Análisis de la organización

celular en el entorno de placas

amiloides en modelos de

enfermedad de Alzheimer

Trabajo de Fin de Máster

Miguel Martín Bórnez

Máster en Investigación Biomédica

Escuela internacional de Posgrado

Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS)

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

Análisis de la organización celular en el

entorno de placas amiloides en modelos de enfermedad de Alzheimer

Lugar de realización: Instituto de biomedicina de Sevilla

Tiempo de ejecución: febrero 2020 – junio 2020

Autor Tutores

Miguel Martin Bornez Alberto Pascual Bravo / Luis María Escudero Cuadrado

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

Agradecimientos

A mis tutores, Alberto Pascual Bravo y Luis María Escudero Cuadrado por

tutorizarme este trabajo. Gracias Alberto por acogerme un año más en el laboratorio, por

ayudarme y apoyarme a encontrar el perfil investigador que más me representa. A todas

las personas nuevas que han formado parte del laboratorio este año: Almudena, Lucia y

Elena. Gracias a Alberto, Alicia, Nieves y a Maribel, por incitarme a creer que el buen

ambiente de trabajo que se respira en el laboratorio es lo normal en ciencia (espero que

esto sea así), y por hacer que tenga ganas de ir al laboratorio todos los días.

Gracias Maribel por ayudarme en todo lo que he necesitado durante estos dos

años.

A mis 4 zapatos.

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

Índice

Agradecimientos ............................................................................................................... 3

1.- Resumen ...................................................................................................................... 5

2.- Antecedentes ............................................................................................................... 6

2.1 – Clínica y epidemiología de la EA ........................................................................ 6

2.2 – Tipos de EA y factores de riesgo ......................................................................... 7

2.3 – Neuropatología de la EA ...................................................................................... 9

2.3.3 – Hipótesis Vascular ...................................................................................... 11

2.4 – Activación glial .................................................................................................. 12

2.6 – Estudios de organización ................................................................................... 13

3.- El entorno de la placa de Aβ: neuritas y sinapsis ...................................................... 14

4.- Tipos celulares en el entorno de la placa amiloide.................................................... 15

4.1 – Astrocitos ........................................................................................................... 15

4.1.1 – Astrocitos en la EA ..................................................................................... 18

4.2 – Microglía ............................................................................................................ 20

4.2.1 – Microglía en la EA ...................................................................................... 21

5.- Aprendizaje automático y propuesta metodológica .................................................. 24

6.- Discusión ................................................................................................................... 25

6.1 – Perspectivas futuras ........................................................................................... 28

7.- Conclusiones ............................................................................................................. 28

8.- Bibliografía ............................................................................................................... 29

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1.- Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo que conforma la

principal causa de demencia con una prevalencia del 5,05% en Europa. Esta enfermedad se

caracteriza por la pérdida progresiva de las capacidades cognitivas. A nivel molecular, los

rasgos clásicos que dan entidad a esta enfermedad son la presencia de acúmulos extracelulares

del péptido β-amiloide (placas de Aβ) y de agregados intracelulares de proteína Tau (ovillos

neurofibrilares). La activación glial es otra de las marcas neuropatológicas que definen la EA,

y toma relevancia en el presente trabajo.

La irrupción de métodos computacionales de aprendizaje automático en biomedicina

han permitido grandes avances en el ámbito de la neuroimagen. El presente trabajo se enmarca

el contexto de la biomedicina computacional y la EA, proponiendo así el estudio de la

organización de la microglía en el parénquima cerebral de ratones WT y modelos de la EA.

Esto permitirá el diseño de una herramienta destinada a datar las placas amiloides en la corteza

de modelos murinos de la EA que tendrá una gran utilidad para estandarizar los experimentos

que involucren a las placas amiloides en la investigación de la EA.

La migración de la microglía a los alrededores de las placas, la activación de estas hacia

un fenotipo concreto, su proliferación, la desaparición de las sinapsis o la muerte neuronal en

el entorno de dichas placas, llevan a considerar la propuesta metodológica. Así se realiza una

revisión bibliográfica de las principales señas de identidad de la enfermedad de Alzheimer, así

como los eventos y tipos celulares en el entorno de las placas amiloides.

Todo apunta a que la organización 3D de la microglía alrededor de la placa debería ser

el siguiente paso en el planteamiento expuesto, lo que permitiría interpretar patrones existentes

en la organización microglial, trasladando posteriormente el estudio tridimensional de este tipo

celular a la herramienta destinada a la predicción pseudo-temporal de las placas de Aβ en la

corteza de ratones murinos de la EA.

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2.- Antecedentes

En 1906, el neurólogo Alois Alzheimer expone, en el 37º congreso de psiquiatría del

suroeste alemán, una comunicación denominada ‘Acerca de una enfermedad peculiar del córtex

cerebral’. Desde entonces, quedan descritas las características de la primera paciente con la

enfermedad de Alzheimer (EA), pese a que no tomase suficiente relevancia en aquella década

(Weber, 1997). La paciente, August Deter, muere 4 años más tarde presentando un estado de

invalidez total. Entre otras características diagnósticas, August sufría alucinaciones, confusión,

se encontraba desorientada y experimentaba pérdidas de memoria y capacidad de

entendimiento.

Pocos años más tarde y tras el analizar la patología cerebral de la paciente, Alois

Alzheimer expone la existencia de depósitos proteicos extracelulares (placas seniles),

agregados proteicos intracelulares (ovillos neurofibrilares) y alteración aterosclerótica en el

tejido cerebral (Stelzmann et al., 1995; Yang et al., 2017).

El término EA queda definido años más tarde, en 1910 (Weber, 1997), y hace referencia

al desorden neurodegenerativo progresivo e irreversible, caracterizado por una pérdida

progresiva de memoria, de las capacidades cognitivas y de entendimiento, que llevan en última

instancia al abandono de las actividades diarias y la adopción de la dependencia total. Sin

embargo, en los últimos años, el término EA ha sido redefinido con el objetivo de que la

definición se sustente en las características neuropatológicas y no en las sintomáticas o clínicas

(Jack et al., 2018).

2.1 – Clínica y epidemiología de la EA

La EA se clasifica dentro de las demencias, término en el que se incluyen aquellas

enfermedades que cursan con alteraciones en el comportamiento, memoria y pensamiento.

Dentro de los distintos tipos de demencia, la EA es la que mayor incidencia tiene, puesto que

la padecen un 10% de la población mayor de 65 años (Comas Herrera et al., 2016; Kumar et

al., 2020). Mundialmente, 45 millones de personas aproximadamente padecen demencia, entre

las que el 70% se corresponden a la EA, aunque existen otras como la demencia frontotemporal

o la enfermedad de Parkinson (Plassman et al., 2007). Debido a que el envejecimiento de la

población mundial supone el principal factor de riesgo no genético de demencias como la EA

y la búsqueda de tratamiento no avanza de la manera deseada, se espera un aumento en el

número de afectados, pudiendo superar los 100 millones para 2050 (Comas Herrera et al., 2016;

Prince et al., 2013).

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Epidemiológicamente, la prevalencia de la EA en Europa es del 5,05 %, cifra que

aumenta con la edad y en mujeres (Niu et al., 2017). Los datos de incidencia se encuentran por

debajo del 1% si atendemos a la población menor de 65 años, porcentaje que asciende al 64%

en personas mayores de 90 (Prince et al., 2013). Todo ello, unido a que la EA se encuentra entre

las primeras causas de muerte (Naghavi et al., 2015) y principales problemas de salud en países

desarrollados (Hane, Robinson, et al., 2017), ponen de manifiesto la importancia de la búsqueda

de soluciones sanitarias para esta enfermedad .

Atendiendo a los aspectos clínicos, el paciente enfermo de EA se caracteriza

principalmente por una pérdida progresiva de memoria, problemas con el manejo de objetos

(apraxia), dificultad para recordar nombres (anomia), pérdida del habla (afasia) e incapacidad

para reconocer la información sensorial (agnosia). Su diagnóstico se basa en los síntomas

clínicos, debido a la falta de biomarcadores fiables y accesibles en la actualidad (Jack et al.,

2018).

