Upload
nurhan-koesali-keskin
View
234
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Bu çalışmada, Kalecik karası (Klon 12), Öküzgözü, Erciş ve Cabernet Sauvignon üzümçeşitlerine ait kallus kültürlerinde, resveratrol üretiminin uyarılması üzerine ultraviyole (UV)ışınının etkisi incelenmiştir.En uygun kallus dokuları, serada yetiştirilen çeliklerin yapraklarından elde edilmiştir. Ortamolarak, %2 sakkaroz, % 0.8 agar, 1.0 μM BAP (6-benzilaminopürin) ve 0.1 μM 2, 4-D (2, 4-diklorofenosi-asetik asit) eklenmiş Gamborg B-5 ortamı kullanılmıştır. Kalluslar, 21 gün ara ileiki defa alt kültüre alınmıştır. İkinci alt kültürden sonra, 12 ve 15 gün yaşlı kalluslara, sterilkabin içerisinde petri kutularının kapakları açılarak, 10 cm uzaklıktan 10 ve 15 dakika süreyle254 nm dalga boyuna sahip UV ışını uygulanmıştır. Uygulamanın ardından kalluslar karanlıkkoşullarda inkübe edilmiştir. Resveratrol ölçümleri 24., 48. ve 72. saatlerde yapılmıştır.Resveratrol üretiminin belirlenmesi amacıyla, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi (HPLC)tekniğinden yararlanılmıştır. UV ışınının asma dokularında resveratrol sentezini uyarmada etkiliolduğu ve in vitro koşullarda resveratrolün üretilebildiği belirlenmiştir. Çalışmada yer alan 4üzüm çeşidinde de en yüksek resveratrol üretimi, UV ışını uygulamasından 48 saat sonra eldeedilmiştir. En yüksek resveratrol derişimi, 66.39 μg/g YA ile Erciş üzüm çeşidindebelirlenirken, bu çeşidi sırasıyla, Cabernet Sauvignon (62.66 μg/g YA), Öküzgözü (62.23 μg/gYA) ve Kalecik karası (2.42 μg/g YA) çeşitleri izlemiştir. UV ışınının her iki uygulama zamanıda etkili bulunmuştur. Genel olarak 12 gün yaşlı kallus kültürlerinde elde edilen resveratrolbirikimi daha yüksek bulunmuştur.2007, 81 sayfaAnahtar Kelimeler: Vitis vinifera L., stilben, resveratrol, kallus kültürü, UV ışını
Citation preview
ANKARA NVERSTES
FEN BLMLER ENSTTS
DOKTORA TEZ
ASMA KALLUS KLTRLERNDE UV IINI ETKS LE RESVERATROL
RETMNN UYARILMASI VE BELRLENMES
Nurhan KESKN
BAHE BTKLER ANABLM DALI
ANKARA
2007
Her hakk sakldr
ZET
Doktora Tezi
ASMA KALLUS KLTRLERNDE UV IINI ETKS LE RESVERATROL
RETMNN UYARILMASI VE BELRLENMES
Nurhan KESKN
Ankara niversitesi
Fen Bilimleri Enstits Bahe Bitkileri Anabilim Dal
Danman: Prof. Dr. Birhan KUNTER
Bu almada, Kalecik karas (Klon 12), kzgz, Erci ve Cabernet Sauvignon zm
eitlerine ait kallus kltrlerinde, resveratrol retiminin uyarlmas zerine ultraviyole (UV)
nnn etkisi incelenmitir.
