APOPTOSIS NEURON DI CORTEX LAYER 5 DAN KINERJA

MOTORIK TIKUS DEWASA SETELAH PEMBERIAN

HUMAN WHARTON’S JELLY- MESENCHYMAL STEM CELLS

DIAN ANGGRAINI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Apoptosis Neuron di

Cortex Layer 5 dan Kinerja Motorik Tikus Dewasa setelah Pemberian human

Wharton’s Jelly-Mesenchymal Stem Cells adalah benar karya saya dengan arahan

dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada

perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya

yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam

teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2016

Dian Anggraini

NIM G34120124

ABSTRAK

DIAN ANGGRAINI. Apoptosis Neuron di Cortex Layer 5 dan Kinerja Motorik

Tikus Dewasa setelah Pemberian human Wharton’s Jelly-Mesenchymal Stem Cells.

Dibimbing oleh BERRY JULIANDI dan ARIEF BOEDIONO.

Apoptosis merupakan salah satu bentuk kematian sel yang secara aktif terjadi

pada organsime multiseluler. Apoptosis dapat terjadi di bagian otak cortex layer 5

yang bertanggung jawab terhadap kontrol motorik. Human Wharton’s jelly-

mesenchymal stem cells (hWJ-MSC) merupakan salah satu sumber stem cell yang

berpotensi sebagai terapi penyakit neurodegeneratif. Penelitian sebelumnya pada

umumnya menggunakan hWJ-MSC sebagai terapi in vivo hewan model. Penelitian

yang menganalisis pengaruh hWJ-MSC terhadap neuron apoptotik di cortex layer 5

pada tikus normal belum pernah dilakukan. Penelitian ini bertujuan menganalisis

pengaruh injeksi subkutan hWJ-MSC terhadap apoptosis neuron di cortex layer 5 dan

kinerja motorik tikus dewasa normal. Penelitian ini terdiri dari 6 kelompok berbeda: 1

kelompok kontrol dan 5 kelompok perlakuan. Kelompok kontrol disuntikkan dengan

NaCl fisiologis sebanyak 0,5 mL (larutan pembawa). Kelompok perlakuan

disuntikkan hWJ-MSC sebanyak 1x106 sel/tikus dalam larutan pembawa. Tikus

dieutanasia pada 0 jam (D0), 12 jam (D0.5), 24 jam (D1), 3 hari (D3), dan 7 hari (D7)

setelah injeksi hWJ-MSC. Injeksi hWJ-MSC tidak berpengaruh terhadap densitas

neuron apoptotik di cortex layer 5 dan kinerja motorik tikus dewasa normal. Sel hWJ-

MSC aman digunakan karena tidak menyebabkan peningkatan ataupun penurunan

neuron apoptotik di cortex layer 5 serta tidak menyebabkan hiperaktif dan

kemunduran kinerja motorik pada tikus dewasa normal.

Kata kunci: Korteks lapisan V, Hematoksilin-Eosin (HE), rotarod

ABSTRACT

DIAN ANGGRAINI. Neuronal Apoptosis in Cortex Layer 5 and Motor Performance

of Adult Rats after Injection of human Wharton’s Jelly-Mesenchymal Stem Cells.

Supervised by BERRY JULIANDI dan ARIEF BOEDIONO.

Apoptosis is a form of cell death that actively occurs in multicellular organism.

Apoptosis can occur in tissue or organ, including in the cortex layer 5 which

responsible for motor control. Human Wharton’s jelly-mesenchymal stem cells (hWJ-

MSC) are source of stem cell that has been used as a potential treatment of

neurodegenerative diseases. But, there are no scientific report on the effect of hWJ-

MSC to apoptotic neurons in cortex layer 5 and motor permormance of normal rats.

This research aims to analyze effect of hWJ-MSC subcutaneous injection to neuronal

apoptosis in cortex layer 5 and motor performance of normal adult rats. This research

consisted of 6 different groups: 1 control group and 5 experimental groups. Control

group were injected with 0.5 mL physiological saline (vehicle). Experimental group

were injected with 1x106 cell/rats hWJ-MSC in vehicle. Euthanasia were performed

in 0 hours (D0), 12 hours (D0.5), 24 hours (D1), 3 days (D3), 7 days (D7) after hWJ-

MSC injection. Injection of hWJ-MSC did not affect apoptotic neurons density and

motor performance of normal adult rats. This research also showed that hWJ-MSC

were safe to use in further clinical application.

Keywords: Cortical layer V, Hematoxylin-Eosin (HE), rotarod

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biologi

APOPTOSIS NEURON DI CORTEX LAYER 5 DAN KINERJA

MOTORIK TIKUS DEWASA SETELAH PEMBERIAN

HUMAN WHARTON’S JELLY- MESENCHYMAL STEM CELLS

DIAN ANGGRAINI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat

dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian telah

dilakasanakan pada bulan Maret hingga Juni 2016, dengan judul Apoptosis

Neuron di Cortex Layer 5 dan Kinerja Motorik Tikus Dewasa setelah Pemberian

human Wharton’s Jelly-Mesenchymal Stem Cells.

Terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr Berry Juliandi, MSi

selaku pembimbing I dan Bapak Prof Drh Arief Boediono, PhD, PAVet (K)

selaku pembimbing II yang telah memberikan banyak bimbingan dan saran

selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi. Terima kasih juga penulis

sampaikan kepada Ibu Dr Dorly, MSi selaku reviewer yang telah memberikan

saran dan masukan dalam penyusunan skripsi, serta Ibu Dr Puji Rianti, MSi

selaku penguji yang telah memberikan waktu, tenaga, pikiran, dan masukan

selama ujian skripsi.

Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Drh Elpita Br Tarigan, Ka

Anggi Rahma Putra, AMd, Ka Alif Iman Fitrianto, SKH yang telah banyak

membantu dalam pelaksanaan penelitian. Di samping itu, penghargaan penulis

sampaikan kepada Bapak Dr Indra Bachtiar dan Bapak Dr Harry Murti dari Stem

Cell and Cancer Institute (SCI), serta Ibu Dr Drh Savitri Novelina, MSi, Ibu Dr

Drh Chairun Nisa, MSi, dan Bapak Drh Danang dari Laboratorium Anatomi

Fakultas Kedokteran Hewan yang telah memberikan fasilitas dalam pelaksanaan

penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orangtua,

seluruh keluarga, dan teman-teman atas segala doa dan dukungan yang telah

diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat menambah wawasan dan bermanfaat

bagi semua pihak.

