma região de repetição de 176pb, correspondente
a 23,40% do tamanho de toda região estudada (Figura 20).
A) Seqüência referência com os polimorfismos detectados na população analisada:
tcttctcgctgtcctctcctctctcgtgcccgcgtttgcgcagccccgggccatgtccgacgcgtccctccgca
gCACATCCACGATGGAGCGTCTTGTCGCCCGTGGGACCTTCCCAGTACTAGTGCGCACCAGCGCCT
GCCGCAGCCTCTTCGGGCCGGTGGACCACGAGGAGCTGAGCCGYGAGCTGCAGGCCCGCCTGGC
CGAGCTGAACGCCGAGGACCAGAACCGCTGGRATTACGACTTCCAGCAGGACATGCCGC
TGCGGGGCCCTGGACGCCTGCAGTGGACCGAAGTGGACAGCGACTCGGTGCCCGCGTTCTACCGC
GAGACGGTGCAGGTGGGGCGCTGCCGCCTGCTGCTGGCGCCGCGGCCCGTCGCGGTCG
CGGTGGCTGTCAGCCCGSCCYTCGAGCCGGCCGCTGAGTCCCTCGACGGCCTCGAGGAGGCGCC
GGAGCAGCTGCCTAGTGTCCCGGTCCCGGCCCCGGCGTCCACCCCGCCCCCAGTCCCGGTCCTGGCTCCAGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGTCGCGGCTCCGGTCGCGGCTCCG
GTCGCGGTCGCGGTCCTGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGGCCCCGGCTCCAGTCGCGGCCCCGGCCCCAGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCCGCCCCGGCCCCGG
CCCCGGACGCGGCGCCTCAAGAGAGCGCCGAGCAGGGCGCGAACCAGGGGCAGCGCG
B) Seqüência Blast SNP Sequence e RepeatMasker Open-3.0:
tcttctcgctgtcctctcctctctcg+Ctgcccgcgtttgcgcagccccgggccatgtccgacgcgtccctcc
gcagCACATCCACGATGGAGCGTCTTGTCGCCCGTGGGACCTTCCCAGTACTRGTGCGCACCAGC
GCCTGCCGCAGCCTCTTCGGGCCGGTGGACCACGAGGAGCTGAGCCGCGAGCTGCAGGCCCGCC
TGGCCGAGCTGAACGCCGAGGACCAGAACCGCTGGGATTACGACTTCCAGCAGGACATG
CCGCTGCGGGGCCCTGGACGCCTGCAGTGGACCGAAGTGGACAGCGACTCGGTGCCCGCGTTCTA
CCGCGAGWCGGTGCAGGTGGGGCGCTGCCGCCTGCTGCTGGCGCCGCGGCCCGTCGC
GGTCGCGGTGGCTGTCAGCCCGCCCCTCGAGCCGGCCGCTGAGTCCCTCGACGGCCTCGAGGAG
GCGCCGGAGCAGCTGCCTAGTGTCCCGGTCCCGGCCCCGGCGTCCACCCCGCCCCCAGYCCCGGTCCTGGCTCCAGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGTCGCGGCTCCGGTCGCGG
CTCCGGTCGCGGTCGCGGTCCTGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCTCCGGCTCCGGCTCCGGCCCCGGCTCCAGTCGCGGCCCCGGCCCCAGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCCCCCGCCCCGGC
CCCGGCCCCGGACGCGGCGCCTCAAGAGAGCGCCGAGCAGGGCGCGAACCAGGGGCAGCGCG
Figura 20. Fragmento de interesse com posição física NC_000011 de 2906424 a 2906314 da seqüência 5’-3’ do gene CDKN1C humano obtido sob identificação D64137 do banco de dados do programa GenBank. (A) Em letras minúsculas,em negrito e em it[alico está representada parte da seqüência do intron 1 e em letras maiúsculas parte da seqüência do exon 2. Na cor amarela estão representadas as seqüências de Primers 1, na cor rosa Primers 2 e na cor vermelha Primers 3. Grifados na cor cinza estão os SNPs detectados (a letra S representa uma citosina ou guanina). (B) Grifados em verde estão os SNPs encontrados no programa BLAST SNP Sequence e grifado em amarelo está a seqüência repetitiva identificada pelo programa RepeatMasker Open-3.0.
4.5 - Análise estatísitca
Devido à ausência de variação nos genótipos estudados nos grupos de eclâmpsia,
PE, e HG, não foram realizadas as análises de freqüência alélica e genotípica.
No grupo controle, composto por 162 pacientes, foi encontrado o genótipo
heterozigoto +275 C/T em uma paciente (0,62%) e o genótipo homozigoto +275 C/C em 161
pacientes (99,38%). Em equilíbrio de Hardy-Weinberg, as freqüências alélicas encontradas
foram f(C)=0,997 e f(T)=0,003. Apesar do valor de p=0.001 aparentar ser extremamente
significativo estatisticamente, o resultado de heterozigoto para apenas um indivíduo não nos
permite adotar este valor como representativo para uma população.
No grupo controle da população geral, composto por 302 indivíduos (98 homens e
204 mulheres não grávidas) foi encontrado o genótipo heterozigoto +317 A/G em um
indivíduo (0,33%) e o genótipo homozigoto +317 A/A em todos os outros indivíduos
(99,67%), com freqüências alélicas f(A)=0,998 e f(G)=0,002 e em equilíbrio de Hardy-
Weinberg. Ao selecionar apenas o grupo feminino, no qual esse polimorfismo foi encontrado,
esta genótipo corresponde a 0,5% do grupo feminino (99,5%), com freqüências alélicas
f(A)=0,997 e f(G)=0,003 e em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Dessa forma neste grupo
controle da população geral, o valor de p=0.001 é significativo estatisticamente. No entanto,
houve o mesmo problema de número reduzido de indivíduos heterozigotos para uma análise
estatística mais adequada.
