API5000TMLC/MS/MSLC/MS/MSシステムをシステムを · Toray Research Center, Inc. 1.導入しているLC/MS/MS API 5000（AB/MDS Sciex） UPLC API 4000（AB/MDS Sciex） Agilent1100

API5000API5000TMTMLC/MS/MSLC/MS/MSシステムをシステムを

用いた高速定量分析法の開発について用いた高速定量分析法の開発について

株式会社東レリサーチセンター株式会社東レリサーチセンター薬物動態研究室薬物動態研究室廣川廣川順一順一[email protected][email protected]

Toray Research Center, Inc.

内容内容

1. 導入しているLC/MS/MS2. 分析法確立までの留意点3. MS/MS条件の最適化（キサンチン類の測定）4. キサンチン類の前処理及び測定5. API5000高速分析実験例6. キャリーオーバー対策7. トラブル事例と解決策8. まとめ


1.1.導入している導入しているLC/MS/MSLC/MS/MS

API 5000API 5000（（AB/MDS AB/MDS SciexSciex）） UPLCUPLCAPI 4000API 4000（（AB/MDS AB/MDS SciexSciex）） Agilent1100Agilent1100

PALPALPALPAL－－New washNew wash

4000 QTRAP4000 QTRAP（（AB/MDS AB/MDS SciexSciex）） Agilent1100 Agilent1100 API 3000API 3000（（AB/MDS AB/MDS SciexSciex）） Agilent1100Agilent1100API 365API 365（（PEPE SciexSciex）） Agilent1100 Agilent1100

TSQ QuantumTSQ Quantum（（Thermo Thermo FinniganFinnigan））TSQ 7000 API 2TSQ 7000 API 2（（FinniganFinnigan MATMAT））TSQ 7000TSQ 7000（（FinniganFinnigan MATMAT））


11--11..導入している導入しているLC/MS/MS LC/MS/MS API5000API5000--UPLCUPLCシステムシステム


22--11..分析法確立までの留意点分析法確立までの留意点

測定条件測定条件

（１）分析カラム夾雑成分との分離を最優先ﾊｲｽﾙｰﾌﾟｯﾄ用分析カラム（高理論段数）の使用ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ，ｽﾃｯﾌﾟｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄを利用

（２）オートサンプラーｷｬﾘｰｵｰﾊﾞｰ対策（洗浄溶媒，洗浄時間の検討，検量線範囲，注入量等）

（３）質量分析計ﾏﾄﾘｯｸｽ効果の低減化ｲｵﾝ化の飽和ﾃﾞｰﾀﾎﾟｲﾝﾄ数クロストーク分解能



測定条件の設定（標準溶液使用）測定条件の設定（標準溶液使用）

定量下限定量下限で使用する溶媒で使用する溶媒

移動相移動相 AA ギ酸，酢酸を含む水ギ酸，酢酸を含む水

ギ酸アンモニウム，酢酸アンモニウムギ酸アンモニウム，酢酸アンモニウムBB アセトニトリル，メタノールアセトニトリル，メタノール

カラムカラム ODS,ODS, C8C8，，HILICHILIC

条件条件グラジエントグラジエント 1010--90%B90%Bアイソクラティックアイソクラティックピーク形状で判断ピーク形状で判断



洗浄溶媒の検討洗浄溶媒の検討

定量定量上限の溶液上限の溶液キャリーオーバーの確認キャリーオーバーの確認

AgilentAgilent11001100UPLCUPLCCTC CTC PALPAL new wash new wash

シリンジの大きさシリンジの大きさ (24 (24 µµL, 55 L, 55 µµL)L)強洗浄溶媒強洗浄溶媒

22--propanol/MeCN/HCOOHpropanol/MeCN/HCOOH，，SDS/SDS/MeCNMeCN，，NHNH33/H/H22O/MeCNO/MeCN

弱洗浄溶媒弱洗浄溶媒移動相（初期移動相）移動相（初期移動相）

洗浄溶媒の種類によって保持時間に影響を及ぼすので注意洗浄溶媒の種類によって保持時間に影響を及ぼすので注意

11 種種22 種種22 種種



前処理条件の検討前処理条件の検討

前処理前処理除タンパク（ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ，メﾀﾉｰﾙ等）除タンパク（ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ，メﾀﾉｰﾙ等）除タンパクフィルター除タンパクフィルター緩衝液での希釈（尿）緩衝液での希釈（尿）