Bogor, Agustus 2016

Dian Anggraini

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

METODE 2

Waktu dan Tempat 2

Bahan dan Alat 3

Metode 3

HASIL DAN PEMBAHASAN 4

Densitas Neuron Apoptotik di Cortex Layer 5 4

Kinerja Motorik Tikus 6

SIMPULAN DAN SARAN 8

Simpulan 8

Saran 8

DAFTAR PUSTAKA 9

LAMPIRAN 13

RIWAYAT HIDUP 16

DAFTAR GAMBAR

1 Fotomikrograf sayatan coronal otak tikus 4

2 Densitas neuron apoptotik di cortex layer 5 5

3 Waktu latensi jatuh tikus dari alat uji rotarod sebelum perlakuan dan

sesudah perlakuan 6

4 Regresi linier waktu latensi jatuh tikus setelah injeksi hWJ-MSC

terhadap densitas neuron apoptotik di cortex layer 5 8

5 Alat uji rotarod 13

DAFTAR LAMPIRAN

1 Dimensi alat uji rotarod 13

2 Tahapan perfusi tikus 13

3 Tahapan pembuatan blok parafin organ otak 14

4 Tahapan penyayatan dan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) sayatan

histologis otak 14

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Apotosis merupakan salah satu bentuk kematian sel dan merupakan proses

yang terjadi terus-menerus pada organisme multiseluler (Kerr et al. 1972).

Apoptosis disebut juga kematian sel terprogram (Oppenheim 1991). Kematian sel

dapat terjadi pada organisme dalam masa perkembangan maupun pada organisme

dewasa. Apoptosis pada organisme dalam masa perkembangan bertujuan untuk

delesi sel. Pada organisme dewasa, kematian sel seimbang dengan pembelahan sel

yang bertujuan menjaga homeostasis massa jaringan (Saikumar et al. 1999).

Proses apoptosis dikontrol secara genetik (Kerr et al. 1994) dan dipengaruhi oleh

agen ekstraseluler seperti kontak fisik (radiasi ion, hipertermia), paparan kimia

(azide, hidrogen peroksida), efek seluler sitokin (tumor necrosis factor,

transforming growth factor-), dan infeksi virus (Arends dan Wyllie 1991;

Martikainen et al. 1990). Apoptosis dicirikan dengan adanya penyusutan sel,

piknosis kromatin, fragmentasi nukleus (karioreksis), dan blebbing membran

plasma, serta adanya fagositosis oleh sel fagosit (Majno dan Joris 1995; Wyllie

1980). Apoptosis dapat terjadi pada seluruh jaringan atau organ, termasuk pada

bagian otak cortex layer 5 yang bertanggung jawab terhadap kinerja motorik.

Motorik atau pergerakan merupakan hasil akhir dari proses kontraksi otot

dan dikontrol oleh bagian otak tertentu. Pergerakan dibagi menjadi dua, yaitu

pergerakan sadar dan tidak sadar. Pergerakan dibawah pengaruh kesadaran,

gerakan yang dipelajari (learned), dan gerakan terampil (skilled) diatur sistem

piramidal. Alur piramidal merupakan alur dari motor cortex langsung ke saraf di

batang otak atau tulang belakang dan sebaliknya. Semua batang saraf dalam

sistem piramidal berasal dari neuron kortikospinal yang terletak dalam cortex

layer 5 (Rathelot dan Strick 2009). Kerusakan sistem piramidal cortex layer 5

dapat menyebabkan penyakit neurodegeneratif seperti penyakit stroke (Yue et al.

1997). Salah satu pengobatan penyakit neurodegeneratif yang efektif yaitu dengan

penggunaan stem cell.

Stem cell merupakan sel yang belum berdiferensiasi, mampu memperbanyak

diri sendiri, dan dapat berdiferensiasi menjadi lebih dari satu jenis sel

(multipoten/pluripoten). Berdasarkan tingkat maturasi tubuh yang menjadi sumber

stem cell, stem cell dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu sel punca embrionik

(embryonic stem cell) dan sel punca dewasa (adult stem cell). Embryonic stem cell

diperoleh saat perkembangan individu masih berada dalam tahap embrio. Adult

stem cell diperoleh di antara sel-sel lain yang telah berdiferensiasi, dalam suatu

jaringan yang telah mengalami maturasi. Berdasarkan organ atau golongan sel

yang akan menjadi jalur diferensiasinya, adult stem cell digolongkan menjadi

hematopoietic stem cells (HSC), neural stem cells (NSC), mesenchymal stem cells

(MSC), dan sebagainya (Halim et al. 2010).

Mesenchymal stem cells (MSC) terdapat pada seluruh organ tubuh manusia,

lebih tepatnya sebagai bagian dari populasi sel yang terdapat di daerah

perivaskular. Menurut Hass et al. (2011), MSC dapat dibedakan berdasarkan dua

sumber utama, yaitu MSC jaringan dewasa (adult tissue) dan MSC jaringan

kelahiran (fetal tissue). Beberapa sumber MSC adult tissue yaitu bone marrow

2

(BM), peripheral blood (PB), dan adipose tissue (AT). Beberapa sumber MSC

fetal tissue yaitu placenta (PL), amniotic fluid (AF), Wharton’s jelly (WJ), dan

sebagainya.

Wharton’s jelly merupakan jaringan ikat mukosa yang terdapat di antara dua

pembuluh arteri dan satu pembuluh vena tali pusat (Meyer et al. 1983). Beberapa

keuntungan human Wharton’s jelly-mesenchymal stem cell (hWJ-MSC)

dibandingkan dengan MSC jaringan dewasa yaitu memiliki kemampuan

proliferasi yang lebih tinggi (Troyer dan Weiss 2008), kuantitas sel yang dapat

diperoleh lebih banyak, metode isolasi secara etika tidak bermasalah dan tidak

bersifat infasif (Hass et al. 2011), bersifat imunosupresif (Weiss et al. 2008),

mengekspresikan gen perkembangan sistem saraf dan perkembangan pembuluh

darah yang lebih banyak (Hsieh et al. 2013).

