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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
“Análise molecular das populações de Potimirim brasiliana Villalobos,
1959 (Decapoda, Caridea, Atyidae)”
Bárbara Matos do Prado
Monografia apresentada ao
Departamento de Biologia da
Faculdade de Filosofia, Ciências e
Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como
parte das exigências para a
obtenção do título de Bacharel em
Ciências Biológicas.
Ribeirão Preto - 2014
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
“Análise molecular das populações de Potimirim brasiliana Villalobos,
1959 (Decapoda, Caridea, Atyidae)”
Bárbara Matos do Prado
Monografia apresentada ao
Departamento de Biologia da
Faculdade de Filosofia, Ciências e
Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como
parte das exigências para a
obtenção do título de Bacharel em
Ciências Biológicas.
Orientador: Dr. Leonardo Antonio Gomes Pileggi
Co-orientador: Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto
Ribeirão Preto - 2014
Prado, B. M.
“Análise molecular das populações de Potimirim brasiliana Villalobos, 1959
(Decapoda, Caridea, Atyidae)”
v+45 p.
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
Orientador: Pileggi, L.A.G.; Co-orientador: Mantelatto, F.L.M.
1.Potimirim brasiliana 2.Atyidae 3.Camarão 4.Sistemática molecular 5.Relações
evolutivas
ii
“Uso a palavra para compor meus silêncios.
Não gosto das palavras
fatigadas de informar.
Dou mais respeito
às que vivem de barriga no chão
tipo água pedra sapo.
Entendo bem o sotaque das águas.
Dou respeito às coisas desimportantes
e aos seres desimportantes.
Prezo insetos mais que aviões.
Prezo a velocidade
das tartarugas mais que as dos mísseis.
Tenho em mim esse atraso de nascença.
Eu fui aparelhado
para gostar de passarinhos.
Tenho abundância de ser feliz por isso.
Meu quintal é maior do que o mundo.
Sou um apanhador de desperdícios:
Amo os restos
como as boas moscas.
Queria que a minha voz tivesse um formato de canto.
Porque eu não sou da informática:
eu sou da invencionática.
Só uso a palavra para compor os meus silêncios.”
O apanhador de desperdícios – Manoel de Barros
iii
A todos que participaram de alguma forma e à
minha família, especialmente aos meus pais.
iv
Agradecimentos
Em primeiro lugar, agradeço ao Prof. Dr. Fernando L. M. Mantelatto pela oportunidade em
conhecer um pouco do meio acadêmico por meio do Laboratório de Bioecologia e Sistemática de
Crustáceo (LBSC). Agradeço também a todas as sugestões e conversas que tivemos durante o
andamento deste projeto, que contribuíram não só a este trabalho, mas também para meu futuro
como bióloga.
Agradeço ao meu orientador, Dr. Leonardo A. G. Pileggi, por toda dedicação e paciência
durante esses dois anos e pouco de trabalho juntos. Agradeço ainda por ter me ensinado e
acompanhado em todos os processos no Laboratório de Molecular. E também por todas as
conversas e emails (às vezes com um pouco de desespero), que me acrescentaram muito no
trabalho.
Agradeço à Universidade de São Paulo pelo auxílio financeiro concedidos a mim para o
desenvolvimento deste trabalho (Bolsa Institucional RUSP – processos 2012/2741 e 2013/1803).
Agradeço também aos projetos que diretamente e indiretamente auxiliaram financeiramente e
logisticamente para a realização deste ao LBSC, todos concedidos ao Prof. Dr. Fernando L. M.
Mantelatto: FAPESP - projeto temático BIOTA-FAPESP (2010/50188-8), CNPq (Edital Universal
471011/2011-8 e PQ 302748/2015-5), Coleções Científicas (504322/2012-5), e CAPES (Ciências
do Mar II Proc. 2005/2014 - 23038.004308/201414)
Agradeço à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP),
especialmente ao Departamento de Biologia, pela formação que tive durante estes quatro anos, e
pela disponibilidade de infra-estrutura para a realização deste projeto. Agradeço também ao
Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jabuticabal
(FCAV/UNESP) pela realização de parte do sequenciamento.
Agradeço a todos do LBSC, que me ajudaram nestes quase três anos de permanência no
laboratório: Rafa, Mari, Mateus, Tati, Kana, Raquel, Kelps, Vanda, Fabrício, Nati, Caio, Ju, Ana,
Mayara, Abner. Agradeço também aos que não estão mais no laboratório, mas que me ajudaram
no início, Isa e Camila. Agradeço à Vandinha por toda ajuda e paciência em me ensinar a trabalhar
com a Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB) do LBSC. Agradeço as
meninas, Kana, Raquel, Nati, Tati e Kelps, por me ajudarem na molecular, tanto à respeito do meu
projeto quanto à respeito de manutenção do laboratório de molecular. Agradeço aos companheiros
v
de iniciação científica, Ju, Ana e Caio, pelas conversar e desesperos compartilhados durante este
período. Agradeço ao Rafa pelas conversas, que sempre me ajudaram e ajudam a refletir, não só
sobre assuntos referentes a este trabalho e ao laboratório, mas também a pensar o que quero fazer
como bióloga daqui pra frente. Estas conversas podem não ter sido em grande quantidade, mas me
fez pensar muita coisa a meu respeito quanto ao futuro na carreira de bióloga. Um sincero
agradecimento especial a todos!
Agradeço a todos os colegas e amigos que me deram apoio durante este período, em
especial, Livia, Layara, Jabu, Well, Bastardo, Soldada, Tolima, Ju, Ana Luiza, Palito e Yoshi.
Agradeço também toda a Bio 48 por fazer os dias e aulas se tornarem mais agradáveis e divertidos
durante todo o curso.
E por fim, agradeço à minha família, em especial aos meus pais, Maria Lúcia e José
Olímpio, por todo apoio e carinho dedicados a mim. Agradeço também pela paciência em me
ouvir sempre que preciso falar, tanto em momentos de desesperos quanto em momentos que só
preciso compartilhar a alegria e animação por algum motivo. Muitíssimo obrigada por estarem
sempre comigo!