液液液液抽出抽出

固固相相抽出（逆相，イオン交換等），抗体ｶﾗﾑの利用抽出（逆相，イオン交換等），抗体ｶﾗﾑの利用

注意点注意点除タンパク除タンパク小刻みにボルテックスによる攪拌小刻みにボルテックスによる攪拌液液液液抽出抽出採取する位置採取する位置固相抽出固相抽出洗浄溶媒洗浄溶媒

抽出溶媒抽出溶媒


22--5.5.分析法確立までの留意点分析法確立までの留意点

前処理及び測定条件の確認前処理及び測定条件の確認

前処理前処理検量線上限検量線上限検量線検量線下限下限ブランクブランクサンプルサンプルゼロサンプルゼロサンプル

測定条件測定条件夾雑成分との分離夾雑成分との分離定量下限定量下限検量線範囲の確認検量線範囲の確認キャリーオーバーの確認キャリーオーバーの確認

S/NS/N ≥≥ 55上限は飽和しないか？上限は飽和しないか？注入量を減らす注入量を減らす試料濃度を薄くする試料濃度を薄くする検量線検量線上限の設定を下げる上限の設定を下げる



その他注意することその他注意すること

最適化最適化多成分同時分析多成分同時分析感度の悪いものに最適化する感度の悪いものに最適化する感度のよすぎるものに対しては最適値からずらす感度のよすぎるものに対しては最適値からずらす

再溶解での注意点再溶解での注意点多成分では溶解度に差があるため，有機溶媒を先に添加多成分では溶解度に差があるため，有機溶媒を先に添加ボルテックスによる攪拌、超音波処理を入念に行うボルテックスによる攪拌、超音波処理を入念に行う溶媒量を増やし、濃度を薄くし、注入量を増やす溶媒量を増やし、濃度を薄くし、注入量を増やす

希釈での注意点希釈での注意点水系が多い溶媒での希釈は吸着がおこる可能性が高い水系が多い溶媒での希釈は吸着がおこる可能性が高い移動相より有機溶媒比が高い溶媒では注入後，ピーク割れやピーク形状移動相より有機溶媒比が高い溶媒では注入後，ピーク割れやピーク形状が悪くなるが悪くなる


33--1.1. MS/MSMS/MS条件の最適化条件の最適化

キサンチン類の構造式キサンチン類の構造式

キサンチンのメチル誘導体であるキサンチンのメチル誘導体であるテオフィリン，テオブロミンテオフィリン，テオブロミン，，カフェインはカフェインは大脳皮質及び延髄の興奮により，大脳皮質及び延髄の興奮により，中枢機能および循環機能の亢進を起こす．中枢機能および循環機能の亢進を起こす．これらのメチルキサンチンは天然に存在する．これらのメチルキサンチンは天然に存在する．

N

N N

HN

O

CH3

H3C

O

Theophyline Theobromine Caffeine

HN

N N

N

O

CH3

O

CH3

N

N N

N

O

CH3

H3C

O

CH3

xanthine

HN

NH

N

HN

O

O

コーヒーの種子：カフェインコーヒーの種子：カフェイン茶の葉：カフェイン，テオフィリン茶の葉：カフェイン，テオフィリンココア：テオブロミン，カフェインココア：テオブロミン，カフェイン


33--22. . MS/MSMS/MS条件の最適化条件の最適化

キサンチン類の構造式と分子量キサンチン類の構造式と分子量

スペクトル測定スペクトル測定

溶解度溶解度アセトニトリルアセトニトリルメタノールメタノール水

HN

N N

N

O

CH3

O

CH3

N

N N

HN

O

CH3

H3C

O

xanthine

Theophyline Theobromine Caffeine

N

N N

N

O

CH3

H3C

O

CH3

HN

NH

N

HN

O

O

M.W. 194M.W. 180M.W. 180

M.W. 152Caffeine-d3M.W. 197

I.S.I.S.

