ANÁLISE QUÍMICA DE ALIMENTOS

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ANÁLISE QUÍMICA

DE ALIMENTOS

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Nutrientes

Toxinas de origem natural

Aditivos

Contaminantes

(de natureza química, biológica ou física)

Alimentos - Composição

Os alimentos são uma mistura de substâncias químicas, que se podem dividir em 4 categorias principais:

Perigos Químicos

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Alimentos - Nutrientes

Proteínas

(péptidos e aminoácidos)

Açúcares

Gorduras

MACRONUTRIENTES

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Alimentos - Nutrientes

Água

Vitaminas

Sais minerais

Ácidos orgânicos

Fibra

Substâncias sápidas, aromáticas, texturais, etc.

Enzimas

Substâncias antioxidantes

Corantes de origem natural

Substâncias biologicamente activas

Aditivos

OUTROS CONSTITUINTES COM VALOR ALIMENTAR

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Food Hazards

Alimentos – Constituintes não nutritivos

Perigos Químicos

Aditivos Toxinas Naturais

Endógenas

Produzidas pelas plantas

Exógenas

Micotoxinas

Ficotoxinas

Toxinas bacterianas

Contaminantes

Ambientais

Resíduos agroquímicos

Resultantes do processamento

Migrantes de material de embalagem

Auxiliares de fabrico

Alergénios

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“NUTRICIONAL” “SEGURANÇA”

“TÉCNICO”“SENTIDOS”

Propriedades capazes de prejudicar o bem-estar ou causar

doença

Características técnicas

Grau de conformidade com os requisitos previamente

estabelecidos

QUALIDADE

ALIMENTAR

Características organolépticas

Grau de Satisfação

Composição em nutrientes

Valor energético

Adequação à pessoa

A QUALIDADE ALIMENTAR SOB DIFERENTES PONTOS DE VISTA

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Análise de Alimentos

Avaliação nutricional

Avaliação da segurança

Avaliação das operações de processamento

Avaliação da Autenticidade

Avaliação de características

sensoriais

OBJECTIVOS

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Análise Química

Análise Microbiológica

Análise Sensorial

Análise Biológica

Análise de parâmetros físicos e físico-químicos

(cor, textura, dureza, viscosidade, etc.)

TIPO DE ANÁLISES

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Alimentos não processados

Alimentos processados

Alimentos semi-processados

Matérias-primas

Ingredientes

Materiais de embalagem

MATERIAIS ANALISADOS

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Métodos Gerais de Análise

Cinzas

Humidade

Proteína

Gordura

Açúcares

Fibra bruta

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Métodos Gerais de Análise - Proteína

Método de Kjeldhal

Método do Biureto

Método de Lowry

Espectrofotometria de UV

Espectrofotometria de IV

PROTEÍNA TOTAL

dependentes da composição em AA

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Método de Kjeldahl

Baseia-se na determinação do teor total de azoto e na sua conversão em proteína assumindo que todo o azoto é proveniente proteína e usando um factor de conversão baseado no teor de azoto nas proteínas maioritárias em

cada tipo de alimento

A determinação do teor de azoto é feita após degradação oxidativa de

toda a matéria orgânica, na presença de sulfato de potássio (ou sulfato de sódio anidro) para aumentar o ponto de ebulição, e

de um catalisador metálico

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Método de Kjeldahl

CHNO + H2SO4 CO2 + H2SO4 + SO2 + H2O + (NH4)2SO4

H2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 H2O

(NH4)2SO4 + 2 NaOH

1. Digestão

2. Neutralização e destilação

Amostra

Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O

3a. Titulação final (com Ác. Sulfúrico)

3b. Titulação final (com Ác. Bórico)

H[(BOH)4] + NH3 NH4[(BOH)4]

2 NH4[(BOH)4] + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2 H[(BOH)4]

H2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 H2O

H2SO4 + 2 NH3 (NH4)2SO4

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Método indirecto que se baseia na decomposição da matéria

orgânica por aquecimento na presença de H2SO4 conc. e

na determinação do amoníaco formado após alcalinização

Método de Kjeldahl

Princípio

• Apropriado para uma larga gama de matrizes, incluindo produtos

de difícil solubilização (com excepção dos métodos de NIR, todos

os outros métodos exigem a solubilização da amostra)

• Os resultados são independentes da composição em AA das

proteínas

• Grande precisão nos resultados obtidos

• É um método oficial aprovado por muitas organizações

internacionais

Vantagens

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Método de Kjeldahl

• Interferência de AA livres e de outros compostos azotados

proteicos

• Implica o uso de catalizadores tóxicos (cobre, titânio,

selénio ou mercúrio)