Mekanisme stem cell dalam memperbaiki jaringan yang rusak terdiri dari

dua jenis, yaitu diferensiasi stem cell dan produksi faktor pertumbuhan (growth

factor). Sel hWJ-MSC normalnya mampu berdiferensiasi menjadi osteosit dan

adiposit (Wang et al. 2004). Akan tetapi, hWJ-MSC juga mampu berdiferensiasi

menjadi sel di luar jalur diferensiasinya seperti oligodendrosit, hepatosit, dan

neuron secara in vitro (Yan et al. 2013; Weiss et al. 2006). Beberapa growth

factor yang disekresikan hWJ-MSC, yaitu granulocyte-colony stimulating factor

(G-CSF) (Lutz et al. 2008), insulin-like growth factor gene 1 (IGF-1) (Palka et al.

2000), dan vascular endothelial growth factor (VEGF) yang bersifat anti-

apoptotik, sebagai faktor angiogenik, dan berperan dalam pengaturan sistem imun

(Weiss et al. 2008; Hung et al. 2007).

Penelitian sebelumnya menyebutkan hWJ-MSC telah digunakan dalam

beberapa terapi in vivo pada tikus model penyakit Parkinson (Weiss et al. 2006;

Yang et al. 2008), tikus model ischemia (Jomura et al. 2006), dan tikus model

penyakit retina (Lund et al. 2006). Akan tetapi, penelitian mengenai pengaruh

hWJ-MSC terhadap tikus normal belum banyak dilakukan. Penelitian mengenai

pengaruh pemberian hWJ-MSC secara in vivo terhadap apoptosis neuron di cortex

layer 5 dan kinerja motorik tikus normal belum pernah dilakukan.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan menganalisis pengaruh pemberian human Wharton’s

jelly-mesenchymal stem cells (hWJ-MSC) terhadap apoptosis neuron di cortex

layer 5 dan kinerja motorik tikus dewasa normal.

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret hingga Juni 2016 di Bagian

Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, FMIPA IPB, Animal Facility

V-Stem, Laboratorium Anatomi, FKH IPB, dan Laboratorium Embriologi FKH

IPB.

3

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan yaitu human Wharton’s jelly-mesenchymal stem

cells (hWJ-MSC) yang diperoleh dari Stem Cell and Cancer Institute (SCI), NaCl

fisiologis, neutral buffered formaline 10%, pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE),

18 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley (umur 3-6 bulan;

bobot ± 250 gram; jenis kelamin jantan), dan pakan standar protein 18% (Harlan

Laboratories). Alat yang digunakan yaitu kandang tikus (suhu 22-25ºC;

kelembaban 37-56%; 12 jam terang dan 12 jam gelap), peralatan histologi, alat uji

rotarod, mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan kamera HDMI.

Metode

Pemberian Perlakuan

Sebelum diberi perlakuan, tikus diaklimatisasi selama 7 hari. Penelitian ini

menggunakan 18 ekor tikus jantan dan terdiri dari 6 kelompok berbeda: 1

kelompok kontrol dan 5 kelompok perlakuan. Masing-masing kelompok terdiri

dari 3 ekor tikus. Kelompok kontrol disuntikkan dengan NaCl fisiologis sebanyak

0,5 mL dan dieutanasia setelah 7 hari. Seluruh kelompok perlakuan disuntikkan

hWJ-MSC sebanyak 1x106 sel/ekor dalam NaCl fisiologis 0,5 mL (Weiss et al.

2006). Penyuntikan dilakukan secara subkutan pada situs paha atas kaki belakang.

Kelompok perlakuan dibagi berdasarkan waktu eutanasia yaitu 0 jam (D0), 12 jam

(D0.5), 24 jam (D1), 3 hari (D3), dan 7 hari (D7) setelah injeksi hWJ-MSC.

Analisis Kinerja Motorik dengan Uji Rotarod

Analisis kinerja motorik kaki depan dan kaki belakang rodensia diuji

dengan menggunakan alat rotarod (Lampiran 1). Uji rotarod dilakukan sebelum

perlakuan dan sesudah perlakuan (sebelum eutanasia). Uji rotarod pada penelitian

ini mengikuti metode Carter et al. (1999). Selama masa pengujian, masing-masing

tikus diletakkan pada alat rotarod dengan kecepatan 10 rpm dan waktu maksimal

60 detik. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Waktu latensi jatuh

tikus dari alat uji rotarod dicatat.

Analisis Neuron Apoptotik di Cortex Layer 5

Tikus dieutanasia pada waktu 0 jam, 12 jam, 24 jam, 3 hari, dan 7 hari

setelah perlakuan. Otak tikus diisolasi dengan metode perfusi yang mengacu pada

Gage et al. (2012) dengan modifikasi (Lampiran 2). Otak tikus dimasukkan dalam

larutan neutral buffered formaline 10% selama dua hari. Bagian otak yang

mengandung cortex layer 5 dipotong secara melintang (coronal) ± 3-5 mm.

Proses pembuatan blok parafin dilakukan terhadap bagian otak yang sudah

dipotong (Lampiran 3). Proses pembuatan preparat histologis dilakukan dengan

pewarnaan HE dengan ketebalan irisan 5 μm (Lampiran 4). Setiap otak tikus pada

masing-masing perlakuan dibuat satu seri preparat, kemudian masing-masing

preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya Olympus CX31 yang

dilengkapi dengan kamera HDMI Indomicro Exfocus-0,5x. Pengamatan jumlah

neuron apoptotik dilakukan pada lima bidang pandang cortex layer 5. Densitas

neuron apoptotik diperoleh dengan membagi jumlah neuron apoptotik terhadap

luas permukaan lima bidang pandang cortex layer 5 (sel/µm2).

4

Analisis Statistik

Pengukuran luas permukaan lima bidang pandang cortex layer 5 dilakukan

dengan menggunakan aplikasi ImageJ dan data densitas neuron apoptotik

dianalisis dengan uji One-way ANOVA. Data waktu latensi jatuh tikus dari alat

rotarod sebelum dan sesudah perlakuan dianalisis dengan uji One-way ANOVA.