En uygun kallus dokular, serada yetitirilen eliklerin yapraklarndan elde edilmitir. Ortam
olarak, %2 sakkaroz, % 0.8 agar, 1.0 M BAP (6-benzilaminoprin) ve 0.1 M 2, 4-D (2, 4-
diklorofenosi-asetik asit) eklenmi Gamborg B-5 ortam kullanlmtr. Kalluslar, 21 gn ara ile
iki defa alt kltre alnmtr. kinci alt kltrden sonra, 12 ve 15 gn yal kalluslara, steril
kabin ierisinde petri kutularnn kapaklar alarak, 10 cm uzaklktan 10 ve 15 dakika sreyle
254 nm dalga boyuna sahip UV n uygulanmtr. Uygulamann ardndan kalluslar karanlk
koullarda inkbe edilmitir. Resveratrol lmleri 24., 48. ve 72. saatlerde yaplmtr.
Resveratrol retiminin belirlenmesi amacyla, Yksek Basnl Sv Kromotografisi (HPLC)
tekniinden yararlanlmtr. UV nnn asma dokularnda resveratrol sentezini uyarmada etkili
olduu ve in vitro koullarda resveratroln retilebildii belirlenmitir. almada yer alan 4
zm eidinde de en yksek resveratrol retimi, UV n uygulamasndan 48 saat sonra elde
edilmitir. En yksek resveratrol deriimi, 66.39 g/g YA ile Erci zm eidinde belirlenirken, bu eidi srasyla, Cabernet Sauvignon (62.66 g/g YA), kzgz (62.23 g/g YA) ve Kalecik karas (2.42 g/g YA) eitleri izlemitir. UV nnn her iki uygulama zaman da etkili bulunmutur. Genel olarak 12 gn yal kallus kltrlerinde elde edilen resveratrol
birikimi daha yksek bulunmutur.
2007, 81 sayfa
Anahtar Kelimeler: Vitis vinifera L., stilben, resveratrol, kallus kltr, UV n
i
ABSTRACT
Ph. D. Thesis
PRODUCTION AND DETERMINATION OF RESVERATROL
IN GRAPEVINE CALLUS CULTURE IN RESPONSE TO UV IRRADIATION
Nurhan KESKN
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture
Supervisor: Prof. Dr. Birhan KUNTER
The effect of ultraviolet (UV) irradiation on induction of resveratrol production on callus
cultures of Kalecik karas Clon 12, kzgz, Erci and Cabernet Sauvignon grape
cultivars was investigated in this study.
The most suitable callus tissues were obtained from the leaves of the cuttings grown in
greenhouse. Gamborg B-5 media including 2% saccarose, 0.8% agar, 1.0 M BAP (6-
benzylaminopurine) and 0.1 M 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxy-acetic acid) was used as culture
media. Callus tissues were sub cultured two times with 21 days intervals. After the second
subculture, 12 and 15 days old callus tissues were exposed to 254 nm UV light at 10 cm
distance from the source for 10 and 15 min by opening covers of the petri dishes in sterile cabin.
After the treatment, callus tissues were incubated under dark conditions. Resveratrol production
was determined at 24, 48 and 72 hours of incubation with High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC).
The results showed that UV irradiation was effective for induction of resveratrol production in
callus tissues of grape cultivars in vitro. The highest resveratrol production was obtained at the
48th hours of incubation. The highest resveratrol concentration was determined in Erci with
66.39 g/g fw and followed by Cabarnet Sauvignon (62.66 g/g fw), kzgz (62.23 g/g fw) and Kalecik karas (2.42 g/g fw). Both 10 min and 15 min UV irradiation periods were found to be effective in induction of resveratrol production. In general, resveratrol accumulation
in 12 days old callus was higher than that of 15 days old.
2007, 81 pages
Key Words: Vitis vinifera L., stilbene, resveratrol, callus culture, UV irradiation
ii
TEEKKR
Doktora tezimi yapmak zere beni ynlendiren, tezimin tm aamalarnda deerli
fikirlerinin yansra ilgi ve desteini esirgemeyen deerli danman hocam, Sayn Prof.
Dr. Birhan KUNTERe sonsuz teekkrlerimi sunarm.
Tez almamn oluumu ve geliimi boyunca, Tez zleme Komitesinde yer alarak
bilimsel dncelerini benimle paylaan, ilgilerini esirgemeyen hocalarm Prof. Dr. Y.
