ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Trabajos Aplicativos en Enzimología y Genética Microbiana

ASIGNATURA : Seminario: Enzimología y Genética Microbiana

DOCENTE :

MSc. Martha Vergara Espinoza

ALUMNOS :

Rómulo Aycachi Inga

¿???????

CICLO :

2008 - I

Lambayeque, 18 de setiembre de 2008.

AVANCES EN LA TRANSFORMACIÓN EN PAPA PARA INDUCIR RESISTENCIA A TIZÓN TARDÍO

María Luisa Guevara Fujita

Bióloga; MSc.

Centro Internacional de la Papa – Departamento de Mejoramiento y Recursos Genéticos.

INTRODUCCIÓN:

La producción de papa en el mundo es afectada por enfermedades causadas por bacterias, hongos y virus. El tizón tardío, causado por Phytophthora infestans, ocasiona pérdidas de más de 15% en la producción mundial de papa. El mejoramiento convencional, que combina el uso de progenitores altamente resistentes a tizón tardío se ve dificultado por la complejidad de las características genéticas del patógeno, que son heredadas de forma cuantitativa. Recientemente, además, se ha observado la presencia de nuevas cepas del patógeno y recombinación sexual, lo cual produciría nuevos genotipos, potencialmente más virulentos.

La introducción de genes foráneos que confieran resistencia a la enfermedad es altamente deseable. En este sentido, este trabajo hace uso de genes que expresan proteínas con efecto antifúngico y antimicrobiano. Con la idea de incrementar las respuestas defensivas de la planta frente al ataque de patógenos. Se espera obtener un efecto sinérgico en la acción de estos genes cuando se usan más de dos genes por evento de transformación. Se utilizó osmotina, lisozima (bovina y del fago T4) y glucanasa. La osmotina es una proteína que se expresa en las plantas en respuesta a situaciones de estrés (salinidad, estímulo hormonal, ataque de patógenos). Se sabe que pertenece a una familia de genes que se encuentra altamente conservada en las Solanaceas y trabajos previos, indican que incrementa la resistencia a infecciones causadas por hongos en las plantas de papa. La glucanasa, por otro lado, es una proteína que cataliza la hidrólisis de polisacáridos presentes en la pared celular del hongo y la lisozima es conocida como una proteína con actividad antimicrobiana, a nivel de la pared celular de las bacterias.

MATERIALES Y MÉTODOS:

o Se desarrollaron construcciones genéticas que llevan uno, dos y tres de los genes mencionados.

o Se hicieron clonamientos a partir de un DNAc de osmotina pA13 de Solanum commersonii en un vector binario de transformación como es el pMOG800.

1

o A este, se le adicionaron, la lisozima bovina c2 y la lisozima del fago T4. Estos genes, con sus respectivos promotores y terminadores, han sido aislados en ambos sentidos de orientación respecto al vector inicial.

o El gen de la glucanasa es un DNAc (clon G46) de Solanum tuberosum. Para este gen se escogió el promotor ubiquitin 3. Este gen ha sido insertado entre la osmotina y lisozima en una sola orientación.

o Una vez obtenidos los nuevos vectores, se procedió a la transformación de las plantas. Para ello, se seleccionó la variedad Amarilis INIA, que tiene resistencia moderada a tizón tardío.

o Estos genes se introdujeron en la cepa LBA4404 de Agrobacterium. La eficiencia de transformación en esta variedad es relativamente baja.

o Se hicieron modificaciones a los medios de regeneración y la selección con el antibiótico kanamicina, también fue modificada (de 100 mg/L a 50 mg/L), debido a que los explantes en dosis altas sufrían necrosis y muerte.

o Los regenerantes obtenidos fueron colocados en medio con antibiótico, Km50 mg/L y luego fueron pasados a magentas.

o Las líneas putativamente transgénicas obtenidas de estos siete vectores, han sido chequedas por pruebas de callos y PCR. Se usan dosis altas de kanamicina y se observa la formación de callos en hojas resistentes al mismo y que por lo tanto son consideradas transgénicas.

o Para la prueba de PCR, se usó primers de kanamicina, seleccionando las líneas donde se amplificó un producto.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

Los resultados obtenidos nos permiten ver que se ha logrado transformar algunas líneas. Sin embargo, la eficiencia de transformación para esta variedad de papa es baja, del orden del 30% (32/107 líneas chequeadas).

