Spektrophotometrie

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I. Einführung Im Folgenden werden die für die Spektrophotometrie wichtigsten Gesetze und Begriffe zusammengestellt. Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz Das Bouguer-Lambert-Beer-Gesetz (meist zu Lambert-Beer-Gesetz verkürzt) stellt die grundlegende Gesetzmäßigkeit für die Spektrophotometrie dar:

A - Absorbance (Extinktion) T - Transmission Io - die auf die Küvette einfallende Lichtintensität Î - die aus der Küvette austretende Lichtintensität ε - molarer dekadischer Extinktionskoeffizient [L/mol⋅cm] c - Konzentration der Lösung [mol/L] d - Schichtdicke der Probe [cm] Der Extinktionskoeffizient ist eine wellenlängenabhängige Stoffkonstante, deren Werte-bereich in Abhängigkeit von den Auswahlregeln über acht Zehnerpotenzen streut. Spin- und symmetrieerlaubte Elektronenübergänge (z. B. erlaubte π→ π* - Übergänge) haben Extinktionskoeffizienten in der Größenordnung 104 bis 105 L/mol⋅cm, symmetrieverbotene Übergänge (n → π* - Übergänge, d → d-Übergänge der klassischen 3d-Metallkomplexe) 101 bis 102 L/mol⋅cm und spinverbotene Übergänge organischer Verbindungen sind äußerst schwach (∼ 10-1 bis 10-3 L/mol⋅cm). Da die Empfindlichkeit der spektrophotometrischen Methode von der Größe des molaren Extinktionskoeffizienten bestimmt wird, sind nur die starken (erlaubten) Elektronenübergänge von praktischer Bedeutung. Daher werden für die spektrophotometrische Analyse anorganischer Stoffe die Metallionen durch Zusatz entsprechender Reagenzien in Komplexe mit sehr großen Extinktionskoeffizienten überführt (z. B. Dithionate). Für organische Verbindungen wird als Meßwellenlänge ein erlaubter π → π* - Übergang ausgewählt. Für organische Verbindungen stellt die Spektrophotometrie auch eine Methode für die Bestimmung der Haupt- und Nebenkomponenten dar, während die Spektrophotometrie für anorganische Ionen nur für die Spurenanalytik Bedeutung besitzt, da es für die Hauptkomponentenanalyse bekanntlich genügend viele Präzisionsmethoden für jedes anorganische Ion gibt, z. B. Gravimetrie, Volumetrie, RFA, ICP. Die Gültigkeit des Lambert-Beer-Gesetzes ist für den vorgesehenen Arbeitsbereich stets zu überprüfen und zu dokumentieren. Abweichungen ergeben sich durch konzentrations-abhängige Aggregation, oder Komplexbildung oder durch Dissoziationen (etwa bei Säuren/Basen). Außerdem ist der Extinktionskoeffizient von der Temperatur (Einfrieren bestimmter Freiheitsgrade) und vom Lösungsmittel (Mikroumgebung des Moleküls) abhängig. Letztlich ist zu berücksichtigen, daß das Lambert-Beer-Gesetz selbst nur ein Grenzgesetz für verdünnte Lösungen darstellt und daher sein Geltungsbereich auch unter idealen Bedingungen eingeschränkt ist.

dcI

ITA o ⋅⋅==−= εlglg

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Nach der Dispersionstheorie ist nicht ε selbst, sondern vielmehr die sog. Molrefraktion, Rmol

konzentrationsunabhängig, wobei n(λ) der Brechungsindex des Mediums ist. Da sich der Brechungsindex i. a. mit der Konzentration ändert, erwartet man auch eine geringfügige Änderung von ε. Solche Abweichungen können z. T. sehr beträchtlich sein, wie Abb. 1 vermittelt.

Abb. 1: Abweichungen vom Lambert-Beersches Gesetz für verschiedene Ionen wäßriger

Lösungen, verglichen mit Werten bei sehr geringen Konzentrationen (10-5mol/L) 1 – Eosin-Anion bei 366 nm; 2 – Eosin-Anion in KJ-Lösung; 3 – Dinitrophthalat in wäßriger Phenollösung bei 436 nm; 4 – dito in La(NO3)3-Lösung bei 436 nm; 5 – NO2

-; 6 – CrO42- bei 436 nm; 7 – 2,4-Dinitrophenol-

bromid-Lösung bei 436 nm; 8 - Eosin-Anion in Et4NCl-Lösung bei 436 nm

( )22 2+⋅=

n

nRmol ε

Spektrophotometrie

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Rauschen Das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) ist eine entscheidende Spezifikation, die das photometrische Auflösungsvermögen eines Spektrometers bestimmt, während der Wellenlängenauflösung durch die Spaltbreiten und die Qualität der optischen Abbildung des Eingangs- und Ausgangsspalts bestimmt wird. Man unterscheidet verschiedene Ursachen des Rauschens, die in unterschiedlicher funktioneller Abhängigkeit von der eingestrahlten Lichtintensität Io stehen und in unterschiedlichen Komponenten der Signalübertragungskette ihren Ursprung haben (Abb. 2).

Abb. 2: Übersicht über verschiedene Rauschkomponenten eines Spektrophotometers

Folgende Komponenten tragen zu einem Gesamtrauschen bei, das als Gesamt-

Rauschverhältnis (signal to noise ratio, SNR) eines Spektrometers angegeben ist. Photonenrauschen

Jede Lichtquelle emittiert Photonen mit einer gewissen statistischen Wahrscheinlichkeit, was zu Rauschen führt. Darüber hinaus kann die Probe selbst Anlaß zu einem beträchtlichen Wärmerauschen geben, welche besonders bei optisch stark streuenden Proben ausgeprägt ist. Diese Komponente kann durch Kühlung der Probe deutlich verringert werden. Detektorrauschen

Verschiedene Phänomene wie das Johnsonrauschen, Schrotrauschen und Temperaturrauschen tragen dazu bei, diese sollen hier allerdings nicht in der Breite diskutiert werden. Elektronisches Rauschen

Tritt in allen Signalstufen auf, die dem Detektor folgen.