Sumário
Resumo ..............................................................................................................................................2
Abstract .............................................................................................................................................4
Introdução .........................................................................................................................................6
Objetivos .........................................................................................................................................11
Material e Métodos .........................................................................................................................13
Obtenção dos espécimes .......................................................................................................14
Obtenção de dados moleculares ............................................................................................14
Extração de DNA ..................................................................................................................15
Amplificação do DNA ..........................................................................................................16
Purificação dos produtos de PCR ..........................................................................................17
Amplificação dos produtos de PCR e sequenciamento do DNA ..........................................17
Edição das sequências ...........................................................................................................17
Análise dos dados ..................................................................................................................24
Resultados .......................................................................................................................................27
Gene nuclear 28S ...................................................................................................................28
Gene mitocondrial COI ..........................................................................................................29
Discussão .........................................................................................................................................32
Conclusão ........................................................................................................................................37
Referências ......................................................................................................................................39
Resumo
Prado, B. M. (2014) Resumo
3
Potimirim é um gênero de pequenos camarões de água doce, que vivem em rios e riachos
litorâneos da região Neotropical. Este possui uma sistemática que foi bastante controversa, porém
algumas questões foram elucidadas recentemente com alguns trabalhos filogenéticos moleculares.
No entanto, não existem trabalhos específicos utilizando-se de ferramentas moleculares sobre as
populações da espécie Potimirim brasiliana, que resolvam a politomia encontrada em seu clado.
Este projeto tem como objetivo uma análise filogenética com base em dados moleculares, visando
à resolução das relações interespecíficas e intraespecíficas. Os marcadores moleculares que foram
usados nas análises filogenéticas são os genes mitocondrial Citocromo oxidase I (COI) e o nuclear
28S. Foram sequenciadas amostras de P. brasiliana provenientes de populações dos estados de
Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro e Bahia, além de espécimes de Potimirim
glabra, Potimirim potimirim e Potimirim sp. As sequências foram editadas no programa
computacional BioEdit versão 7.0.9, assim como a construção da sequência consenso de ambas as
fitas. As sequências nucleotídicas editadas foram alinhadas pelo método de distância no programa
ClustalW (implementado no BioEdit). Para se buscar o modelo de substituição mais adequado
para os dados em questão, foi utilizado o programa JModeltest 2.1.4. Posteriormente, os
alinhamentos foram analisados por máxima verossimilhança no programa Mega 6. A filogenia do
28S não elucidou as relações evolutivas entre as populações de P. brasiliana, mostrando apenas a
separação entre dois grupos: um subgrupo formado por P. potimirim e um subgrupo formado pela
espécie P. brasiliana e P. sp. Na filogenia do COI nota-se a separação entre o clado de P.
brasiliana e as demais espécies, revelando que este seja um grupo monofilético. Entre os
espécimes de P. brasiliana foram encontradas algumas separações de grupos, porém sem um
padrão geográfico de distribuição.
Abstract
Prado, B. M. (2014) Abstract
5
Potimirim is a genus of small fresh water shrimps, that live in rivers and coastal streams of
the Neotropical region. It has a very controversial systematic, but some issues were recently
elucidated by some molecular phylogenetic works. However, there are no specific studies using
molecular tools to Potimirim brasiliana populations that solve the polytomy found on its clade.
This project aims a phylogenetic analysis based on molecular data, order the resolution of
interspecific and intraspecific relations. The molecular markers used in phylogenetic analyzes are
the mitochondrial gene Cytochrome oxidase I (COI) and the nuclear 28S. It were sequenced P.
brasiliana individuals from populations in Santa Catarina, Parana, Sao Paulo, Rio de Janeiro and
Bahia, and also specimens of Potimirim glabra, Potimirim potimirim and Potimirim sp. The
sequences were edited in software BioEdit version 7.0.9., as well as the construction of consensus
sequence of both tapes. The nucleotide sequences edited were aligned by distance method in the
program ClustalW (implemented in BioEdit). To find the replacement model more appropriate for
the data in question, was used the program JModeltest 2.1.4. Subsequently, the alignments were
analyzed by Maximum Likelihood in the program Mega 6. The 28S phylogeny don´t brought the
evolutionary relationships between the populations of P. brasiliana, showing only the separation
between two groups: a subgroup formed by P. potimirim and a subgroup formed by the species P.
brasiliana and P. sp. In the phylogeny of the COI is possible to note the separation between the
clade of P. brasiliana and the other species, revealing that this is a monophyletic group. Among
the specimens of P. brasiliana were found some separations of groups, but without a geographic
pattern of distribution.
Introdução
Prado, B. M. (2014) Introdução
7
A família Atyidae De Haan, 1849, que está inserida na superfamília Atyoidea De Haan,
1849, e na subordem Caridea Dana, 1852, apresenta importância ecológica em ecossistemas
subtropicais e tropicais dulcícolas, tanto pelo processo de renovação de sedimentos (Moulton et
al., 2004; Souza & Moulton, 2005), quanto pelo papel fundamental na cadeia trófica de ambientes
límnicos (Benzie, 1982). Os camarões de água doce da família Atyidae encontram-se distribuídos em rios e riachos
litorâneos da região Neotropical, sob vegetação marginal submersa ou escondidos sob rochas e
cascalho (Chace & Hobbs, 1969; Ramos-Porto & Palácios, 1981; Lima et al., 2006; Torati, 2009),
e locais com correnteza (Chace & Hobbs, 1969; Ramos-Porto & Palácios, 1981). A ocorrência
apenas em regiões litorâneas deve-se a dependência de água salobra para o desenvolvimento das
larvas dos atídeos (Molina, 1987). Alguns fatores abióticos influenciam a estrutura populacional,
como a temperatura que, por exemplo, é um fator que atua sobre a velocidade do desenvolvimento
larval (Hoffmann & Negreiros-Fransozo, 2010), além de afetar também alguns padrões de
reprodução (Barros & Fontoura, 1996b). Flutuações de densidade populacional podem ocorrer
devido às variações de disponibilidade de alimento, em razão das correntes dos cursos d’água
(Covich et al., 1991).
Este táxon envolveu muitas dúvidas e posições controversas em sua taxonomia ao longo do
tempo. Uma delas foi a necessidade de se criar um novo gênero para separar espécies de
Ortmannia Rathbun, 1901 que eram diferentes de Atya Leach, 1816 (Torati, 2009). O gênero
Potimirim foi proposto por Holthuis em 1954, com este intuito. Já em 1961, Hart propôs o gênero
Jonga Hart, 1961 para a espécie Potimirim serrei Bouvier, 1909, pois este possui uma fileira de
pequenos espinhos na margem supra-orbital do rostro, o que é ausente em Potimirim (Torati,
2009).
Esta família apresenta 40 gêneros, sendo Potimirim Holthuis, 1954 um deles (De Grave &
Fransen, 2011). Algumas características reúnem os camarões do gênero: rostro curto com dentes
somente na margem inferior; espinhos supraorbitais ausentes e com espinhos antenais e
pterigostomiamos; córnea dos olhos não expandida; ausência de exopoditos na base dos
pereópodos; presença de epipodito na base dos primeiros três ou quatro pares de pereópodos;
presença de quelas delgadas; mesmo que pequenas, as palmas nos quelípodos estão presentes;
diferenciação do apêndice do primeiro par de pleópodo, em machos (Holthuis, 1954).