2.2 – Tipos de EA y factores de riesgo

Según su etiología, la EA clasifica en dos tipos los cuales se diferencian, aparte de su

causa, en la edad de aparición y su incidencia. Es importante recalcar que pese tener ciertas

diferencias, la sintomatología y neuropatología es la misma.

Los pacientes de EA familiar poseen mutaciones en genes relacionados con el

procesamiento de la proteína precursora amiloide (APP). Concretamente, los genes usualmente

afectados en este tipo de EA son APP, PSEN1 y PSEN2, que codifican para APP, presenilina1

(PS1) y presenilina2 (PS2) respectivamente (Goate et al., 1991; Levy-Lahad et al., 1995;

Sherrington et al., 1995). Estas proteínas se encuentran implicadas en el origen de Aβ, puesto

que APP es la proteína a partir de la cual se genera, mediante la actuación de un complejo

proteico en el que se incluyen PS1 o PS2. La EA familiar representa alrededor del 4% de los

pacientes de EA y aparece antes de los 60 años, características que la diferencian de la EA

esporádica (Ringman et al., 2015). Fruto de la relación entre estas mutaciones y la EA familiar

surge la hipótesis de la cascada amiloide propuesta décadas atrás (J. A. Hardy & Higgins, 1992).

Esta hipótesis, resumida posteriormente en el presente trabajo, posiciona la deposición de Aβ

como evento principal e inductor de distintos procesos patológicos que finalizan en el desarrollo

de la demencia.

Con respecto a las mutaciones mencionadas anteriormente, el gen que se encuentra

afectado en más ocasiones es el gen que codifica para PS1, con un porcentaje de 70%, frente al

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10% de mutaciones en APP, tomando como referencia el total de pacientes de EA familiar

(Czech, Tremp, & Pradier, 2000). APP está localizado en el cromosoma 21, motivo por el cual

se encuentra afectado en los pacientes con Síndrome de Down (Wiseman et al., 2015). Por su

parte, el gen PSEN1 se localiza en el cromosoma 14 y en comparación con PSEN2, posee

muchas más mutaciones descritas, 185 frente a 14 respectivamente (Czech et al., 2000; Levy-

Lahad et al., 1995; Sherrington et al., 1995).

Por otro lado, se encuentra la EA esporádica, que representa la gran mayoría de casos

de pacientes de EA y que posee origen multifactorial. En este caso, la edad de aparición suele

ser 60 años o posterior. El factor de riesgo no modificable por excelencia para la EA esporádica

es la edad (Serrano-Pozo & Growdon, 2019), tal y como se muestra en los datos de prevalencia

e incidencia por edad (Comas Herrera et al., 2016; Prince et al., 2013).

Además, y pese a no tener una causa directa genética, hay factores de riesgo genéticos

que determinan la aparición de la enfermedad. En primer lugar, el gen que más impacto tiene

en la EA esporádica es el que codifica para apolipoproteína E (ApoE), para el cual existen

diversos alelos (ε2, ε3 y ε4) (Poirier et al., 1993). Esta proteína se encuentra implicada en el

transporte y metabolismo lipídico. Mientras que el alelo ApoE2 se relaciona con un efecto

protector para la EA esporádica (Corder et al., 1994), ser heterocigoto para el alelo ApoE4

aumenta el riesgo de padecer EA esporádica, riesgo que aumenta en gran medida para

homocigotos para ApoE4 (Serrano-Pozo & Growdon, 2019). Junto a ApoE4, se ha establecido

como factor de riesgo la existencia de SNPs en el gen CLU, que codifica para apolipoproteína

J (Robinson, Lee, & Hane, 2017). La identificación de estos alelos y los comentados

posteriormente, y su implicación como factores de riesgo en la EA ha sido posible gracias a los

estudios de asociación del genoma completo (‘Genome wide association studies’, GWAS) (J.

C. Lambert et al., 2013; Robinson et al., 2017).

En general, los alelos que hacen susceptibles a sus portadores de padecer la EA

esporádica pueden clasificarse en genes implicados en el metabolismo lipídico, en la

endocitosis o en la respuesta inmune, que toma más importancia en el contexto del presente

trabajo (Pimenova, Raj, & Goate, 2018). En el plano de la respuesta inmune, se han identificado

genes como CR1, CD33 o TREM2 (Robinson et al., 2017), entre los que destaca este último, un

receptor de membrana expresado por microglía en el SNC, y que supone un factor de riesgo

para la EA esporádica (Guerreiro et al., 2012; Yeh, Hansen, & Sheng, 2017).

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No solo la genética toma un papel fundamental en el desarrollo de la EA, también

existen factores ambientales que predispone su aparición. Sin duda alguna, la edad es el factor

de riesgo no modificable que contribuye a la aparición o desarrollo de la enfermedad de forma

más notable, pero también encontramos muchos otros factores modificables como la

hipertensión, padecer diabetes, hiperhomocisteinemia o ser fumador (Baumgart et al., 2015;

Serrano-Pozo & Growdon, 2019).

2.3 – Neuropatología de la EA

Las alteraciones en los cerebros con EA suelen ser divididas en alteraciones

macroscópicas y microscópicas.

Macroscópicamente, los principales rasgos que caracterizan a la enfermedad es la

pérdida del volumen cerebral acelerada, disminución del tamaño de ribete cortical (atrofia

cortical) y aumento del tamaño de los ventrículos (Dickerson et al., 2009).

Desde el punto de vista microscópico, los rasgos neuropatológicos pueden ser resumidos

en acumulación extracelular de Aβ en forma de placas amiloides y acumulación intracelular de

la proteína Tau en forma de ovillos neurofibrilares. Además, en cerebros de pacientes de EA

tiene lugar una respuesta glial que conlleva un proceso neuroinflamatorio, en paralelo a

degeneración neuronal en zonas cerebrales específicas (De Strooper & Karran, 2016; Long &

Holtzman, 2019; Scheltens et al., 2016), rasgos que se irán describiendo posteriormente.

El péptido Aβ es aislado por primera vez en 1984 y un año después, se describe como

componente principal de las placas amiloides (Glenner & Wong, 1984; Masters et al., 1985).

Aβ se genera tras la acción secuencial de β-secretasa y el complejo γ-secretasa sobre APP

(Haass, Kaether, Thinakaran, & Sisodia, 2012). Como ya se ha comentado, mutaciones en APP,

así como en componentes del complejo γ-secretasa han sido descritas en pacientes de EA

familiar (Goate et al., 1991; Wiseman et al., 2015). Todos estos hechos, llevan al origen de la

hipótesis de la cascada amiloide (J. A. Hardy & Higgins, 1992), que propone la oligomerización

de Aβ42 y su deposición en forma de placas como causa directa del desarrollo de la demencia.

Las acciones que tienen como resultado la acumulación de especies de Aβ en forma de

placas se pueden simplificar en dos procesos: la generación de Aβ y su eliminación a través de

distintas vías. El procesamiento de APP es un proceso fisiológico, sin embargo, en la EA dicho

procesamiento puede tomar una vía distinta, diferenciándose así el procesamiento de APP

amiloidogénico y no amiloidogénico (Fig. 1), dependiendo de si se produce Aβ o no

respectivamente (Hane, Lee, & Leonenko, 2017).

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La vía amiloidogénica del procesamiento de APP implica la acción secuencial de la β-

secretasa (BACE1) y la γ-secretasa. Por su parte, el procesamiento de APP sigue la vía no

amiloidogénica cuando actúan α-secretasa seguida de γ-secretasa. En ambas vías actúa la γ-

secretasa, un complejo proteico en cuyo sitio activo se encuentra PSEN1 o PSEN2. Además, la

correcta actividad catalítica del complejo precisa de nicastrina (Yu et al., 2000), APH-1 (Gu et

al., 2003) y PEN-2 (Steiner et al., 2002; Wolfe, 2019) . El péptido Aβ generado cuando APP es

procesado por la vía amiloidogénica puede estar formado por un número de aminoácidos

diferente (desde 37 a 43), siendo Aβ40 y Aβ42 los péptidos más comunes, entre ellos Aβ42

presenta mayor tendencia a la agregación (Haass et al., 2012).