13

7

○○○○△△水

N

N N

N

O

CH3

D3C

O

CH3溶解度を知ることが，重要溶解度を知ることが，重要前処理，再溶解溶媒前処理，再溶解溶媒

内標の選定内標の選定dd体を選択しても，楽に定量はできないこともある体を選択しても，楽に定量はできないこともある


3-3. MS/MS条件の最適化Q1/Q3 の最適化

イオン化とはイオン化とは．．．．．．分子を気化させて，プロトンが負荷（正イオン分子を気化させて，プロトンが負荷（正イオン [[M+HM+H]]++））

プロトンを失うプロトンを失う（負イオン（負イオン [[MM––HH]]––））

NN2Q1Q1[[M+HM+H]]++

フラグメントイオン（フラグメントイオン（QQ33））[([(MM--56)56)+H+H]]++

2

1. Quantitative Optimization (Infusion)MS/MS Analysis を選択Q1/Q3の設定6ピーク（Intensityの高いものから）Declustering Potential (DP）, Colligion Energy （CE）, Collision Cell Exit Potencial (CXP) の最適化

2. Manual TuningScan Type Q1 MS (Q1)

Product Ion MS2 (Q3)CE の値 10,20,30,40


33--44. . MS/MS条件の最適化Ion Ion optics poptics pathath

Q0 Q1 Q2 Q3

Orifice (OR)

DP CE

ST3ST2ST1

CXPEP

Collision Gas (CAD)Curtain Gas (CUR)GS1

GS2

Temp

API-5000

DP: to minimize solvent cluster ionsEP: guide and focus the ionsCE: accelerate into the Q2 collision cellCXP: focus and accelerate the ions out of the collision cellGS1 : nebulizer gasGS2: turbo gasCUR: flow between the curtain plate and the olificeCAD: to fragment the precursor ionsTEM: to help evaporate the solvent

Compound-dependent

Source-dependent

QJet


33--55. . MS/MS条件の最適化API5000API5000ととAPI4000API4000でのマスでのマススペクトルデータの比較スペクトルデータの比較

（（Product ion scan Product ion scan での結果での結果））

API5000API5000

10 10 ng/mLng/mL

溶解溶媒での比較溶解溶媒での比較

API4000API4000

CE30TheophylineTheophyline

m/z 181.1

CE30

m/z 181.1

3030000000

1155000000

IntensityIntensity

1251250000

44000000

IntensityIntensity

水水//アセトニトリルアセトニトリル

0.10.1 volvol%%AcOHAcOH//メタノールメタノール

水水//アセトニトリルアセトニトリル

0.10.1 volvol%%AcOHAcOH//メタノールメタノール

m/z

m/z


33--66. . MS/MS条件の最適化TheophylineTheophyline 及び及びTheobromineTheobromine ののマスマススペクトルデータ比較スペクトルデータ比較（（ Product ion scan Product ion scan での結果での結果））

Scan type Scan type Product ion Product ion MS2MS2

CE 20CE 20,, 3030,, 4040

N

N N

HN

O

CH3

H3C

O

Theophyline

Theobromine

HN

N N

N

O

CH3

O

CH3

m/z

mm//zz 112424..22

mm//zz 69.69.00

CE40

CE30

CE30

CE20TheobromineTheobromine

TheophylineTheophyline mm//zz 181.1181.1

mm//zz 181.1181.1

mm//zz 113838.1.1

mm//zz 96.196.1

mm//zz 1110.10.00mm//zz 69.069.0

3030000000

IntensityIntensity

3030000000

66000000

8787000000


33--77. . MS/MS条件の最適化TheobromineTheobromineのマススペクトルとのマススペクトルとクロマトグラムクロマトグラム及び及びTheophylineTheophyline のクロストークのクロストーク

181.4/138.1181.4/138.1

181.4/110.0181.4/110.0

181.4/69.0181.4/69.0

Q1/Q3Q1/Q3

TheobromineTheobromine

2255000000

1100000000

40400000

IntensityIntensity

Column Column HypersilHypersil Gold Gold , 2., 2.11 mm mm i.di.d. x . x 550 mm, 0 mm, 1.91.9µµm, m, TermoTermoMobile Phase A 1 Mobile Phase A 1 volvol% AcOH/H% AcOH/H22OOMobile Phase B 1 Mobile Phase B 1 volvol% % AcOH/MeOHAcOH/MeOHTime program 0 Time program 0 →→ 1.51.5 min A/B = min A/B = 9090/1/100 →→ 4040//6060Flow rate 600 Flow rate 600 µµL/minL/min

2 min

mm//zz 138.1138.1mm//zz 110.0110.0mm//zz 69.069.0

Theophyline のクロストーク

CE30CE30

m/z

3 min

IntensityIntensity

220000000000

m/z


33--88. . MS/MS条件の最適化TheophylineTheophyline及び及びTheobromineTheobromineのクロマトグラムのクロマトグラム（（Q1/Q3 Q1/Q3 のの選択）選択）