Prado, B. M. (2014) Introdução
8
É notório a grande dificuldade na identificação das espécies de Potimirim (Page et al.,
2008), a qual deve-se pela grande variabilidade existente dentro das espécies (Muller, 1892;
Villalobos, 1959; Smalley, 1963) que possuem morfologias similares e ocupam, as vezes,
ambientes semelhantes. Porém trabalhos filogenéticos moleculares, suportados por morfologia
alfa (Page et al., 2008; Torati & Mantelatto, 2012) proporcionaram a resolução de algumas
questões. Ainda, a biologia molecular tem se tornado uma importante ferramenta para a resolução
de relações filogenéticas, uma vez que existem casos no qual a morfologia não é suficiente (Hillis,
1987; Meyer, 1997). Como exemplo tem-se a separação da espécie Potimirim glabra Kingsley,
1878 em três espécies (Potimirim glabra – encontrada na parte pacífica da América Central e
Norte; Potimirim sp 2 – encontrada na parte atlântica da América Central e Norte; Potimirim
brasiliana Villalobos, 1959 – encontrada somente no Brasil), status este concluído pelo trabalho
de Torati & Mantelatto (2012).
Atualmente o gênero Potimirim é composto por cinco espécies descritas de camarões de
água doce (Torati & Mantelatto, 2012): Potimirim americana Guérin-Méneville, 1855, Potimirim
mexicana De Saussure, 1857, Potimirim potimirim Muller, 1881, Potimirim glabra e Potimirim
brasiliana. Além desta, existem duas espécies novas em processo de descrição por Torati &
Mantelatto: Potimirim sp 1 e Potimirim sp 2.
Potimirim brasiliana (Figura 1) é uma espécie endêmica do Brasil, com ocorrências
registradas nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná e Santa
Catarina (Villalobos, 1959; Barros & Fontoura, 1996a; Torati, 2009; Torati & Mantelatto, 2012).
De acordo com Torati (2009), algumas características reúnem estes atídeos na espécie Potimirim
brasiliana: margem superior do rostro bastante curvada; epipoditos presentes na base do quarto
par de pereópodos; pleurobrânquias presentes no oitavo somito torácico dos machos; dátilo do
terceiro e quarto pares de pereópodos não muito espessos, apresentando margem superior não
muito convexa e, com 6-8 espinhos grandes e curvos em sua margem inferior; camada espessa de
cerdas do tipo “pits” na superfície interna do mero do terceiro e quarto pereópodos; parte inferior
da margem anterior da quinta pleura praticamente reta; apêndice masculino estreito, com um
entalhe em sua margem distal, apresentando três lobos bem definidos; margem superior do lobo
posterior do apêndice masculino convexa.
De acordo com Grilli et al. (2014), P. brasiliana, da mesma forma que P. potimirim, é uma
espécie gonocórica (sexos separados). Chegou-se a esta conclusão neste trabalho por meio da
Prado, B. M. (2014) Introdução
9
realização de uma descrição, com base em estudos morfológicos, do sistema sexual de ambas as
espécies, na qual não se encontrou indivíduos em transição ou que apresentassem,
simultaneamente, caracteres masculinos e femininos. O dimorfismo sexual nesta espécie é bem
evidente, como se observa pela presença de apêndice masculino (Figura 2) encontrados nos
machos, além da diferença no tamanho entre indivíduos de ambos os sexos. A fêmea geralmente
atinge maior tamanho, maximizando o potencial reprodutivo da espécie (Parker, 1992). Em 2013,
Rocha et al. realizaram um trabalho com um grupo de espécimes de Potimirim brasiliana coletado
na Estação Ecológica Juréia-Itatins, em Peruíbe, estado de São Paulo e mediu a fecundidade média
das fêmeas, que resultou em 361 ovos por fêmea. Estes ovos ficam aderidos às cerdas dos
pleópodos por meio de filamentos, dando condições adequadas de areação e limpeza (Barros &
Fontoura,1996a). Além disso, no trabalho de Rocha et al. (2013) foram observadas variações de
atividade reprodutiva e fecundidade tanto pela época do ano, quanto pela localização das
populações (populações mais ao sul do Brasil possuem uma menor atividade reprodutiva),
sofrendo, assim, influencia de fatores ambientais e da latitude.
Figura 1: Potimirim brasiliana, exemplar de uma fêmea coletada na Ilha de São Sebastião em
Ilhabela (SP) (CCDB 2205) (1: Carapaça; 2: Somitos Abdominais; 3: Télson; 4: Pereópodos; 5:
Pleópodos; 6: Urópode).
Prado, B. M. (2014) Introdução
10
A maioria dos trabalhos que envolvem a espécie P. brasiliana é de caráter morfológico e
ecológico. Não há um estudo conclusivo sobre as relações existentes entre as populações de P.
brasiliana ao longo de sua distribuição geográfica, que pode ser observada na politomia
encontrada em seu clado na filogenia molecular do gene mitocondrial 16S (Torati & Mantelatto,
2012). Em razão desta problemática, é de grande importância a realização de uma análise
filogenética, com base em dados moleculares mais variáveis (e.g. COI), visando avaliar as
relações entre as populações da espécie P. brasiliana, e as relações dentro do gênero.
Figura 2: Detalhe do apêndice masculino de um exemplar de Potimirim brasiliana (CCDB 2205).
Objetivos
Prado, B. M. (2014) Objetivos
12
O presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo filogenético do gênero
Potimirim com base em dados moleculares, visando entender as relações evolutivas entre as
populações de Potimirim brasiliana, e em relação a outras espécies do gênero, utilizando como
marcadores moleculares o gene mitocondrial COI e o gene nuclear 28S.
Material e
Métodos
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
14
Obtenção dos espécimes
Os espécimes de Potimirim brasiliana e de outras espécies do gênero Potimirim utilizados
para este estudo foram obtidos da Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB)
do Laboratório de Bioecologia e Sistemática de Crustáceos (LBSC), Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FFCLRP/USP). Os espécimes
foram coletados manualmente com o uso de peneiras nos estados de Santa Catarina, Paraná, São
Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Bahia. Os novos exemplares coletados foram devidamente
identificados, etiquetados e armazenados em álcool etílico 80% e incorporados à
CCDB/FFCLRP/USP. A confirmação da identificação das espécies foi realizada baseada nos
trabalhos de Holthuis (1954), Villalobos (1959), Chace & Hobbs (1969), Chace (1972), Melo
(2003), Torati (2009) e Torati & Mantelatto (2012), levando em conta características morfológicas
como: forma do apêndice masculino, morfologia do rostro e do dátilo dos terceiro e quarto pares
de pereópodos. A obtenção e manipulação do material genético estão em conformidade com a
licença do SISBIO para coleta e análise genética de decápodes (nº 11777-1 Data da Emissão:
16/09/2007).
