TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS QUE SE UTILIZAN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.

Wilfido Hoyos Muñoz.

Palabras claves: inmunoensayos, bacterias, protozoarios, agua, microbiología de aguas, identificación rápida

Resumen.

Son muchas las enfermedades trasmitidas al ingerir alimentos o agua contaminada en donde estos actúan como vehículos de trasmisión de organismos dañinos como son salmonelosis, hepatitis viral tipo A y toxoplasmosis.” Más de 250 enfermedades conocidas se transmiten a través de alimentos. Esta situación, aunada a la demanda por resultados inmediatos y a los avances tecnológicos, ha conducido al desarrollo de una amplia gama de métodos rápidos en las últimas décadas(Palomino-Camargo” C & González-Muñoz Y) en tal sentido en el presente artículo se detallan las técnicas microbiológicas que nos brindan agilidad para la identificación de microorganismos tales como, técnicas moleculares para la detección e identificación de patógenos en alimentos, Métodos inmunológicos utilizados en la identificación rápida de bacterias y protozoarios en aguas, Identificación bacteriana basada en el espectro de masas de proteínas

Introducción

Se sabe que más de 250 enfermedades conocidas son trasmitidas a través e alimentos y que alrededor de 40 diferentes patógenos de origen alimentario causan enfermedades humanas. Más del 90% de los casos confirmados y las muertes causadas por dichos patógenos han sido atribuidos a bacterias (Palomino-Camargo C & González-Muñoz Y), los métodos de identificación clásicos requieren generalmente de un uso adecuado de cultivo que resulta costo y demanda gran cantidad de tiempo con resultados de baja sensibilidad, es por ello necesario el estudio de técnicas agiles y efectivas que permitan identificación de patógenos que afectan la humanidad.

Métodos.

Se realizó una revisión de tipo narrativo referente a las técnicas de técnicas microbiológicas, obteniendo información de fuentes primarias de carácter

científico, donde se tuvo en cuenta la actualidad de la información consultada, análisis objetivo y alcance del mismo. Los términos de búsqueda fueron :

Técnicas moleculares para la detección e identificación de patógenos en alimentoshttp://www.scielosp.org/pdf/rpmesp/v31n3/a20v31n3.pdf, Métodos inmunológicos utilizados en la identificación rápida de bacterias y protozoarios en aguas. Página web: http://www.scielo.sld.cu/pdf/hie/v51n1/hie09113.pdf, Identificación bacteriana basada en el espectro de masas de proteínas: Una nueva mirada a la microbiología del siglo XXI, http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182012000300003

Discusión

Métodos moleculares para la detección e identificación de patógenos transmitidos por alimentos La identificación molecular se basa en la composición constitutiva de los ácidos nucleicos más que en los productos de su expresión. Estos métodosmoleculares se utilizan a menudo en asociación con la identificación microbiológica convencional, estos métodos tiene su origen en investigaciones desde los años 1.980, siendo los primeros métodos de identificación molecular la hibridación ADN-ADN, él análisis de secuencias del ADNr 16S, la hibridación con una sonda específica y el análisis RFLP o ribo tipificación.

El descubrimiento de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) la clonación, la secuenciación y la tecnología de detección por fluorescencia, y la accesibilidad a gran cantidad de información en la web ayudó al desarrollo de nuevas herramientas. Se puede destacar la plataforma molecular, incluyendo sistemas de amplificación in vitro en tiempo real, biosensores y microarreglo, desarrollados o se están desarrollando para su uso como métodos rápidos en la detección de patógenos en alimentos.

Reacción en cadena de la polimerasaSe constituye en la técnica de diagnóstico molecular ampliamente utilizada debido a su protocolo rápido y de fácil uso, generalmente se requiere de 2 a 3 horas para completar una PCR, pero resultados más avanzados solamente requieren minutos.

Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA)

Es una técnica menos desarrollada que la PCR, hay registros de ensayos para identificar patógenos con resultados en tiempo real por lo tanto se prevé con mucho interés por su capacidad de detectar organismos viables

Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

Se ha utilizado para la caracterización de Salmonella, Listeria y otros patógenos de transmisión alimentaria, en la tipificación de Salmonella, aislada a partir de alimentos de origen animal y pacientes humanos y ha sido utilizada mundialmente para la vigilancia e investigación de los brotes de E. coli

Biosensores.

Se han aplicado exitosamente en la detección de patógenos alimentarios. Estos sensores se han desarrollado utilizando ADN, técnicas inmunológicas y péptidos de fagos.” El uso de biosensores en un estudio demostró que E. coli y Salmonella podrían detectarse en leche descremada, con límites de detección de 25 y 23 UFC/Ml respectivamente” (Fuente: Hakovirta, 2008)

Microarreglos

Consisten en un gran número de sondas (clones de ADN, productos de la PCR u oligonucleótidos sintéticos) inmovilizadas sobre una superficie sólida. Tras los pasos de hibridación y lavado, el ácido nucleico enlazado a las sondas genera un patrón de fluorescencia que es entonces registrado y analizado utilizando un escáner que ha permitido gran acumulación de datos recogidos por instituciones académicas y organizaciones industriales se han desarrollado para los patógenos asociados a alimentos. Un microarreglo particular, basado en el gen gyrB, fue utilizado para detectar e identificar rápidamente a Salmonella y Shigella.

Pirosecuenciación 454: una nueva herramienta para la detección de patogenos en alimentos y medioambiente.

La tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos ha dado pasos increíbles en los últimos cinco años, con el desarrollo y comercialización de microrreactores para la rápida secuenciación de alto rendimiento, también conocido como pirosecuenciación 454 (52). Con estas nuevas tecnologías, los genomas pueden ser completamente secuenciados en semanas (incluso en horas), en lugar de años, debido a que esta metodología no requiere bibliotecas de ADN, ni clones, solo el ácido nucleico aislado. Esta secuenciación ha ampliado el repertorio de los genomas bacterianos secuenciados, incluyendo múltiples cepas patógenas , y ha ayudado a identificar los agentes potenciales, bacterianos, protozoarios o virales, asociados con enfermedades de etiología desconocida.

Métodos inmunológicos utilizados en la identificación rápida de bacterias y protozoarios en aguas.

Método por precipitación

“Al mezclar cantidades suficientes de un antígeno soluble con anticuerpos específicos, la interacción Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esta estará constituida por grandes complejos inmunes formados por la interacción Ag-Ac. Cuando se agregan concentraciones crecientes de antígeno soluble a una cantidad fija de suero que contiene anticuerpos específicos, a medida que la cantidad de antígeno agregado aumenta, la cantidad "de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual declina” (Revista Cubana de Higiene y Epidemiología. 2013; p.5)

Estos métodos pueden ser desarrollados en medios líquidos o en geles y han demostrado una notable eficacia para individualizar y purificar los antígenos dotados de diferencias particulares. La unión Ag-Ac se traduce por la formación de un precipitado insoluble con la condición de que los reactivos se encuentren a concentración equivalente.

Métodos por aglutinación

Las reacciones de aglutinación involucran una interacción entre el Ag y el Ac que llevará a la aparición de un aglutinado que se visualiza como grumos, gránulos de aglutinado o agregado; consisten en hacer reaccionar cantidades equivalentes de los reactantes (Ag y Ac). Los principios fisicoquímicos que gobiernan la formación de estos aglutinados son los mismos que rigen la de un precipitado.