No grupo das portadoras de HAC (42 pacientes), foi encontrado o genótipo
heterozigoto +495 C/G em uma paciente (2,38%) e no restante das pacientes desse grupo
(41 pacientes - 97,62%) foi encontrado o genótipo homozigoto +495 C/C. As freqüências
alélicas encontradas foram de (C) 0,988 e (G) 0,012, que estão em equilíbrio de Hardy-
Weinberg. Neste grupo, o valor de p=0.006, apesar de demonstrar ser significativo (p<0.05),
de novo não pode ser levado em consideração como valor estatisticamente significativo,
devido ao baixo número de amostras.
Também no grupo HAC, foi encontro o genótipo heterozigoto +498 C/T em uma
paciente (2,38%) e no restante das pacientes HAC (41 pacientes - 97,62%) foi encontrado o
genótipo homozigoto +498 C/C, com f(C)=0,988 e f(T)=0,012. Sob a mesma ótica, o mesmo
valor de p=0.006, não pode ser levado em consideração como valor estatisticamente
significativo.
Os recém-nascidos (RN) foram subdivididos em Pequenos (PIG ou p<10), Grandes
(GIG ou p>90) e Adequados (AIG ou p≤90 e ≥10) para a Idade Gestacional (IG), de acordo
com a relação do peso ao nascimento e IG verificados em estudo populacional (HALL et al.,
2007).
Das 349 pacientes, 260 (74,5%) deram a luz a recém-nascidos (RN) AIGs, 37
(10.6%) a RNs GIGs, 27 (7,7%) a RNs PIGs. Três (0,85%) RNs nasceram abaixo de 27
semanas de gestação, cinco (1,45%) RN nasceram acima de 42 semanas de gestação (não
era possível inserir e analisar por meio do gráfico RNs que nasceram antes de 27 semanas
e depois de 42 semanas, tendo em vista que a escala do gráfico começava em 27 e
terminava em 42 semanas) e 17 (4,9%) RN não apresentavam os dados nos prontuários
para que fosse possível classificá-los. Quando utilizados, os testes de Fisher e do Qui-
quadrado não apresentaram valor estatisticamente significativo (p<0.05) entre esses dados.
Ao serem novamente classificados os RNs em peso em relação à IG, porém
separando as mães em grupos, as 159 mães do grupo controle tiveram 124 (76,54%) RNs
AIGs, 17 (10,49%) GIGs, oito (4,94%) PIGs; um (0,62%) abaixo de 27 semanas de gestação,
três (1,85%) acima de 42 semanas de gestação e nove (5,56%) não foram classificados. No
grupo PE, foram encontrados 56 AIGs (74,67%), oito PIGs (10,67%), sete GIGs (9,33%),
dois (2,67%) abaixo de 27 semanas de gestação e dois (2,67%) sem classificação e as
quatro portadoras de eclâmpsia tiveram RNs AIGs. No grupo HAC, 29 AIGs (69,05%),
quatro PIGs (9,52%), cinco GIGs (11,9%), um (2,38%) acima de 42 semanas de gestação e
3 (7,14%) sem classificação. Finalmente no grupo HG, foram encontrados 47 AIGs (71,21%),
sete PIGs (10,61%), oito GIGs (12,12%), um (1,52%) acima de 42 semanas de gestação e
trës (4,55%) permaneceram sem classificação. Os testes de Fisher e do Qui-quadrado não
apresentaram diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre esses grupos.
A idade média de idade materna de todo o grupo de mulheres grávidas foi de
aproximadamente 27 anos, onde a mais nova possuía 14 anos e a mais velha 42 anos, na
data da coleta dos dados. A média de idade materno do grupo controle foi de 26 anos
(menor idade encontrada de 14 anos e maior de 42 anos), no grupo de PE, a média foi de
27 anos (mínima de 15 e máxima de 42 anos), no grupo HAC a média foi de 30 anos (menor
idade encontrada 18 anos e maior 42 anos) e no grupo HG a média foi de 27 anos (menor
idade 16 e maior 41 anos). O teste de Tukey não apresentou valores estatisticamente
significativos (p<0,05) entre os valores das médias obtidas.
Dos dados dos RN disponíveis, 158 eram do sexo feminino e 173 do sexo masculino;
65 do sexo feminino e 88 do sexo masculino no grupo controle, 42 do sexo feminino e 34 do
sexo masculino no grupo PE/E, HAC 24 do sexo feminino e 15 do sexo masculino e HG 27
do sexo feminino e 36 do sexo masculino.
Analisando os dados disponíveis, 174 RN nasceram por meio de parto cesárea (PC)
e 158 nasceram de parto normal (PN). Dividindo nos grupos estudados, no grupo controle,
65 RN nasceram por meio de PC, 94 por meio de PN. No grupo PE/E, 49 PC e 28 PN; HAC
26 por meio de PC e por meio de 13 PN e HG 34 PC, 29 PN.
V. DISCUSSÃO
Das mulheres gestantes, cerca de 1% sofre complicações devidas à hipertensão
arterial pré-existente, de 5% a 6% é acometida por hipertensão gestacional sem proteinúria
e 2% sofre de PE (MAGEE et al., 2009). No nosso estudo, como o projeto inicial estava
focado em PE, as pacientes inicialmente eram recrutadas devido à hipertensão na gestação,
mas, muitas vezes o diagnóstico de PE só era confirmado ou excluído após a reavaliação
dos prontuários. Com isso, do universo de 349 amostras coletadas, o grupo controle (162)
representou 46,55% dos casos, PE (74) representou 21,26%, eclâmpsia (4) 1,15%, HAC
(42) 12,07% e HG (66) 18,97%.
Podemos observar que a frequência de PIG, AIG e GIG encontrados na população
estudada não são discrepantes quando inseridos na curva padrão descrita por
LUBCHENCO et al. (1963).
Estudos em diversos modelos de camundongos knockout ou trasngênicos confirmam
que a região 11p15.5 possui um importante cluster de genes que sofrem imprinting e que
são cruciais para o controle do crescimento fetal. Estes estudos sugerem grande relevância
na associação de alterações dessa região com as síndromes de Beckwith-Wiedemann e
Silver-Russell (NAGAYA et al., 2009).