Sabit AAOLU (Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri Blm) ve
Sayn Prof. Dr. lk MEHMETOLU na (Ankara niversitesi Mhendislik Fakltesi
Kimya Mhendislii Blm ve Fen Bilimleri Enstits Mdr) teekkr ederim.
Doktora renimim sresince bilgi birikimlerini benimle paylaan, yakn ilgi ve
desteklerini esirgemeyen hocalarm Prof. Dr. Hasan ELK ve Prof. Dr. Gkhan
SYLEMEZOLUna; nerileri ve samimi yaklamlar iin hocam Prof. Dr. ebnem
ELLALTIOLUna ok teekkr ederim. Yine bu srete, Blm olanaklarndan
yararlanma imkn salayan Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri
Blm Bakanlna ve Bahe Bitkileri Blmnn tm deerli retim ye ve
elemanlar ile idari personeline teekkrlerimi sunarm.
Tez almamn maddi desteklerini salayan, Yznc Yl niversitesi Rektrl
Bilimsel Aratrma Projeleri Bakanl (2005-ZF-D19 Nolu proje)na, Ankara
niversitesi Biyoteknoloji Enstits (2005-163 Nolu proje)ne, Ankara niversitesi
Bilimsel Aratrma Projeleri Mdrl (2005 K 120/140-6 kod nolu Bilim nsan
Yetitirme konulu (BYEP) proje) ve Ankara niversitesi Fen Bilimleri Enstitsne
sonsuz teekkr ederim. zellikle BYEP olanaklarnn salanmasnda yakn ilgi ve
desteinden dolay Ankara niversitesi Fen Bilimleri Enstits Mdr Yardmcs Prof.
Dr. Aydn GNEe teekkr ederim.
Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri Blmnde 35. madde
kapsamnda Doktora yapabilmem ile ilgili izin ve grevlendirilmem konusundaki
iii
destei iin deerli hocam Yznc Yl niversitesi, Ziraat Fakltesi Dekan Prof. Dr.
Frat CENGZe teekkr bir bor bilirim.
Tezimin deiik aamalarnda yardmlarn ve manevi desteklerini grdm Do. Dr.
Afife GVEN (Ankara niversitesi, Mhendislik Fakltesi, Kimya Mhendislii
Blm), Uzman Nilfer VURAL (Ankara niversitesi, Biyoteknoloji Enstits
Enstrmental Analiz Birimi sorumlusu) ve Kimya Mhendisi Ebru ERTEye de ok
teekkr ederim.
Her ne kadar bugnleri gremediyse de manevi olarak hep yanmda hissettiim rahmetli
babam Mustafa KSALye, dnyaya geldiim gnden beri benden hogr, anlay ve
desteini esirgemeyen, bana hem anne hem de baba olan sevgili annem Mihriban
KSALye, abim Muzaffer KSALye, ablam Neriman KOa, kardeim Mjgan
KSALye sonsuz kranlarm sunarm.
Ve sevgili eim Yrd. Do. Dr. Sddk KESKNe (Yznc Yl niversitesi, Tp
Fakltesi, Biyoistatistik A.B.) ncelikle iyi ve kt gnde, yanmda olsun ya da olmasn
desteini esirgemedii iin, ayrca tezimin istatistik analizlerinde gsterdii stn
baars iin sonsuz teekkrlerimi sunarm. Son olarak, varlyla canma can katan
biricik kzm Reyyan KESKNe iyi ki varsn der, teekkr ederim.