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Falschlicht Unter Falschlicht (stray light) versteht man Licht, welches undifferenziert Probe und Monochromator durchläuft. Abweichungen der Extinktionswerte vom Lambert-Beer-Gesetz mit zunehmendem prozentualem Falschlichtanteil vermittelt Abb. 3.

Abb. 3: Einfluss des Falschlichtanteils auf das Lambert-Beer-Gesetz Zur quantitativen Bewertung des Falschlichtanteils muß die Definitionsgleichung durch den zusätzlichen Photostrom IS erweitert werden, wobei berechtigterweise angenommen wird, daß das Falschlicht in Probe und Referenz in gleichem Ausmaß geschwächt wird.

S

So

II

IIA

+

+= lg A – Absorbance (Extinktion)

Falschlicht hat zur Folge, daß „starke“ Absorptionsbanden (kleines „I“; IS wird signifikant!) „gestaucht“ erscheinen; das Spektrum wird verzerrt und liefert daher falsche Absorptions- und Konzentrationswerte. Die Bewertung des Falschlichtanteils ist Gegenstand der Validierung von Spektrometern für spektrophotometrische Analysen. Die Untersuchung des Falschlichtanteils gehört zu den Routinearbeiten der Geräteverantwortlichen und ist im Rahmen der Qualitätssicherung in den sog. Systemlog-Büchern zu dokumentieren. Zur Messung des Falschlichtanteils wird mit für einzelne Spektralbereiche geeigneten Lösungen der Nutzlichtanteil Io bzw. I ausgeblendet. Gemessen wird dann das reine Falschlicht. Lösungen für die Messung des Falschlichtanteils: KCl 12 g/L ≤ 200 nm NaI 10 g/L 220 nm NaNO2 50 g/L 340 nm Methylenblau 0,01 % 600 – 700 nm

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Derivativspektroskopie Die Derivativspektroskopie ist ein wichtiges Hilfsmittel zur Konzentrationsbestimmung. Sie eignet sich für die Ermittlung von Absorptionsmaxima einzelner Komponenten bei der Multikomponentenanalyse, was vor allem dann von Nutzen ist, wenn sich die Absorptionsmaxima der Komponenten in binären Mischungen nur geringfügig unterscheiden. Aus dem Lambert-Beer-Gesetz A = ε ⋅ c⋅ d wird die n-te Ableitung

n

n

n

n

d

ddc

d

Ad

λ

ε

λ⋅=

erhalten, woraus ersichtlich ist, daß die Höhe der Ableitungen der Konzentration direkt proportional ist, was die Grundlage für die Anwendung der Derivativspektren zur Konzentrationsbestimmung bildet. Für die Realisierung der Ableitungen steht bei den meisten Spektrometern eine Software zur Verfügung (Praktikumsgerät in Data Handling) oder die Ableitungen können mit externer Datenbearbeitung unter Anwendung eines entsprechenden Programms (z. B. Origin

®) erzeugt werden. In Abb. 4 ist die erste bis vierte Ableitung eines aus zwei gleichartigen Gaußkurven zusammengesetzten Summenspektrums (1+2) dargestellt. Man erkennt, daß mit zunehmender Ableitungsordnung die im Spektrum „versteckten“ Komponenten sich immer deutlicher abzeichnen. In der vierten Ableitung sind beide Komponenten sehr gut zu erkennen. Nachteiligerweise treten jedoch auch verstärkt Artefakte auf (in der Abb. 3 an den beiden Spektrumsgrenzen als Nebenmaxima zu erkennen). Diese Satelliten entsprechen keinen reellen Komponenten im Ausgangsspektrum.

Abb. 4: Erste bis vierte Ableitung eines aus zwei Gaußkurven zusammengesetzten Summen- Spektrums (1 + 2)

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Die Derivativspektroskopie hat ein besseres Nachweisvermögen und kann daher in der Spurenanalytik als empfindliche Nachweis- und quantitative Methode angewendet werden, Weiterhin kann die Derivativspektroskopie auch in trüben Lösungen erfolgreich angewendet werden (z. B. Phenol im Abwasser; biologische Systeme). Multikomponentenanalyse Für Zweikomponentenanalysen kann auf der Grundlage des Lambert-Beer-Gesetzes die Auswertung bei zwei Wellenlängen Ergebnisse ausreichender Genauigkeit liefern, um ein Gemisch zu quantifizieren. Gemäß Lambert-Beer-Gesetz gelten für ein Gemisch aus den beiden Komponenten 1 und 2 bei den zwei Meßwellenlängen λ1 und λ2 die Beziehungen für λ1: D1 = ε11 ⋅ c1 + ε12 ⋅ c2

für λ2: D2 = ε21 ⋅ c1 + ε22 ⋅ c2

mit der optischen Dichte Di bei der Wellenlänge i

d

AD i

i =

Ai Extinktion bei der Wellenlänge i d Schichtdicke εij Extinktionskoeffizient für die Komponente j bei der Wellenlänge i

In Matrixschreibweise:

=

2

1

2221

1211

2

1

c

c

D

D

εε

εε

Für die gesuchten Konzentrationen cj erhält man gemäß der Cramerschen Regel

Det

Detc

j

j =

( ) ( )( ) ( )12212211

122221

2221

1211

222

121

1εεεε

εε

εε

εε

ε

ε

⋅−⋅

⋅−⋅==

DDD

D

c

( ) ( )( ) ( )12212211

211112

2221

1211

221

111

2εεεε

εε

εε

εε

ε

ε

⋅−⋅

⋅−⋅==

DDD

D

c

Für die photometrische Bestimmung von Mehrkomponentengemischen werden multivariate

Verfahren (z. B. PLS-R, Partial Least Squares Regression) angewendet, bei denen das gesamte Spektrum für die Datenanalyse ausgenutzt wird. Auf diese Verfahren kann in diesem Rahmen allerdings nicht eingegangen werden.