Obtenção de dados moleculares
Os dados foram obtidos com base em protocolos, seguindo a metodologia de Pileggi &
Mantelatto (2010) e Torati & Mantelatto (2012), com algumas modificações que visaram à
adequação ao material.
Os genes escolhidos para atuarem como marcadores moleculares deste trabalho foram os
genes mitocondrial Citocromo oxidase I (COI) e nuclear 28S. Esta escolha foi devido ao gene COI
ser reconhecido como bastante informativo para uma variedade de níveis filogenéticos (Crandall
et al., 2000; Schubart et al., 2000; Porter et al., 2005; Mantelatto et al., 2006; Page et al., 2008;
Pileggi & Mantelatto, 2010; Vergamini et al., 2011; Rossi & Mantelatto, 2013), uma vez que
genes mitocondriais apresentam uma maior taxa de mutação em relação aos genes nucleares,
possuindo sinal filogenético em um período de tempo mais curto. O 28S foi testado também,
apesar de ser um gene nuclear, pois é mais usado na separação de espécies, tendo neste caso o
objetivo de posicionar Potimirim brasiliana na filogenia do gênero. A escolha de um gene
mitocondrial e um nuclear se deve ao fato de que o primeiro apresenta um padrão linear da
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
15
evolução por ser uma herança uniparental, enquanto o outro apresenta um padrão reticulado por
ser uma herança biparental (Neigel & Avise, 1986).
Para a extração de DNA procurou-se, sempre que possível, selecionar animais de maior
tamanho, machos e adultos, facilitando assim a precisão na identificação destes com base nos
apêndices masculinos antes de se iniciar a extração. Estes espécimes, cujo tecido muscular foi
extraído, foram separados e etiquetados dentro de seu lote e designados como voucher genético.
Extração de DNA
A extração foi realizada em três etapas. Na primeira etapa foi extraído tecido muscular
abdominal, e algumas vezes até mesmo um pleópodo, dos espécimes escolhidos. O pleópodo foi
extraído quando o indivíduo era muito pequeno e havia pouco tecido muscular abdominal,
garantindo que se conseguisse uma concentração maior de DNA. Neste caso, não se extraía o par
de pleópodo no qual se encontra o apêndice masculino, pois não se deve retirar uma estrutura que
seja muito utilizada em sua identificação. O tecido extraído foi incubado em banho-seco por 12-
24h em 600µl de tampão de lise e 200µl de proteinase K (500µg/ml) a 55°C. Na segunda etapa,
primeiramente os tubos com o material ficaram 10 minutos no gelo, para que a atividade da
proteinase K fosse inativada. Em seguida, adicionou-se 200µl de acetato de amônio (7,5 M), para
que houvesse a separação das proteínas, seguido por uma centrifugação. O sobrenadante foi
retirado do tubo e transferido para outro contendo 600µl isopropanol, que possui a função de
decantar o DNA que ali se encontra. Os sobrenadantes com isopropanol ficaram 24h descansando
a -20°C. Na terceira etapa, após uma centrifugação, descartou-se o isopropanol e adicionou-se
15µl de etanol 70% para lavar o restante de isopropanol que tenha ficado junto ao DNA. O etanol,
depois de passar 10 minutos na geladeira e ser centrifugado, foi descartado. Em seguida,
liofilizou-se e ressuspendeu-se os pellets em 20µl de tampão TE.
Foram realizadas extrações de DNA de 72 indivíduos do gênero Potimirim, no qual 49
indivíduos são da espécie P. brasiliana, alvo deste projeto. Estes indivíduos representam
populações dos estados de Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro e Bahia. Além
destes, alguns espécimes de P. potimirim foram usados, sendo que estes já possuíam material
extraído (Tabela I).
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
16
A concentração de DNA extraído foi medida pelo Nanodrop 2000 Spectrophotometer®, a
fim de se possibilitar a adequação da concentração do DNA extraído à concentração necessária
para se realizar a amplificação dos genes de interesse pela técnica de PCR (Polymerase Chain
Reaction) (Sambrook et al., 1989).
Tabela I: Relação dos espécimes de Potimirim potimirim que já possuíam material extraído (CCDB: Coleção de
Crustáceos do Departamento de Biologia).
CCDB Localidade Número de indivíduos
sequenciados
2634 Ilhéus (BA), Brasil 1
2399 Isla Colon, Bocas del Toro,
Panama
6
1893 Caieira do Norte (SC),
Brasil
1
Amplificação do DNA
O gene mitocondrial COI foi amplificado por meio de técnica de PCR fazendo uso dos
primers LCO1490 (5´ - GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G - 3´) e HCO2198 (5´ -
TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA - 3´) (Folmer et al., 1994), e o gene nuclear 28S
pelos primes 28S Rd1a (5’ - CCC SCG TAA YTT AAG CAT AT - 3’) e 28S Rd4b (5’ - CCT
TGG TCC GTG TTT CAA GAC - 3’) (Edgecombe & Giribet, 2006). Os produtos de PCR foram
obtidos a partir de uma reação de volume total 25µl contendo água destilada e deionizada, Taq
Buffer, MgCl2 (25 mM), betaína (5 M), DNTPs, primers, Taq polimerase e DNA extraído.
O DNA foi amplificado no Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) com os
seguintes ciclos termais: COI - desnaturação inicial por 2 min a 94°C; anelamento por 35 ciclos
(30s a 94°C; 30s a 48°C e 1 min a 72°C); extensão final por 2 min a 72°C; 28S – desnaturação
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
17
inicial por 5 min a 95°C; anelamento por 40 ciclos (45s a 95°C; 45s a 52°C e 1 min a 72°C);
extensão final por 3 min a 72°C.
Purificação dos produtos de PCR
A purificação foi realizada utilizando-se kit SureClean®. Aos produtos de PCR foram
adicionados 20µl de SureClean, seguido por centrifugação de 30min. O sobrenadante foi
removido, e o pellet lavado com 40µl de etanol 70%. Após outra centrifugação de 30min e a
retirada do etanol, as amostras foram liofilizadas e, os pellets foram ressuspendidos em 22µl de
Água Milli-Q Autoclavada. Para que se seguisse para a próxima etapa, foi medida a concentração
do material, sendo necessário no mínimo 10 ng/µl para cada fita do DNA a ser sequenciada.