Hubungan waktu latensi jatuh setelah perlakuan dengan densitas neuron apoptotik

di cortex layer 5 dianalisis dengan uji regresi linier.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Densitas Neuron Apoptotik di Cortex Layer 5

Pengamatan sel-sel apoptotik umumnya menggunakan pewarnaan terminal

deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) dan in-situ end

labeling (ISEL) (Zhu et al. 2004; El‐Khodor dan Burke 2002; Simic et al. 2000).

Prinsip pewarnaan TUNEL dan ISEL yaitu mendeteksi DNA yang rusak (Gavrieli

et al. 1992). Pengamatan neuron apototik pada penelitian ini menggunakan

pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE). Pewarnaan HE sebenarnya kurang tepat

digunakan untuk mengamati sel apoptotik karena hanya mampu membedakan inti

sel dan sitoplasma sel secara morfologis.

Sayatan histologis otak bagian cortex layer 5 dengan pewarnaan HE

menunjukkan adanya neuron normal dan neuron apoptotik (Gambar 1). Neuron

normal ditunjukkan dengan ciri-ciri sel berukuran besar, inti berwarna ungu, dan

sitoplasma transparan. Neuron apoptotik ditandai dengan ciri-ciri sel berbentuk

tidak beraturan, sitoplasma menyusut, inti mengalami piknosis dan berwarna

gelap.

Gambar 1 Fotomikrograf sayatan coronal otak tikus (A) Bagian cortex layer 5 dan

(B) Neuron apoptotik pada bagian cortex layer 5 dengan pewarnaan HE.

Fotomikrograf menunjukkan sel neuron normal (panah) dan sel neuron

apoptotik (kepala panah).

Hasil penghitungan densitas neuron apoptotik di cortex layer 5 pada

masing-masing perlakuan menunjukkan perbedaan nilai yang tidak signifikan

(One-way ANOVA; P=0,376; P>0,05) (Gambar 2). Nilai tersebut

mengindikasikan pemberian hWJ-MSC tidak berpengaruh terhadap densitas

neuron apoptotik di cortex layer 5. Hal tersebut menunjukkan bahwa pemberian

A

Cortex layer 5

B

5

hWJ-MSC pada tikus dewasa normal tidak menurunkan ataupun meningkatkan

neuron yang mengalami apoptosis di cortex layer 5. Jaringan atau organ yang

terlalu banyak mengalami apoptotis sel dapat menimbulkan kekacauan pada

fungsi jaringan atau organ tersebut. Peningkatan neuron apoptotik dalam jumlah

yang berlebihan pada otak dapat menimbulkan berbagai penyakit

neurodegeneratif, seperti penyakit Parkinson (Anglade et al. 1997), Alzheimer

(Shimohama 2000), dan ischemia stroke (Broughton et al. 2009). Neuron normal

yang tersisa pada penderita penyakit tersebut tidak mampu untuk meregenerasi sel

yang telah hilang akibat apoptosis. Penurunan apoptosis sel dalam jumlah yang

berlebihan pada suatu jaringan atau organ tertentu dapat menyebabkan penyakit

tumor. Penelitian (Lowe dan Lin 2000) menyebutkan penurunan apoptosis sel

berkorelasi dengan mutasi gen yang bertanggung jawab terhadap kontrol

perkembangan tumor pada hewan model.

Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Weiss et al. (2006) yang

menyebutkan transplantasi hWJ-MSC pada otak tikus normal tidak

mempengaruhi apoptosis neuron, tidak memicu produksi tumor otak, dan tidak

menimbulkan respon sistem imun. Oleh karena itu, penggunaan hWJ-MSC pada

tikus dewasa normal aman digunakan karena tidak menyebabkan peningkatan

ataupun penurunan neuron apoptotik di cortex layer 5.

Gambar 2 Densitas neuron apoptotik di cortex layer 5. Perlakuan terdiri atas

kelompok kontrol (K), waktu eutanasia 0 jam (D0), 12 jam (D0.5), 24

jam (D1), 3 hari (D3), dan 7 hari (D7) setelah injeksi hWJ-MSC.

Densitas neuron apoptotik memiliki kecenderungan mengalami penurunan

pada 0 jam (D0), 12 jam (D0.5), 24 jam (D1), dan 7 hari (D7) setelah injeksi hWJ-

MSC (Gambar 2). Kecenderungan penurunan densitas neuron apoptotik pada 0

jam, 12 jam, 24 jam, 3 hari, dan 7 hari setelah injeksi hWJ-MSC diduga

disebabkan oleh adanya inhibisi apoptosis sel akibat senyawa yang disekresikan

oleh hWJ-MSC. Sel hWJ-MSC diketahui mensekresikan senyawa neuroprotektif

yang dapat menghambat kerusakan neuron (Hsieh et al. 2013). Penelitian Lin et al.

(2011) menyebutkan hWJ-MSC mampu menurunkan apoptosis neuron dan

menurunkan area otak yang rusak akibat stroke. Shyu et al. (2004) juga

menyebutkan bahwa injeksi subkutan granulocyte colony-stimulating factor (G-

CSF) pada tikus model ischemia stroke mampu memperbaiki neuron yang rusak

di bagian cortex pada hari ke-7 sampai hari ke-28 perlakuan. Senyawa G-CSF

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

K D0 D0.5 D1 D3 D7

Den

sita

s S

el (

sel/

µm

2)

Perlakuan

6

merupakan salah satu senyawa growth factor yang disekresikan oleh hWJ-MSC

(Lu et al. 2006; Koh et al. 2008). Senyawa G-CSF dari hWJ-MSC juga telah

diketahui mampu menurunkan dan mencegah apoptosis neuron (Solaroglu et al.

2006; Solaroglu et al. 2009).

Senyawa growth factor lain yang disekresikan oleh hWJ-MSC yaitu

vascular endothelial growth factor (VEGF) dan insulin-like growth factor gene 1

(IGF-1) (Zhang et al. 2011). Senyawa VEGF memiliki efek anti-apototik (Hung et

al. 2007) dan neuroprotektif (Wick et al. 2002). Senyawa IGF-1 juga diketahui

memiliki efek anti-apoptotik (Joseph D’Ercole dan Ye 2008). Oleh karena itu,

kecenderungan penurunan densitas neuron apoptotik pada 0 jam (D0), 12 jam

(D0.5), 24 jam (D1), dan 7 hari (D7) setelah injeksi hWJ-MSC diduga disebabkan

oleh beberapa senyawa growth factor yang disekresikan oleh hWJ-MSC seperti

G-CSF, IGF-1, dan VEGF yang memiliki efek anti-apoptotik dan neuroprotektif.