• A digestão de alguns produtos é difícil devido ao excesso

de espuma formada

• Apresenta baixa sensibilidade

• Demorado

• O resultado final implica a escolha de um factor de

conversão adequado (6,25 em média; leite: 6,38)

Desvantagens

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As proteínas são capazes de se ligar em meio alcalino ao catião Cu2+ com formação de um complexo violeta estável que apresenta máximos de absorção a 310 nm e na zona

dos 540-560 nm

Método do Biureto

Princípio

• Os AA livres e outros compostos azotados não são contabilizados

• Os resultados são independentes da composição em AA das proteínas

• É fácil de executar

Vantagens

• Dá maus resultados em produtos ricos em amido e emgordura

• No caso de presença de proteínas insolúveis (colagénio, p.ex.), implica um complexo processo prévio de oxidação comH2O2, seguido de secagem e solubilização a quente com SDS

• É demorado (30-40 minutos)

Desvantagens

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Baseia-se na redução do reagente de Folin-Ciocalteau (mistura de ác. fosfotúngstico e ác. fosofmolíbdico) por acção dos resíduos de tirosina, triptofano e, em menor grau, de cisteína e histidina, com formação de uma coloração azul característica com máximo de absorção a 745-750

nm. O desenvolvimento da cor é altamente dependente do pH (pH entre 10,0 e 10,5)

Método de Lowry

Princípio

• Grande sensibilidade (0,005-0,1 mg)

• Fácil de executarVantagens

• Moderada dependência da composição em AA

• Interferência de um elevado número de compostos (pode serdiminuída pelo recurso a uma prévia ppção com TCA)

• Instabilidade do reagente de Folin a pH alcalino

• Demorado (mínimo de 15 minutos) e com necessidade de fixaçãorigorosa do tempo de reacção

Desvantagens

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Métodos Gerais de Análise - Gordura

Inclui normalmente a gordura propriamente dita (triacilgliceróis)

bem como todas as outras fracções apolares, nomeadamente

• Fosfolípidos e esfingolípidos

• Ceras

• Esteróis

• Terpenos

• Vitaminas lipossolúveis

passíveis de extracção por solventes apolares como o éter etílico

ou o éter de petróleo

GORDURA TOTAL

1%

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Métodos Gerais de Análise - Gordura

Extracção por Soxhlet

Extracção líquido(sólido)/líquido em ampola de decantação

• Método de Schmid, Bondzynski e Ratzlaff (digestão com HCl)

• Método de Rose-Gottlieb (digestão com amónia)

Separação por densidade

• Método de Gerber/Van Gulik (digestão com H2 SO4)

GORDURA TOTAL

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Métodos Gerais de Análise - Açúcares

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Métodos Físicos

Métodos Refractométricos

Métodos Polarimétricos

Métodos Densimétricos (hidrométricos)

São métodos não destrutivos

Têm aplicação limitada a algumas matrizes específicas

É necessário muito rigor com a temperatura

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Refractometria

nD20 = nD

T + 0,00045 (T - 20oC)

nD = [V ar] / [ V líquido ] temperatura

composição

concentração

pureza

Refractómetros: calibrados em índice de refracção ou

directamente numa escala de concentração de açúcares

º Brix = % sacarose m/m

Correcçãotemperatura

(linha D do sódio, a 589 nm)

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Polarimetria

Mede a extensão da interacção da substância com o plano de polarização daluz.

Centro quiral - dependendo da orientação dos 4 substituintes.

O nº de graus e a direcção da rotação são a medição observada, devendo sercorrigida para o comprimento da célula e concentração da solução:

[a]lit = [(a)obs] / (l x c)

a = rotação (graus) (específica ou observada)l = comprimento da célula (dm)c = concentração (g/ml)

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Hidrometria

- Equivalente a medir densidade, mede a gravidade específica da solução queestá relacionada com o teor em hidratos de carbono.