La gran diferencia entre las reacciones de precipitación y las reacciones de aglutinación radica en las características del Ag: mientras que en las reacciones de precipitación se emplean antígenos solubles, en las reacciones de aglutinación el Ag es particulado. Con un Ag soluble, también es posible diseñar una reacción de aglutinación gracias a que es posible utilizar distintas partículas (partículas inertes, ejemplo: látex) y realizar un pegado químico o fisicoquímico del Ag soluble a dichas partículas, para generar un "Ag particulado" útil para fines de identificación. Las reacciones de aglutinación desde el punto de vista de su utilidad en el laboratorio tienen la ventaja de ser muy sencillas de realizar, no requieren de ningún equipamiento para su lectura, son rápidas y fáciles de implementar. Además, presentan una mayor sensibilidad que las reacciones de precipitación, por lo que las han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe mencionar que las reacciones de aglutinación presentan una menor sensibilidad que otras

reacciones, tales como ELISA e inmunofluorescencia indirecta; son menos específicas, pues tienen la desventaja de depender grandemente de los factores físico - químicos, tales como concentración de electrolitos, pH, temperatura y tiempo de reacción. No obstante, las ventajas enumeradas hacen de estas una valiosa herramienta para la detección de antígenos en colonias bacterianas obtenidas a partir de muestras de agua.( Revista Cubana de Higiene y Epidemiología. 2013;51 p.6)

Aglutinación por método del látex

Está basado en la prueba de aglutinación. Los anticuerpos son adheridos a partículas de látex. Al enfrentarse el látex sensibilizado con el Ag específico se produce la agregación entre estas esferas y los antígenos. Esta prueba ha sido usada principalmente en bacteriología y en virología. Se han desarrollado con éxito métodos por aglutinación de látex para Salmonella spp., Vibrio cholerae y E. coli.

Determinación de antígenos por ELISA

Se utiliza para la determinación de antígenos. Este tipo de sistema permite tanto la detección de bacterias patogénicas como de toxinas en muestras ambientales, con una sensibilidad 1-5 UFC/25 mL de muestra y una especificidad de 95 - 99 %, lo cual ofrece resultados en tiempos más cortos que los métodos tradicionales.

La modalidad más frecuente del método ELISA para la determinación de antígenos es el modelo ELISA "sandwich" directo. En este modelo, el Ac específico para el Ag de interés se encuentra adsorbido en un soporte sólido sobre el cual se añadirá la muestra biológica. En el caso de que en dicha muestra se encuentre el Ag, quedará capturado en la placa y será puesto en evidencia tras la adición de otro Ac específico conjugado con la enzima. Por último, se añade el sustrato incoloro que, por acción de la enzima, dará un producto coloreado que producirá un color observable a simple vista y cuantificable mediante un espectrofotómetro.

Inmunofluorescencia

“La presencia del Ac conjugado con el flourocromo no necesita de ninguna reacción química para hacerse evidente. Los fluorocromos emiten luz de una determinada longitud de onda luego de ser exitados por un haz de luz de longitud de onda menor.19 Cada fluorocromo es capaz de emitir luz dentro de un determinado espectro de longitud de onda. Por ejemplo, el fluorocromo denominado isotiocianato de fluoresceina (FITC, siglas en inglés) emite en la gama del verde, mientras que la ficoeritrina emite en la gama del rojo. El hecho de

que existan distintos fluorocomos capaces de emitir a diferentes longitudes de onda, permite que puedan detectarse antígenos diferentes en un mismo microorganismo.La visualización de la reacción puede realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia (para colonias de microorganismos fijadas en portaobjetos) o por citometría de flujo (para microorganismos en suspensión).”( Revista Cubana de Higiene y Epidemiología. 2013;51 p.6).

Conclusiones

Debido a su rapidez, elevada sensibilidad y eficiencia para la detección temprana de microorganismos patógenos, las técnicas de diagnóstico molecular representan una alternativa prometedora en el campo de los alimentos y se vislumbra como una herramienta novedosa con un futuro prometedor para la industria de los alimentos , por ello, el número de métodos moleculares con potencial utilidad en el área de microbiología de alimentos se ha ido incrementando y diversificando, cada uno con sus respectivas fortalezas y debilidades.

Referencias bibliográficas

http://www.scielosp.org/pdf/rpmesp/v31n3/a20v31n3.pdf

http://www.scielo.sld.cu/pdf/hie/v51n1/hie09113.pdf