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Forderungen und Probleme bei der Mehrkomponentenanalyse: • Validität des Lambert-Beer-Gesetzes für alle Komponenten • Steile Flanken als Auswertewellenlängen vermeiden (Maxima, Minima oder ausgeprägte

Schultern verwenden) • Sehr große und sehr kleine Extinktionen wegen der geringen photometrischen

Genauigkeit vermeiden • Probleme ergeben sich bei sehr ähnlichen Absorptionsspektren IR-Spektrophotometrie Allgemeines

Die IR-Spektrophotometrie ist eine hoch selektive Methode zur quantitativen Bestimmung von Substanzen und Substanzgemischen im Bereich der Haupt- und Nebenkomponenten sowie in der Spurenanalytik bis in den ppm-Bereich. Außer von Quantenbedingungen hängen das Auftreten und die Intensität von Absorptionsbanden bei der IR-Spektroskopie noch vom Dipolmoment eines Moleküls ab. Zur Erzeugung einer IR-Absorption ist eine Änderung des Dipolmoments während der Schwingung erforderlich. Diese Auswahlregeln haben zur Konsequenz, dass in symmetrischen Molekülen Schwingungen, die symmetrisch zum Symmetriezentrum erfolgen, IR-inaktiv (es erfolgt keine Dipolmomentänderung) sind (s. Abb. 5 a/b). Im umgekehrten Fall sind Schwingungen, die nicht symmetrisch zum Symmetriezentrum erfolgen im IR gewöhnlich erlaubt (s. Abb. 5 c/d). Abb. 5: Valenzschwingungen des CO2-Moleküls (oben) und die Änderung von Polarisierbarkeit α und Dipolmoment µ (unten).

Anwendungsgebiete sind die Analytik von Polymeren, die Qualitätskontrolle von Pflanzen-Schutzmitteln, die pharmazeutische Analytik, die Prozeßanalytik sowie Analytik von organischen Syntheseprodukten. Im Bereich der Umweltanalytik existiert für die

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summarische Bestimmung von Kohlenwasserstoffen im Bereich >0,01 mg/l die DIN-Vorschrift 38409 H18. Bezüglich der Zuverlässigkeit (ausgedrückt in RSD) ist die IR-Spektrophotometrie mit der UV/VIS-Spektrophotometrie vergleichbar, bezüglich der Selektivität (= Fähigkeit einer Methode, mehrere Analyten ungestört von anderen Probenkomponenten bestimmen zu können) ist sie dieser jedoch weit überlegen. Im sogenannten finger-print-Gebiet des IR-Spektrums (ν% < 1500 cm-1) gibt es auch für strukturell sehr ähnliche Verbindungen in der Regel für jede Komponente immer eine isolierte oder nahezu isolierte Absorptionsbande, die für die quantitative Analyse eines Stoffgemisches ausgewählt werden kann, während sich die UV/VIS-Spektren von Gemischen aus ähnlichen Verbindungen weitgehend überlagern. In Konkurrenz zur IR-Spektrophotometrie steht zweifelsohne die viel leistungsstärkere HPLC (mit jeweiligen Detektoren), vor allem für die Analyse sehr komplexer Stoffgemische. Für spezielle Anwendungen (wenige Komponenten, schwierige Trennungen, schnelle, einfache und billige Methode) wird die IR-Spektrophotometrie jedoch auf Grund der Tatsache, daß eine Trennung der Substanzgemische nicht erforderlich ist, die Methode der Wahl bleiben. Hervorzuheben ist die IR-Spektrophotometrie mit multivariater Datenauswertung in der Prozeßanalytik für die Steuerung und Kontrolle chemischer Reaktionsabläufe im technischen Maßstab. Im Unterschied zur UV/VIS-Spektrophotometrie sind für die IR-Spektrophotometrie einige Besonderheiten, die sich aus dem Lambert-Beerschen Gesetz ergeben, herauszustellen: Die molaren Extinktionskoeffizienten für Kernschwingungen liegen im Bereich von nur etwa 10 bis 300 L/mol⋅cm und sind daher im Vergleich zu erlaubten Elektronenenübergängen um den Faktor von 103 geringer. Außerdem können in der IR-Spektrophotometrie wegen der Eigenabsorption des Lösungsmittels in der Regel nur Küvetten mit kleiner Schichtdicke d (d < 0,2 cm) verwendet werden. Da ε und d kleiner als in der UV/VIS-Spektrophotometrie sind, sind gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz relativ hohe Konzentrationen (0,01 bis 1 molar) erforderlich. Abgesehen davon, daß für solche Konzentrationen die Löslichkeit des Analyten in einem für die IR-Messung geeigneten Lösungsmittel oftmals nicht realisiert werden kann, ist mit Abweichungen vom Lambert-Beer-Gesetz zu rechnen. Wird in der UV/VIS-Spektro-photometrie in der Regel das Absorptionsmaximum als Meßwellenlänge verwendet, sind in der IR-Spektrophotometrie deshalb integrale Extinktionen erforderlich, da z. B. eine Verdopplung der Konzentration keine doppelte Extinktion im Absorptionsmaximum, wohl aber die doppelte Peakfläche liefert (Die Absorptionsbanden werden breiter!). Abweichungen vom Lambert-Beer-Gesetz sind vor allem bei Absorptionsbanden von solchen funktionellen Gruppen zu erwarten, die konzentrationsabhängige Assoziatgleichgewichte bilden können (z. B. ν(OH) und ν(C=O)). Für schmale Absorptionsbanden von Deformationsschwingungen oder die Valenzschwingungen der nicht zur Assoziation fähigen CH-Gruppen bleibt hingegen die Linearität des Lambert-Beer-Gesetzes in großem Konzentrationsbereich erhalten, weshalb in guter Näherung das Absorptionsmaximum als Meßwellenlänge gewählt werden kann. Auswahl der Analysenbanden • Aufnahme der Spektren aller Komponenten des Substanzgemisches • Suche nach einer geeigneten Absorptionsbande für jede Komponente. Es ist zu vermeiden,

dass Bandenüberlagerungen auftreten; intensive Banden ergeben eine höhere

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Empfindlichkeit. Bei strukturell ähnlichen Verbindungen sind Absorptionsbanden aus dem fingerprint-Bereich auszuwählen.