Em mamíferos, muitos genes “marcados” estão envolvidos no controle do
crescimento fetal e são expressos em ambos os tecidos, placentário e fetal. Na placenta,
estes genes regulam o crescimento e a transferência de nutrientes (ANGIOLINI et al., 2006).
OUDEJANS et al. (2007) propuseram que variações de genes que contribuem para o
padrão e as características epigenéticas nos tecidos placentários, em especial os genes que
sofrem imprinting, devem ser mais investigados.
A atuação desses genes no crescimento fetal pode ser mediado, em partes, por meio
de mudanças no desenvolvimento placentário, particularmente na principal superfície de
transferência de nutrientes materno-fetais durante o final da gestação. Em modelos de
camundongos knockouts do gene CDKN1C, o labirinto trofoblástico é fracamente
vascularizado ou desproporcionalmente reduzido em tamanho, mas normal em relação às
suas estruturas (FOWDEN et al., 2006).
Alterações das características epigenéticas como hipermetilação ou hipometilação do
promotor do gene CDKN1C também têm sido relacionadas ao surgimento de alterações
mielóides malignas (HATZIMICHAEL et al., 2008) e neoplasias de ducto pancreático (SATO
et al., 2005).
Segundo LEE et al. (1997), em alelos mutantes herdados maternalmente a perda de
um único nucleotídeo G nesta seqüência hexanucleotídica (CGGCC) (denominada del347G
pelos autores), prevê a produção de uma proteína truncada composta por 24 aminoácidos
N-terminal mais seis aminoácidos, ocasionando a falta de produção do domínio inibidor de
CDK e do domínio QT (domínio que contém glutamina e treonina) tornando essa alteração
uma mutação nula e sem efeito. Mas essa alteração precisa ser melhor investigada na
população brasileira, uma vez que foram encontradas duas amostras (número 236-controle
da população geral e número 789, da população de gestantes-controles) com alterações
nessa região descrita por LEE et al. (1997).
Os resultados apresentados não demonstraram associação da PE com supostas
alterações nucleotídicas na seqüência do gene CDKN1C na região de deleção del347G e na
região de inversão IVS1+60G→A, descritas por NIELSEN et al., (2005). Esses resultados
não demonstraram uma diferença de proporção e freqüências alélicas estatisticamente
significativas nas populações estudadas, devido ao fato do número de amostras não ser tão
representativo quando estratificado em grupos e principalmente de terem sido encontradas
alterações pontuais em indivíduos de grupos distintos, ou seja, uma amostra do grupo
controle das portadoras de PE (1/162 ou 0,61%) na região dos Primers 1 e duas amostras
do grupo das portadoras de HAC (2/42 ou 4,76%) na região de inversão IVS1+60G→A ou
dos Primers 2.
As alterações encontradas não estão em concordância com a freqüência dessas
alterações no gene CDKN1C nos achados da literatura descritos por NIELSEN et al. (2005),
RODRIGUEZ et al. (2007) e ROMANELLI et al. (2009), mesmo quando essas freqüências
são comparadas a outras doenças estudadas como diabetes, arteriosclerose e HELLP/Pré-
eclâmpsia.
A eficiência, sensibilidade e a resolução da técnica de PCR-SSCP podem ser
influenciadas por diversos parâmetros que incluem a qualidade, o comprimento e a
quantidade de bases de citosina e guanina no amplicon, a temperatura do gel durante a
eletroforese, condições e composição do tampão de denaturação e de corrida do gel, tipo de
malha ou poros de acordo com a matriz do gel e concentração do gel (ZHU et al., 2006).
ENQUOBAHRIE et al. (2008), na tentativa de encontrar genes associados à PE,
investigaram por meio das técnicas de microarray e reação em cadeia da polimerase (PCR)
quantitativa em tempo real o RNA da placenta de 18 mulheres portadoras de PE e 18
mulheres normotensas. Neste trabalho, sondas de 22 mil genes foram utilizadas e após
análise estatística os autores encontraram expressão diferencial em 58 genes relacionados
ao sistema imune, inflamação, estresse oxidativo, sinalização, crescimento e vias de
desenvolvimento nas placentas das mulheres portadoras de PE, evidenciando também a
importância de genes como o CDKN1C no risco do aparecimento da PE.
A supressão (downregulation) ou expressão aberrante dos transcritos do gene
CDKN1C têm sido associadas ao surgimento de neoplasias como hepatocarcinoma celular
(FORNARI et al., 2008) e osteossarcoma (LI et al., 2008). Após análise de polimorfismos
intrônicos do gene CDKN1C em 82 amostras de câncer de mama, foi levantada por
LARSON et al. (2008) a possibilidade de este gene ser um supressor tumoral de câncer de
mama.
SENGUPTA et al. (2009) utilizando um modelo de células-tronco embrionárias
humanas, descreve que o microRNA (miRNA) miR-92b atua diretamente na supressão
(downregulation) dos níveis de proteína do gene P57 durante a fase de checagem
(checkpoint) G1/S do ciclo celular. A inibição do miR-92b em células-tronco embrionárias
aumenta os níveis de proteína P57, e a super-expressão do miR-92b em células
diferenciadas diminui os níveis de proteína P57.
ROMANELLI et al. (2009) em um trabalho realizado com pacientes com HELLP (do
inglês hemolysis; elevated liver enzimes; low platelets; ou hemólise, enzimas hepáticas
elevadas, baixa contagem de plaquetas), uma forma severa de PE, descreve mutações no
gene CDKN1C que predispõem à produção de proteínas truncadas em três crianças filhas
de mães com HELLP/PE. Os autores encontraram mutações no exon 2 (232 C/T) e no exon
3 (845 C/A e 845delC).
Dessa forma, com os resultados descritos neste estudo, não foi possível confirmar a
possibilidade de utilização do gene CDKN1C como marcador de predisposição à PE. A
freqüência dessas variantes do gene CDKN1C deve ser investigada na população brasileira
devido à escassez de dados e a particular heterogeneidade da mesma. Pesquisar a
associação dessas variantes com possíveis doenças e com o seu modelo de transmissão
traria grande auxílio para o diagnóstico, tratamento e manejo das doenças estudadas.