Nurhan KESKN
Ankara, ubat 2007
iv
NDEKLER
ZET....i
ABSTRACT....iii
TEEKKR....v
SMGELER DZN......ix
EKLLER DZN........x
ZELGELER DZN....xii
1. GR ................................................................................................................... 1
2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ZETLER ........................................ 5
2.1 Fitoaleksinler .............................................................................................................5
2.2 Asmalarda Stilben Fitoaleksinleri ........................................................................... 6
2.3 Resveratrol Moleklnn zellikleri ve Asmalardaki Fizyolojik Rol .............. 8
2.4 Asmalarda Resveratrol ve Dier Stilben Fitoaleksinlerinin Uyarlmasna
Neden Olan Etmenler..11
2.4.1 Biyotik elisitrler..................................................................................................11
2.4.2 Abiyotik elisitrler ............................................................................................... 17
2.4.2.1 Ultraviyole (UV) n ........................................................................................18
2.4.2.2 Kimyasal maddeler ...........................................................................................19
2.3.3 Yetitiricilik faktrleri ......................................................................................... 23
2.4 Asmalarda in vitro Koullarda Resveratrol retme almalar .......................27
2.5 Resveratroln Biyolojik Etkileri............................................................................29
3. MATERYAL VE YNTEM....................................................................................32
3.1 Materyal ...................................................................................................................32
3.2 Yntem ..................................................................................................................... 34
3.2.1 Kallus kltr almalar...................................................................................34
3.2.1.1 Eksplantlarn eldesi...........................................................................................34
3.2.1.2 Eksplantlarn sterilizasyonu.............................................................................35
3.2.1.3 Kallus kltrlerinin kurulmas........................................................................35
3.2.2 Elisitr (Uyarc) uygulanmas ............................................................................37
3.2.3 Yksek basnl sv kromotografisi (HPLC) almalar.................................39
3.2.3.1 Kallus dokularndan resveratroln ztlenmesi............................................39
v
3.2.3.2 Stok solsyonlarn hazrlanmas ve kalibrasyon............................................39
3.2.3.3 Resveratroln HPLC ile analizi.......................................................................41
3.2.3.4 Bileik tans ve hesaplama...............................................................................42
3.2.4 Sonularn istatistik deerlendirmesi.................................................................44
4. BULGULAR ..............................................................................................................45
4.1 UV In Uygulama Sresinin Resveratrol Deriimine Etkisi .............................45
4.1.1 Kalecik karas .......................................................................................................45
4.1.2 kzgz ..............................................................................................................49
4.1.3 Erci .......................................................................................................................53
4.1.4 Cabernet Sauvignon.............................................................................................56
4.2 zm eitlerinin Resveratrol retim Kapasiteleri Bakmndan
Karlatrlmas ......................................................................................................60
4.3 Kallus Yalarnn Resveratrol retimine Etkisi ..................................................62
5. TARTIMA VE SONU..........................................................................................64
KAYNAKLAR .............................................................................................................. 70
ZGEM................................................................................................................... 80
vi
SMGELER DZN
CoA Koenzim A
CS Cabernet Sauvignon
ER Erci
HPLC Yksek Basnl Sv Kromatografisi
KK Kalecik karas
LDL Dk younluklu lipoprotein
G kzgz
PR Patojen ilikili
YA Ya arlk
UV Ultraviyole
BAP 6-benzilaminoprin
2,4-D 2, 4-diklorofenosi-asetik asit
JA Jasmonik asit
SA Salisilik asit
MeJa Metil jasmonat
BHT Benzotiadizol
ABA Absizik asit
vii
EKLLER DZN