TheobromineTheobromine

TheoTheophylinephyline

181.3/181.3/138.2138.2

クロストークの影響もないクロストークの影響もない

Q1/Q1/Q3Q3IntensityIntensity

99000000

25250000

3 min

181.1/181.1/124.2124.2

1.5 min

Column Column HypersilHypersil Gold Gold , 2., 2.11 mm mm i.di.d. x . x 550 mm, 0 mm, 1.91.9µµm, m, TermoTermoMobile Phase A 1 Mobile Phase A 1 volvol%% AcOH/HAcOH/H22OOMobile Phase B 1 Mobile Phase B 1 volvol%% AcOH/MeOHAcOH/MeOHTime program 0 Time program 0 →→ 1.51.5 min A/B = min A/B = 9090/1/100 →→ 4040//6060Flow rate 600 Flow rate 600 µµL/minL/min


33--99. . MS/MS条件の最適化33化合物化合物+IS+ISの最適化の最適化の結果の結果

TheophylineTheophylineTheobromineTheobromineCaffeineCaffeineCaffeineCaffeine-d3

Q1/Q1/Q3Q3 TheophylineTheophyline TheobromineTheobromineCaffeineCaffeine181.1/181.1/124.2124.2181.3/181.3/138.2138.21195.295.2//138.1138.1198.2/198.2/138.2138.2

N

N N

HN

O

CH3

H3C

O

HN

N N

N

O

CH3

O

CH3

N

N N

N

O

CH3

H3C

O

CH3

N N

HN

CH3

O N N

N

CH3

O

CH3

N

OH3C HN

O

m/z 138m/z 124

TheophylineTheophylineTheobromineTheobromineCaffeineCaffeineCaffeineCaffeine-d3

DP EP DP EP CECE CXPCXP80 10 80 10 2525 2525

100 14 100 14 2525 202090 14 90 14 2525 202090 12 90 12 3030 2020

N

OH3C

CADCAD CUR GS1 GS2 IS TEPCUR GS1 GS2 IS TEP66 10 50 10 50 5050 5500 6505500 650


44..キサンチン類の前処理及び測定測定方法測定方法

コンピュータがコンピュータが22台存在（パソコン画面が台存在（パソコン画面が22台）台）

API5000API5000 を先にを先にwaitwait状態状態UPLCUPLC の測定を開始の測定を開始

問題点：それぞれにファイル名を入力する手間問題点：それぞれにファイル名を入力する手間

UPLCUPLCののInjection Injection を感知して，を感知して，MSMSデータの取り込みが開始データの取り込みが開始


44--1. 1. キサンチン類の前処理方法キサンチン類の前処理方法

（固相抽出）（固相抽出）固相抽出総合カタログ固相抽出総合カタログSUPELCOSUPELCOより引用より引用

Discovery DSCDiscovery DSC--18185050 mg/1mLmg/1mL コンディショニングコンディショニング

MeOHMeOH 0.5 0.5 mLmLHH22O O 0.5 0.5 mLmLウサギ血漿ウサギ血漿

100100 µµLL洗浄洗浄5 5 volvol%% MeOHMeOH 0.5 0.5 mLmL

溶出溶出MeOHMeOH 0.5 0.5 mLmL

窒素気流下窒素気流下乾燥乾燥再溶解再溶解

11 volvol%% AcOH/MeOHAcOH/MeOH (90:10)(90:10)100 100 µµLL

5 5 µµLL注入注入


44--22..キサンチン類の前処理及び測定キサンチン類の測定結果キサンチン類の測定結果

TheophylineTheophyline CaffeineCaffeine

Area

rat

io

Area

rat

io

11--10001000 ng/mLng/mL 11--10001000 ng/mLng/mL

Concentration (ng/mL)Concentration (ng/mL)

TheobromineTheobromineAnalyte

Theophyline –0.00159 0.00677 0.9934Caffeine 0.0165 0.0108 0.9969

Theobromine 0.0104 0.00216 0.9958Calibration curve (y = a + bx )Linear regression (1/x 2 weighting)

a b r

Area

rat

io

55--10001000 ng/mLng/mL

Concentration (ng/mL)


44--33..キサンチン類の前処理及び測定BlankBlank samplesample及び及びLLQCLLQCのクロマトグラムのクロマトグラム

Blank sample LLQC

1 ng/mL

1 ng/mL

5 ng/mL

I.S.