Figura 1. Procesamiento de APP. A la izquierda, vía amiloidogénica: la actuación de β-secretasa libera

sAβPPβ y CTFβ sobre el que posteriormente actúa γ-secretasa para producir Aβ, extracelularmente, y

AICD. A la derecha, vía no amiloidogénica: la actuación de α-secretasa libera sAβPPα y CTFα sobre el

que posteriormente actúa γ-secretasa generando p3 y AICD.

Como se comentó anteriormente, la alteración del equilibrio entre la producción y la

eliminación de Aβ conllevará la acumulación de este en el parénquima (Hane, Lee, et al., 2017;

Tarasoff-Conway et al., 2015). Existen distintas vías mediante las que Aβ es eliminado. Puede

estar mediada por proteínas: endopeptidasas, metaloproteasas de la matriz (MMPs), o

catepsinas (Ries & Sastre, 2016; Tarasoff-Conway et al., 2015); o bien puede llevarse a cabo

una degradación o internalización, mediada de forma directa por microglía o astrocitos,

mediante procesos celulares de fagocitosis o endocitosis y receptores como Trem2, TLR o

RAGE (Ries & Sastre, 2016). Por último, Aβ puede abandonar el parénquima cerebral gracias

a astrocitos o transportadores para cruzar la BHE, como LRP1, macroglobulina α2 o LRP2

(cuando Aβ se une previamente a ApoJ/Clusterina) (Tarasoff-Conway et al., 2015). Cabe

destacar el papel del denominado sistema glinfático y de los líquidos cerebrales como otra de

las vías principales en la eliminación de Aβ del parénquima cerebral. Así, el Aβ presente en el

γ-secretasa

β-secretasa

α-secretasa

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líquido intersticial puede ser eliminado a través del líquido cefalorraquídeo (LCR) que fluye de

manera perivascular. El paso del líquido intersticial al LCR se encuentra mediado por

acuaporina 4 (AQ4), expresada por astrocitos (Tarasoff-Conway et al., 2015).

Otro de las señas de identidad en la neuropatología de la EA es la presencia de ovillos

neurofibrilares (‘neurofibrilar tangles’, NFT), considerada en la hipótesis descrita por Hardy

y Higgins (J. A. Hardy & Higgins, 1992). Los ovillos neurofibrilares son agregados

intraneuronales compuestos mayoritariamente por la proteína Tau hiperfosforilada y con

plegamiento anormal que, cuando la neurona muere, quedan agregados extracelularmente. Esta

marca histopatológica propia de la EA tiene una progresión espaciotemporal que correlaciona

con el declive cognitivo (Serrano-Pozo, Frosch, Masliah, & Hyman, 2011) y que ha permitido

desde hace décadas establecer los estadíos de Braak para la EA (H Braak & Braak, 1991; Braak

et al., 2006).

La proteína Tau es una proteína asociada a microtúbulos (localización axonal)

responsable de su estabilización, cuya correcta función contribuye a mantener la estabilidad del

citoesqueleto. Cuando Tau es fosforilado por distintas específicas, como GSK3b, pierde su

afinidad por el microtúbulo y permite el desensamblaje de estos. En la EA, Tau es fosforilada

de manera exagerada, lo que le proporciona capacidad agregante, organizándose en filamentos

helicoidales pareados (PHF) y filamentos rectos que se entrecruzan y unen a otros elementos

para formar los NFT, visibles con marcaje Tioflavina-S debido a su conformación en hojas β.

Cuando esta fosforilación ocurre, la proteína pasa a ocupar el soma neuronal, donde agrega para

formar los NFT (Serrano-Pozo et al., 2011).

2.3.3 – Hipótesis Vascular

Hasta la fecha, la investigación en la EA ha estado dirigida principalmente a la hipótesis

amiloide, sin embargo, cada vez son más los experimentos que sostienen el carácter

multifactorial de la EA (Jack et al., 2018; Love & Miners, 2016). Esto, unido a las críticas que

rodean la hipótesis clásica de la cascada amiloide (J. Hardy & Selkoe, 2002) provocan que se

hayan propuesto distintas aproximaciones con respecto a la etiología de la enfermedad (Karran

& De Strooper, 2016).

Dentro de estos nuevos factores causantes de enfermedad se encuentra la alteración del

sistema vascular. Muchos factores de riesgo modificables para la EA mantienen una relación

directa con el sistema vascular cerebral (Jack C de la Torre, 2004; Love & Miners, 2016).

Además, el sistema vascular cerebral es el primero en verse afectado durante la EA, lo que lo

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convierte en uno de los principales marcadores a tener en cuenta en el diagnóstico (Iturria-

Medina et al., 2016). Por otro lado, se ha descrito una disfunción neurovascular en la EA que

tiene un gran impacto en la regulación del flujo cerebral en la EA (Kisler et al., 2017).

Los factores de riesgo modificables o ambientales citados anteriormente hacen

referencia a obesidad, la hipertensión o padecer diabetes mellitus; o bien a hábitos como

consumir tabaco y llevar una vida sedentaria (Hane, Lee, et al., 2017; Karran & De Strooper,

2016), todos ellos con influencia en la vasculatura. Es por ello que gran parte de las acciones

que pueden llevarse a cabo para reducir el riesgo de desarrollar la EA estén relacionadas con la

mejora de los factores expuestos (Hane, Robinson, et al., 2017). Todo esto a llevado a establecer

la hipótesis vascular dentro de la patología de Alzheimer.

La hipótesis vascular está basada en el hecho de que los cerebros de pacientes de EA

tienen una red capilar reducida y desorganizada (J C de la Torre & Mussivand, 1993). En

modelos de EA y humanos, se ha descrito una reducción en la microvasculatura y número de

vasos e hipoperfusión en zonas adyacentes a las placas amiloides (Kawai, Kalaria, Harik, &

Perry, 1990; Meyer, Ulmann-Schuler, Staufenbiel, & Krucker, 2008; Sengillo, 2014), hecho

que puede guardar relación con la acumulación de marcadores angiogénicos e hipóxicos

alrededor de dichas placas (Rosales-Nieves et al., n.d.), así como una alteración en la estructura

de la BHE (Sweeney et al., 2018a). Además, entre otras marcas histopatológicas, en la EA

destaca la angiopatía amiloide cerebral o CAA ("cerebral amyloid angiopathy”), con depósitos

de Abeta sobre los vasos sanguíneos cerebrales, lo que puede provocar obstrucción de los

propios vasos sanguíneos (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018).

2.4 – Activación glial

En los últimos años, la respuesta glial en la enfermedad de Alzheimer ha sido objeto de

amplio estudio frente a otros campos dentro de esta enfermedad, constituyendo una de las

principales alteraciones microscópicas de la EA (Serrano-Pozo et al., 2011).

Dicha activación se encuentra comúnmente asociada a las placas amiloides, resaltando

el papel de Aβ en la respuesta glial (Lucin & Wyss-Coray, 2009; Serrano-Pozo et al., 2011).

Estos procesos de activación glial se conocen como astrogliosis o microgliosis, según haga

referencia a activación astroglial o microglial (Long & Holtzman, 2019), los dos principales

tipos celulares gliales que actúan como mediadores de la neuroinflamación (Hane et al., 2017;

Serrano-Pozo et al., 2011).

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Entre los daños, patógenos o en definitiva, patrones de daño molecular que

desencadenan el cambio de fenotipo glial, se encuentra Aβ (Lucin & Wyss-Coray, 2009).