ekil 2.1 Asmada bulunan baz stilben grubu fitoaleksinlerin kimyasal yaplar ............. 7 ekil 2.2 Stilben fitoaleksinlerinin biyosentez yolu ......................................................... 8 ekil 3.1 zm eitlerine ait olgun salkmlarn grn ........................................... 33 ekil3.2 Kallus kltrleri iin kullanlan eksplantlar...................................................... 36 ekil 3.3 Yaprak eksplantlarndan elde edilen kalluslar ................................................. 36 ekil 3.4 UV lambasnn kurulduu dzenek ................................................................. 37 ekil 3.5 Kalluslara UV nnn uygulanmas ................................................................ 38 ekil 3.6 Resveratrol ztlenmesin aamalar ................................................................ 40 ekil 3.7 Resveratrol standart ile izilen kalibrasyon erisi .......................................... 41 ekil 3.8 HPLC kromatogram rnei ............................................................................ 43 ekil 4.1 Kalecik karas zm eidinde, 12 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika
UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ............................................................................................................. 46
ekil 4.2 Kalecik karas zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika
UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ............................................................................................................. 48
ekil 4.3 kzgz zm eidinde, 12 gn yal kalluslara,10 ve 15 dakika UV
n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ... 50 ekil 4.4 kzgz zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV
n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ... 52 ekil 4.5 Erci zm eidinde, 12 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV n
uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ........... 54 ekil 4.6 Erci zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV n
uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri .......... 56 ekil 4.7 Cabernet Sauvignon zm eidinde, 12 gn yal kalluslara, 10 ve 15
dakika UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ........................................................................................... 57
viii
ekil 4.8 Cabernet Sauvignon zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri .......................................................................................... 59
ekil 4.9 12 gn yal kalluslarda, uygulamalara gre zm eitlerinin resveratrol
birikimlerinin karlatrlmas ....................................................................... 61 ekil 4.10 15 gn yal kalluslarda, uygulamalara gre zm eitlerinin resveratrol
birikimlerinin karlatrlmas ..................................................................... 61 ekil 4.11 10 dakika sre ile UV n uygulamas yaplm 12 ve 15 gn yal
kallus kltrlerinde resveratrol birikimlerinin karlatrlmas ................... 63 ekil 4.12 15 dakika sre ile UV n uygulamas yaplm 12 ve 15 gn yal kallus kltrlerinde resveratrol birikimlerinin karlatrlmas .............................. 63
ix
ZELGELER DZN
izelge 3.1 zm eitlerine ait baz zellikler.............................................................. 34 izelge 4.1 Kalecik karas zm eidinde, 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA)
etkileri ........................................................................................................... 46 izelge 4.2 Kalecik karas zm eidinde, 15 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA)
etkileri ........................................................................................................... 48 izelge 4.3 kzgz zm eidinde, 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri .......... 50 izelge 4.4 kzgz zm eidinde, 15 gn yal kalluslarda, UV n uygulama
ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri ......... 52 izelge 4.5 Erci zm eidinde 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri ............... 53 izelge 4.6 Erci zm eidinde 15 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA ) etkileri ............. 55 izelge 4.7 C. Sauvignon zm eidinde, 15 gn yal kalluslarda, UV n
uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA ) etkileri....................................................................................... 57 izelge 4.8 C. Sauvignon zm eidinde,15 gn yal kalluslarda, UV n
uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA ) etkileri....................................................................................... 59
x
1. GR
Bitkilerin yaam dngleri boyunca byme ve gelime olaylarnn sonucu olarak
meydana getirdikleri birincil rnler, ekosistemin tm varlklarnn yaamnda nem
tad gibi insanlar iin de beslenmeden barnmaya kadar vazgeilmezdir. Dier
taraftan bitkiler, birincil rnlerden farkl olarak dorudan byme ve gelime ile ilikili
olmayan, trlere zg zel molekller sentezleyebilmektedir. Bu zel molekllere
ikincil rnler (sekonder metabolitler) ad verilmektedir.