Theophyline

Theobromine

Caffeine

3 min 3 min

2000

1400

1200

3000

Intensity5000

6000

2500

45000

Intensity

Column Column Super ODS, 2.0 mm Super ODS, 2.0 mm i.di.d. x 100 mm, 2.0. x 100 mm, 2.0µµm, TOSOHm, TOSOHMobile Phase A Mobile Phase A 1 1 volvol%% AcOH/HAcOH/H22OOMobile Phase B Mobile Phase B 1 1 volvol%% AcOH/MeOHAcOH/MeOHTime program Time program 0 0 →→ 3 min A/B = 88/123 min A/B = 88/12Flow rate Flow rate 600 600 µµLL/min/minInjection volume Injection volume 55 µµLL

Caffeine-d3


55--11. . API5000API5000高速分析実験例高速分析実験例(1)(1)プロスタグランジン（プロスタグランジン（PGPG）類の構造式）類の構造式

COOH

HO

HO OH

COOH

HO

HO OH

COOH

HO

HO OH

OH

COOH

HO

HO

COOH

HO

HO OH

COOH

HO

HO OH

11β-epi-PGF2α9β-PGF2α 8-epi-PGF2α

5-trans-PGF2α PGF2α 15-epi-PGF2α

88--epiepi--PGFPGF22ααは組織障害や疾病の悪化に関与，血管収縮作用を有する．は組織障害や疾病の悪化に関与，血管収縮作用を有する．


55--22. . API5000API5000高速分析実験例高速分析実験例(1)(1)PGPGの測定の測定

従来法従来法

HPLCHPLC：：ACQUITY UPLCACQUITY UPLCTMTM (Waters)(Waters)分析カラム：分析カラム：ACQUITY UPLC BEH C18, ACQUITY UPLC BEH C18, 100 mm 100 mm ×× 2.1 mm, 1.7 2.1 mm, 1.7 µµmm移動相：移動相：アセトニトリルアセトニトリル//水水//酢酢酸酸 (30/70/0.01)(30/70/0.01)Flow rateFlow rate：：0.4 0.4 mLmL/min/minMass spectrometerMass spectrometer：：API5000 (AB/MDS API5000 (AB/MDS SciexSciex))

HPLCHPLC：：HP1100 (HP1100 (AgilientAgilient Technologies)Technologies)分析カラム分析カラム：：SuperspherSuperspher RPRP--8 (125 mm 8 (125 mm ×× 4.6 mm, 4 4.6 mm, 4 µµm)m)移動相：アセトニトリル移動相：アセトニトリル//水水//酢酸酢酸 (30/70/0.01)(30/70/0.01)Flow rateFlow rate：：0.4 0.4 mLmL/min/minMass spectrometerMass spectrometer：：TSQ7000 (Thermo Electron)TSQ7000 (Thermo Electron)

8-epi-PGF2α

PGF2α

9β-PGF2α

11β-PGF2α8-epi-PGF2α

5-trans-PGF2α

PGF2α

15-epi-PGF2α

5 min

5 min

25 min


55--33. . API5000API5000高速分析実験例高速分析実験例(2)(2)アンジオテンシン類のアミノ酸配列とアンジオテンシン類のアミノ酸配列と

マススペクトルマススペクトル

レニン・アンジオテンシン系は生体のレニン・アンジオテンシン系は生体の血圧調節及び電解質バランスの維持血圧調節及び電解質バランスの維持に重要な役割をはたしている．に重要な役割をはたしている．AngAng I I はは1010残基のアミノ酸からなる残基のアミノ酸からなる

ペプチドで，肝臓で産生されるペプチドで，肝臓で産生されるアンジオテンシノーゲンに，腎臓で主にアンジオテンシノーゲンに，腎臓で主に産生されるレニンが作用することによって産生されるレニンが作用することによって遊離されることが知られている．遊離されることが知られている．アンジオテンシン変換酵素により，アンジオテンシン変換酵素により，AngAng IIののCC末端側のアミノ酸残基が末端側のアミノ酸残基が22つ切断つ切断されたされたAngAng IIIIは，血管収縮や，水・電解質は，血管収縮や，水・電解質