Cuando dicha activación se lleva a cabo, ambos tipos celulares producen factores inflamatorios

(Zhang & Jiang, 2015), con el fin de eliminar el causante de la respuesta inmune y recuperar el

estado fisiológico. Sin embargo, cuando grandes cantidades de Aβ empiezan a depositarse en

el parénquima, y el balance generación-eliminación es alterado, se produce el fenómeno

conocido como neuroinflamación, un proceso que se retroalimenta con la generación de estrés

oxidativo, muerte neuronal y daño tisular.

Una de las principales evidencias de la implicación de la activación glial en la EA es la

identificación mediante GWAS de polimorfismos en genes relacionados con la inmunidad

innata y la microglía, que se relacionan con la EA esporádica, como CR1, CLU, TREM2, CD33

o PICALM (Guerreiro et al., 2012; J.-C. Lambert et al., 2009; Pimenova et al., 2018). La

heterogeneidad de fenotipos “activos” de células gliales descritos y la complejidad de la

activación dificulta esclarecer el papel de dicha activación la enfermedad, pese a que juega un

claro papel en el desarrollo de la EA (Hansen, Hanson, & Sheng, 2018; Zhao et al., 2018)

2.6 – Estudios de organización

Las herramientas basadas en análisis de imagen que permiten cuantificar la organización

del tejido ha dado resultados cuando han sido aplicados a enfermedades con causas

heterogeneas, como las enfermedades neuromusculares (Sánchez-Gutiérrez et al., 2016;

Sánchez-Gutiérrez et al., 2017). Esto, combinado con la irrupción de metodos computacionales

de aprendizaje automático en biomedicina (Wainberg et al., 2018) han incitado a la realización

del proyecto.

En el presente trabajo se lleva a cabo una breve revisión sobre algunos de los tipos

celulares dispuestos en la periferia de las placas amiloides que contribuyen, en mayor o menor

medida al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Dicha revisión bibliográfica servirá como

contexto para exponer la propuesta metodológica dirigida a datar las placas amiloides en la

corteza de modelos de la EA a partir del análisis de la organización que adoptan los distintos

tipos celulares seleccionados alrededor de dichas placas.

Este punto de vista se encuentra poco estudiado en enfermedades neurodegenerativas,

por lo que el desarrollo de una herramienta capaz de datar placas amiloides sería de utilidad

estandarizar experimentos que involucren placas amiloides en la investigación de la EA.

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3.- El entorno de la placa de Aβ: neuritas y sinapsis

La corteza cerebral en la EA se encuentra hipoperfundida, lo cual es considerado como

una característica que se desarrolla en estadios tempranos en la EA (Love & Miners, 2016;

Thomas, Miners, & Love, 2015). Por su parte, los niveles del factor de crecimiento endotelial

(VEGF) se encuentran incrementados en análisis postmorten de dichos pacientes (Thomas et

al., 2015). En respuesta a hipoxia, VEGF incrementa su expresión, proceso mediado por

factores inducibles por hipoxia (HIFs) al unirse al elemento de respuesta a hipoxia en el gen de

VEGF (Carmeliet, 2000). En concreto, las placas de Aß acumulan marcadores de

hipoxia/angiogénicos (Love & Miners, 2016; March-Diaz et al., 2019; Rosales-Nieves et al.,

n.d.; Thomas et al., 2015), y por lo tanto, la expresión de VEGF también se encuentra

incrementada en el entorno de la placa amiloide (Rosales-Nieves et al., n.d.; S.-P. Yang et al.,

2004).

Las placas amiloides se encuentran rodeadas de un halo de oligómeros de Aβ (Tsai,

Grutzendler, Duff, & Gan, 2004), afectando negativamente a las sinapsis cercanas a dichas

placas. Estudios centrados en los alrededores de las placas amiloides describen una pérdida de

sinapsis local, así como de espinas dendríticas (Spires-Jones et al., 2007) en sinapsis adyacentes

a dichas placas en modelos de la EA (Koffie et al., 2009), causado por la Aβ oligomérico o

fibrillas de Aβ (Tsai et al., 2004). En dicho estudio (Koffie et al., 2009), la densidad sináptica

llega a ser casi nula en los depósitos de Aβ. Dado que las placas ocupan un espacio, tiene sentido

asumir que haya una pérdida de sinapsis en dicho entorno, lo cual es confirmado con estudios

en microscopía electrónica (Koffie et al., 2009).

Por otro lado, muchas de las placas amiloides que se pueden encontrar en cerebros de

pacientes con la EA, son placas clasificadas como neuríticas, las cuales tienen asociadas

neuritas distróficas positivas para APP o distintas especies de la proteína TAU, entre otras (

Thal, Griffin, & Braak, 2008). Las neuritas distróficas son engrosamientos irregulares de

naturaleza neural producidas por alteraciones en el citoesqueleto. En la EA, son abundante en

el hipocampo, CA1 y en la corteza entorrinal. La aparición temprana de esta patología neurítica

en las zonas próximas a las placas de Abeta es una característica de la EA y guarda relación con

la disfunción sináptica y neuronal que aparece en el transcurso de la enfermedad (Sanchez-Varo

et al., 2012).

La lesión “negativa” más notable en la EA es la pérdida neuronal, causa principal de

la atrofia cortical existente en cerebros de pacientes. Se encuentran descritas pérdidas de entre

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un 15-35% en el número de sinapsis por neurona cortical en biopsias de la cerebros de la EA

(Selkoe, 2002). Como se comentó anteriormente, la distribución espacio-temporal de los NFT

coincide con el declive cognitivo. Sin embargo, la pérdida neuronal correlaciona mejor con el

declive cognitivo, debido a que conforme avanza la enfermedad, en una misma zona se

encuentra más muerte neuronal que NFT (Gómez-Isla et al., 1997; Serrano-Pozo et al., 2011;

Terry et al., 1991). Este hecho impulsa la teoría de que existen dos tipos de muerte neuronal en

la EA, uno que sufren las neuronas que contienen NFT y otro que afecta a las neuronas que no

poseen NFT (Serrano-Pozo et al., 2011). Los mecanismos de muerte neuronal son mediados

por Tau y por Aβ (Review en Forner, Baglietto-Vargas, Martini, Trujillo-Estrada, & LaFerla,

2017; Mucke & Selkoe, 2012; Dietmar Rudolf Thal et al., 2008), estudios in vitro muestran la

neurotoxicidad de dímeros de Aβ aislados de cerebros de pacientes con la EA (Shankar et al.,

2008).

Además de la pérdida neuronal, la pérdida de sinapsis es otro factor que contribuye a

la atrofia cortical del cerebro de la EA, y por tanto al declive cognitivo (Hane, Lee, et al., 2017;

Selkoe, 2002). Este hecho se demostró con estudios de inmunohistoquímica con anticuerpos

contra proteínas pre y post sinápticas y con estudios de microscopía electrónica (Serrano-Pozo

et al., 2011). El patrón espacio-temporal de la pérdida de sinapsis coincide con el de la pérdida

de neuronas. Sin embargo, a día de hoy, la pérdida de densidad sináptica se considera el

parámetro que mejor correlaciona con el declive cognitivo en la EA (Selkoe, 2002). Existen

mecanismos compensatorios descritos con respecto a la pérdida de sinapsis en estadios

tempranos de la EA, concretamente en sinapsis colinérgicas y glutamatérgicas, las cuales

degeneran en estadios tardíos de la EA (Schliebs & Arendt, 2011).

4.- Tipos celulares en el entorno de la placa amiloide

Las placas amiloides tienden a ocupar el parénquima cerebral conforme la enfermedad

avanza (Thal et al., 2002). Alrededor de estas placas, se disponen determinados tipos celulares

que forman parte del tejido cerebral. En el presente trabajo se lleva a cabo una breve revisión

sobre algunos de los tipos celulares dispuestos en la periferia de las placas amiloides que

contribuyen, en mayor o menor medida, al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.