Modern kimya ve zellikle bitki biyokimyasnn gelimesi ve 20. yzyln ortalarnda
analitik yntemlerin, zellikle kromatografik yntemlerin hzla ilerlemeye balamasyla
birlikte, ikincil rnlerin molekler yaplar tanmlanmaya balamtr. Bu gelimelere
molekler biyolojideki gelimelerin de katlmasyla birlikte, ikincil rnlerin, bitkilerin
bulunduklar evre koullarna adaptasyonunda, ekosistem ile bitki sal arasndaki
ilikilerin dzenlenmesinde rol oynadklar aa karlmtr. Bu maddeler, dk
molekl arlkl olmakla birlikte, bitkilerden retildikleri miktarlar da olduka dk
(kuru arln %1inden daha az) olup, bitkinin fizyolojik durumu ve gelime
aamasna bal olarak sentezlenmektedir. Karmak ve zel kimyasal yaplara sahip
olan bu maddelerin retilmeleri, biyotik ve abiyotik stres koullar tarafndan uyarlarak
artrlabilmektedir.
kincil rnlerin, dorudan bitki iin nemli olmalarnn yan sra, yzyllardr bitkileri
kullanan insanlar iin de nemli olduklar giderek daha iyi anlalmaktadr. Bitkilerden
elde edilen besin maddelerinin, zel tad ve aromalar bu maddelerden kaynaklanmakta
ve bylece bu maddeler insan yaamna tad ve renk katmaktadr. Bu konuda, kahvedeki
kafein ve ttndeki nikotin en yaygn bilinen rnekler olarak verilebilir. kincil
rnlerin bir dier ve ok nemli yararlanma alanlar bitkilerin tedavi amal
kullanmnn bu maddelere dayanmasdr. nsanolu, bitkileri ve dolaysyla ikincil
rnleri iyi veya kt amal olarak yzyllardr kullanmtr. Gnmzde de ikincil
rnler; ila, kozmetik, tarmsal kimyasallar, gda katk maddeleri gibi birok sektr
iin nemli olan deerli ham maddelerdir. Bitkiler leminde 100.000 kadar ikincil
rnden sz edilirken, bu saynn ancak yarsnn kimyasal yaplarnn tanmlanabildii
1
ve halen bilinmeyenlerle birlikte, bitkilerin esiz bir kimyasal eitlilik sunarak yukarda
belirtilen sektrler iin deerli ham madde kaynaklar olduu kabul edilmektedir.
Gnmzde ila sektrne konu olan kimyasallarn %25inin bitki kkenli ham
maddelere dayand dikkate alndnda, doal bitkisel kaynaklarn yksek getirili
ekonomik deerler olduu aka ortaya kmaktadr (Bourgaud et al. 2001, Oksman-
Caldentey and Inz 2004).
Doktora tez almasna konu olan resveratrol, tp ve eczaclk literatrnde son yllarda
giderek nem kazanm olan ikincil bir bitki rndr. Bir ok kaynak, (Frankel et al.
1993, Kopp 1998, Srdi et al. 2000, Falchetti et al. 2001, Moriarty et al. 2001, Cui et al.
2002) resveratroln koroner kalp hastalklar riskini azaltan ve kanser hcrelerinin
oluumunu engelleyen gl bir antioksidan olduunu bildirmektedir. Bu maddeye olan
ilgi, uzun yllar Japonya ve inde halk ilac olarak bilinen, Polygonum cuspidatum
bitkisinin kklerinden yaplan kojo-kon adl geleneksel ilatan kaynaklanmaktadr.
Bu ila; hipertansiyon, damar tkankl, cilt iltihab ve alerji gibi birok hastaln
tedavisinde kullanlmaktadr (Goldberg et al. 1996). Bugne kadar yaplan almalar
dikkate alndnda, 72 bitki trnde resveratroln retilebildii belirlenmitir (Dong
2003). Bu trlerin bir ou tarmsal ama dnda olup, dorudan insan beslenmesine
konu olan trlerin says olduka snrldr. Bu trlerden; asma, dut, yaban mersini,
yerfst ve Antepfst en bata gelenlerdir. Asma ise dier trlerle
karlatrldnda, daha yksek resveratrol retebilme kapasitesi ve taze veya ilenmi
rnlerinin yaygn kullanm nedeniyle deer kazanmakta ve aratrmalarda ne
kmaktadr.
zm ve arabn tbbi deeri, eski Msr kaynaklarnda yer ald gibi Hippocrates
tarafndan da bildirilmitir. Hindistanda zm ayurvedik beslenmede kullanld gibi
Orta-dou, in ve Gney Afrikada tbbi anlamda kullanlmaktadr. Aralarnda
Amerikan ve ngiliz farmokopelerinin de bulunduu baz ila rehberlerinde zme yer
verilmitir (Bavaresco and Vezzulli 2006).