Amplificação dos produtos de PCR e sequenciamento do DNA
Ambas as etapas foram realizadas pelo Departamento de Tecnologia da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal (FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho” (UNESP). O sequenciamento foi realizado em um sequenciador automatizado
ABI Prism 3100 Genetic Analyzer® (Applied Biosystems automated sequencer).
A Tabela II apresenta um resumo dos espécimes que foram sequenciados, com suas
respectivas localidades de coleta.
Edição das sequências
As sequências foram editadas no programa computacional BioEdit versão 7.0.9. (Hall,
2005), assim como a construção da sequência consenso de ambas as fitas. Após esta etapa, as
sequências consenso foram comparadas com outras sequências depositadas em banco de dados
genéticos utilizando-se o programa de pesquisa BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.shtml).
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
18
Tabela II: Continua. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção
(CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).
Espécie Localidade CCDB Número de acesso no
GenBank COI/28S
Potimirim brasiliana Ilhabela, São Paulo,
Brasil
1991 KP202785/ KP202724
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 KP202787/ KP202726
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 KP202806/ KP202747
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 ─ / KP202748
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 KP202815/ KP202749
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 KP202816/ KP202750
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 ─ / KP202740
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 KP202817/ KP202741
Potimirim brasiliana Ubatuba, São Paulo,
Brasil
2006 KP202781/ KP202751
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 KP202811/ KP202736
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 KP202812/ ─
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
19
Tabela II: Continua. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção
(CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).
Espécie Localidade CCDB Número de acesso no
GenBank COI/28S
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 KP202819/ KP202743
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 KP202813/ KP202744
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 KP202820/ KP202745
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 KP202814/ ─
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 ─ / KP202759
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 ─ / KP202760
Potimirim brasiliana Mangaratiba, São
Paulo, Brasil
2142 ─ / KP202761
Potimirim brasiliana Iguapé, São Paulo,
Brasil
2386 KP202808/ ─
Potimirim brasiliana Iguapé, São Paulo,
Brasil
2386 ─ / KP202752
Potimirim brasiliana Paraty, Rio de
Janeiro, Brasil
2005 KP202786/ KP202725
Potimirim brasiliana Paraty, Rio de
Janeiro, Brasil
2005 KP202802/ ─
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
20
Tabela II: Continua. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção
(CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).
Espécie Localidade CCDB Número de acesso no
GenBank COI/28S
Potimirim brasiliana Paraty, Rio de
Janeiro, Brasil
2005 KP202803/ KP202737
Potimirim brasiliana Paraty, Rio de
Janeiro, Brasil
2005 ─ / KP202738
Potimirim brasiliana Paraty, Rio de
Janeiro, Brasil
2005 KP202804/ KP202746
Potimirim brasiliana Paraty, Rio de
Janeiro, Brasil
2005 KP202805/ KP202739
Potimirim brasiliana Matinhos, Paraná,
Brasil
2115 KP202788/ ─
Potimirim brasiliana Matinhos, Paraná,
Brasil
2115 KP202818/ ─
Potimirim brasiliana Matinhos, Paraná,
Brasil
2115 KP202807/ ─
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 KP202789/ KP202727
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 KP202790/ KP202728
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 KP202791/ KP202729
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 KP202792/ KP202730
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
21
Tabela II: Continua. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção
(CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).
Espécie Localidade CCDB Número de acesso no
GenBank COI/28S
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 KP202793/ KP202731
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 ─ / KP202753
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 ─ / KP202754
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 ─ / KP202755
Potimirim brasiliana Uruçuca, Bahia,
Brasil
1585 ─ /KP202756
Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia,
Brasil
2633 KP202794/ ─
Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia,
Brasil
2633 KP202821/ ─
Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia,
Brasil
2633 KP202795/ ─
Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia,
Brasil
2633 KP202796/ KP202732
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
22
Tabela II: Continua. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção
(CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).
Espécie Localidade CCDB Número de acesso no
GenBank COI/28S
Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia,
Brasil
2633 KP202797/ ─
Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia,
Brasil
2633 ─ / KP202757
Potimirim brasiliana Ilhéus, Bahia,
Brasil
2633 ─ / KP202758
Potimirim brasiliana BR 376, Santa
Catarina, Brasil
2116 KP202798/ KP202733
Potimirim brasiliana BR 376, Santa
Catarina, Brasil
2116 KP202799/ KP202734
Potimirim brasiliana BR 376, Santa
Catarina, Brasil
2116 KP202809/ KP202742
Potimirim brasiliana BR 376, Santa
Catarina, Brasil
2116 KP202810/ KP202735
Potimirim potimirim Itapitangui, São
Paulo, Brasil
3721 ─ / KP202763
Potimirim potimirim Itapitangui, São
Paulo, Brasil
3720 ─ / KP202773
Potimirim potimirim Ariri, São Paulo,
Brasil
3741 KP202800/ KP202774
Potimirim potimirim Cananéia, São Paulo,
Brasil
3743 KP202784/ KP202762
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
23
Tabela II: Continua. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção
(CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).
Espécie Localidade CCDB Número de acesso no
GenBank COI/28S
Potimirim potimirim Ilhabela, São Paulo,
Brasil
3942 ─ / KP202775
Potimirim potimirim Ilhéus, Bahia,
Brasil
2634 ─ / KP202765
Potimirim potimirim Canavieiras, Bahia,
Brasil
3037 ─ / KP202772
Potimirim potimirim Piuma, Espírito
Santo, Brasil
4069 KP202825/ ─
Potimirim potimirim Piuma, Espírito
Santo, Brasil
4069 KP202826/ ─
Potimirim potimirim Iconha, Espírito
Santo, Brasil
4066 KP202823/ KP202766
Potimirim potimirim Iconha, Espírito
Santo, Brasil
4066 ─ / KP202767
Potimirim potimirim Iconha, Espírito
Santo, Brasil
4066 ─ / KP202768
Potimirim potimirim Iconha, Espírito
Santo, Brasil
4066 KP202822/ KP202769
Potimirim potimirim Iconha, Espírito
Santo, Brasil
4066 KP202824/ KP202770
Potimirim potimirim Iconha, Espírito
Santo, Brasil
4066 KP202801/ KP202771
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
24
Tabela II: Conclusão. Lista de sequências com seus respectivos locais de coleta, números de catálogo da coleção
(CCDB) e de acesso no GenBank (─: ausência de dados).