• Suche nach einem geeigneten Lösungsmittel für Messungen in dem ausgewählten Spektralbereich (s. ANLAGE). Zu beachten sind: Transparenz des Lösungsmittels;

Löslichkeit der Probe; keine Schädigung des Küvettenmaterials.

Schichtdicke der Küvette • Übliche Schichtdicken liegen im Bereich 0,001 - 0,2 cm. Die IR-Küvetten sind i. d. R.

Alkalihalogenidscheiben, die über einen Abstandshalter aus Blei miteinander mechanisch verbunden sind. Das Füllen der Küvetten erfolgt mit einer geeigneten Spritze. Der Einfüllstutzen wird mit einem Teflonstopfen verschlossen. Für die Bestimmung von Kohlenwasserstoffen können auch Quarzküvetten (d=1 oder 2 cm) verwendet werden, da Quarz in dem engen Spektralbereich der CH-Valenzschwingungen von 3100 - 2850 cm-1 transparent ist.

• Eine genaue Bestimmung der Schichtdicke im Strahlengang erfolgt bei IR-Küvetten durch die Interferenzmethode.

Fällt kohärentes, monochromatisches Licht durch die Scheibe A und die Luftschicht der Dicke d auf die Scheibe B, so wird dort ein Teil des Lichtes reflektiert. Da die Reflektion an einem optisch dichteren Medium erfolgt, tritt hier ein Phasensprung von λ/2 auf. Da ein Teil des Lichtes am dichteren, der andere am optisch dünneren Medium reflektiert wird, tritt ein durch Reflektion verursachter Phasensprung mit dem Phasenunterschied von π auf. Ein Teil des reflektierten Lichtes transmittiert Scheibe A, ein anderer Teil wird an A reflektiert, wobei wieder ein Phasensprung von λ/2 auftritt. Ein Teil dieses Lichtbündels passiert B, gleichzeitig tritt aber eine erneute Reflexion ein. Aus Scheibe B tritt somit Licht auf den Detektor, dass keinerlei Reflektionen erhalten hat, sowie Licht, das 1, 2, 3 … n-mal reflektiert wurde. Aus den mit der leeren Küvette gemessenen Interferenzen - möglichst im Bereich kleiner

Wellenzahlen - wird die Schichtdicke d wie folgt berechnet:

dn

=⋅ −2 2 1( )ν ν

n - Ordnung der Interferenzen

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(Der ausgewählte Wellenlängenbereich darf nicht im Absorptionsbereich von Luft-CO2 liegen!)

Geräteparameter (für ein Dispersionsgerät, z. B. Praktikumsgerät Specord M 82) • Spaltprogramm: 2- bis 4-mal größer als bei Registrierung des Übersichtsspektrums. • Verstärkung: klein (großes Signal/Rausch-Verhältnis!). • Registriergeschwindigkeit: klein oder bei fester Wellenzahl im Bandenmaximum

(„selected wavenumber“) Auswertung 1. Maximum der Absorptionsbande (Emax)

Sind die Forderungen an die Genauigkeit nicht zu hoch, kann auf die Ermittlung der integralen Extinktionen verzichtet und im Maximum der Absorptionsbanden (Emax) ausgewertet werden. Diese Vorgehensweise ist insbesondere dann in Betracht zu ziehen, wenn Absorptionsbanden ausgewählt werden, die von der Assoziation weitgehend unbe-einflusst sind, so z. B. Deformationsschwingungen weit ab vom Assoziationszentrum. Ist die Absorptionsbande direkt an den assoziierenden Molekülteil geknüpft (z. B. die νC=O –Bande in Carbonylverbindungen), so wird Emax zu fehlerhaften Resultaten führen. Bei isolierten Absorptionsbanden werden die Extinktionswerte im Bandenmaximum entnommen und durch Abzug der Null-Extinktion aus dem Spektrum des reinen Lösungsmittels korrigiert. Liegen schmale, symmetrische überlagerte Absorptionsbanden vor, so können diese auf einfache Weise mit der sog. Halbwinkelmethode graphisch separiert werden.

In Abb. 6 wird die Vorgehensweise der Bandenseparation mit der Halbwinkelmethode für die Bestimmung der korrigierten Extinktion, Ekorr (= Strecke 4) der überlagerten Absorptionsbande II erläutert.

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Abb. 6: Graphische Bandenseparation mittels der Halbwinkelmethode 1 – Basislinie

2 – Sekante am Minimum der überlagerten Bande 3 – Winkelhalbierende zwischen den Kurven 1 und 2 4 – Lot im Maximum der Analysenbande auf die Kurve 3: Ekorr Statt der Extinktionen kann auch die Länge der Strecke 4 zur Berechnung verwendet werden.