の再吸収促進など，様々な生理機能の再吸収促進など，様々な生理機能を発揮し，血圧を上昇の方向へと導いているを発揮し，血圧を上昇の方向へと導いていると考えられている．と考えられている．AngAng IIIIIIははAngAng IIIIののNN末端のアミノ酸残基が末端のアミノ酸残基が11つ切断されたペプチドである．

NH2―Asp―Arg―Val―Tyr―Ile―His―Pro―Phe―His―Leu―OH

NH2―Asp―Arg―Val―Tyr―Ile―His―Pro―Phe―OH

NH2―Arg―Val―Tyr―Ile―His―Pro―Phe―OH

Angiotensin I (Ang I)

Angiotensin II (Ang II)

Angiotensin III (Ang III)

[M + H]+[M + 2H]2+

[M + 2H]2+

Inte

nsity

Inte

nsity

Inte

nsity

[M + H]+

[M + H]+[M + 2H]2+

m/z 649

m/z 524

m/z 467

Ang I

Ang II

Ang III

m/z 649 → 269

m/z 524 → 263

m/z 467 → 263

つ切断されたペプチドである．

m/z


55--44. . API5000API5000高速分析実験例高速分析実験例(2)(2)アンジオテンシン類の測定アンジオテンシン類の測定

ZORBAX Poroshell 300Eztend-C182.1 mm x 75 mm, 5µmMobile phase A: 10 mmol/L ammonium formate (pH 10)

B: AcetonitrileGradient A/B=90/10→50/50→90/10 (0.0→6.0→6.1 min)Flow rate 0.20 mL/min

20 ng/mLAngiotensin I

Angiotensin II

Angiotensin III

[Val5]-Angiotensin I

[Val5]-Angiotensin II

[Val4]-Angiotensin III

33221100

上清を濃縮乾固上清を濃縮乾固

血漿血漿 0.5 0.5 mmLL

ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ 1 1 mmLL

LC/MS/MS 5 LC/MS/MS 5 µµL L 注入注入

内標準物質内標準物質

攪拌，遠心分離攪拌，遠心分離

移動相移動相 0.1 0.1 mmLL

44

前処理フロー前処理フロー

保持時間（分）保持時間（分）


6.6. キャリーオーバーキャリーオーバー対策対策

問題点：問題点：・定量値へ与える影響は大・定量値へ与える影響は大・繰り返し分析により，バックグランドが上昇・繰り返し分析により，バックグランドが上昇・次の試料のクロマトグラムの形状，定量値への影響・次の試料のクロマトグラムの形状，定量値への影響

対策：対策：・高濃度のサンプルを注入しない．検量線範囲の見直し・高濃度のサンプルを注入しない．検量線範囲の見直し・夾雑成分などの汚れにより誘起される場合もあるため，・夾雑成分などの汚れにより誘起される場合もあるため，精製度の低い試料の注入は控える．精製度の低い試料の注入は控える．・・time program time program において有機溶媒比を高い設定にして，において有機溶媒比を高い設定にして，

カラムの洗浄工程を加える．カラムの洗浄工程を加える．・配管の繋ぎ目，インジェクションポートの洗浄・配管の繋ぎ目，インジェクションポートの洗浄・測定後は，有機溶媒・測定後は，有機溶媒//水等（水等（22--propanol/Hpropanol/H22OO）で洗浄する）で洗浄する


66--1.1. キャリーオーバーキャリーオーバー対策対策--11UPLCUPLC洗浄システムの構造洗浄システムの構造

弱溶媒弱溶媒

強溶媒強溶媒


66--22. . キャリーオーバー対策キャリーオーバー対策--22（（CTC PAL New wash stationCTC PAL New wash station））

サイドポートサイドポート

Pump 1Pump 1Pump 2Pump 2

シリンジシリンジ

ニードルニードル

Injection PortInjection PortWash Wash StationStation

プランジャープランジャー

Wash 1Wash 1Wash 2Wash 2


66--33. . キャリーオーバー対策キャリーオーバー対策--22（（New wash stationNew wash stationののtimetime program program ））

1 pre clean with sol 2 12 Neelde outside clean sol 1 23 Neelde outside clean sol 2 24 Neelde inside clean sol 1 15 Loop Rinse Time sol 2 (s) 6

6 Air vol up (uL) 2

7 Air vol down (uL) 28 SP syringe clean time 1(s) 109 SP syringe valv clean time 1(s) 1010 SP syringe valv clean time 2(s) 511 Valve clean time sol 1 (s) 512 Valve clean time sol 2 (s) 513 Valve switch cycle 1014 V_switch interval (s) 2