- Menor rigor que os métodos anteriores e só para soluções

temperatura

tensão superficial

filmes superficiais

Depende: tabelas de conversão

especificar o líquido

agitação

Densímetros:

- % sacarose (ºBrix)- ºBaumé (Bé) incorrecto

1,064

correcto1,070

hidrómetro

curva que a solução faz

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Métodos Químicos

MÉTODOS QUÍMICOS

CONVENCIONAIS

baseados na capacidade redutora dos açúcares

MÉTODOS

COLORIMÉTRICOS

Munson-Walker

Luff-Schoorl

Lane e Eynon

Nelson-Somogyi

Fenol-sulfúrico

Ácido 3,5-dinitrosalissílico

Antrona

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Capacidade redutora dos Açúcares

Açúcares ≠ capacidade redutora estruturatemperaturapHtempointerferentes

Hemiacetal ácido

Cu2+ Cu+ redução

oxidação

livre

glucosesacarose

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Capacidade redutora dos Açúcares


Sacarose

Lactose

Maltose

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Fundamento químico:

Não só para aldeídos...

a frutose origina, por tautomerismo ceto-enólico, glucose e manose, açúcares redutores

D-frutose enodiol

D-glucose

D-manose

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Solução de Fehling: solução alcalina de sal de cobre

2 soluções:

1. CuSO4

2. NaOH + tartarato de Na e K

tartarato cúprico

Métodos baseados na capacidade redutora dos Açúcares

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Tabelas deconversão

hidrólise

∆

neutralizaçãodefecação

Um volume rigorosamente medido de solução de Fehling (em excesso) éaquecido em condições estandardizadas com um volume rigoroso de amostra(contendo açúcares redutores). O precipitado formado de Cu2O é filtrado epesado (gravimetria). A massa de açúcares correspondente à massa deprecipitado é obtida em Tabelas apropriadas.

Para determinação dos hidratos de carbono totais é necessário hidrolisarpreviamente e neutralizar.

Método de Munson-Walker

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Método de Luff-Schoorl

2 Cu2+ + 4 I- ------> 2 CuI + I2

I2 + 2 S2O32- ----------> 2 I- + S4O6

2-

Um volume rigorosamente medido de solução de Fehling (em excesso)é aquecido em condições estandardizadas com um volume rigoroso deamostra (contendo açúcares redutores). O excesso de Cu2+ (Cu2+ nãoconsumido) reage com KI, adicionado em excesso, libertando iodo. Oiodo é titulado com solução de tiossulfato (iodometria). A massa deaçúcares correspondente ao volume de titulante usado é obtida emTabelas apropriadas.

R-CO + Cu2+ + 4OH- ----------------------------> RCOOH + Cu2Opp + H20

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Métodos Colorimétricos

Os glúcidos redutores aquecidos em meio alcalino reduzem o ião cobre. O Cu+

formado reduz o reagente arsenomolíbdico a óxido de molibdénio, de

coloração azul, cuja intensidade de cor é proporcional à quantidade de

açúcares redutores existentes na amostra. O teor de açúcares redutores é

calculado por espectrofotometria, utilizando-se uma curva padrão construída a

partir de uma solução de glucose.

Nelson-Somogyi

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Ácido 3,5-dinitrosalisílico

Compostos de cor castanho-avermelhada, medidos a 540 nm

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Método da Antrona

Pela acção hidrolítica e desidratante do ácido sulfúrico concentrado as

ligações glicosídicas são hidrolisadas e os açúcares libertados são

desidratados a furfural ou hidroximetilfurfural. Essas substâncias condensam

com a antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno) dando um produto de coloração

azul-petróleo. Quantificação a 620nm, utilizando uma curva padrão de frutose.

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Métodos por IV

IV Próximo (NIR) – 0,75 a 2,5 µm

IV Médio (MIR) – 2,5 a 25 µm Absorvência

Reflectância

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IV Médio

O teor proteico pode ser medido pela intensidade da banda de absorção a 1548 cm-1 (6,45 µm), que é

característica da ligação peptídica

O método é usado principalmente em leite

Permite a determinação simultânea de gordura (1745 cm-1) e de lactose (1042 cm-1)

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IV Próximo

O teor proteico pode ser medido pela intensidade de

um conjunto de bandas de absorção definidas

estatisticamente a partir da análise de um grande

número de produtos similares ao produto em análise,

cujo teor proteico foi determinado previamente por

um outro método

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Vantagens dos métodos de IV

Rápidos (100 amostras/hora)

Não destrutivos

Fácil preparação da amostra

Permitem a detecção simultânea de outros componentes (Principalmente o NIR)

Permitem a análise de produtos sólidos (NIR)

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Desvantagens dos métodos de IV

Forte interferência da água (MIR)

Influência do tamanho das gotículas em que se encontram as proteínas

Processos de calibração complexos

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Análise de Macronutrientes

ProteínasMétodos Electroforéticos

Métodos Cromatográficos

Métodos Imunológicos

AminoácidosMétodos Cromatográficos

TLC – com revelação selectiva

HPLC – após derivatização de forma a tornar os compostos fluorescentes ou com absorvência no UV-VIS

GC – após derivatização de forma a tornar os compostos voláteis

Componentes das gorduras Métodos Cromatográficos

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Análise de Macronutrientes

Açúcares Métodos Enzimáticos

Métodos Cromatográficos

HPLC – com detector IR, ELSD (Evaporative Light Scattering Detector), PAD (PulsedAmperometric Detector), etc.