4.1 – Astrocitos

Los astrocitos, denominados en su conjunto como astroglía, es el tipo celular glial más

presente en el SNC, y supera en cinco veces la cantidad de neuronas existentes (Cai, Wan, &

Liu, 2017; Colombo & Farina, 2016). Los astrocitos comparten origen con otras células del

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

SNC, como las neuronas o los oligodendrocitos. Todos ellos provienen del neuroectodermo, a

diferencia de la microglía (Zhang & Jiang, 2015).

Estas células gliales, se han subdividido en astrocitos protoplasmáticos y fibrosos desde

finales del siglo pasado, atendiendo a su morfología y localización anatómica (Cai et al., 2017;

Perez-Nievas & Serrano-Pozo, 2018; Sofroniew & Vinters, 2010). El primer subtipo carece de

reactividad para la proteína GFAP, la cual forma parte de los filamentos intermedios del

citoesqueleto. Por otra parte, los astrocitos fibrosos, son astrocitos con inmunoreactividad para

GFAP que se encuentran en la materia blanca, a lo largo de los axones (Molofsky et al., 2012;

Perez-Nievas & Serrano-Pozo, 2018). La proteína GFAP es la que se utiliza como marcador de

forma general en la identificación de astrocitos, aunque también existen otros marcadores

(Carter et al., 2019).

Con respecto a su morfología, de manera general se caracterizan por poseer una forma

estrellada (de donde proviene su nombre) con prolongaciones que interaccionan con otros

astrocitos, microglía, vasos sanguíneos y neuronas. Clásicamente, los astrocitos

protoplasmáticos poseen prolongaciones más cortas, adoptando una forma globoide, en

comparación con los fibrosos, que poseen ramificaciones más largas que adoptan formas

parecidas a fibras. Los astrocitos protoplasmáticos han sido los que más interés han tenido en

investigación de enfermedades neurodegenerativas (Perez-Nievas & Serrano-Pozo, 2018;

Sofroniew & Vinters, 2010). Sin embargo, y pese a que dicha clasificación sigue siendo válida

y útil (Sofroniew & Vinters, 2010), la heterogeneidad funcional, morfológica y molecular de

los astrocitos es mucho más amplia.

Fisiológicamente, los astrocitos cumplen diversas funciones. En primer lugar, desde su

descubrimiento, se conoce que actúan como armazón del SNC, cumpliendo una función

estructural, así como de soporte trófico para las neuronas (Halassa & Haydon, 2010; Minter,

Taylor, & Crack, 2016). Junto a éstas, los astrocitos participan en el ciclo Glutamina-Glutamato,

mediante el cual se mantiene la síntesis de neurotransmisores glutamato y GABA (a partir de

glutamato) (Verkhratsky, Nedergaard, & Hertz, 2014). El ciclo Glutamina-Glutamato permite

a las neuronas obtener glutamina para sintetizar glutamato gracias a los astrocitos, que sí

cuentan con la enzima piruvato carboxilasa necesaria para obtener glutamato a partir de glucosa,

a diferencia de las neuronas (Schousboe, Bak, & Waagepetersen, 2013).

Un solo astrocito contacta con miles de sinapsis a la vez (Halassa & Haydon, 2010), lo

cual influye en la función sináptica. Clásicamente, la relación entre astrocitos y sinapsis ha sido

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la formación de las llamadas sinapsis tripartitas, en las que dichas células controlan distintos

parámetros relacionados con la actividad sináptica, como la concentración del propio

neurotransmisor. Además, en este tipo de sinapsis, los astrocitos pueden liberar al espacio

sináptico moduladores de la actividad sináptica, “gliotransmisores”, cuya función sigue siendo

motivo de discusión (Perez-Nievas & Serrano-Pozo, 2018).

Los astrocitos forman parte de diversas unidades estructurales en conjunto con otras

células. En primer lugar, éstos forman parte de las unidades neurovasculares, unidades

funcionales que permiten regular el flujo sanguíneo de la microvasculatura cerebral (Abbott,

Rönnbäck, & Hansson, 2006). Estas unidades se encuentran formadas por la unión de astrocitos,

y el resto de células gliales, con células endoteliales, pericitos y células del musculo liso del

propio vaso (células vasculares), así como neuronas. Esto posiciona al astrocito como agente

fundamental en la conexión del sistema vascular con las neuronas y el tejido cerebral (Liu et

al., 2019). Además, en las últimas décadas se empieza a definir la unidad gliovascular, en la

que un astrocito y las neuronas con las que conecta, interaccionan con segmentos de vasos

sanguíneos y conforman una unidad funcional capaz de regular la barrera hematoencefálica y

de nuevo, la microcirculación cerebral (Abbott et al., 2006; Nedergaard, Ransom, & Goldman,

2003).

Se puede afirmar que los astrocitos forman unidades funcionales con distintos tipos

celulares capaces de regular el comportamiento de la barrera hematoencefálica, barrera física

cuya función patológica influye en distintas enfermedades neurodegenerativas (Argaw et al.,

2012; Sweeney, Sagare, & Zlokovic, 2018b). Pero, además, estas células gliales contribuyen a

la formación y mantenimiento de la barrera hematoencefálica (BHE), junto con pericitos y las

propias células endoteliales. Éstas últimas se encuentran unidas por uniones estrechas entre

ellas y rodeadas por los pericitos y terminales de astrocitos (podocitos). La BHE separa la

circulación sanguínea del parénquima cerebral, sirviendo de barrera física selectiva que impide

el influjo al parénquima de cierta moléculas en función de su polaridad y tamaño (Sofroniew &

Vinters, 2010). El trasiego de moléculas de agua entre el compartimento vascular y el

parénquima cerebral se lleva a cabo mediante proteínas acuaporinas (AQ), concretamente AQ1

y AQ4. Ésta última relacionada con el término sistema glinfático, sistema mediante el cual se

lleva a cabo el drenaje de solutos tóxicos a través de dicha proteína en los podocitos (Perez-

Nievas & Serrano-Pozo, 2018; Verkhratsky et al., 2014).

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El hecho de que los astrocitos se encuentren estratégicamente posicionados entre las

sinapsis, el parénquima cerebral y los vasos sanguíneos, incita a seleccionarlos como

mediadores del proceso por el que la actividad neuronal se encuentra conectada con el flujo

sanguíneo cerebral (Halassa & Haydon, 2010).

Además, también cumple otras funciones fisiológicas en campos como el

neurodesarrollo y mantenimiento de las sinapsis. Durante esta etapa tiene lugar la formación de

sinapsis, que posteriormente serán mantenidas o eliminadas, proceso conocido como “poda”

(prunning) sináptica. Estos procesos son atribuidos a las células gliales, tanto astrocitos como

microglía (Clarke & Barres, 2013; Perez-Nievas & Serrano-Pozo, 2018) y relacionan, por tanto,

los astrocitos con procesos de plasticidad sináptica y sinaptogénesis en el desarrollo cerebral

(Vasile, Dossi, & Rouach, 2017).

4.1.1 – Astrocitos en la EA

El microambiente de que rodea a las pacas amiloides en la EA está caracterizado por

generar una respuesta microglial y astrocitaria (Serrano-Pozo et al., 2013). La astrogliosis

asociada a las placas amiloides supone una de las características neuropatológicas de la EA y

está caracterizada por un aumento de expresión de GFAP, vimentina y ALDH1L1 (Fig. 2). De

hecho, está descrito que los astrocitos reactivos rodean con sus prolongaciones los depósitos de

Aβ y no migran hacia las placas amiloides (Galea et al., 2015; Perez-Nievas & Serrano-Pozo,

2018).