Estas líneas obtenidas serán después sometidas a infección por el patógeno, tanto a nivel de laboratorio como a nivel de campo.

Se espera además poder aumentar el número de genes en aquellas contrucciones que sean prometedoras, en terminos de números de líneas transgénicas producidas y en cuanto al comportamiento que presentenfrente a la infección usando por ejemplo otros genes de interés que puedan incrementar la resitencia a Phytophthora.

2

3

TRANSFORMACIÓN, REGENERACIÓN Y SELECCIÓN

MANIPULACION GENETICA DE Rhizobium DE Pisum sativum MEDIANTE PLASMIDOS BACTERIANOS

RECTIFICADOS PBR322-M

INTRODUCCIÓN

Teniendo a la ingeniería genética como biotecnología de punta, cuyo objeto es el de formar nuevas combinaciones de material genético, mediante la inserci6n de DNA exógeno en un hospedero, en el cual sea capaz de expresarse y propagarse; EI presente trabajo propone un protocolo que facilita la transformación de bacterias simbióticas del género Rhizobium mediante la inserción de plásmidos pBr322-M portadores de un gen que confiere resistencia a pudrición radicular; así como amplificar y clonar el DNA exógeno del plásmido con fines de crear una biblioteca de genes.

MATERIALES Y MÉTODOS

EI proceso de transformación incluye colección, preservación en silicagel, desinfección con agua bidestilada, alcohol al 70% y C12Hg al 0.2%, de nódulos efectivos provenientes de plantas de Pisum sativum. Una vez obtenido el inóculo de los nódulos, se adicionó CI2Ca al 5% para sensibilizar la pared celular; luego de un minuto se adicionó el plásmido pBr322-M, seguidamente se dejo incubar par 10 minutos, para posteriormente proceder a1 shock fisiológico de 4°C par 10 minutos a 42°C por el mismo tiempo. La clonación de bacterias transformadas (BRT) y la amplificaci6n del DNA exógeno se realizó en medio de cultivo (MC) Elmarc y por selección de marcadores moleculares; la siembra se realizó utilizando DCA 4x3, correspondiendo TO a BRT en MC sin antibióticos; T 1 a BRT en MC con tetraciclina (Tc); T2 a BRT en MC con ampicilina (Ap) y T3 a BRT en MC con Ap x Tc. La evaluación del número de colonias y bacterias transformadas se realizó mediante conteo de cinco campos visuales.

RESULTADOS DE DISCUSION

La transformación bacteriana implica que el DNA exógeno ingresó al sistema bacteriano y forma parte de él. EI gen de interés previamente aislado y purificado fue insertado utilizando Bam HI cuya secuencia de corte GATC también escinde la región que codifica resistencia a tetraciclina (TcR), provocando que las bacterias transformadas sean susceptibles a Tc. La seguridad de bacterias Rhizobium competentes (BRT) se evidencia por la proliferación de colonias en el medio con Ap y en el medio con Ap x Tc. La no proliferación en medio con Tc implica bacterias transformadas pero por no poseer el gen de TcR, no son capaces de hacerlo, demostrando la existencia de una inhibición insercional. Experimentalmente se ha verificado que cierto porcentaje de bacterias transformadas y que incluyen el plásmido han perdido el gen de interés, posiblemente a la falta de integración o por la poca o nula

4

actividad de las secuencias promotoras o por factores de transcripción y traducción.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los plásmidos como vectores de clonación:

Los plásmidos se replican independientemente del cromosoma del hospedador. Además de llevar los genes requeridos para su propia replicación, la mayoría de los plásmidos son vectores naturales porque con frecuencia llevan otros genes que confieren propiedades importantes a sus hospedadores. Tales genes pueden ser adquiridos por recombinaciones dentro del hospedador. En ingeniería genética, los genéticos añaden genes a un plásmido en un tubo de ensayo.

Los plásmidos poseen propiedades muy útiles como vectores de clonación. En esta propiedad se incluyen:

1. Su pequeño tamaño, que hace que este DNA sea fácil de aislar y de manipular.

2. Su origen de replicación independiente, de manera que la replicación del plásmido en la célula ocurre independientemente del control directo del cromosoma.

3. Su número múltiple su numero múltiple de copias, de manera que en la célula pueden estar presentes varias o numerosas copias, lo que posibilita la amplificación del DNA.