Kinerja Motorik Tikus

Data uji rotarod yang diperoleh dari penelitian ini ialah waktu latensi jatuh

tikus dari alat rotarod sebelum dan sesudah perlakuan. Semakin tinggi waktu

latensi jatuh tikus dari alat rotarod menunjukkan tikus memiliki kinerja motorik

yang baik. Semakin rendah waktu latensi jatuh tikus dari alat rotarod

menunjukkan tikus memiliki kinerja motorik yang kurang baik. Hasil uji rotarod

sebelum perlakuan pada masing-masing kelompok menunujukkan nilai yang tidak

berbeda secara signifikan (One-way ANOVA; P=0,238; P>0,05) (Gambar 3).

Nilai tersebut mengindikasikan bahwa tikus yang digunakan pada setiap perlakuan

dalam kondisi motorik yang seragam.

Gambar 3 Waktu latensi jatuh tikus dari alat uji rotarod sebelum perlakuan dan

sesudah perlakuan. Perlakuan terdiri atas kelompok kontrol (K), waktu

eutanasia 0 jam (D0), 12 jam (D0.5), 24 jam (D1), 3 hari (D3), dan 7

hari (D7) setelah injeksi hWJ-MSC.

Hasil uji rotarod setelah perlakuan pada masing-masing kelompok

menunjukkan perbedaan nilai yang tidak signifikan (One-way ANOVA; P=1,427;

P>0,05) (Gambar 3). Nilai tersebut mengindikasikan pemberian hWJ-MSC tidak

berpengaruh terhadap kinerja motorik tikus dewasa normal. Hal tersebut

menunjukkan bahwa pemberian hWJ-MSC tidak mempengaruhi peningkatan

0

10

20

30

40

50

60

70

K D0 D0.5 D1 D3 D7

Wa

ktu

La

ten

si J

atu

h (

det

ik)

Perlakuan

Sebelum

Sesudah

7

ataupun penurunan kinerja motorik tikus dewasa normal. Penurunan dan

peningkatan kinerja motorik yang terlalu berlebihan menunjukkan adanya

penyakit otak dan saraf. Contoh penyakit yang memiliki gejala kelebihan

pergerakan atau hiperaktif yaitu penyakit Attention-Deficit Hiperactivity Disorder

(ADHD) (Sagvolden et al. 2005) dan penyakit Autism Spetrum Disorder (ASD)

(Penagarikano et al. 2011; Radyushkin et al. 2009; Schmeisser et al. 2012).

Contoh penyakit yang memiliki gejala kemunduran pergerakan yaitu penyakit

Parkinson (Marras et al. 2002) dan penyakit stroke (Hendricks et al. 2002).

Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Weiss et al. (2006) yang

menyebutkan transplantasi hWJ-MSC pada otak tikus normal tidak

mempengaruhi kinerja motorik tikus. Oleh karena itu, penggunaan hWJ-MSC

pada tikus dewasa normal aman digunakan karena tidak menyebabkan hiperaktif

ataupun kemunduran kinerja motorik.

Kinerja motorik tikus dewasa normal memiliki kecenderungan mengalami

peningkatan yang konsisten pada 24 jam (D1), 3 hari (D3), dan 7 hari (D7) setelah

injeksi hWJ-MSC. Kecenderungan peningkatan kinerja motorik tikus yang

konsisten pada 24 jam (D1), 3 hari (D3), dan 7 hari (D7) setelah injeksi hWJ-

MSC diduga disebabkan oleh adanya trigger dari senyawa growth factor yang

disekresikan oleh hWJ-MSC.

Weiss et al. (2006) menyebutkan transplantasi hWJ-MSC pada tikus model

hemiparkinson mampu memperbaiki kinerja motorik tikus akibat adanya berbagai

senyawa tropik yang disekresikan oleh hWJ-MSC. Yang et al. (2008)

menyebutkan transplantasi hWJ-MSC pada tikus yang dipotong sumsum tulang

belakangnya mampu meningkatkan kemampuan lokomosi tikus pada 3 hari dan 6

hari setelah transplantasi. Perbaikan lokomosi tersebut diduga diinisiasi oleh

berbagai growth factor salah satunya yaitu VEGF. Penelitian Lin et al. (2011)

menemukan bahwa transplantasi hWJ-MSC pada tikus model middle cerebral

artery occlusion mampu memperbaiki fungsi motorik tikus pada perlakuan 36 hari.

Zhang et al. (2011) menyebutkan transplantasi hWJ-MSC pada tikus model

ataksia mampu meningkatkan kinerja motorik tikus pada 7 minggu perlakuan.

Perbaikan kinerja motorik tersebut diinisiasi oleh senyawa IGF-1 yang merupakan

faktor angiogenik. Shyu et al. (2004) menyebutkan pemberian senyawa G-CSF

pada tikus model ischemia stroke mampu meningkatkan kinerja motorik tikus

pada hari ketujuh perlakuan. Hal tersebut dapat terjadi karena G-CSF mampu

meningkatkan neural plasticity dan vaskularisasi. Oleh karena itu, kecenderungan

peningkatan kinerja motorik tikus dewasa normal pada 24 jam (D1), 3 hari (D3),

dan 7 hari (D7) setelah injeksi hWJ-MSC diduga disebabkan oleh adanya trigger

dari senyawa growth factor yang dihasilkan oleh hWJ-MSC, seperti VEGF, IGF-1,

dan G-CSF.

Berdasarkan hasil di atas, terdapat kecenderungan hubungan terbalik antara

densitas neuron apoptotik di cortex layer 5 dan kinerja motorik tikus dewasa

normal pada 24 jam (D1) dan 7 hari (D7) setelah injeksi hWJ-MSC. Pada kedua

perlakuan tersebut, densitas apoptosis neuron cenderung menurun dan kinerja

motorik tikus dewasa normal cenderung meningkat.

8

Gambar 4 Regresi linier waktu latensi jatuh tikus setelah injeksi hWJ-MSC

terhadap densitas neuron apoptotik di cortex layer 5.