A diferencia de la microglía, la magnitud de la reacción astrocítica no se correlaciona

con el tamaño de placa. Esto sugiere que los astrocitos reactivos asociados a la placa están

reaccionando al daño neurítico inducido por la placa en lugar de al propio Aβ, lo cual es

apoyado por el hecho de que ratones modelos de la EA GFAP KO se interrumpe el contacto

astrocito-placa, e incrementa el número de neuritas distróficas por placa (Serrano-Pozo et al.,

2013). Esto dota a los astrocitos de un papel protector en la patología, sin embargo, los

astrocitos reactivos secretan moléculas inflamatorias en la EA, como TNFα, IL1 o IL6

(Sofroniew & Vinters, 2010). Esto provoca, en última instancia un microambiente de

neuroinflamación que podría ayudar a la generación de Aβ (Perez-Nievas & Serrano-Pozo,

2018).

Por otro lado, los astrocitos tienen un importante papel fisiológico en la degradación de

Aβ, puesto que expresan metaloproteinasas y enzima degradadoras de Aβ ya descritas

anteriormente en el presente trabajo. Este papel podría estar alterado en la EA contribuyendo a

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

la alteración entre la producción y la eliminación de Aβ (Tarasoff-Conway, Carare, Osorio,

Glodzik, Butler, Fieremans, Axel, Rusinek, Nicholson, Zlokovic, Frangione, Blennow,

Menard, et al., 2015). Su activación también implica una alteración en la BHE, debido a que

los pies astrocíticos forman parte de ella. Este hecho altera la eliminación de especies de Aβ

por el torrente sanguíneo (Tarasoff-Conway, Carare, Osorio, Glodzik, Butler, Fieremans, Axel,

Rusinek, Nicholson, Zlokovic, Frangione, Blennow, Menard, et al., 2015). Además, la pérdida

de la microvasculatura y la alteración de la expresión de AQ4 cerca de placas sugiere que el

proceso de eliminación de Aβ que depende del flujo de Aβ del líquido intersticial al LCR

(dependiente de AQ4) puede estar alterado (Rosales-Nieves et al., n.d.).

Figura 2. Astrocitos GFAP positivos con prolongaciones dirigidas a la placa amiloide. La marca

amarilla representa la posición central de la placa amiloide. Imagen obtenida de modelo murino de la

EA (APP751) en el laboratorio.

Los astrocitos funcionan como neuroprotectores de manera fisiológica, sin embargo,

parece que durante el trascurso de la EA, dicha función neuroprotectora se pierde y

posiblemente, ocurra una ganancia de función tóxica (Perez-Nievas & Serrano-Pozo, 2018).

*

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

4.2 – Microglía

La microglía constituye del 5-12% de las células existentes en el SNC, estando más

presentes en la sustancia blanca que en la gris (Hickman et al., 2018; Mittelbronn et al., 2001).

Son las principales células inmunes residentes del cerebro, conformando la primera línea de

defensa del sistema inmune, están involucradas en la homeostasis del tejido cerebral y en la

eliminación de desechos y patógenos, de hecho, son ampliamente conocidos como macrófagos

residentes del SNC (Hickman et al., 2018).

El estudio de la microglía toma ventaja en 1918, cuando Pio del Rio Hortega publica un

método de tinción que permite su distinción en el parénquima cerebral (Río-Hortega, 1918).

Poco después, describe su función fagocítica, plasticidad, distribución y heterogeneidad, las

llamó el ‘tercer elemento’ del SNC (Río-Hortega, 1919). Estas células tienen su origen en el

saco vitelino a partir de un progenitor eritromieloide, y son mantenidas por autorrenovación

(Ginhoux et al., 2010; Tay et al., 2017).

Las células microgliales presentan una morfología diferencial dependiendo de su estado

de activación. En condiciones fisiológicas, la microglía presenta una morfología muy

ramificada con prolongaciones dinámicas, que se despliegan y repliegan para sensar el entorno,

por lo que no están en situación de “reposo” (Colonna & Butovsky, 2017). Esto tiene un

importante impacto en sus funciones fisiológicas (Kettenmann et al., 2011), ya que poder

comprobar continuamente la homeostasis del ambiente permite a la microglía llevar a cabo

acciones que entran dentro del mantenimiento de la homeostasis y la defensa frente a patógenos

(Hickman et al., 2018). Participan así, con el objetivo de conservar la homeostasis del SNC, en

varios procesos como neurotropismo, poda sináptica, apoptosis neuronal durante el desarrollo

y limpieza de restos celulares (Nayak, Roth, & McGavern, 2014).

Así, las ramificaciones de la microglía se ponen en contacto con las neuronas, los

astrocitos y los vasos sanguíneos y vigilan constantemente el estado funcional de las sinapsis.

Las funciones fisiológicas de mantenimiento cerebral de la microglía implican, por lo tanto, la

remodelación sináptica, la migración a los sitios de muerte neuronal para fagocitar las células

muertas (Krasemann et al., 2017), además del mantenimiento de la homeostasis de la mielina

(Hickman et al., 2018).

La microglía también es protagonista de la protección contra los agentes perjudiciales,

tanto propios como ajenos. En esta categoría se incluyen patógenos infecciosos, proteínas como

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

Aβ, α -sinucleína, huntingtina mutante, o priones, así como tumores primarios o metastásicos

del SNC (Hickman et al., 2018).

En resumen, conviene resaltar que no hay microglía en reposo, sino en estado

“vigilante”, estado que las capacita para realizar sus funciones de mantenimiento y de

protección. La desregulación de cualquiera de estas funciones resulta en un desequilibrio que

inicia o propaga la neurodegeneración (Hickman et al., 2018).

En el momento en el que las prolongaciones detectan un estímulo o perturbación de la

homeostasis, se produce un cambio morfológico hacia una forma más ameboide, aumentando

el volumen celular y acortando las prolongaciones, hecho observados in vivo en estudios de

doble fotón (Colonna & Butovsky, 2017; Davalos et al., 2005). Dicho cambio, no solo ocurre

a nivel morfológico, sino que conlleva más cambios fenotípicos posteriores a cambios en el

perfil transcripcional. Así, son secretados diversas moléculas inflamatorias que comienzan el

proceso de inflamación, activando al resto de células implicadas en la respuesta inmune, como

ciclooxigenasa-2, especies reactivas de oxígeno (ROS), quimioquinas o citoquinas (Uddin et

al., 2020). Además de expresar una gran cantidad de moléculas de superficie como CD14 o

receptores de quimioquinas (Block, Zecca, & Hong, 2007). Por otro lado, la activación

microglial, además de tener efectos citotóxicos, también posee efectos beneficiosos, puesto que

puede liberar factores neuroprotectores y neurotróficos (Glezer, Simard, & Rivest, 2007; Uddin

et al., 2020).

El hecho de que la microglía reaccione ante cualquier agente que altere la homeostasis

del SNC es conocido como activación microglial. Clásicamente, los estados de activación

microgliales se han resumido en M1 y M2 (Tang & Le, 2016a), donde M1 representa un estado

en el que la célula genera un respuesta citotóxica y proinflamatoria, y M2 representa el estado

microglial de activación en el cual se promueve una respuesta de supervivencia y anti-

inflamatoria (Leyns & Holtzman, 2017; Tang & Le, 2016b). Sin embargo, en la actualidad es

considerado que el estado de la microglía no debe ser simplificado a estados “on-off”, sino que

hay una enorme diversidad funcional, con distintos perfiles de expresión, y perfiles funcionales

dependiendo del estímulo o el proceso patológico (Gomez-Nicola & Perry, 2015; Keren-Shaul

et al., 2017; Leyns & Holtzman, 2017).

4.2.1 – Microglía en la EA

La principal evidencia de la implicación microglial en la patología de la EA es la

identificación mediante GWAS de SNPs en genes relacionados con la inmunidad innata que

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conforman los principales factores de riesgo genéticos para la EA esporádica (Guerreiro et al.,

2012; J.-C. Lambert et al., 2009; Pimenova et al., 2018).

La microglía también se relaciona con la eliminación de Aβ debido a su función

fagocítica, sin embargo, cuando la microglía es incapaz de eliminar los depósitos de Aβ, ésta

los compacta para proteger a la neurona de su toxicidad (Hansen, Hanson, & Sheng, 2018). De

hecho, se ha descrito que el hecho de que las placas se encuentren rodeadas por microglía que

ha migrado hacia ellas protege a las neuronas de un contacto directo con el Aβ que contienen

dichas placas (Yuan et al., 2016).