Für genauere Ansprüche ist die Separation überlagerter Absorptionsbanden durch

geeignete Software zu realisieren. 2. Integrale Extinktion

Ist die Linearität des Lambert-Beer-Gesetzes mit Emax nicht mehr gegeben, so muß die integrale Extinktion (Peakfläche) verwendet werden, die mit geeigneter Software (im Praktikum mit der internen Gerätesoftware oder Origin

®) aus den registrierten Spektren ermittelt werden kann. Die Erläuterung erfolgt am Gerät.

Emax

E0

1

Spektrophotometrie

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II. Praktikumsaufgaben Die aufgeführten Fragen sind für den Versuch vorzubereiten und in das Protokoll zu integrieren.

1. IR-Spektrophotometrie

1.1 Messung der Transmissionscharakteristik von n-Hexan

Eine IR-Küvette (d = 0,02 cm) ist mit n-Hexan zu füllen. Die Transmissionscharakteristik ist im Bereich 1800 – 800 cm-1 zu messen. Es ist zu überprüfen, ob das verwendete Lösungsmittel für den Meßbereich 1800 – 800 cm-1 geeignet ist. Referenzküvette (d = 0,02 cm) mit dem gleichen Lösungsmittel füllen und Nulllinie im Meßbereich 1800 – 800 cm-1 überprüfen.

1.2 Ermittlung der Schichtdicke einer IR-Küvette

Die leere Küvette wird in den Messstrahlengang positioniert und im Meßbereich 1100 – 700 cm-1 mit dem Ordinatenmaßstab 70 – 100% gemessen. Aus verschiedenen Interferenzmaxima wird mehrfach d berechnet und der Mittelwert gebildet.

Frage 1 Die Ordinate in der Spektrendarstellung ist frei wählbar. Für welche Aufgabenstellungen wählen Sie die Transmission, für welche die Absorbance (Extinktion)? Frage 2 Warum werden in der IR- Spektrophotometrie Schichtdicken <0,2 cm verwendet, während in der UV/Vis-Spektrophotometrie eine Schichtdicke von 1 cm die Standardküvette darstellt? Frage 3 UV/Vis- und IR-Spektrophotometrie unterscheiden sich auch im Konzentrationsbereich (10-5 bis 10-4 mol/l bzw. 10-2 bis 1 mol/l). Warum sind in der IR-Spektrophotometrie so hohe Konzentrationen erforderlich? Welche Probleme können sich daraus ergeben? 1.3 Bestimmung des Stoffmengenverhältnisses von trans-, cis- und 1.2-Polybutadien in

Polymerölen Analytische Problemstellung

Bei der homogenen Polymerisation von Butadien entstehen folgende Isomere: trans-Polybutadien, cis-Polybutadien und 1.2-Polybutadien (s. Formelschema).

Spektrophotometrie

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FORMELSCHEMA Struktureinheiten der isomeren Polybutadiene und Wertebereich der out-of-plane-

Schwingungen γCH

γγγγCH 970 - 960 cm-1 (s) 675 - 730 cm-1 (m) 1005 – 985 (s) + 940 – 900 (s) Für die Auffindung optimaler Reaktionsbedingungen zur Polymerisation von Butadien mit dem Ziel, den Anteil am trans-Produkt auf über 85% zu erhöhen, wird für die Ermittlung der Produktzusammensetzung der Polymeröle eine analytische Methode benötigt, die mehr als 50 Analysen pro Tag auf möglichst einfache Weise gestattet. Es wird die IR-Spektrophotometrie verwendet, da jedes Isomer im Bereich der out-of-plane-Schwingungen ( γCH) eine spezifische Information liefert (s. Formelschema). Das Stoffmengenverhältnis ntrans : ncis : n1.2 ist für ein gegebenes Polymeröl IR-spektrophotometrisch zu ermitteln. Die Ermittlung von Ekorr erfolgt durch Messung der Differenz von Emax und der Null-linie in den Einheiten einer Länge [mm]. Für die Bandenseparation überlagerter Absorptionsbanden ist die Halbwinkelmethode (graphische Korrektur) anzuwenden.

CH2CH2

trans-Polybutadien

H

H

CH2H

CH2

H

cis-Polybutadien

CH2

CH2H

1,2-Polybutadien

Spektrophotometrie

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Durchführung

• Probenpräparation und Meßprogramm:

Probenpäparation: kapillar, KBr

Range: 1100 - 600 cm-1

Y-Ordinate: Absorbance (0 - 1.0)

Int. time: 0.5 s Auswertung

1. Im Bandenmaxinum (Emax); Bandenseparation mit der schnellen und einfachen

Halbwinkelmethode

Für jedes Isomere wird nach Formelschema im Wertebereich der out of plane-Schwingung eine typische Bande ausgewählt. (Für das 1.2-Polymer wird die Absorptionsbande im fett gedruckten Bereich ausgewählt.) Die korrigierte Extinktion ist für die 3 Banden im Maximum zu ermitteln. Mit dem Lineal sind die korrigierten Höhen zu messen. Die Bandenseparation erfolgt mit der Halbwinkelmethode.

Aus dem Lambert-Beerschen Gesetz folgt:

ntr : ncis : n1.2 = Ekortr / εtr : E

korcis / εcis : E

kor1.2 / ε1.2 (1)

Die Extinktionen sind zu normieren. Die Normierungsfaktoren k wurden der Literatur entnommen:

k1.2 : ktr : kcis = 1,0 : 1,58 : 5,77

Ermittlung des Stoffmengenverhältnisses:

Die Summe der normierten Höhen hges entspricht der Stoffmenge aller Isomeren (nges). Für die prozentuale Stoffmenge des Isomeren i (ni) gilt die Beziehung

nh

hi

i

ges

= ⋅ 100% hi - korrigierte und normierte Höhe, ermittelt

aus dem Bandenmaximum des Isomeren i Frage 4 Welche Vor- und Nachteile besitzt die Halbwinkelmethode für die Gehaltsbestimmung? Frage 5 Für welche analytischen Aufgabenstellungen ist diese Methode gerechtfertigt? Frage 6 Auf welche Weise könnte die Methode hinsichtlich der Genauigkeit für die Bestimmung des Stoffmengenverhältnisses verbessert werden?