Espécie Localidade CCDB Número de acesso no
GenBank COI/28S
Potimirim potimirim Isla Colon, Bocas del
Toro, Panamá
2399 KP202827/ KP202780
Potimirim potimirim Isla Colon, Bocas del
Toro, Panamá
2399 KP202828/ ─
Potimirim potimirim Isla Colon, Bocas del
Toro, Panamá
2399 KP202829/ KP202779
Potimirim potimirim Isla Colon, Bocas del
Toro, Panamá
2399 ─ / KP202777
Potimirim potimirim Isla Colon, Bocas del
Toro, Panamá
2399 ─ / KP202778
Potimirim potimirim Isla Colon, Bocas del
Toro, Panamá
2399 KP202783/ KP202764
Potimirim potimirim Caieira do Norte,
Santa Catarina, Brasil
1893 ─ / KP202776
Potimirim glabra Costa Rica - costa do
Pacífico
3341 KP202782/ ─
Análise dos dados
As sequências nucleotídicas editadas foram alinhadas pelo método de distância no
programa ClustalW (implementado no BioEdit) utilizando os parâmetros do “default” do
programa.
As análises filogenéticas foram realizadas pelo método de máxima verossimilhança com os
genes mitocondrial COI e nuclear 28S. Para o COI foram analisados 57 espécimes do gênero
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
25
Potimirim, sendo 36 P. brasiliana, sete P. sp 2 (obtidas do GenBank como P. glabra*), duas P.
glabra (uma obtida no GenBank), 12 P. potimirim, além de duas espécimes como grupo externo,
sendo uma Atya scabra Leach, 1816 (obtida no GenBank) e uma Micratya poeyi Guérin-
Méneville, 1855 (obtida no GenBank). Para o 28S foram analisados 59 espécimes do gênero
Potimirim, sendo 37 P. brasiliana, 20 P. potimirim (uma obtida no GenBank), uma P. sp 2 (obtida
no GenBank como P. glabra*), além de cinco espécimes como grupo externo, sendo uma Jonga
serrei Bouvier, 1909 (obtida no GenBank), uma Micratya poeyi (obtida no GenBank), uma Atya
ortmannioides Villalobos, 1956 (obtida no GenBank), uma Atya scabra (obtida no GenBank) e
uma Atyoida bisulcata Randall, 1840 (obtida no GenBank). Todos os espécimes que foram
utilizados neste trabalho e cujas sequências foram obtidas do GenBank se encontram na Tabela III,
com seus respectivos números de acesso. Para se buscar o modelo de substituição mais adequado
para os dados em questão, foi utilizado o programa JModeltest 2.1.2 (Darriba et al., 2012).
Posteriormente, os alinhamentos foram analisados por máxima verossimilhança no programa
Mega 6 (Tamura et al., 2013) de acordo com os métodos selecionados anteriormente e, utilizando-
se a metodologia de bootstrap com 1000 réplicas.
Tabela III: Continua. Lista de espécies do Genbank que foram utilizadas, localidades, número de acesso no Genbank
e referência onde foi publicada a sequência.
Espécie (gene) Localidade Genbank Referência
P. glabra (COI) Panamá JF811005.1 Page et al., 2011
P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811012.1 Page et al., 2011
P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811011.1 Page et al., 2011
P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811010.1 Page et al., 2011
P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811009.1 Page et al., 2011
P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811008.1 Page et al., 2011
P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811007.1 Page et al., 2011
P. glabra* (COI) Trinidade e Tobago JF811006.1 Page et al., 2011
P. potimirim (28S) Panamá FN995614.1 Von Rintelen et al., 2012
Estes P. glabra encontrados no GenBank que estão marcados (*), de acordo com Torati & Mantelatto (2012), trata-
se de uma nova espécie encontrada na costa Atlântica da América Central, que foi chamada pelos autores de P. sp 2.
Prado, B. M. (2014) Material e Métodos
26
Tabela III: Conclusão. Lista de espécies do Genbank que foram utilizadas, localidades, número de acesso no
Genbank e referência onde foi publicada a sequência.
Espécie (gene) Localidade Genbank Referência
P. glabra* (28S) Trinidade e Tobago FN995613.1 Von Rintelen et al., 2012
Atya scabra (COI) Trinidade e Tobago JF810990.1 Page et al., 2013
Micratya poeyi (COI) Caribe FJ348827.1 Cook et al., 2010
Atya scabra (28S) ---- FN995550.1 Von Rintelen et al., 2012
Micratya poeyi (28S) ---- FN995595.1 Von Rintelen et al., 2012
Jonga serrei (28S) ---- FN995587.1 Von Rintelen et al., 2012
Atya ortmannioides (28S) ---- FN995549.1 Von Rintelen et al., 2012
Atyoida bisulcata (28S) ---- FN995553.1 Von Rintelen et al., 2012
Resultados
Prado, B. M. (2014) Resultados
28
Primeiramente, realizou-se o PCR de apenas três extrações como teste para observar o
resultado, em ambos os casos, para os genes COI e 28S. Este primeiro PCR teste foi realizado com
temperatura de anelamento de 50°C e 48°C para COI e 28S, respectivamente, conforme o
protocolo. Os resultados dos PCRs foram observados em eletroforese com gel de agarose 1% e
fotografados com uma câmera digital C-7070 Olimpus® em um transiluminador UV M20 UVP
®.
Porém a banda, em ambos os acasos, não foi visualizada. A aparição desta banda significa que a
região do DNA necessária para este trabalho foi amplificada. Com isso, houve a necessidade de se
alterar a temperatura de anelamento. As temperaturas que apresentaram resultado positivo foram
48°C para COI e 52°C para 28S. Esta adaptação da temperatura é necessária, pois as condições
das reações e o material que foi extraído possuem suas particularidades, sendo distintos de
trabalho para trabalho, onde a temperatura e a duração de tempo necessário para o anelamento do
primer dependem da composição de bases, comprimento e concentração de primers (Innis &
Gelfard, 1990). Todos os espécimes passaram por amplificação por PCR para ambos os genes, 28S e COI,
porém nem todos tiveram resultado positivo. Em alguns casos, mesmo alterando a temperatura de
anelamento e a concentração de material extraído, a banda não apareceu. Já em outros casos, a fita
não aparecia totalmente limpa, com a presença de bandas inespecíficas, podendo ter ocorrido um
erro na extensão devido à inibição da enzima DNA polimerase. Na primeira situação, este não
passou pelo processo de sequenciamento; já no segundo caso, se ambas as fitas de um espécime
estivessem muito ruins, esta sequência não foi utilizada para as análises moleculares.