Como ya se ha comentado, otra de las evidencias más claras de la implicación de este

tipo celular en la EA es el hecho de que la microglía se dispone alrededor de las placas seniles

(Serrano-Pozo et al., 2013) (Fig. 3). En la EA, se ha descrito que la microglía adopta un fenotipo

DAM (‘disease associated microglia’) (Keren-Shaul et al., 2017; Krasemann et al., 2017)

caracterizado por poseer un perfil de expresión en el que genes fagocíticos, lisosomales y de

metabolismo lipídico se encuentran regulados a la alza. Estos genes son Trem2, Axl, Ctsb y

Ctsd (catepsinas), Lpl y ApoE, entre los que destacan Trem2 y ApoE como factores necesarios

para alcanzar dicho fenotipo en su fase más avanzada (Brown & St George-Hyslop, 2017;

Keren-Shaul et al., 2017).

Por otro lado, la microglía expresa receptores que se pueden unir a Aβ (en sus distintos

modos de agregación) provocando el inicio de la inflamación, como CD36, TLR2-4-6 o

NLRP3, además de poder ser estimuladas por patrones moleculares asociados a daño o ATP

(Colonna & Butovsky, 2017; Davalos et al., 2005). Todo ello promueve la liberación de TNF-

α y IL-1β que en cierta medida pueden contribuir a la agregación de Aβ, pues promueven la

neuroinflamación y neurotoxicidad (Colonna & Butovsky, 2017; Yuan et al., 2016; Zhao et al.,

2018).

Otra posible relación de la microglía con la EA está relacionada con la edad, principal

factor de riesgo no modificable para la aparición de EA esporádica. El envejecimiento puede

tener como resultado una función microglial insuficiente para frenar y prevenir la EA. Esto va

a provocar que las especies tóxicas de Aβ vayan acumulándose, y las neuronas sufran daños.

Proceso que en última instancia va a suponer mayor activación microglial provocando el inicio

de un ciclo inflamatorio, conocido como neuroinflamación (Hansen et al., 2018).

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Figura 3. La microglía se posiciona alrededor de las placas amiloides. Marcaje realizado con DAPI

(marcaje nuclear), Iba1 (marcaje microglial) y Tioflavina (marcaje de placas de Aβ). Imagen obtenida

de modelo murino de la EA (APP751) en el laboratorio.

Pasando al plano de las células gliales en general, existen ciertas evidencias que apoyan

relación astrocitos – microglía en la EA. La microglía se encuentra rodeando a las placas, como

ya se ha comentado, y en una capa más externa, se disponen los astrocitos. Ambas células

establecen una relación en ese entorno (Perez-Nievas & Serrano-Pozo, 2018; Serrano-Pozo et

al., 2013). Además, estudios realizados por los mismos autores describen una correlación entre

el número de células microgliales y astrocitos con fenotipos activados. Por último, en un

escenario de estudio de reactividad microglial asociada a placas y el alelo ApoE4 (Rodriguez,

Tai, LaDu, & Rebeck, 2014), se comprueba la influencia de los astrocitos en dicho proceso.

Dada su importancia, y por considerarlo suficiente para lograr el objetivo propuesto, se

considera el uso de la célula microglial como principal tipo celular a utilizar en el diseño del

modelo expuesto en el presente trabajo. Como se detalla a continuación, se plantea el estudio

de la organización microglial en torno a las placas de modelos murinos de la EA para la

predicción pseudo-temporal de la edad de las placas amiloides.

DAPI ThioS

Iba1

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5.- Aprendizaje automático y propuesta metodológica

El aprendizaje automático o machine learning (ML) hace referencia a un conjunto de

técnicas destinadas a obtener predicciones basadas en uno o varios parámetros medibles (of

Engineering, 2018).

Dentro de dichos métodos existen dos variantes: el aprendizaje automático supervisado

y el no supervisado. En primer lugar, el ML supervisado, precisa la característica a predecir, así

como un “set” o conjunto de imágenes que sirvan para entrenar al modelo. Como ejemplo para

su entendimiento se describe el caso de este proyecto, destinado a clasificar las placas amiloides

según su edad a partir de la organización microglial: si se aplicara un método de ML

supervisado, las imágenes utilizadas deberían tener asociada la edad de dicha placa

(característica a predecir) además de su respectivo vector de valores analizables (parámetros

medibles) (Wainberg et al., 2018). Por su parte, el ML no supervisado no precisa la aportación

de la característica a predecir. En este caso, el modelo proporciona la forma en la que los datos

se comportan, es decir, genera un patrón de comportamiento de las características medibles.

Aplicado a la propuesta en cuestión, los parámetros medibles de las imágenes proporcionadas

se agruparían según rangos de edad de aparición de la placa.

A continuación, se describen el plan de trabajo y la metodología propuestas para abarcar

la hipótesis planteada.

Se partirá de muestras de tejido cerebral de ratones de 7-9 meses de edad, sobre las que

se llevarán a cabo marcajes con técnicas inmunohistoquímicas siguiendo el protocolo estándar

del laboratorio (Wälchli et al., 2014). El desarrollo de la herramienta y modelo computacional

requiere datos de partida que serán extraídos a partir de las imágenes realizadas. En este caso

las imágenes se obtendrán combinando marcadores microgliales, (Iba1), astrogliales, y

nucleares (DAPI). También conviene realizar sobre dichas muestras un marcaje de tioflavina,

que permitirá observar las placas en el caso de las muestras procedentes de ratones modelos de

la EA. A partir de dichas muestras se llevará a cabo la toma de imágenes mediante microscopia

confocal de manera aleatoria en la misma zona de la corteza.

Posteriormente, se llevará a cabo el procesamiento de las imágenes y la cuantificación

de estas. Para ello, mediante el software Matlab, se realizará un procesamiento destinado a

eliminar ruido e imperfecciones en las imágenes mediante transformaciones morfológicas.

Mediante el mismo software, se llevarán a cabo la segmentación, estableciendo ROIs aleatorios

en las muestras WT. Para el caso de las muestras pertenecientes a modelos de la EA, se

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establecerán ROIs que incluyan placas de Aβ de distinto tamaño, así como ROIs en zonas donde

no sean visibles placas de Aβ.

La segmentación anterior nos permitirá llevar a cabo dos análisis referentes a la

organización de la microglía en el parénquima. En primer lugar, se pretende concretar el patrón

de organización de dichas células en la condición WT mediante el uso de un modelo

computacional topológico basado en el concepto matemático de Voronoi. Así, se podrán

cuantificar las diferencias en la organización microglial en la corteza cerebral de ratones WT y

AD.

Por otro lado, este diseño metodológico permitirá el diseño de una nueva herramienta.

A partir las imágenes que incluyan placas de Aβ de los modelos de EA se estudiará la elección

de distintos parámetros que permitan obtener valores cuantificables de cada imagen. Los

parámetros a seleccionar se basarían en distancias relativas: distancias medias entre placa y

núcleos microgliales, entre los propios núcleos microgliales o, en el caso de que se incluyan

otros tipos celulares como astrocitos, distancias relativas entre ambos tipos celulares. Además,

se tendrían en cuenta diversos parámetros de uso común en análisis de grafos: número medio

de vecinos, camino más corto, etc. La obtención de varios parámetros o “características”

cuantificables de cada imagen permitirá llevar a cabo una clasificación pseudo-temporal de las

placas de Aβ. Esta herramienta de clasificación se basará en la aplicación de técnicas de

aprendizaje automático sobre el stock de imágenes con respectivos parámetros asociados.

