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Unidad9. Principios de Ingeniería GenéticaAplicaciones de Biología Molecular
• Aislamiento, análisis y manipulación de ácidosnucleicos
• Generación de moléculas de DNA recombinante
• Ingeniería Genética
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA)Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA)
(detergentes, proteasas, cambios de presión)
Separación del DNA del resto de los componentes celulares(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas,
solventes (fenol-cloroformo)
Repetir la extracción. Eliminación del fenol.
Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol oisopropanol
Disolver el DNA (Se concentra)
Análisis del DNA
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Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría
Espectro deabsorción de DNA
Estimación de laconcentración de A.N. porespectrofotometría
A260 = 1
50 g/ml DNA dc
33 g/ml DNA cs
40 g/ml RNA
También se mide larelación de abs.
A260/ A280 => 1.8-2.0
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Separación en geles de agarosa (1–4%)
Electroforesis horizontal.
Migran al ánodo
Tinción con bromuro de etidio
Intercala entre las bases del DNA
Forman complejos fluorescentes
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Herramientas para el análisis de DNA.Enzimas de restricción y sus sitios de corte
• Son purificadas de bacterias
•Las enzimas de restricción sonendonucleasas
•Rompen en sitios específicos delDNA
•Reconocen secuenciaspalíndromicas específicas de 4; 6o 8 pb
•Algunas generan extremosromos y otros extremos cohesivosen el DNA al que cortan
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDOEXTREMOS COHESIVOS “STICKY”
DNA de un plásmidodigerido con EcoRI
DNA genómicodigerido con EcoRI
Extremos son compatibles
Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasaforma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas
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VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS
INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR)
Corte del DNA con enzimas de restricciónLigación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector
Plásmido
DNA de interés
Tratamiento conenzima de restricción
Fragmentos de DNA conextremos cohesivoscompatibles
Mezclar losfragmentos enpresencia de unaDNA ligasa
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CONSTRUCCIÓN DE UNABIBLIOTECA GENÓMICA
Una biblioteca de DNA genómicoes un conjunto de fragmentosde DNA de un organismo yempaquetados envectores (plásmidos), que sonmantenidos en célulasbacterianas.
Digestióncon enzimasde restricción
DNA fragmentadoy clonado en plásmidos
Introducción de losplásmidos en bacterias
TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA
DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN
DNA dedoble hélice
Desnaturalización:se genera DNA decadena sencilla
Renaturalización:se forma DNAduplex
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BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cDNA
Caja Petri concolonias debacterias
Se hace una réplicade las colonias en lamembrana
Lisis de lasbacterias ydesnaturalizacióndel DNA conNaOH
Sonda: DNA decadena sencillamarcado con 32P
Incubación conlas sonda y
lavadoColonias con elplásmido deinterés
Exposición a unfilm fotográfico.Detección decolonias con elplásmido deinterés.
Membrana de nylon o nitrocelulosa
SÍNTESIS DE cDNA y construcción de una bibliotecade cDNA
Selección del tejido Extracción de RNAm
Hibridar con oligo-dT
Síntesis de cDNA conuna transcriptasa
reversa
Síntesis de la segundacadena de DNA
Eliminación del RNA
Las transcriptasasreversas sonenzima virales.Sintetizan DNAusando RNA comomolde
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Transferencia en Southern
Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadenade la Polimerasa (PCR)
Great Fountain Geyser,
Yellowstone. Manantial
Temperatura 55-80°C
Thermus aquaticus
TaqDNA Polimerasa
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El número de copias del fragmento de DNA aumentaexponencialmente
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La reacción de PCR tiene múltiplesaplicaciones
• Detección de alelos mutantes caracterizados.• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.• Identificación de microorganismos patógenos.
– Caracterización de cepas del virus de la influenza• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de
cDNA (Clonación de genes)• Secuenciación de DNA• Generación de mutantes puntuales.• Estudiar la expresión génica.
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La era genómica. Secuenciación de DNA
La era genómica. Secuenciación de DNA
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SECUENCIACIÓN DE DNA
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Secuenciación de Genomas
Aplicaciones de Biología Molecular
Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado enla longitud de fragmentos de restricción)
Diagnóstico genético. PCR
Producción de proteínas recombinantes en bacterias
Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas
Terapia génica
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Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en lalongitud de fragmentos de restricción)
A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en lasecuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base.
Estos cambios pueden generar la formación de un sitio dereconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón decorte de una enzima de restricción para cada individuo va a serúnico.