HPLC – após derivatização de forma a tornar os compostos fluorescentes ou com absorvência no UV-VIS

GC – após derivatização de forma a tornar os compostos voláteis

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Análise de Proteínas Específicas

HPLC

Cromatografia em Fase Reversa (C18)

Cromatografia de Crivagem Molecular

Cromatografia de Troca Iónica

A detecção das proteínas é geralmente feita por detector de UV a 210 ou 280 nm, estando dependente da composição das proteínas em AA

AA que absorvem a 210 nm

Aromáticos; Histidina; Cisteína; Metionina

AA que absorvem a 280 nm

Aromáticos: Fenilalanina, Tirosina e Triptofano

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Cromatografia em fase reversa

Usam-se colunas do tipo C18 ou C2

A separação é baseada na afinidade da proteína para a fase estacionária, nomeadamente

das porções mais hidrofóbicas (apolares) das moléculas

A eluição é feita geralmente a temperaturas elevadas (40-70 ºC)

A detecção dos compostos é feita geralmente por detectores de UV a 210 nm ou 280 nm

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Cromatografia em fase reversa

Vantagens

Grande poder de resolução

Permite o uso de eluentes com baixa força iónica

Desvantagens

Risco de desnaturação proteica, com a consequente perda da actividade biológica

Uso de solventes mais tóxicos

O processo de separação é de certa forma empírico

Dificuldade na obtenção de resultados reprodutíveis

Presença de muitos interferentes

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Análise de Proteínas Específicas

HPLC - RP

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Cromatografia de crivagem molecular

A separação é baseada no tamanho das proteínas

O material de enchimento tipicamente usado nas colunas consiste em sílica quimicamente modificada

para evitar fenómenos de atracção por polaridade

As moléculas das proteínas com menor dimensão, são capazes de entrar nos poros da fase

estacionária, apresentando maior tempo de retenção

Inversamente, as proteínas com maior dimensão não conseguem penetrar nos referidos poros, pelo

que são eluídas mais rapidamente.

As colunas usadas apresentam especificidade para determinadas massas moleculares


A calibração é feita com proteínas puras com massa molecular conhecida

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Cromatografia de crivagem molecular

Vantagens

Não há desnaturação proteica

Fácil execução

Desvantagens

Picos pouco definidos (baixa resolução)

Interferência devido a interacções hidrofóbicas ou electrostáticas

Má separação (devido a comportamento irregular) de proteínas não globulares

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Cromatografia de troca-iónica

É o processo cromatográfico menos usado

A separação é baseada na carga das proteínas, a qual varia em função do pH do meio em que a

proteína está solubilizada.

Podem usar-se colunas de troca catiónica ou de troca aniónica

No caso das colunas de troca catiónica, usam-se eluentes ácidos (a pH inferior ao PI , as proteínas

estão carregadas positivamente)

No caso das colunas de troca aniónica, usam-se eluentes básicos (a pH superior ao PI , as proteínas

estão carregadas negativamente)

A selecção da coluna mais indicada é difícil, pois é preciso atender à sua estabilidade perante

condições drásticas de pH e a escolha do tamanho dos poros do enchimento usado está dependente

da massa molecular das proteínas a separar


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Cromatografia de troca-iónica

Vantagens

Limitada desnaturação proteica

Bom poder de resolução

Grande número de variáveis com influência na retenção e na selectividade

Desvantagens

Processo de optimização laborioso

Efeitos corrosivos dos tampões usados

Interferência de interacções hidrofóbicas com os enchimentos das colunas

Desnaturação das proteínas a valores extremos de pH

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Análise de Aminoácidos

Situações em que existem restrições dietéticas ou em que existe uma única fonte de aa na dieta

Fórmulas infantis e algumas fórmulas especiais para adultos

Alimentos fortificados em 1 ou mais aa, com objectivos de promover um efeito nutricional específico

Fortificação com metionina de fórmulas infantis à base de soja

Fortificação com glutamina ou arginina de fórmulas para doentes com necessidades metabólicas

específicas

Casos em que os níveis de certos aa não podem exceder determinados níveis

Alimentos para doentes com fenilcetonúria (limites fixados para a presença de fenilalanina)

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Situações em que pode haver problemas no processamento de alimentos

Formação de bases de Maillard, dependentes da presença de lisina

Requerimentos legais

Fórmulas infantis e fórmulas para determinado tipo de pacientes

Caracterização da genuidade de alguns alimentos

O perfil de aa é usado em estudos para determinação das castas usadas na elaboração de vinhos

Estudo de processos

A alteração na composição em aa é usada em estudos de processos fermentativos (vinhos,

queijos, iogurtes, enchidos, etc.)