Gene nuclear 28S
Para o gene nuclear 28S foram obtidas sequências que variam de 734 a 756 pares de bases
(bp), e as provenientes do Genbank variam de 666 a 1110 bp, com isso foram todas alinhadas pelo
ClustalW com um total de 666 bp. O modelo selecionado pelo programa JModeltest que melhor se
adequou a este padrão de dados, segundo o critério de informação Akaike (AIC), foi Tamura-
Nei+I, o qual apresentou as seguintes frequências das bases: A = 0,2303, C = 0,2710, G = 0,3426,
T = 0,1561.
Com base nas diferenças genéticas das sequências e por meio do método de máxima
verossimilhança do programa Mega, foi construído um cladograma observado na Figura 3.
Prado, B. M. (2014) Resultados
29
Observou-se neste cladograma a existência de um grupo formado apenas pelos espécimes
de P. potimirim (Figura 3 - A) que está inserido dentro de outro grupo composto pelos espécimes
de P. brasiliana e um espécime de P. sp 2 (Figura 3 - B). Esta nova espécie citada neste trabalho
foi proposta por Torati & Mantelatto (2012), com base em dados moleculares, no qual representa
os espécimes antes chamados de P. glabra que ocorrem na região do Caribe.
Gene mitocondrial COI
Foram obtidas sequências para o gene COI com uma quantidade que varia de 640 a 700 bp,
porém como as sequências provenientes do Genbank são menores (de 324 a 530 bp), o
alinhamento foi realizado com apenas 530 bp para todas as sequências. O programa JModeltest
selecionou o modelo Tamura-Nei + G como o mais adequado para este padrão de dados, segundo
o critério de informação Akaike (AIC), apresentando as seguintes frequências das bases: A =
0,3183, C = 0,1490, G = 0,2432, T = 0,2895.
A partir do cladograma obtido (Figura 4) observou-se a separação do clado de Potimirim
brasiliana (Figura 4 - C) das outras espécies, permitindo dizer que este é um grupo monofilético.
Observa-se também que há uma relação maior entre P. glabra e P. sp 2 (Figura 4 - D), e que
dentro de P. potimirim (Figura 4 - E) existe uma separação entre os espécimes do Brasil (Figura 4
- F) e os do Panamá (Figura 4 - G).
Prado, B. M. (2014) Resultados
30
Figura 3: Cladograma de espécies de Potimirim, baseado no método de máxima verossimilhança do gene 28S.
Números dos ramos referem-se aos valores de significância para 1000 réplicas de bootstraps. BA: Bahia; SP: São
Paulo; RJ: Rio de Janeiro; SC: Santa Catarina; Tobago: Trinidade e Tobago; *: espécime que deveria passar por uma
confirmação de sua identificação, porém sua sequência foi obtida no Genbank.
A
B
Prado, B. M. (2014) Resultados
31
Figura 4: Cladograma de espécies de Potimirim, baseado no método de máxima verossimilhança do gene COI.
Números dos ramos referem-se aos valores de significância para 1000 réplicas de bootstraps. BA: Bahia; SP: São
Paulo; RJ: Rio de Janeiro; SC: Santa Catarina; PR: Paraná; *: espécime que deveria passar por uma confirmação de
sua identificação, porém sua sequência foi obtida no Genbank.
C
D
E
G
F
Discussão
Prado, B. M. (2014) Discussão
33
O gene nuclear 28S não se mostrou eficiente para o estudo da relação entre as populações
de P. brasiliana, uma vez que todos os espécimes ficaram reunidos em um único grupo. Esta
politomia é semelhante à encontrada no trabalho de Torati & Mantelatto (2012), no qual foi
utilizado o gene 16S. Os genes 28S e 16S são conservados de tal maneira, que em ambos os casos,
não foi possível resolvem as relações evolutivas entre as populações de P. brasiliana. No trabalho
de Hou et al. (2007) a filogenia encontrada para os genes nucleares (18S e 28S) não foram
eficientes também, já que algumas politomias foram encontradas entre as espécies do gênero
Gammarus Fabricius, 1775. No cladograma proposto no presente trabalho para o gene 28S
observa-se a presença de um grupo composto apenas por P. potimirim, apontando ser este um
grupo monofilético.
Genes mais conservados como os nucleares são mais utilizados em trabalhos que não
precisam de marcadores moleculares tão variáveis, ou seja, na qual o gene não deve ter sofrido
muitas mutações. Um exemplo é o trabalho de Gao et al. (2008), no qual foi realizado um estudo
filogenético com o objetivo de analisar as relações entre grupos basais de hexápoda, na qual
incluíram insetos, crustáceos, miriápodes e cheliceriformes. Para este tipo de estudo, ambos os
genes utilizados, 18S e 28S, produziram resultados consistentes. Para este trabalho o gene 28S foi
utilizado com o objetivo de posicionar P. brasiliana entre outras espécies do gênero, e testar se as
separações das espécies são resultados de eventos recentes ou não. Este fato pode ser observado
pela existência da separação entre P. brasiliana e P. potimirim, e a presença de uma politomia
entre P. brasiliana e P. sp 2., que apontam como especiações resultantes de evento mais antigo no
primeiro caso, e de evento mais recente no segundo caso.
A partir do cladograma obtido com COI (Figura 4) observou-se a nítida separação do clado
de Potimirim brasiliana com o de Potimirim glabra juntamente com Potimirim sp 2, corroborando
o trabalho de Torati & Mantelatto (2012), por meio de dados moleculares (gene 16S) e
morfológicos (apêndice masculino), que propôs a separação de P. glabra em três espécies distintas
(P. glabra-Pacífico, P. brasiliana-Atlântico-Brasil e P.sp 2- Atlântico-Caribe). Nota-se que há
uma relação de maior proximidade entre P. glabra e P. sp 2, corroborando a semelhança
morfológica entre eles (Torati & Mantelatto, 2012). No entanto, o cladograma proposto no
referido trabalho não foi capaz de resolver politomias intraespecíficas devido ao conservadorismo
do gene 16S.