É importante salientar que foram encontradas duas novas variantes no grupo de
HAC (2/37), o que poderia indicar um papel das variantes nesses casos, corroborando os
dados de RODRIGUEZ et al. (2007), de associação com arteriosclerose e infarto do
miocárdio.
Não podemos descartar a importância do estudo de mecanismos epigenéticos que
regulam o gene CDKN1C, salientando a pesquisa do envolvimento de genes que sofrem
imprinting na etiopatogenia da PE.
RODRIGUEZ et al. (2007) encontraram uma associação significativa entre variações
de marcadores microsatélites da região promotora do gene CDKN1C e infarto do miocárdio
em pacientes com aterosclerose, mostrando uma associação de alterações nesse gene com
a clínica. Esses autores finalizam com a hipótese de que esses polimorfismos possam servir
como marcadores farmacogenéticos para o tratamento que reduz a aterosclerose
diminuindo o rico de infarto do miocárdio. Essa associação poderia justificar os dados
encontrados em nosso trabalho, onde foram detectados polimorfismos nos casos 484 e 859,
diagnosticados como pacientes com HAC. Nesse sentido, estudos mais amplos na
população brasileira precisam ser realizados, principalmente entre portadores de
hipertensão arterial.
Mudanças na seqüência de aminoácidos da proteína não necessariamente alteram
sua função, portanto estudos de função dessa proteína se fazem necessários.
Todas as variantes encontradas neste estudo não estavam descritas e não
constavam em banco de dados de pesquisa de SNPs e mutações [BLAST SNP Sequence
(disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/), International HapMap Project
(disponível em: http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en), SNP Database (disponível
em: snpnet.jst.go.jp/top_e.html)]. Dessa forma as novas seqüências identificadas serão
depositadas na forma de novos SNPs no banco de dados do programa BLAST SNP
Sequence.
Devido ao fato de esses polimorfismos não estarem descritos na literatura, foi de
grande importância identificar e analisar a seqüência de aminoácidos que compõem a
proteína traduzida por este gene, uma vez que alteração na seqüência de aminoácidos pode
resultar em um stop códon (códon de término de transcrição), uma proteína truncada (que
possui uma estrutura defeituosa que não pode desenvolver a função para a qual foi
concebida), uma alteração silenciosa (onde o códon codifica o mesmo aminoácido) ou ainda
como nossos resultados indicam, resultar em uma alteração missense (que promove a
codificação de um aminoácido diferente).
As variantes encontradas são referentes à seqüência da isoforma A (de cadeia
longa) do gene CDKN1C, já que a isoforma B (de cadeia curta) possui uma grande região
deletada, o que não corresponde aos dados encontrados no seqüenciamento e no
alinhamento da seqüência obtida com a seqüência referência descrita no GenBank
(GENBANK, 2008) sob identificação de acesso D64137, como isoforma A.
Nos casos de PE não foi possível encontrar variantes do gene estudado pelo menos
nas regiões pesquisadas. No entanto, os resultados para as pacientes 484 e 859, variantes
+495C/G e +498C/T, respectivamente, parecem sinalizar para um papel do CDKN1C em
quadros de hipertensão desvinculados da gravidez, uma vez que as duas pacientes
pertenciam ao grupo de HAC. Já o caso 236 (variante +317A/G), da população geral,
apresentava histórico familial de alterações de tireóide em mãe e irmã.
Vários genes polimórficos têm sido associados com o risco de desenvolver PE.
Recentemente um relevante e significativo estudo sobre a genética da pré-eclâmpsia não
confirmou a associação significativa entre polimorfismos genéticos em genes candidatos e a
doença (CARTY et al., 2008).
A produção e o nível de biomarcadores são em última instância dependentes de
estudos genômicos. Contanto, em comparação como o genoma, o proteoma é muito mais
dinâmico, assumindo que o genoma não muda durante a gravidez e o proteoma mudará
significativamente. Estudos de proteômica e metabolômica em paralelo com estudos
genômicos, irão contribuir positivamente com o sucesso da aquisição de novos e eficientes
marcadores para a PE.
A importância maior desta pesquisa é de que se constitui o primeiro estudo
populacional de larga escala do gene CDKN1C na população brasileira.
VI. CONCLUSÕES
Não foi verificada a associação de variantes do gene CDKN1C com o
desenvolvimento de pré-eclâmpsia.
Foram detectadas quatro variantes do gene CDKN1C não descritos na literatura,
sendo dois em pacientes com hipertensão arterial crônica.
Não houve diferença estatisticamente significantiva na distribuição das variantes das
regiões estudadas do gene CDKN1C entre as populações estudadas.
As variantes do gene CDKN1C não se mostraram bons marcadores para o
desenvolvimento de pré-eclâmpsia, mas os resultados sinalizam para um papel em casos de
hipertensão arterial crônica.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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VIII. ANEXOS
Anexo A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA
DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
CEP. 14048-900 RIBEIRÃO PRETO - S.P.
B R A S I L
CAMPUS UNIVERSITÁRIO - MONTE ALEGRE FONE: 602-1000 - FAX (016) 633-1144
ESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA
1.Nome da Pesquisa: “Estudo da influência da região 11p15.5 na pré-eclâmpsia” 2.Pesquisador responsável: Francielle M Araujo, Profa.Dra.Ester S Ramos (CRM - 57.626) 3. Promotor da pesquisa: Hospital das Clínicas da FMRP-USP 4. Esclarecimentos: Algumas mulheres após a 20ª semana de gravidez apresentam pressão alta e perda de proteínas na urina, o que é chamado de pré-eclâmpsia. Se a paciente não tiver os cuidados médicos necessários, o problema pode se agravar e prejudicar a saúde da mãe e do bebê. Uma das causas pode ser genética (ou de família) podendo repetir em parentes. Nesta pesquisa, através dos resultados de algumas perguntas sobre sua família e alguns exames, poderá ser dada depois uma melhor orientação para você e seus parentes. O estudo não trará nenhuma despesa para você. Você pode auxiliar neste trabalho através de um pouco de sangue e com um pouco de urina (colhidos como qualquer exame de rotina). Em casos especiais, também com um pedacinho da placenta depois que ela estiver fora do útero e não tiver mais contato com o nenê. Todo esse material será usado para estudar a sua constituição genética através do DNA (mas não será utilizado para outros fins sem um novo consentimento).