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Zusatzaufgaben für die IR-Spektrophotometrie Für die Zusatzaufgaben werden Werte von dem Assistenten bereitgestellt. Diese wurden im Vorfeld mit Hilfe der im Praktikum verwendeten Geräte ermittelt.

Z.1 Überprüfung des Lambert-Beer-Gesetzes für eine zur Assoziation fähigen Absorptionsbande (am Beispiel von C=O in Aceton) und von Deformationsschwingungen (γγγγ(CH) am Beispiel von Styren); Ermittlung der molaren Extinktionskoeffizienten

Probelösungen und Meßbereich

Konzentration und Meßbereich für Aceton (A) und Styrol (Sty) in n-Hexan:

Meßbereich cm-1

Aceton Probelösung 1(A) 2(A) 3(A) 4(A) 5(A) 6(A) Konzentration mol/L 0,75 1,0 1,25 1,5 1,75 2,0 1800 - 1600 Küvette d/mm 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 Styren Probelösung 1(Sty) 2(Sty) 3(Sty) 4(Sty) 5(Sty) 6(Sty) Konzentration mol/L 0,86 1,37 1,98 2,66 3,04 3,8 1050 - 850 Küvette d/mm 0,1 0,1 0,02 0,02 0,02 0,02 Auswertung

• Aus den IR-Spektren ist die Funktion Emax = f (c) zu erstellen und die Linearität ist

visuell zu prüfen.

• Die Funktion Eintegral = f (c) ist zu erstellen und die Linearität ist visuell zu prüfen. • Es sind die molaren Extinktionskoeffizienten der zwei Substanzen für Emax und

Eintegral zu berechnen. • Die Ergebnisse sind zu bewerten.

Frage 7 Warum und unter welchen Bedingungen ist in der IR-Spektrophotometrie mit einer Abweichung vom Lambert-Beer-Gesetz zu rechnen? Welche Konsequenz folgt daraus? Frage 8 Warum wird bei Auswertung an einer Deformationsschwingung meist keine Abweichung vom Lambert-Beer-Gesetz in der Darstellung Emax = f(c) beobachtet?

Spektrophotometrie

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Z.2 Ermittlung des Stoffmengenverhältnises von o- und p-Nitrophenol in Syntheseprodukten

Analytische Problemstellung Bei der Nitrierung von Phenol entsteht ein Gemisch von ortho- und para-Nitrophenol. Das Stoffmengenverhältnis north / npara kann zwischen 1,0 und 2,0 betragen.

Die Analyse von Produktionschargen soll IR-spektrophotometrisch erfolgen. Mit einer Validierungsprobe ist die Richtigkeit der Methode zu bewerten.

Durchführung

1. LM: Chloroform (CHCl3) 2. Küvette: NaCl, d = 0,2 mm 3. Abkürzungen:

ortho-Nitrophenol: oNPh (M = 139 g/mol) para-Nitrophenol: pNPh (M = 139 g/mol)

4. Folgende Lösungen wurden verwendet:

Stammlösungen:

• STL I: 695 mg ortho-NPh in 25 ml CHCl3 (c = 0,2 mol/L) • STL II: 695 mg para-NPh in 25 ml CHCl3 (c = 0,2 mol/L)

Meßlösungen reine Komponenten:

• ML I: 2,5 mL STL I auf 5 ml verdünnen mit CHCl3 (c = 0,1 mol/L) • ML II: 2,5 mL STL II auf 5 ml verdünnen mit CHCl3 (c = 0,1 mol/L) Kalibrationslösungen:

5 ml Meßkölbchen, STL I vorlegen und mit STL II auffüllen

Bezeichnung mL STL I mL STL II northo / npara

MIX 1 2,0 2,0 1,0 MIX 2 2,4 2,0 1,2 MIX 3 2,8 2,0 1,4 MIX 4 2,4 1,6 1,5 MIX 5 2,4 1,5 16 MIX 6 2,7 1,5 1,8 MIX 7 3,0 1,5 2,0

Validierungslösung (VAL_NPh) VAL-NPh: 2,5 ml STL I 1,6 ml STL II northo / npara = 1,56

Analysenlösungen

ANA-NPh

Spektrophotometrie

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Die Versuchsdaten wurden durch folgende Messungen erhalten

• Aufnahme der Transmissionscharakteristik von CHCl3 gegen Luft • Aufname der Nullextinktion CHCl3 gegen CHCl3 • Aufnahme der IR-Spektren von oNPh und pNPh im Bereich 900 – 815 cm-1

(Lösungen ML I und ML II) gegen CHCl3 • Doppelte Messung der Extinktionen • Messung der Lösungen MIX 1 – MIX 7 • Messung der Validierungslösung VAL-NPh • Messung der Analysenlösung(en) ANA-NPh

Auswertung

Nachfolgende Größen sind zu berechnen und im Protokoll anzugeben: • Ermittlung der Extinktionskoeffizienten ε (L/mol⋅cm) bei den Meßwellenzahlen • Berechnung der korrigierten Extinktionen (Abzug der Nullextinktion) • Berechnung der (korrigierten) Extinktionsmittelwerte sowie des Extinktions-

verhältnisses E820 / E850 • Berechnung der Stoffmengen der Isomere in den Kalibrierproben • Ermittlung der Konstanten der linearen Kalibration für die Funktion

E820/E850 = f(no-NPh/np-NPh) • Ermittlung der relativen Verfahrensstandardabweichung, RSD und Prüfung auf

Linearität • Ermittlung des Stoffmengenverhältnisses der Validierungsprobe, Berechnung der

Wiederfindungsrate und Bewertung der Richtigkeit der Methode • Ermittlung des Stoffmengenverhältnisses mit Vertrauensbereich in

Analysenproben Frage 9 Was versteht man unter dem Begriff Validierung?