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Análise de Aminoácidos Livres

1. Dissolução

Usa-se geralmente HCL 1,5 N / 15 min à temp. ambiente. Os problemas mais comuns são:

O triptofano liga-se às proteínas; A cisteína e a leucina exigem um meio mais ácido para se dissolverem

2. Precipitação de proteínas

Pode usar-se ác.perclórico, ác. sulfossalicílico ou acetonitrilo

3. Eliminação de matéria gorda

4. (Eliminação de interferentes por extracção em fase sólida)

5. Derivatização

6. Análise por HPLC ou GC

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Análise de Aminoácidos Totais

1. Hidrólise de proteínas e péptidos

Usa-se geralmente HCL 6 N / 24 h a 110 ºC. Os problemas mais comuns são:

A glutamina e a asparagina são convertidas nos ácidos correspondentes

O triptofano degrada-se, em especial na presença de açúcares

A cisteína e a cistina são oxidadas

A serina e a treonina têm tendência a degradar-se por oxidação

2. Acerto do pH

3. Eliminação de matéria gorda

4. (Eliminação de interferentes por extracção em fase sólida)

5. Derivatização

6. Análise por HPLC ou GC

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DERIVATIZAÇÃO ANALÍTICA

Processos de modificação química de compostos, usados

para a produção de derivados suficientemente voláteis e

dotados de propriedades adequadas para a sua análise

cromatográfica

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Em regra, têm como único objectivo melhorar a detectabilidade dos compostos a analisar

Essa melhoria é conseguida pela formação de derivados com características de

absorção de radiações de UV absorção de radiações na zona do visível (cor) fluorescência

Ao contrário do que se passa em GC, existe um número apreciável de processos de derivatização pós-coluna

REACÇÕES DE DERIVATIZAÇÃO USADAS EM HPLC

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Derivatização de Aminoácidos (HPLC)

Acilação com Ortoftaldialdeído (OPA)

Compostos Fluorescentes

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Acilação com Cloreto de Dansilo

Compostos Fluorescentes e com

com características de absorção no UV


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HPLC

HPLC Parameters:Binary Gradient HPLC with Fluorescence DetectorFlow rate: 1 ml/minλ Ex. 330 nm — λ Em. 450 nmInjection volume: 20 µl

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Acilação com Cloreto de Dabsilo

Compostos com cor amarelada

(436-460 nm)


+ HCl

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Alquilação com 1-flúoro-2,4,dinitrobenzeno (FDNB)

DINITROFENILAMINOÁCIDOS

Cor amarela

Estáveis em meio ácido


+ HF

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Reacção com a ninidrina

Composto com cor púrpura

(570 nm)


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Derivatização de Aminoácidos (GC)

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GC

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Análise de Açúcares

Açúcares - HPLC

1. Fructose 2. Glucose 3. Sacarose 4. Lactose 5. Maltose

coluna: fase normal - NH2, 4.6 x 250mmeluente: CH3CN / H2O, 75:25fluxo: 0,6mL/mintemperatura: 25°Cdetector: índice de refracção IR

coluna: troca aniónica, 7.8 x 300mmeluente: água destilada (pH10-14) fluxo: 0,6 mL/mintemperatura: 85ºCdetector: IR

1. Rafinose 2. Sacarose 3. Lactulose 4. Glucose 5. Galactose 6. Fructose 7. Ribitol 8. Manitol

9. SorbitolHPAEC – high performance anion

exchange chromatography

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Açúcares - HPLC

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Açúcares - GC

1. D-Arabinose2. anómeros D-Ribose 3. D-Xilose4. D-Manose5. D-Frutose6. α-D-Galactose7. α-D-Glucose8. β-D-Glucose

coluna:Heliflex® AT-1701, 30m x

0,25mm x 0,25µm

temperatura: 200°C

gás de arraste: hélio a 0,7mL/min

detector: FID a 250°C

TMS-derivados

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