Ribeirão Preto, ____ de _____________ de ______.
____________________________________________ Francielle Marques Araujo/Ester Silveira Ramos
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu _______________________________________________RG n
o _______________,
abaixo assinado, tendo sido devidamente esclarecido sobre todas as condições do Projeto de Pesquisa intitulado “ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA REGIÃO 11p15.5 NA PRÉ-ECLÂMPSIA” que tem como pesquisadoras
responsáveis a Srta. Francielle Marques Araujo e a Profa. Dra. Ester Silveira Ramos, especialmente no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos que serei submetido, aos riscos e aos benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como a forma de indenização por danos decorrentes da pesquisa, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram assegurados, a seguir relacionados: 1. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações relacionadas com a pesquisa e o tratamento a que serei submetido; 2. A liberdade de retirar o meu consentimento e de deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isso traga prejuízo à continuidade do meu tratamento; 3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada a minha privacidade; 4. O compromisso de que me será prestada informação atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar a minha vontade de continuar dele participando; 5. O compromisso de que serei devidamente acompanhado(a) e assistido(a) durante todo o período de minha participação no projeto, bem como de que será garantida a continuidade do meu tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa.
Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade em participar do referido projeto.
Ribeirão Preto, ____de _____________de _____
___________________________________ Assinatura do paciente
Anexo B – Ofício referente à aprovação do TCLE pelo CEP do HCFMRP-USP
Anexo C – Parecer do CONEP referente ao projeto de pesquisa
IX. APÊNDICES
Apêndice A – Grupo de pacientes com PE/E, HAC, HG e grupo controle
DNA Classificação CDKN1C CDKN1C CDKN1C Tamanho em relação Tipo de Sexo Idade
primer 1 primer 2 primer 3 a idade gestacional parto RN materna
236 eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 23
237 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 16
238 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 34
239 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 21
240 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 31
241 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 24
242 controle seq.referência seq.referência seq.referência abaixo 27s normal M 30
243 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 17
244 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 19
245 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
246 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 21
255 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 24
256 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 25
257 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 21
258 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 38
259 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 17
260 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 32
261 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 24
262 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 22
264 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 29
265 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 38
267 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 18
268 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 16
269 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 27
270 HAC seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 41
271 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 27
272 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 20
273 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 23
274 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 30
276 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 27
279 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 21
280 HG seq.referência seq.referência seq.referência 22
281 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 28
282 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 21
283 HG seq.referência seq.referência seq.referência 24
284 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 29
285 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 23
292 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 30
293 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 18
294 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal 30
295 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 26
296 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
300 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 33
301 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 28
302 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 42
307 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 21
319 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 36
322 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 21
323 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 17
324 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 30
325 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 19
341 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 18
342 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 18
344 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 31
348 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 30
349 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 18
368 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 33
369 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
372 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 36
373 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 16
374 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 41
375 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 28
376 HAC seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 18
383 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 19
384 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 33
390 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 30
391 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 32
392 controle seq.referência seq.referência seq.referência 27
393 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 20
407 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 19
408 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 28
409 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 38
410 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 27
411 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 17
412 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 26
413 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 20
415 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 28
416 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 31
417 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 21
418 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG
normal F 20
419 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 26
420 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 30
422 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 26
423 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 36
424 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 29
426 HAC seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 32
427 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 22
428 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 28
429 HG seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s normal M 26
430 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 34
431 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 22
432 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 41
433 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
434 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 16
435 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 25
436 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 28
438 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG
cesárea F 22
442 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
443 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 19
444 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 33
445 HAC seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 32
446 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 21
447 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 21
448 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 21
473 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 36
474 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 28
475 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 28
476 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG
normal F 17
478 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
479 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 22
480 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG
cesárea F 25
481 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
482 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 28
483 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 28
484 HAC seq.referência 495C/G seq.referência AIG normal F 42
485 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG
cesárea F 19
487 HG seq.referência seq.referência seq.referência 34