Spektrophotometrie

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2. UV/VIS-Spektrophotometrie 2.1 Spekrophotometrische Bestimmung von Nitrit in Oberflächenwasser nach

DIN 38 405 Tl. 10

Grundlage des analytischen Verfahrens

Das Verfahren ist geeignet zur Bestimmung von Nitrit-Stickstoff in Massenkonzentrationen von 0,005 bis etwa 10 mgN/L.

Die analytische Grundlage des Verfahrens bildet gemäß Reaktionsschema 1 die Diazotierung von Sulfanilamid in saurer Lösung bei pH ≈ 1,9 und nachfolgende Kupplung der Diazoniumverbindung mit N-(1-Naphthyl)-ethylen-diamin zu einem roten Azofarbstoff mit einem Absorptionsmaximum bei λ = 540 nm. Der Nitrit-Gehalt wird nach dem DIN-Verfahren über eine Kalibration ermittelt. Grundlage bildet das Lambert-Beer-Gesetz.

Reaktionsschema 1

Durchführung

Herstellung bzw. bereits vorbereitete Lösungen

Alle Chemikalien müssen dem Reinheitsgrad „zur Analyse“ entsprechen. Für die Herstellung von Lösungen ist jeweils destilliertes Wasser zu verwenden.

1. Reagenzlösung (RGL) (wird vom Assistenten zur Verfügung gestellt)

4,0 g Sulfanilamid werden in einer Mischung von 10 ml ortho-Phosphorsäure (ρ = 1,71 g/mL) und 50 ml Wasser gelöst und danach mit 0,25 g N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-dihydro-chlorid versetzt. In einem Meßkolben wird die Lösung zu 100 mL mit Wasser aufgefüllt. (1 Monat Haltbarkeit der Lösung bei 4°C im Dunkeln!)

+(H+)

+

Azofarbstof f

2HCl.

NH2 - (CH2)2 - NH2HOSO3 NN

NH2(CH2)2NH2.2HCl+

HOSO3 N2H

N2HHOSO3HNO2+NH2HOSO3

+(H+)

+

Azofarbstof f

2HCl.

NH2 - (CH2)2 - NH2HOSO3 NN

NH2(CH2)2NH2.2HCl+

HOSO3 N2H

N2HHOSO3HNO2+NH2HOSO3

Spektrophotometrie

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2. Nitrit-Stammlösung (STL) (wird vom Assistenten zur Verfügung gestellt)

24,63 ± 0,02 mg Natriumnitrit (1 h bei 150 °C getrocknet) werden in einem 100 mL Meßkolben gelöst und mit Wasser aufgefüllt. (1 Monat Haltbarkeit bei 4°C im Dunkeln!) 1 mL Lösung enthält 50 µg N.

3. Nitrit-Standardlösung (STDL) (wird vom Assistenten zur Verfügung gestellt)

2,5 mL Nitrit-Stammlösung STL werden in einem 250 mL Meßkolben mit Wasser aufgefüllt. 1 mL Lösung enthält 0,5 µg N.

4. Validierungslösung (VAL_NO2) (wird vom Assistenten zur Verfügung gestellt)

5. Analysenlösungen (AL_NO2) (wird vom Assistenten zur Verfügung gestellt)

Meßanweisung (für Specord M 500):

• Meßwellenlänge: λ = 540 nm • Korrektur: Standard gegen Wasser • Zweifache Extinktionsmessung, tabellarischer Ausdruck der Meßreihen

Kalibrierlösungen (KL)

Es sind zehn Nitrit-Standardlösungen herzustellen. Hierfür sind IM VORFELD die notwendigen Volumina der STDL zu berechnen (zur Verfügung stehen 25er Messkölbchen).

ml STDL

µg N/ mL

0,0 0,016 0,025 0,033 0,041 0,049 0,058 0,066 0,074 0,082

Bezeichnung

KL-0

KL-1

KL-2

KL-3

KL-4

KL-5

Kl-6

KL-7

KL-8

KL-9

Mit Wasser wird auf ca. 20 mL aufgefüllt, nach Zugabe von 1,0 ml Reagenzlösung (RGL) wird geschüttelt und mit Wasser aufgefüllt. Nach 20 - 30 min wird die Extinktion der Lösungen gemessen.

Die experimentelle Durchführung zur Ermittlung des Gehalts von Validierungs- und Analysenlösung erfolgt nach der gleichen Prozedur wie die Kalibrierung.

Spektrophotometrie

20

Auswertung

• Erstellung eines Excelprogramms (Einführung erfolgt durch Assistenten)

• Ermittlung der Verfahrenskenndaten für die Grundkalibrierung

• Prüfung der Richtigkeit mit der Validierungslösung VAL_NO2

• Ermittlung des Gehalts der Analysenlösung AL_NO2 Frage 10 Wie kann die Nachweisgrenze in der Photometrie verbessert werden? Frage 11 Warum verbessert die Verwendung einer 10 cm Küvette nicht die Nachweisgrenze? Zusatzaufgaben für die UV/Vis-Spektrophotometrie

Z.3 Spektrophotometrischen Bestimmung von Methylenblau in Wasserproben im ppb-Bereich mittels Derivativspektroskopie

Analytische Problemstellung

Die Bestimmung anionischer Tenside (langkettige Sulfonate) in Wasserproben erfolgt nach dem Verfahren DIN 33 409-H23-1, welches darauf beruht, daß die anionischen Tenside mit Methylenblau einen farbigen Komplex bilden, der mit Chloroform extrahiert und zur quantitativen photometrischen Analyse bei 680 nm gemessen wird. Das Verfahren ist anwendbar für Gehalte im Bereich 20 – 150 µg/100 mL Probe-lösung. Es steht zur Aufgabe, das Verfahren für Probengehalte < 20 µg/100 mL zu erweitern und die prinzipielle Eignung der Derivativspektroskopie für diese Bereiche mit wesentlich niedrigeren Nachweisgrenzen mit dem Reagenz Methylenblau zu testen. Durchführung