Hasil uji regresi linier menunjukkan bahwa terdapat korelasi negatif antara

kinerja motorik dengan densitas neuron apoptotik di cortex layer 5 yang bernilai

-0,093 (Uji regresi linier; r=-0,093; r<1) (Gambar 4). Nilai tersebut

mengindikasikan bahwa terdapat hubungan negatif yang sangat lemah antara

kinerja motorik dengan densitas neuron apoptotik di cortex layer 5. Yue et al.

(1997) dan Li et al. (1998) menyatakan bahwa terdapat hubungan terbalik antara

densitas neuron apoptotik dengan kinerja motorik tikus, yaitu semakin rendah

densitas neuron apoptotik pada otak bagian cortex semakin tinggi kinerja motorik

tikus.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Injeksi subkutan hWJ-MSC tidak berpengaruh terhadap densitas neuron

apoptotik di cortex layer 5 dan kinerja motorik tikus dewasa normal. Sel hWJ-

MSC aman digunakan karena tidak menyebabkan peningkatan ataupun penurunan

apoptosis neuron di cortex layer 5 serta tidak menyebabkan hiperaktif dan

kemunduran kinerja motorik pada tikus dewasa normal.

Saran

Pengamatan apoptosis neuron sebaiknya menggunakan pewarnaan yang

dapat mendeteksi kerusakan DNA yaitu pewarnaan terminal deoxynucleotidyl

transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) dan in-situ end labeling (ISEL).

Perlu dilakukan analisis chemokine assay untuk mengetahui senyawa yang

disekresikan oleh hWJ-MSC secara in vivo dan perlu dilakukan labeling hWJ-

MSC untuk mengatahui migrasi hWJ-MSC di dalam tubuh tikus.

y = -0.008x + 5.343

r = -0.093

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 10 20 30 40 50 60 70

Den

sita

s S

el (

sel/

µm

2)

Waktu Latensi Jatuh (detik)

9

DAFTAR PUSTAKA

Anglade P, Vyas S, Javoy-Agid F, Herrero MT, Michel PP, Marquez J, Mouatt-

Prigent A, Ruberg M, Hirsch EC, Agid Y. 1997. Apoptosis and autophagy

in nigral neurons of patients with Parkinson's disease. Histol

Histopatol. 12(1): 25-32.

Arends MJ, Wyllie AH. 1991. Apoptosis: mechanisms and roles in pathology. Int

Rev Exp Pathol. 32: 223-254.

Broughton BR, Reutens DC, Sobey CG. 2009. Apoptotic mechanisms after

cerebral ischemia. Stroke. 40(5): e331-e339.

Carter RJ, Lione LA, Humby T, mangiarini L, Mahal A, bates GP, Dunnett SB,

Jennnifer A, Morton AJ. 1999. Characterization of progressive motor

deficits in mice transgenic for the human Huntington’s Disease mutation. J

Neurosci. 19(8): 3248-3257.

Gage GJ, Kipke DR, Shain W. 2012. Whole animal perfusion fixation for rodents.

J Vis Exp. 65: e3564.

Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. 1992. Identification of programmed cell

death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol.

119: 493-501.

Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono T, Setiawan B. 2010. Stem

Cell Dasar Teori & Aplikasi Klinis. Jakarta (ID): Erlangga.

Hass R, Kasper C, Bohm S, Jacobs R. 2011. Different populations and source of

human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal

tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9: 12.

Hendricks HT, van Limbeek J, Geurts AC, Zwarts MJ. 2002. Motor recovery after

stroke: a systematic review of the literature. Arch Phys Med Rehab. 83(11):

1629-1637.

Hsieh JY, Wang HW, Chang SJ, Liao KH, Lee IH, Lin WS, Wu CH, Lin WY,

Cheng SM. 2013. Mesenchymal stem cells from human umbilical cord

express preferentially secreted factors related to neuroprotection,

neurogenesis, and angiogenesis. PLoS ONE. 8(8): e72604.

Hung SC, Pochampally RR, Chen SC, Hsu SC, Prockop DJ. 2007. Angiogenic

effects of human multipotent stromal cell conditioned medium activate the

PI3K-Akt pathway in hypoxic endothelial cells to inhibit apoptosis, increase

survival, and stimulate angiogenesis. Stem Cells. 25: 2363-2370.

Jomura S, Uy M, Mitchell K, Dallasen R, Bode CJ, Xu Y. 2007. Potential

treatment of cerebral global ischemia with Oct-4+ umbilical cord matrix

cells. Stem Cells. 25: 98-106.

Joseph D'Ercole A, Ye P. 2008. Expanding the mind: insulin-like growth factor I

and brain development. Endocrinology. 149: 5958–5962.

Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. 1972. Apoptosis: a basic biologic phenomenon

with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br J Cancer. 26: 239-257.

Kerr JFR, Winterford CM, Harmon BV. 1994. Apoptosis: its significance in

cancer and cancer therapy. Cancer. 73: 2013-2026.

Koh SH, Kim KS, Choi MR, Jung KH, Park KS, Chai YG, Kim HT. 2008.

Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a

10

neuroprotective therapy for ischemic stroke in rats. Brain Res. 1229: 233-

248.

Li Y, Powers C, Jiang N, Chopp M. 1998. Intact, injured, necrotic and apoptotic

cells after focal ischemia in the rat. J Neurol Sci. 156: 119-132.

Lin YC, Ko TL, Shih YH, Lin MYA, Fu TW, Hsiao HS, Hsu JYC, Fu YS. 2011.

Human umbilical mesenchymal stem cells promote recovery after ischemic

stroke. Stroke. 42(7): 2045-2053.

Lowe SW, Lin AW. 2000. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21(3): 485-495.

Lu LL, Liu YJ, Yang SG, Zhao QJ, Wang X, Gong W, Chen ZZ. 2006. Isolation

and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with

hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica.

91(8): 1017-1026.

Lund RD, Wang S, Lu B, Girman S, Holmes T, Sauve Y, Messina DJ, Harris IR,

Kihm AJ, Harmon AM, Chin FY, Gosiewska A, Mistry SK. 2007. Stem

Cells. 25: 602-611.