488 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG 20
489 HAC seq.referência seq.referência seq.referência 33
490 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 34
491 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 17
492 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 14
493 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 20
494 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 16
495 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 32
496 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 23
497 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 31
498 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal M 37
499 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 30
500 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 40
501 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 29
502 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 35
503 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 21
505 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 19
506 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 19
507 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 39
508 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 36
509 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 40
510 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 34
511 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 35
512 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 30
513 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 22
514 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 32
515 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência abaixo 27s cesárea F 24
516 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 32
517 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 15
518 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 23
520 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 39
521 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 30
522 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 30
523 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 22
524 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 35
531 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 23
533 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 16
534 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 22
535 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 38
536 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 36
538 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 23
542 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 23
544 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 23
546 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 29
550 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 27
551 controle seq.referência seq.referência seq.referência 34
552 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG normal F 27
553 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 29
554 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 18
556 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 26
557 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 23
558 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 25
559 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 23
560 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 28
561 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 22
562 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 32
564 controle seq.referência seq.referência seq.referência 27
565 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 25
566 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 19
567 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 32
568 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 36
569 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG3 normal M 25
570 controle seq.referência seq.referência seq.referência 23
571 controle seq.referência seq.referência seq.referência 48
572 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 24
574 HAC seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 27
575 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 29
576 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 27
577 HAC seq.referência seq.referência seq.referência 26
578 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
580 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 23
591 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 30
593 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 20
594 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 28
595 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 25
596 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 28
600 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 32
601 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 25
602 controle seq.referência seq.referência seq.referência 32
604 controle seq.referência seq.referência seq.referência 49
609 eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 20
612 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 33
614 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 33
620 HAC seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea M 27
623 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 34
634 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 21
637 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 23
638 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 30
639 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 33
651 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F
652 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 29
655 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 18
656 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 36
657 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 16
688 eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 17
690 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 26
693 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 24
694 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 19
695 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 30
701 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 29
703 HAC seq.referência seq.referência seq.referência
705 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 43
706 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 32
707 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 35
708 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 20
709 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 29
710 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 24
776 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 26
778 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 35
779 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 19
781 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 24
784 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 20
786 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 30
787 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 35
789 controle 275 C/T seq.referência seq.referência AIG cesárea F 38
791 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 32
794 controle seq.referência seq.referência seq.referência 21
795 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 25
797 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 21
800 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 38
809 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 31
810 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 17
840 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 26
842 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 23
843 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência abaixo 27s cesárea F 33
844 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 34
845 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 25
846 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal M 40
847 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG fórceps M 25
848 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 25
849 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 19
850 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 31
851 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG fórceps F 35
852 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 22
853 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 23
855 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 37
856 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 32
857 controle seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s fórceps M 26
858 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 34
859 HAC seq.referência 498C/T seq.referência 42s cesárea F 18
860 controle seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s cesárea M 29
861 controle seq.referência seq.referência seq.referência normal M 26
862 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 17
864 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 30
865 HG seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 27
866 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 19
867 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 22
868 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 25
874 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 30
875 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 23
876 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 39
877 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 33