ニードル外側洗浄ニードル外側洗浄

ニードル内側洗浄ニードル内側洗浄

サンプルループ洗浄サンプルループ洗浄

サンプルをエアで挟み込むサンプルをエアで挟み込む

サイドポートからシリンジ洗浄サイドポートからシリンジ洗浄

サイドポートからバルブ洗浄サイドポートからバルブ洗浄

ポンプからバルブ洗浄ポンプからバルブ洗浄


66--44. . キャリーオーバー対策キャリーオーバー対策--33（（Agilent1100Agilent1100：：Injection timeInjection time programprogramの設定）の設定）

1 draw def. amount from sample

2 needle to wash port

3 needle to wash port

4 needle into location 91

5 inject

6 wait 0.60 min

7 valve bypass

8 draw 80.0 uL from location 92

9 eject 80.0 uL from into air

10 draw 80.0 uL from location 93

11 eject 80.0 uL from into seat max speed

12 wait 3.5 min

13 valve mainpass

14 valve bypass

ニードル外側洗浄ニードル外側洗浄

Vial 91Vial 91でニードル洗浄でニードル洗浄

Vial 92Vial 92の洗浄溶媒の吸入の洗浄溶媒の吸入

シートの洗浄シートの洗浄Vial 93Vial 93の洗浄溶媒の吸入の洗浄溶媒の吸入排出排出

測定時間測定時間

ValveValveの洗浄（メインパス）の洗浄（メインパス）

ValveValveの洗浄（バイパス）の洗浄（バイパス）


77--1.1. トラブル事例と解決策ピークが検出されない，感度が悪いピークが検出されない，感度が悪い

MSMS の汚れの汚れ

洗浄液洗浄液

洗浄場所洗浄場所

確認確認

22--propanolpropanol5050vol%MeOH/H2O (1 vol%MeOH/H2O (1 volvol% HCOOH)% HCOOH)

Curtain plate, Orifice, ProbeCurtain plate, Orifice, Probe

Spray needleSpray needle 位置位置 xx, y , y


7.2.7.2. トラブル事例と解決策ピークが検出されない，感度が悪い，保持時間の変動ピークが検出されない，感度が悪い，保持時間の変動

HPLCHPLC の問題の問題

ライン及びバルブの洗浄ライン及びバルブの洗浄サンプルループサンプルループ 10,10, 2020 uLuLピークチューブピークチューブ太さ太さ移動相の移動相のpHpH変化変化移動相の置換が不十分移動相の置換が不十分

ポンプの故障？ポンプの故障？


7.3.7.3. トラブル事例と解決策トラブル事例を解決するためにトラブル事例を解決するために

トラブル事象が起こった直前の作業を見直すことトラブル事象が起こった直前の作業を見直すこと

１つ１つ原因を解明１つ１つ原因を解明一度に複数の要因を変更しない一度に複数の要因を変更しない

トラブルをよく観察するトラブルをよく観察する

マスクロマトグラムの観察マスクロマトグラムの観察測定機器の動作確認測定機器の動作確認


8.8. まとめまとめ

１１ API5000API5000高速分析は医薬品の開発スピードを上げるためには有用高速分析は医薬品の開発スピードを上げるためには有用

２２高速高感度分析を行うためには高速高感度分析を行うためにはQ1/Q3Q1/Q3，前処理，測定条件の最適化が必要，前処理，測定条件の最適化が必要

キャリーオーバー（洗浄溶媒の選択）キャリーオーバー（洗浄溶媒の選択）

キサンチン類の測定を行い，キサンチン類の測定を行い，TheophylineTheophyline Caffeine Caffeine に関してはに関しては 11--10001000 ng/mLng/mLTheobromineTheobromine に関してはに関しては 55--10001000 ng/mLng/mLで検量線の直線性が得られた．で検量線の直線性が得られた．

３３トラブルになった時はあわてずに観察することトラブルになった時はあわてずに観察すること最後まであきらめない最後まであきらめない

ご清聴ありがとうございました．ご清聴ありがとうございました．

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API5000TMLC/MS/MSLC/MS/MSシステムをシステムを · Toray Research Center, Inc. 1.導入しているLC/MS/MS API 5000（AB/MDS Sciex） UPLC API 4000（AB/MDS Sciex） Agilent1100