Lutz M, Rosenberg M, Kiessling F, Eckstein V, Heger T, Krebs J, Ho AD, Katus

HA, Frey N. 2008. Local injection of stem cell factor (SCF) improves

myocardial homing of systemically delivered c-kit + bone marrow-derived

stem cells. Cardiovasc Res. 77(1): 143-150.

Majno G, Joris I. 1995. Apoptosis, oncosis, and necrosis. Am J Pathol. 146(1): 3-

15.

Marras, C., Rochon, P. and Lang, A.E., 2002. Predicting motor decline and

disability in Parkinson disease: a systematic review. Arch Neurol-

Chicago. 59(11): 1724-1728.

Martikainen P, Kyprianou N, Issacs JT. 1990. Effect of transforming growth

factor-1 on proliferation and death of rat prostatic cells. Endocrinology.

127:2963-2968.

Meyer FA, Laver-Rudich Z, Tanenbaum R. 1983. Evidence for a mechanical

coupling of glycoprotein microfibrils with collagen fibrils in Wharton’s

jelly. Biochim Biophys Acta. 755: 376–387.

Oppenheim RW. 1991. Cell death during development of the nervous system.

Annu Rev Neurosci. 14: 453–501.

Palka J, Bankowski E, Jaworski S. 2000. An accumulation of IGF-I and IGF-

binding protein in human umbilical cord. Mol Cell Biochem. 206: 133-139.

Penagarikano O, Abrahams BS, Herman EI, Winden KD, Gdalyahu A, Dong H,

Sonnenblick LI, Gruver R, Almajano J, Bragin A, Golshani P, Trachtenberg

JT, Peles E, Geschwind DH. 2011. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy,

neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell.

147: 235–246.

Radyushkin K, Hammerschmidt K, Boretius S, Varoqueaux F, El-Kordi A,

Ronnenberg A, Winter D, Frahm J, Fischer J, Brose N, Ehrenreich H. 2009.

Neuroligin-3-deficient mice: model of a monogenic heritable form of autism

with an olfactory deficit. Genes Brain Behav. 8: 416–425.

Rathelot JA, Strick PL. 2009. Subdivisions of primary motor cortex based on

cortico-motoneuronal cells. Proc Natl Acad Sci. 106: 918–923.

Sagvolden T, Johansen EB, Aase H, Russell VA. 2005. A dynamic developmental

theory of attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) predominantly

11

hyperactive/impulsive and combined subtypes. Behav Brain Sci. 28(3): 397-

418.

Saikumar P, Dong Z, Milkhailov V, Denton M, Winberg JM, Venkatachalam MA.

1999. Apoptosis: definition, mechanisms, and relevance to desease. Am J

Med. 107(5): 489-506.

Schmeisser MJ, Ey E, Wegener S, Bockmann J, Stempel AV, Kuebler A, Janssen

AL, Udvardi PT, Shiban E, Spilker C, Balschun D. 2012. Autistic-like

behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/

Shank2. Nature. 486(7402): 256-260.

Shimohama S. 2000. Apoptosis in Alzheimer's disease-an update. Apoptosis. 5(1):

9-16.

Shyu WC, Lin SZ, Yang HI, Tzeng YS, Pang CY, Yen PS, Li H. 2004. Functional

recovery of stroke rats induced by granulocyte colony-stimulating factor-

stimulated stem cells. Circulation. 110: 1847-1854.

Simic G et al. 2000. Ultrastructural analysis and TUNEL demonstrate motor

neuron apoptosis in Werdnig-Hoffmann disease. J Neuropath Exp

Neur. 59(5): 398-407.

Solaroglu I, Tsubokawa T, Cahill J, Zhang JH. 2006. Anti-apoptotic effect of

granulocyte-colony stimulating factor after focal cerebral ischemia in the

rat. Neuroscience. 143(4): 965-974.

Solaroglu I, Cahill J, Tsubokawa T, Beskonakli E, Zhang JH. 2009. Granulocyte

colony-stimulating factor protects the brain against experimental stroke via

inhibition of apoptosis and inflammation. Neurol Res. 31(2): 167-172.

Troyer DL, Weiss ML. 2008. Concise review: Wharton’s jelly-derived cells are a

primitive stromal cell population. Stem Cells. 26: 591-599.

Wang HS, Hung SC, Peng ST, Huang CC, Wei HM, Guo YJ, Fu YS, Lai MC,

Chen CC. 2004. Mesenchymal stem cell in the wharton’s jelly of the human

umbilical cord. Stem Cells. 22: 1330-1337.

Weiss ML, Medicetty S, Bledsoe AR, Rachakatla RS, Choi M, Merchav S, Luo

Y, Rao MS, Velagaleti G, Troyer D. 2006. Human umbilical cord matrix

stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a

rodent model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 24: 781-792.

Weiss ML, Anderson C, Medicetty S, Seshareddy KB, Weiss RJ, Vanderwerff I,

Troyer D, Mcintosh KR. 2008. Immune properties of human umbilical cord

wharton’s jelly-derived cells. Stem Cells. 26: 2865-2874.

Wick A, Wick W, Waltenberger J, Weller M, Dichgans J, Schulz JB. 2002.

Neuroprotection by hypoxic preconditioning requires sequential activation

of vascular endothelial growth factor receptor and Akt. J Neurosci. 22:

6401–6407.

Wyllie AH. 1980. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with

endogenous endonuclease activation. Nature. 248: 555-556.

Yan M, Sun M, Zhou Y, Wang W, He Z, Tang D, Lu S, Wang X, Li S, Wang W,

Li H. 2013. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in

Wharton’s jelly to dopamine neurons mediated by the Lmx1a and neurturin

in vitro: Potential therapeutic application for Parkinson’s disease in a rhesus

monkey model. Stem Cell Gene Ther Parkins Dis. 8(5): 1-17.

12

Yang CC, Shih YH, Ko MH, Hsu SY, Cheng H, Fu YS. 2008. Transplantation of

human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly after

complete transection of the rat spinal cord. PLoS ONE. 3(10): e3336.

Yue X, Mehment H, Penrice J, Cooper C, Cadyt E, Wyatt JS, Reynolds EOR,

Edwards AD, Squier MV. 1997. Apoptosis and necrosis in the newborn

piglet brain following transient cerebral hypoxia-ischemia. Neuropath Appl

Neuro. 23: 16-25.