879 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 21
881 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 29
893 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 29
896 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 34
898 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 26
900 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência 27
909 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 35
911 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 21
912 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 35
914 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 33
915 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 40
917 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 30
926 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 36
932 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 32
938 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 20
968 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 23
969 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 28
971 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 25
973 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 28
1135 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 22
1136 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 29
1137 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 26
1138 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 25
1139 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 29
1141 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 30
1142 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 40
1144 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 31
1146 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 40
1148 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 31
1149 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 42
1150 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 29
1152 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 40
1153 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 33
1154 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 37
1155 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 33
1156 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 23
1159 HAC seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 33
1160 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 30
1161 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 38
1162 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 29
1165 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 25
1170 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG fórceps M 30
1172 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 18
1174 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 22
1178 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 42
1179 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 16
1182 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 23
1183 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 18
1184 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 26
1188 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 16
1206 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 25
1208 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 34
1209 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG fórceps M 20
1211 controle seq.referência seq.referência seq.referência acima 42s cesárea F 32
1213 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 22
1214 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência 16
1215 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 26
1216 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 32
1218 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 35
1279 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 24
1281 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 27
1282 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 16
1284 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência GIG normal F 33
1285 HG seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea M 20
1287 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 31
1288 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 16
1289 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 28
1291 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 22
1292 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 34
1293 HG seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 20
1294 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 37
1295 eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 20
1300 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 18
1301 pré-
eclâmpsia seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea M 24
1302 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal M 23
1303 controle seq.referência seq.referência seq.referência PIG cesárea F 37
1304 controle seq.referência seq.referência seq.referência GIG cesárea F 30
1305 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG cesárea F 24
1366 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG fórceps F 23
1373 controle seq.referência seq.referência seq.referência AIG normal F 22
Apêndice B – Grupo controle da população geral
DNA CDKN1C CDKN1C Idade Sexo Antecedentes familiares
primer 1 primer 2
1 seq.referência seq.referência 25 F pai diabético e mãe pressão baixa
2 seq.referência seq.referência 23 F
3 seq.referência seq.referência 20 F
4 seq.referência seq.referência 22 F
5 seq.referência seq.referência 23 F
6 seq.referência seq.referência 22 M
7 seq.referência seq.referência 22 F pai hipertenso
8 seq.referência seq.referência 23 M
9 seq.referência seq.referência 21 F
10 seq.referência seq.referência 23 F
11 seq.referência seq.referência 22 M
12 seq.referência seq.referência 23 M pai e mãe
13 seq.referência seq.referência 23 M
14 seq.referência seq.referência 23 M pai e mãe diabéticos
15 seq.referência seq.referência 20 F
16 seq.referência seq.referência 21 F
17 seq.referência seq.referência 22 F
18 seq.referência seq.referência 22 F
19 seq.referência seq.referência 22 M mãe obesa
20 seq.referência seq.referência 23 F pai
21 seq.referência seq.referência 22 F
22 seq.referência seq.referência 22 M
23 seq.referência seq.referência 18 M
24 seq.referência seq.referência 20 M
25 seq.referência seq.referência 22 M
26 seq.referência seq.referência 25 M mãe
27 seq.referência seq.referência 21 M mãe hipertensa
28 seq.referência seq.referência 22 M paie e mãe hipertensos
29 seq.referência seq.referência 22 M
30 seq.referência seq.referência 23 M pai
31 seq.referência seq.referência 26 F
32 seq.referência seq.referência 21 M
33 seq.referência seq.referência 21 F
34 seq.referência seq.referência 25 M
35 seq.referência seq.referência 24 M
36 seq.referência seq.referência 20 F
37 seq.referência seq.referência 22 F
38 seq.referência seq.referência 25 M
39 seq.referência seq.referência 23 F mãe
40 seq.referência seq.referência 25 M pai
41 seq.referência seq.referência 21 F mãe obesa e pai hipertenso
42 seq.referência seq.referência 28 F mãe
43 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético e mãe hipertensa
44 seq.referência seq.referência 25 M
45 seq.referência seq.referência 31 F
46 seq.referência seq.referência 20 F
47 seq.referência seq.referência 20 F pai hipertenso e obeso
48 seq.referência seq.referência 20 F
49 seq.referência seq.referência 22 F
50 seq.referência seq.referência 22 M
51 seq.referência seq.referência 22 M pai
52 seq.referência seq.referência 22 F mãe
53 seq.referência seq.referência 21 F mãe
54 seq.referência seq.referência 23 F pai/mãe/irmãos obesos e hipertensos
55 seq.referência seq.referência 22 F
56 seq.referência seq.referência 23 F
57 seq.referência seq.referência 24 F
58 seq.referência seq.referência 18 M
59 seq.referência seq.referência 17 M
60 seq.referência seq.referência 18 M
61 seq.referência seq.referência 18 F mãe hipertensa
62 seq.referência seq.referência 23 M
63 seq.referência seq.referência 19 F pai hipertenso
64 seq.referência seq.referência 22 M
65 seq.referência seq.referência 21 M irmãos obesos
66 seq.referência seq.referência 21 F
67 seq.referência seq.referência 26 F pai/mãe/irmãos
68 seq.referência seq.referência 20 F
69 seq.referência seq.referência 20 F
70 seq.referência seq.referência 19 F pai
71 seq.referência seq.referência 20 F pai/mãe
72 seq.referência seq.referência 22 M pai hipertenso
73 seq.referência seq.referência 20 F
74 seq.referência seq.referência 24 M
75 seq.referência seq.referência 22 F
76 seq.referência seq.referência 22 F
77 seq.referência seq.referência 21 F
78 seq.referência seq.referência 21 F
79 seq.referência seq.referência 23 M
80 seq.referência seq.referência 21 M
81 seq.referência seq.referência 20 F pai hipertenso
82 seq.referência seq.referência 21 F
83 seq.referência seq.referência 18 M
84 seq.referência seq.referência 18 M
85 seq.referência seq.referência 24 F
86 seq.referência seq.referência 18 M irmãos obesos
87 seq.referência seq.referência 22 M
89 seq.referência seq.referência 22 F
90 seq.referência seq.referência 21 F
91 seq.referência seq.referência 20 F
92 seq.referência seq.referência 22 F
93 seq.referência seq.referência 21 M
94 seq.referência seq.referência 20 M
95 seq.referência seq.referência 22 F
96 seq.referência seq.referência 23 F mãe hipertensa
97 seq.referência seq.referência 20 F
98 seq.referência seq.referência 24 F mãe e irmãos colesterol alto
99 seq.referência seq.referência 18 M
100 seq.referência seq.referência 20 M