4. La presencia de marcadores seleccionables, tales como genes de resistencia a antibióticos, haciendo así más fácil la detección y selección de los clones que contiene el plásmido.

Aunque en el ambiente natural los plásmidos conjugados se transfieren generalmente por contacto célula a célula, los plásmidos vectores de clonación han sido modificados a fin de evitar su transferencia por conjugación y así lograr su contención biológica. Sin embargo, en el laboratorio es posible realizar la transferencia por transformación o electroporación.

El plásmido pBR322

Presenta un número de características que lo hacen adecuado como vector de clonación:

1. Es relativamente pequeño, solo 4361 pares de bases.2. Se mantiene de forma estable en su hospedador (Escherichia coli) en

un número de copias relativamente elevado 20-30 copias por célula.3. Pueden ser amplificado hasta un número elevado (1000-3000 copias por

célula y aproximadamente el 40% del genoma) por inhibición de la síntesis de proteica mediante la adición de cloranfenicol.

4. Es fácil de aislar en la forma superenrollada usando diversas técnicas sencillas

5. Se puede insertar en él una cantidad razonable de DNA foráneo, aunque los insertos de más de 10 kb lo convierten en inestables.

6. Se conoce la secuencia completa de bases de este plásmido. Lo que permite localizar sitios en los que pueden actuar las enzimas de restricción.

5

7. Existen sitios únicos de corte para varias enzimas de restricción tales como PstI, SalI, EcoRI, HindIII y BamHI. Es importante disponer de un solo sitio de reconocimiento para al menos una enzima de restricción, porque así el tratamiento con esta enzima permite linearizar el plásmido sin que pierda ningún fragmento.

8. Posee un gen responsable de resistencia a ampicilina y otra que le confiere resistencia a tetraciclina. Estos genes permiten seleccionar fácilmente los transformantes que contienen el plásmido. Los sitios reconocidos por algunas de las enzimas de restricción están dentro de uno u otro de estos genes de resistencia, facilitando la identificación de los plásmidos que llevan DNA clonado.

9. Puede ser fácilmente introducido en las células por transformación.

El uso del plásmido pBR322 en la clonación de genes se muestra en la figura inferior. Como se observa, el sitio BamHI está dentro del gen de resistencia a tetraciclina y el sitio PstI está dentro del gen resistencia a la ampicilina. Si el DNA extraño se inserta en uno de estos sitios, se perderá la resistencia al antibiótico conferida por el gen que contiene ese sitio, un fenómeno conocido como inactivación insercional. La inactivación insercional se usa para detectarla presencia del DNA clonado dentro del plásmido. Así, cuando pBR322 se digiere con BamHI y se liga a DNA extraño, y luego se aíslan los clones bacterianos transformados, aquellos clones que sean resistentes a ampicilina y tetraciclina carecerán de DNA extraño. Sin embargo, las células que son todavía resistentes a ampicilina y la resistencia a tetraciclina pueden determinarse independientemente en placas con agar, resulta fácil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las células que no contengan plásmidos.

6

7

Uso del plásmido pBR322 como vector de clonación mostrando como la inserción de DNA foráneo causa la inactivación del gen de resistencia a tetraciclina

Referencias:

- Libro de resúmenes. 2006. IV Congreso Peruano de Genética. Universidad Nacional Agrícola La Molina. Sociedad Peruanan de Genética. Pp. 50 – 54.

- Ramón L., J. 2005. Agricultura Transgénica. Obntenido el 15 de setiembre de 2008 en http://www.ranf.com/publi/mono/011/lacadena.pdf

- Mentaberry, A. 2007. Sistemas de transformación vegetal: Agrobacterium tumefasciens. Agrobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Obtenido el 15 de setiembre de 2008 en http://www.fbmc.fcen.uba.ar/~23-1-2007/Clase4%20Transformacion%20por%20Agrobacterium.pdf

- Biotecnología en pocas palabras: Plantas transgénicas. 2007. Sociedad española de Biotecnología. Obtenido el 15 de setiembre de 2008 en http://www.monsanto.es/files/Sebiot_1.pdf

- Pérez, W y G. Forbes. 2008. Manual tecnico: Tizón tardío de la papa. Centro Internacional de la Papa. Obtenido el 15 de setiembre de 2008 en http://www.cipotato.org/publications/pdf/004271.pdf

8