Zhang MJ, Sun JJ, Qian L, Liu Z, Zhang Z, Cao W, Li W, Xu Y. 2011. Human

umbilical mesenchymal stem cells enhance the expression of neurothropic

factors and protect ataxic mice. Brain Res. 1402: 122-131.

Zhu C, Qiu L, Wang X, Hallin U, Cande C, Kroemer G, Hagberg H, Blomgren K.

2004. Involvement of apoptosis-inducing factor in neuronal death after

hypoxia-ischemia in the neonatal rat brain. J Neurochem. 86(2): 306-317.

13

LAMPIRAN

Lampiran 1 Dimensi alat uji rotarod

Gambar 5 Alat uji rotarod

Keterangan:

Diameter (d) : 16 cm

Panjang (p) : 25,5 cm

Tinggi (t) : 11 cm

Jarak antar ruang (j) : 7 cm

Lampiran 2 Tahapan perfusi tikus

Tikus dibius dengan ketamine dan xylazine

↓

Tikus dipastikan sudah terbius

↓

Tikus dibedah hingga terlihat organ jantungnya

↓

Dilakukan sedikit pelukaan pada bagian atrium kanan

↓

Dilakukan infus NaCl 0,9% pada bagian ventrikel kiri

↓

Tunggu hingga seluruh darah tikus keluar dan tergantikan dengan NaCl 0,9%

↓

Setelah seluruh darah keluar, dilakukan infus neutral buffered formaline (NBF)

10% pada bagian atrium kanan

↓

Tunggu hingga seluruh NaCl 0,9% tergantikan dengan NBF 10% yang ditandai

dengan formaline dancing

↓

Dilakukan isolasi otak

p

j

t

d

14

Lampiran 3 Tahapan pembuatan blok parafin organ otak

Otak yang sudah diisolasi

↓

Otak difikasasi dengan larutan neutral buffered formaline 10% minimal 2 hari

↓

Otak yang mengandung cortex layer 5 dipotong (ditrimming) secara melintang

(coronal) ± 3-5 mm

↓

Otak yang sudah dipotong dimasukkan ke dalam larutan alkohol bertingkat, xilol,

dan parafin cair

↓

Alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90% @ 24 jam

↓

Alkohol 95% 12 jam

↓

Alkohol 100% I, alkohol 100% II, alkohol 100% III @ 1 jam

↓

Xilol I, xilol II @ 1 jam

↓

Xilol III 30 menit (suhu ruang) 30 menit (suhu parafin (61°C))

↓

Parafin I, parafin II, parafin III @ 45 menit (suhu parafin)

↓

Dilakukan bloking (embedding) parafin

Lampiran 4 Tahapan penyayatan dan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)

sayatan histologis otak

Blok parafin diletakkan pada alat mikrotom

↓

Dilakukan penyayatan dengan ketebalan irisan 5 µm

↓

Irisan sayatan diletakkan pada kaca preparat

↓

Sayatan histologis otak diletakkan di atas hot plate 45°C selama 1-3 jam

↓

Sayatan histologis otak dimasukkan dalam inkubator 37°C selama 1 hari

↓

Sayatan histologis otak dimasukkan ke dalam xilol, alkohol bertingkat, air keran,

akuades, dan pewarna HE

↓

Xilol III, xilol II, xilol I @ 2 menit

↓

Alkohol 100% III, alkohol 100% II, alkohol 100% I @ 2 menit

↓

Alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70% @ 2 menit

15

↓

Air keran 10 menit

↓

Akuades 5 menit

↓

Pewarna Hematoksilin 4 menit

↓

Air keran 10 menit (dilakukan kontrol warna)

↓

Akuades 5 menit

↓

Pewarna Eosin 3 menit

↓

Akuades 10 detik (dilakukan kontrol warna)

↓

Alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 95% @ 5 kali celup

↓

Alkohol 100% I, alkohol 100% II, alkohol 100% III @ 5 kali celup

↓

Xilol I, xilol II, xilol III @ 5 kali celup

↓

Sayatan histologis diberikan 1 tetes entelan dan ditutup dengan cover glass

16

RIWAYAT HIDUP

Nama lengkap penulis adalah Dian Anggraini, lahir di Wonogiri, 9

Desember 1994. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari

pasangan Tarno dan Mulyati. Penulis menempuh pendidikan sekolah dasar di

SDN Penjaringan 08 Jakarta dan melanjutkan pendidikan jenjang sekolah

menengah pertama di SMPN 21 Jakarta. Pada tahun 2009 penulis melanjutkan

pendidikan sekolah menengah atas di SMK Farmasi Candra Naya Jakarta dan

lulus pada tahun 2012, kemudian melanjutkan pendidikan strata S1 melalui jalur

Prestasi Internasional Nasional (PIN) di Departemen Biologi, Insitut Pertanian

Bogor (IPB).

Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif dalam organisasi Himpunan

Mahasiswa Biologi (Himabio) sebagai sekretaris Divisi Biosains tahun 2013-

2015. Penulis juga aktif dalam beberapa kepanitian seperti Lomba Cepat Tepat

Biologi (LCTB) tahun 2013 dan 2014, Penulisan Karya Ilmiah (PKI) pada 2014

dan 2015, Seminar Nasional dan Workshop Biology on Science and Application

(BIONIC) tahun 2014 dan 2015, dan Masa Perkenalan Departemen (MPD) tahun

2015, serta Asosiasi Sel Punca Indonesia (ASPI) tahun 2016. Selain aktif

berorganisasi penulis juga berhasil meraih prestasi pada kegiatan Olimpiade Sains

Terapan Nasional (OSTN) dan Pekan Kreativitas Mahasiswa (PKM) yaitu Juara 1

Nasional OSTN Bidang Lomba Biologi Terapan tahun 2011 di Univesitas Gadjah

Mada (UGM), Juara 1 Bidang Poster PKM Penelitian Eksakta PIMNAS ke-28

tahun 2015 di Universitas Halu Oleo (UHO) dan lolos sebagai peserta PKM-

Penelitian didanai DIKTI tahun 2016. Di samping itu, penulis juga memiliki

pengalaman dalam presentasi oral pada kegiatan PKM PIMNAS ke-28 tahun 2015

di Universitas Halu Oleo (UHO), Kendari, Sulawesi Tenggara.