102 seq.referência seq.referência 19 F
103 seq.referência seq.referência 24 F mãe
104 seq.referência seq.referência 22 M
105 seq.referência seq.referência 29 F
106 seq.referência seq.referência 25 M
107 seq.referência seq.referência 24 F
108 seq.referência seq.referência 24 F
109 seq.referência seq.referência 29 F pai/mãe
110 seq.referência seq.referência 27 M pai/mãe/irmãos
111 seq.referência seq.referência 18 F
112 seq.referência seq.referência 20 F pai/mãe/irmãos
113 seq.referência seq.referência 24 M
114 seq.referência seq.referência 21 F
115 seq.referência seq.referência 18 F
116 seq.referência seq.referência 22 M
117 seq.referência seq.referência 34 F mãe
118 seq.referência seq.referência 27 F mãe
119 seq.referência seq.referência 22 F pai/irmãoes
120 seq.referência seq.referência 20 F pai hipertenso
121 seq.referência seq.referência 22 F
122 seq.referência seq.referência 24 M avó materna diabética
123 seq.referência seq.referência 23 F pai/irmãos obesos
124 seq.referência seq.referência 24 F pai/mãe hipertensos
125 seq.referência seq.referência 45 M
126 seq.referência seq.referência 27 F
127 seq.referência seq.referência 37 M
128 seq.referência seq.referência 34 M avô materno obeso
129 seq.referência seq.referência 25 F
130 seq.referência seq.referência 34 M
131 seq.referência seq.referência 22 M
132 seq.referência seq.referência 19 F
133 seq.referência seq.referência 20 F
134 seq.referência seq.referência 19 F
135 seq.referência seq.referência 20 F
136 seq.referência seq.referência 19 F pai
137 seq.referência seq.referência 19 F
138 seq.referência seq.referência 20 F
139 seq.referência seq.referência 20 F
140 seq.referência seq.referência 20 F
141 seq.referência seq.referência 19 M
142 seq.referência seq.referência 20 F
143 seq.referência seq.referência 19 F pai
144 seq.referência seq.referência 19 F
145 seq.referência seq.referência 34 M mãe
146 seq.referência seq.referência 20 F pai
147 seq.referência seq.referência 18 M pai/mãe/irmãos
148 seq.referência seq.referência 19 F
149 seq.referência seq.referência 20 F
150 seq.referência seq.referência 20 F pai/mãe
151 seq.referência seq.referência 21 F mãe
152 seq.referência seq.referência 21 M
153 seq.referência seq.referência 23 M mãe
154 seq.referência seq.referência 21 F pai
155 seq.referência seq.referência 24 M pai hipertenso
156 seq.referência seq.referência 22 F
157 seq.referência seq.referência 23 M pai hipertenso e mãe diabética
158 seq.referência seq.referência 21 F pai obeso
159 seq.referência seq.referência 20 F
160 seq.referência seq.referência 22 M
161 seq.referência seq.referência 25 M pai diabético
162 seq.referência seq.referência 23 M
163 seq.referência seq.referência 23 M pai obeso
164 seq.referência seq.referência 22 F
165 seq.referência seq.referência 20 F
166 seq.referência seq.referência 21 F
167 seq.referência seq.referência 22 F pai diabético
168 seq.referência seq.referência 23 F mãe obesa e hipertensa
169 seq.referência seq.referência 24 M
170 seq.referência seq.referência 21 F mãe diabética
171 seq.referência seq.referência 26 F
172 seq.referência seq.referência 22 F mãe e irmão hipertensos
173 seq.referência seq.referência 22 F
174 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético
175 seq.referência seq.referência 20 F pai diabético
176 seq.referência seq.referência 20 F
177 seq.referência seq.referência 22 F
178 seq.referência seq.referência 22 F
179 seq.referência seq.referência 23 M
180 seq.referência seq.referência 21 M
181 seq.referência seq.referência 22 M pai diabético e colesterol alto
182 seq.referência seq.referência 18 M
183 seq.referência seq.referência 19 M pai obeso
184 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético e colesterol alto
185 seq.referência seq.referência 21 M
186 seq.referência seq.referência 20 F pai obeso
187 seq.referência seq.referência 20 F mãe colesterol alto
188 seq.referência seq.referência 19 F mãe diabética e obesa
189 seq.referência seq.referência 23 F
190 seq.referência seq.referência 23 F
191 seq.referência seq.referência 24 F pai hipertenso e colesterol alto
192 seq.referência seq.referência 26 F irmã obesidade mórbida
193 seq.referência seq.referência 22 F
194 seq.referência seq.referência 23 F pai hipertenso
195 seq.referência seq.referência 22 F
196 seq.referência seq.referência 18 F mãe diabetes e irmão obeso
197 seq.referência seq.referência 17 F mãe colesterol alto
198 seq.referência seq.referência 18 F
199 seq.referência seq.referência 20 F
200 seq.referência seq.referência 23 F
201 seq.referência seq.referência 23 M
202 seq.referência seq.referência 19 M pai hipertenso
203 seq.referência seq.referência 21 F
204 seq.referência seq.referência 17 F
205 seq.referência seq.referência 19 F
206 seq.referência seq.referência 21 F mãe tireóide
207 seq.referência seq.referência 18 F pai diabético
208 seq.referência seq.referência 19 M irmão hipertenso
209 seq.referência seq.referência 19 F pai diabético
210 seq.referência seq.referência 17 F
211 seq.referência seq.referência 20 M
212 seq.referência seq.referência 22 F
213 seq.referência seq.referência 22 F pai colesterol alto
214 seq.referência seq.referência 18 F
215 seq.referência seq.referência 20 F mãe colesterol alto e hipertensa
216 seq.referência seq.referência 22 F
217 seq.referência seq.referência 23 M
218 seq.referência seq.referência 19 M pai hipertenso
219 seq.referência seq.referência 19 F
220 seq.referência seq.referência 19 F
221 seq.referência seq.referência 19 M
222 seq.referência seq.referência 22 M pai colesterol alto
223 seq.referência seq.referência 19 F
224 seq.referência seq.referência 21 F
225 seq.referência seq.referência 17 F
226 seq.referência seq.referência 18 F
227 seq.referência seq.referência 21 M
228 seq.referência seq.referência 19 M pai hipertenso
229 seq.referência seq.referência 19 F
230 seq.referência seq.referência 19 F
231 seq.referência seq.referência 23 F
232 seq.referência seq.referência 21 F
233 seq.referência seq.referência 25 F pai e mãe hipertensos
234 seq.referência seq.referência 22 F
235 seq.referência seq.referência 18 M pai obeso
236 317A/G seq.referência 32 F mãe e irmã tireóide
237 seq.referência seq.referência 18 F
238 seq.referência seq.referência 22 M pai e mãe e irmã obesos
239 seq.referência seq.referência 21 F
240 seq.referência seq.referência 22 F
241 seq.referência seq.referência 19 F
242 seq.referência seq.referência 22 F
243 seq.referência seq.referência 19 F
244 seq.referência seq.referência 19 F
245 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético e mãe hipertensa
246 seq.referência seq.referência 27 F
247 seq.referência seq.referência 24 M
248 seq.referência seq.referência 19 F
249 seq.referência seq.referência 19 F
250 seq.referência seq.referência 21 M pai hipertenso e pai diabética
251 seq.referência seq.referência 23 M
252 seq.referência seq.referência 23 M
253 seq.referência seq.referência 20 F
254 seq.referência seq.referência 19 F pai colesterol alto
255 seq.referência seq.referência 22 F pai e mãe hipertensos
256 seq.referência seq.referência 21 F avó materna hipertensa
257 seq.referência seq.referência 32 F
258 seq.referência seq.referência 22 F pai hipertenso e colesterol alto
259 seq.referência seq.referência 19 F avô materno diabético
260 seq.referência seq.referência 19 F
261 seq.referência seq.referência 20 M
262 seq.referência seq.referência 21 F
263 seq.referência seq.referência 19 F mãe colesterol alto
264 seq.referência seq.referência 18 F
265 seq.referência seq.referência 22 F
266 seq.referência seq.referência 20 M
267 seq.referência seq.referência 25 M pai hipertenso
268 seq.referência seq.referência 20 F
269 seq.referência seq.referência 20 F mãe hipertensa
270 seq.referência seq.referência 18 F
271 seq.referência seq.referência 22 M
272 seq.referência seq.referência 19 F
273 seq.referência seq.referência 23 F mãe hipertensa
274 seq.referência seq.referência 20 F
275 seq.referência seq.referência 18 M avô materno hipertenso
276 seq.referência seq.referência 19 M
277 seq.referência seq.referência 19 F
278 seq.referência seq.referência 20 F irmã colesterol alto
279 seq.referência seq.referência 22 F avó hipertensa e obesa
280 seq.referência seq.referência 22 F avó diabética
281 seq.referência seq.referência 21 F pai obeso
282 seq.referência seq.referência 22 M avô diabético
283 seq.referência seq.referência 20 F
284 seq.referência seq.referência 22 F
285 seq.referência seq.referência 23 F
286 seq.referência seq.referência F
287 seq.referência seq.referência 21 F avó diabética
288 seq.referência seq.referência 22 F pai diabético
289 seq.referência seq.referência 23 F
290 seq.referência seq.referência 26 M
291 seq.referência seq.referência 22 M mãe diabética
292 seq.referência seq.referência 26 M pai obeso
293 seq.referência seq.referência 23 F mãe obesa
294 seq.referência seq.referência 22 F pai hipertenso e colesterol alto
295 seq.referência seq.referência 21 F mãe obesa
296 seq.referência seq.referência 21 F mãe obesa
297 seq.referência seq.referência 21 F
298 seq.referência seq.referência 21 F pai diabético
299 seq.referência seq.referência 22 M
300 seq.referência seq.referência 19 F
301 seq.referência seq.referência 25 F pai hipertenso e tio diabético
302 seq.referência seq.referência 24 F pai e mãe colesterol alto
303 seq.referência seq.referência 22 F mãe hipertensa
304 seq.referência seq.referência 24 F
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