Prado, B. M. (2014) Discussão
34
Há neste cladograma uma separação entre a espécie P. potimirim e as demais espécies
utilizadas neste estudo. Este fato pode ter relação com o desenvolvimento ontogenético do grupo,
mais precisamente em relação ao desenvolvimento do apêndice masculino. De acordo com Torati
& Mantelatto (2012), o estado primitivo do apêndice masculino teria sido mantido em adultos de
P. americana, sendo posteriormente modificado em um estado intermediário mantido pelas
espécies P. potimirim, P. mexicana e P. sp 1. Após este estado intermediário, teria ocorrido outra
modificação, dando origem ao formato do apêndice masculino presente nas espécies P. brasiliana,
P. glabra e P. sp 2. Este desenvolvimento ontogenético corrobora com a separação do grupo de P.
potimirim das demais espécies, e também com a existência de uma maior relação entre P.
brasiliana, P. glabra e P. sp 2, resultados encontrados neste trabalho. Porém, esta separação em
dois grupos proposta por Torati & Mantelatto (2012), um grupo formado por P. potimirim, P.
mexicana e P. sp 1 e outro grupo formado por P. brasiliana, P. glabra e P. sp 2, não é
corroborado pelo trabalho de Grilli et al. (2014), que leva em consideração o sistema sexual das
espécies. O sistema sexual das espécies não segue este padrão já que P. mexicana e P. potimirim,
ambos do mesmo grupo, possuem sistemas sexuais distintos, sendo P. mexicana hermafrodita
protândrico e P. potimirim gonocórico (Grilli, et al., 2014).
Entre os espécimes de P. brasiliana para o gene COI foram encontradas algumas
separações de grupos, entretanto sem um padrão geográfico de distribuição, no qual espécimes de
uma mesma população não aparecem reunidos formando um subgrupo. Este fato foi encontrado
também no trabalho de Vergamini et al. (2011), na qual um dos objetivos era estabelecer as
relações entre as populações de Macrobrachium amazonicum Heller, 1862, porém a análise
molecular com o gene COI não revelou detalhes das relações entre as populações de alguns grupos
formados. Resultado semelhante também foi encontrado em Macrobrachium olfersii Wiegmann,
1836 por Rossi & Mantelatto (2013), no qual não se encontrou um padrão geográfico nas
separações das populações. Em todos os três casos, o resultado mostra que as populações não se
encontram isoladas geneticamente, ocorrendo fluxo gênico entre elas. Uma espécie irá se dispersar
geograficamente até encontrar uma barreira, que pode ser um acidente geográfico histórico, como
por exemplo, cadeias de montanhas, desertos e oceanos (Slatkin, 1987). Um exemplo de barreira
geográfica são as correntes oceânicas, uma vez que é conhecida a influência na separação genética
entre populações de camarões marinhos situadas ao norte da região da ressurgência de Cabo Frio e
as situadas ao sul (Maggioni et al., 2003). Porém, as correntes oceânicas também são, em alguns
casos, explicações para a ocorrência de fluxo gênico, como no caso da espécie Macrobrachium
Prado, B. M. (2014) Discussão
35
olfersii do trabalho de Rossi & Mantelatto (2013) e, pode ser também uma explicação para este
trabalho em relação às populações de P. brasiliana. Apesar dos camarões serem de água doce, eles
necessitam de água salobra para o desenvolvimento de suas larvas em ambos os casos, para P.
brasiliana (Molina, 1987) e M. olfersii (Hedgpeth, 1949; Bowles et al., 2000), momento em que
as correntes oceânicas agem permitindo o fluxo gênico.
Um exemplo de barreira geográfica que pode ter influenciado na especiação dentro do
gênero Potimirim foi o fechamento do canal do Panamá (Torati, 2009). P. glabra envolvia P.
brasiliana e P. sp 2, recentemente é que foram separadas em três espécies pelo trabalho de Torati
& Mantelatto (2012). Esta especiação pode ter iniciado com o fechamento do canal do Panamá, na
qual provavelmente ocorreu a separação de populações de P. glabra entre o Atlântico e o Pacífico
(Torati, 2009). Após esta separação das populações, pode ter ocorrido um isolamento reprodutivo,
que levou à especiação: P. glabra, encontrada na parte pacífica da América Central e Norte; e P.
brasiliana encontrada na parte atlântica. Já o aparecimento da nova espécie, P. sp 2, deve ser
devido a um evento mais recente (Torati, 2009), no qual levou a separação de populações de P.
brasiliana entre a América do Sul e América do Norte e Central. Este trabalho corrobora com esta
explicação biogeográfica, pois para ambos os genes, 28S e COI, encontra-se uma relação mais
próxima entre P. brasiliana e P. sp 2. Outro fato que pode ser relação com o fechamento do canal
do Panamá e a separação entre populações de P. potimirim do Brasil e do Panamá, porém
necessita-se de estudos mais detalhados da espécie para se levantar qualquer hipótese.
A separação na população de P. brasiliana de grupos sem um padrão geográfico pode ser
explicada também pelo marcador genético não ser sensível para as relações entre estas populações.
Atualmente alguns trabalhos estão usando microssatélites como marcadores moleculares. Estes
microssatélites, também chamado de sequências simples repetidas ou sequências curtas repetidas
em tandem, sofrem altas taxas de mutação, apresentando um índice de mutação de 10-6
a 10-2
por
geração (Schlötterer, 2000), o que os torna mais variáveis que genes mitocondriais. O trabalho de
Maggioni et al. (2003) utilizou microssatélites para realizar um levantamento sobre a variabilidade
genética e a estrutura populacional de Litopenaeus schmitti Burkenroad, 1936 na costa brasileira.
O resultado encontrado foi uma diferenciação entre as populações de L. schmitti do norte e sul do
país, que não tem relação com alguma barreira já conhecida no local onde está separação ocorre,
região próxima a Santos (SP). Algumas explicações para esta diferenciação foram especuladas:
uma ressurgência encontrada próxima a área, representando uma barreira, ou que esta separação
Prado, B. M. (2014) Discussão
36
tenha sido resultado de alguma barreira do passado, que impediu o fluxo gênico na época. Da
mesma forma que o trabalho de Maggioni et al. (2003) utilizou microssatélites, se desenvolvermos
microssatélites para Potimirim, talvez tenhamos uma visão mais detalhada da distribuição e
separação populacional de P. brasiliana, e de todo o gênero.
Conclusão
Prado, B. M. (2014) Conclusão
38
A filogenia do 28S não revelou as relações evolutivas entre as populações de P. brasiliana,
mostrando a existência de um grupo de P. potimirim inserido dentro de um grupo formado por P.
brasiliana e P. sp 2. Já as relações reveladas com base no gene COI suportam o monofiletismo da
espécie Potimirim brasiliana, uma vez que esta espécie apresentou uma separação entre seu clado
e as demais espécies presentes no cladograma. Entre os espécimes de P. brasiliana foram
encontradas algumas separações de grupos, entretanto sem um padrão geográfico de distribuição,
o que mostra que as populações não se encontram isoladas geneticamente, ao menos com a
evidência proporcionada por este marcador.
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