Individuo 1 Individuo 2
Homocigoto Homocigoto
Este es el fundamento de pruebas de paternidad.
heterocigoto
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Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtenerla “huella genética”
Se utiliza latécnica deSouthernblot
Mancha deSangre
El DNA se extraede las célulassanguíneas
Digestión del DNA conenzimas de restricción
Los fragmentos de DNA seseparan por electroforesisSouthern blot
Sonda de DNAmarcada se uneespecíficamente
La membrana se lava y se revelapara detectar bandas de
interacción DNA-DNA
El patrón de DNA secompara con el de
“sospechosos”
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Distrofia Muscular
Hemofilia
Neurofibromatosis
Esclerosis lateral
Inmunodeficiencia ADA
Hipercolesterolemia
Amiloidosis
Cáncer de mama
Enfermedadpolicística de hígado
Enfermedad de Tay-Sachs
Alzheimer
Retinoblastoma
FenilcetonuriaAnemia falciforme
Neoplasia endócrina
Melanoma maligno
Exostosis múltiple
Fibrosis cística
Hemocromatosis
Poliposis
Enf. Huntington
Retinitis pigmentosa
Cáncer de colon
Enf. de Gaucher
Se han mapeado genes anormales causantes de enfermedades
Diagnóstico genético. PCR
Debido a que las mutaciones más comunes que son responsables deestas enfermedades ya están caracterizadas, se han establecidoalgunas pruebas genéticas:
Pruebas diagnósticas. Establecen o confirman el diagnóstico de unindividuo que ya está afectado.
Pruebas pre-sintomáticas. Determinan con un alto grado de certeza siun individuo va a desarrollar alguna enfermedad.
Pruebas predictivas. Indican un elevado riesgo de una enfermedadpero no pueden establecer con certeza si un individuo va a estarafectado.
Estas pruebas genéticas son especializadas pues muchas de ellasinvolucran la amplificación del fragmento de DNA correspondienteal gen que se busca y la secuenciación del gen.
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Producción de proteínas recombinantes en bacterias.
Escalamiento y purificación de la proteína
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Aplicaciones en Biotecnología Vegetal
• Plantas transgénicas que expresan proteínas que leconfieren alguna propiedad agronómicaimportante:– Resistencia a plagas de insectos– Resistencia a herbicidas– Resistencia a virus
• Detección de microorganismos patógenos enplantas por métodos moleculares.– Virus, bacterias, micoplasmas
El mejoramiento tradicional de plantas implica hacer una cruzaentre genotipos distintos para incorporar un carácter y luego hacerselección y autocruzas para obtener un homocigoto.
Patrón de herencia Mendeliana. Puede llevar varios años hastaobtener el homocigoto con los caracteres deseados.
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La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento de ungen de cualquier especie e incorporarlo en plantas para quetengan una nueva característica.
Una limitación importante esla transformación(introducción del DNA) decéluals vegetales.
Transformación por bombardeo
Transformación por Agrobacterium tumefaciens
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Resistencia a plagas de insectos. Gusano barrenador en maíz.
En las esporas de Bacillus thuringiensis se acumulan proteínas (Cry) conactividad insecticida.
Toxinas Bt
El insecto ingiere la protoxina alalimentarse del tejido de la planta
La protoxina sufre proteólisis en elintestino del insecto y se generala toxina activa
La toxina se une a receptores enlas cel. epiteliales del intestino
La toxina se oligomeriza y formaporos en la MP de la cel. epitelial
Mecanismo de acción de las toxinas Bt
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La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable
Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos:
Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas.
Se incrementa el rendimiento
El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente enlos últimos años:
Controversias sobre plantas transgénicas.
• Los vectores para la transformación de plantas tienenmarcadores de resistencia a antibióticos como marcadores deselección. La presencia ubicua de estos genes pueden facilitar latransferencia resistencia a antibióticos a bacterias pátogenas.
• Generalmente los marcadores de selección son KanR y NeoR
• Escape de genes del cultivo transgénico a malezas.Generación de supermalezas resistentes a herbicidas.
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El caso de maíz en México.
México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad yespecies de maíz silvestre en México.
Transferencia de genes a estas especies.
Reducción en la diversidad?
Aislar el gen de interés y clonarlo en un vector.
Interrumpir el gen con una secuencia de DNA queconfiera resistencia a un antibiótico.
Transformar células embrionarias totipotenciales con lasecuencia quimérica de DNA.
Seleccionar las células transformadas en presencia delantibiótico.
Inyectar las células a embriones de ratón.
Transferir los embriones a una hembra para sudesarrollo.
En la camada se obtendrán ratones heterocigotos (x/-)
Hacer una cruza entre dos heterocigotos.
El 25% será (-/-).
Animales transgénicos. Ratones “knock-out”