Como validación de la predicción temporal de las placas de Aβ, se plantea usar la

cuantificación del número de sinapsis, neuronas y neuritas distróficas en las inmediaciones de

la placa que servirán como parámetros para establecer la correlación entre éstos y la edad

propuesta. La relación directa entre dichos parámetros y la edad que se propone para la placa

amiloide confirmará el valor de la predicción llevada a cabo, a más edad predicha debería

observarse más daño neuronal asociado.

6.- Discusión

La necesidad de encontrar nuevas vías para el desarrollo del tratamiento de la EA es una

realidad en la investigación de la enfermedad. En el presente trabajo se propone abarcar parte

de la neuropatología característica de la EA, el papel de la microglía, desde un punto de vista

novedoso que utiliza métodos de biomedicina computacional para el estudio de la organización

de la microglía en el parénquima, concretamente alrededor de las placas amiloides.

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La EA es una enfermedad que padecen el 70% de los pacientes que sufren demencias.

Es, por lo tanto, la enfermedad con mayor incidencia dentro de las demencias. Concretamente,

la incidencia de la EA en Europa alcanza valores de 11,08 por 1.000 personas al año (Niu et al.,

2017). El mismo metaanálisis describe una prevalencia de la EA en Europa de 5,05 %, la cual

aumenta con la edad y en mujeres. Además, la EA se posiciona entre una de las primeras causas

de muerte en países desarrollados, así como uno de los principales problemas de salud en estos

países (Naghavi et al., 2015; Robinson et al., 2017). La tendencia de padecer la EA va en

aumento debido al envejecimiento de la población, que junto a lo ya expuesto, pone de

manifiesto la importancia de la búsqueda de soluciones sanitarias para esta enfermedad (Prince

et al., 2013).

Por su parte, la etiología de la enfermedad es considerada diversa, pues son muchos

factores no modificables, ambientales y genéticos los que predisponen a la población a padecer

la EA esporádica (Iturria-Medina et al., 2016). Pese a ello, se conoce que la disfunción vascular,

la activación glial, los depósitos de Aβ y los ovillos neurofibrilares guardan relación con el

desarrollo de la EA (Iturria-Medina et al., 2016; Rouch et al., 2015; Serrano-Pozo et al., 2011).

La microglía es el principal tipo celular perteneciente al sistema inmune en cerebro,

conformando la primera línea de defensa, está involucrada en la homeostasis del tejido cerebral

y en la eliminación de desechos y patógenos, o agentes perjudiciales como Aβ (Hickman et al.,

2018). La activación glial hace referencia a los cambios fenotípicos que experimentan dichas

células frente a un patógeno o daño en el parénquima. Cuando Aβ interacciona con la microglía

a través de diversos receptores de membrana (Zhao et al., 2018), la microglía adopta un fenotipo

diferencial heterogéneo en la EA (Hickman et al., 2018; Keren-Shaul et al., 2017) cuya

caracterización exacta requiere de mayor investigación.

Son pocos los autores que han abordado la EA desde el punto de vista expuesto en el

este trabajo, sin embargo, se han llevado a cabo distintos análisis para estudiar la organización

de las células gliales en el cerebro (Bouvier et al., 2016; Galea et al., 2015) (Fig. 4). Pese a que

en el estudio citado (Bouvier et al., 2016) el objetivo perseguido es la mejora de la calidad de

imágenes tridimensionales en cerebros de pacientes y modelos de la EA, utilizan una interesante

metodología computacional similar a la comentada en este trabajo. Sin embargo, se considera

positivo el hecho de que exista al menos un análisis similar de organización celular en el

parénquima cerebral. Además, no se han estudiado ni el “revestimiento” normal de las células

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microgliales ni su agrupación en la EA como estructuras complejas en 3D, objetivo final del

proyecto iniciado en este trabajo.

Por otro lado, el análisis topológico de células en modelos de la EA también se ha

aplicado a astrocitos (Galea et al., 2015), con el objetivo de estudiar esclarecer el debate que ha

existido en la comunidad científica sobre la migración de los astrocitos a las placas amiloides

aplicando análisis espaciales cuantitativos y modelos computacionales de topología 3D. Los

resultados obtenidos son muy prometedores y concluyentes, pues describen un cambio

fenotípico y no espacial en la respuesta astroglial frente a las placas de Aβ.

Figura 4. Organización microglial en corteza cerebral de ratones controles sin patología. A la

izquierda se marca microglía Iba1 positiva, a la derecha se aplica el método de segmentación basado en

Voronoi. Obtenida de (Bouvier et al., 2016).

Como ya se ha comentado, la herramienta que permitirá clasificar las placas amiloides

según su edad de aparición estará basada en técnicas de aprendizaje automático. El ML, en la

actualidad mejorado a “deep learning”, es utilizado en una gran cantidad de ámbitos y no ha

tardado en aprovecharse en la investigación biomédica. Uno de las grandes beneficiados ha sido

el análisis de la neuroimagen en un ámbito de investigación clínica (Mateos-Pérez et al., 2018),

aportando mejoras en el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas (Huertas-Fernández

et al., 2015).

Una vez puesto en contexto y definida la metodología, se plantea el problema de

elección de método para el modelo de aprendizaje automático a emplear en la herramienta de

predicción pseudo-temporal. supervisado o no supervisado. Cada abordaje, aplicado a la idea

expuesta, tiene ventajas y desventajas. En primer lugar, el abordaje supervisado implicaría tener

que “etiquetar” cada imagen previa aplicación del método, es decir, deberíamos conocer la edad

de cada placa representada en la imagen, lo cual es considerado una desventaja por la dificultad

de precisión del dato. Además, una de las técnicas más usadas dentro del abordaje con técnicas

de aprendizaje automático supervisado son las redes neuronales. La aplicación de este método

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

supone un trabajo complejo de diseño del método computacionalmente hablando, y tiene un

alto coste computacional al aplicarla para la predicción de un número, que, puesto en contexto,

debe ser exacto al tratarse del tiempo de aparición de una placa de Aβ. Por otro lado, el

aprendizaje automático no supervisado tiene un coste computacional mucho menor y las

imágenes no deben ser “etiquetadas”, por lo que se elimina el problema comentado. Uno de los

métodos más comunes dentro de este tipo de aprendizaje automático no supervisado es el k-

means, que lleva a cabo una cabo una clasificación por clusters de los distintos parámetros

seleccionados en la imagen. Se obtendrían así patrones de cluster de datos para cada rango de

edad de placa, patrones que serían atribuibles a la imagen que queremos estudiar. En este caso,

la limitación principal seria la ya comentada falta de precisión en la clasificación.

6.1 – Perspectivas futuras

El camino lógico a seguir es llevar a cabo un diseño experimental similar realizando el

estudio de forma tridimensional, en vez de en 2D. La obtención de muestras implicaría el uso

del método de clarificación iDisco (Liebmann et al., 2016). Con respecto al procesado de las

imágenes, existen diversas herramientas disponibles de segmentación 3D como LimeSeg

(Machado et al., 2019), plugin del software FIJI (Schindelin et al., 2012). De la misma manera,

se cuantificarán parámetros relacionados con la distribución de la microglía en el parénquima

y la posición relativa de las placas Aβ. Todo ello permitiría establecer un modelo topológico de

la organización de la microglía, y poder cuantificar las diferencias topológicas entre la

organización de la microglía WT y en la EA.

7.- Conclusiones

• Se han expuesto las principales características del ambiente en el parénquima

cerebral en los alrededores de las placas amiloides.

• Se ha llevado a cabo una breve revisión de los tipos principales considerados de

células en el entorno de la placa amiloide.

• Tras contextualizar el trabajo, se expone la propuesta metodológica destinada al

estudio de la organización microglial en la corteza cerebral de modelos de la EA.

• Se propone el desarrollo de una herramienta de predicción pseudo-temporal de

las placas de Aβ con utilidad en la investigación de la EA basada en la

organización microglial en el entorno de las placas amiloides, con vistas a una

mejora al incorporar información tridimensional de dicha

organización/empaquetamiento.

Trabajo Fin de Máster Miguel Martín Bórnez

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