• Verwendet wurden:

- 8 Kalibrationslösungen (Kal 1 bis Kal 8): Kal 1 Kal 2 Kal 3 Kal 4 Ka 5 Kal 6 Kal 7 Kal 8 29 43 58 72 144 173 216 288 ppb

- Validierungsprobe (Val): 101 ppb • Im Bereich der längstwelligen Absorptionsbande wurden von diesen Lösungen mit

der Korrektur Standard Absorptionsspektren aufgenommen. • Nach Aufnahme aller Spektren wurde in Data Handling die 1. Ableitung der

Spektren dargestellt.

Spektrophotometrie

21

Auswertung

• Die lineare Kalibrationsfunktion ist zu erstellen! Für den Informationswert ist der

Abstand der zur jeweiligen Probe gehörenden Extrema im 1. Ableitungsspektrum zu verwenden!

• Die Linearität der Kalibrierfunktion ist statistisch zu prüfen! Folgende Verfahrenskenndaten sind zu bestimmen

• Konstanten der linearen Regression, ao und a1

• Reststandardabweichung, sy.x

• Verfahrensstandardabweichung, sx.o

• Nachweis- (xNG) und Bestimmungsgrenze für die Präzision 30 % (xBG) • Das Analysenergebnis der Validierungsprobe ist mit Vertrauensbereich anzugeben

und das Ergebnis ist zu bewerten! Frage 12 Für welche analytischen Aufgabenstellungen ist die Derivativspektroskopie anzuwenden?

Z.4 Bestimmung der Wirkstoffe Acetylsalicylsäure und Caffein

(Zweikomponentenanalyse mit überlagerten Spektren)

Analytische Aufgabenstellung

Im Rahmen der Qualitätskontrolle eines Arzneimittels (Tablette) mit den Wirkstoffen Acetylsalicylsäure (ASS) und Caffein (CAF) ist für die routinemäßige Überprüfung des Wirkstoffgehaltes bei der Arzneimittelfertigung (CUT = Content Uniformity Test) eine schnelle und einfache Methode zu entwickeln. Es ist die UV-spektrophotometrische Zweikomponentenmethode mit überlagerten Spektren zu prüfen. Die Wirkstoffgehalte sind wie folgt deklariert: 120 mg ASS und 60 mg Caffein pro 200 mg Tablette. Der restliche Massenanteil entfällt auf das Placebo (Stabilisatoren usw.), das jedoch oberhalb 250 nm nicht absorbiert.

Lösungsweg, Herstellung der Meßlösung ML sowie der Validierungslösungen VAL

Für die Zubereitung der Prüflösung werden 5 Tabletten in 1 L 50 %igem Ethanol gelöst. 50 mL dieser Prüflösung (PL) werden mit 50 %igem Ethanol zu 1 L verdünnt (Meßlösung ML), von der das UV-Spektrum im Bereich 220 bis 300 nm gemessen wird. Die Konzentrationen betragen 30 mg/L ASS und 15 mg/L CAF. Zur Eignungsprüfung der Photometrie für die analytische Aufgabenstellung, d. h. die Prüfung auf Richtigkeit, werden zwei Validierungslösungen (VAL 1 und VAL 2) zubereitet: je 30 mg/L ASS, 15 mg/L CAF und 20 mg Placebo. Zur Prüfung der Richtigkeit der Methode ist der Wirkstoffgehalt ASS und CAF mittels der einfachen Zweikomponentenmethode mit überlagerten Spektren bei zwei Auswertewellenlängen mit den Prüflösungen VAL 1 und VAL 2 zu ermitteln. Die Eignung ist an Hand der Wiederfindungsrate zu prüfen.

Spektrophotometrie

22

Die erforderlichen spezifischen Exktionen (ε) an den Auswertewellenlängen (λ1 und λ2) wurden aus 6 Kalibrationslösungen der reinen Komponenten ASS und CAF (KL_ASS ... und KL_CAF ...) ermittelt Verwendete Lösungen: Lösung

CAF Mg/100 mL

ASS mg/100 mL

Kal 1 1,144 2,493 Kal 2 1,314 2,806 Kal 3 1,495 3,009 Kal 4 1,737 3,226 Kal 5 1,899 3,396 Kal 6 2,117 3,500 VAL 1 1,518 2,99 VAL 2 1,514 2,99

Die Versuchsdaten wurden durch folgende Messungen erhalten

• Registrierung des UV-Spektrums jeweils einer der 6 Kalibrationslösungen der

reinen Komponenten ASS und CAF im Bereich 220 bis 300 nm • Auswahl der Auswertewellenlängen λ1 und λ2

Aufgaben • Ermittlung der Extinktion bei den ausgewählten Wellenlängen für KL_ASS1 bis

KL_ASS6 und KL_CAF1 bis KL_CAF6 mit tabellarischem Ausdruck der Daten • Ermittlung der spezifischen Extinktionen (ε) an den Auswertewellenlängen • Ermittlung der Extinktionswerte an den Auswertewellenlängen für die zwei

Validierungslösungen VAL 1 und VAL 2 • Berechnung des Gehalts an ASS und CAF • Berechnung der Wiederfindungsrate und Bewertung des Ergebnisses • Für die Datenauswertung (Ermittlung der spezifischen Extinktionen der Analyten,

des Gehalts der Validierungslösungen sowie der Wiederfindungsrate) ist ein Excelprogrammzu erstellen (Rücksprache Praktikumsassistent).