2
Stilben grubu bir fitoaleksin olan resveratrol; asmalarda ekirdek, tane kabuu,
yapraklar ve destek doku organlarnda biyotik ve abiyotik stres faktrlerine kar
sentezlenmektedir. Bu nedenle, taze zm veya ilenmi rnlerinin, besleyici
zelliklerinin artrlmasnn yan sra, resveratrol ierii bakmndan yksek olduu
dnemde tketilmesiyle salk ynnden salayaca katknn artrlmas
hedeflenmektedir. Ancak, resveratroln sentezlenme mekanizmasn etkileyen
faktrlerin kontrol edilemeyii bu yndeki aratrmalarda en nemli sorunu
oluturmaktadr. Dier yandan, dorudan resveratrol ztnn tbbi destek olarak
kullanlabilmesine ynelik ham maddenin elde edilmesi ayr bir aratrma alann
oluturmaktadr. Bu almalar, merkezde kimya ve eczaclk bilimlerinden arlkl
olarak yararlanmakla birlikte, ham maddeyi oluturan bitkiyi tanyan, oaltan ve
yetitiren ziraat ve son rnn etkisini inceleyen tp bilimlerinden de destek alan,
disiplinleraras bilgi retme alanlardr. Bu anlay ile ziraat mhendislii, geleneksel ve
biyoteknolojik yntemlerin uygulanmas ile almalara katkda bulunmaktadr.
Genel olarak, ikincil rnlerin elde edilmesi iin gerekli olan materyal, daha ok doal
yetime alanlarndan toplanan bitkilerden elde edilmektedir. Baz trlerin ise bu amaca
ynelik kltrleri yaplmaktadr. Geleneksel yntemler olarak adlandrlan her iki
koulda da elde edilen saf madde miktar, bitkisel materyalin miktarna ve kalitesine
bal olarak deimektedir. Her iki durumda da bitkilerin iinde bulunduu ekolojik
koullarn olumlu veya olumsuz etkilerinden bamsz retim yapmak mmkn deildir.
Bu nedenle, ikincil rnlerin elde edilmesinde, kontroll koullardan ve birim alan en
iyi ekilde deerlendirecek sistemlerden yararlanlmas hedeflenmektedir. Genel olarak,
bitki doku kltrlerinin ikincil rn retimindeki avantajlarn aadaki balklar
altnda zetlemek mmkndr (Ramachandra and Ravishankar 2002, Lila 2005).
1. Doku veya hcreler zerinde ayn dzeyde etkiler meydana getirerek bir rnek rn
elde etmeyi mmkn klmaktadr.
2. Yln her dneminde retim imkn salamaktadr.
3. zel dokularda retilen molekller, yalnz bu doku veya hcrelerin kltre alnmas
ile retilebilir. Bylece tm bitki materyalinin kullanlmas yerine hedef organ veya
hcrelerden daha kolay madde ztlenmesi salanmaktadr.
3
4. Kltre alnmas zor trlerde ar hasat nedeniyle olas yok edilme tehlikesinin
nne geilmesine imkn salamaktadr.
5. Bir ok ikincil rn, son derece karmak molekl yaplar nedeniyle sentetik veya
yar sentetik olarak elde edilemediinden veya sentetik trevlerinin maliyeti ok
yksek olduundan bu yntemler ile bunlarn daha ekonomik retimleri
salanmaktadr.
6. Madde retim amac dnda, molekllerin biyosentez mekanizmalarnn aa
karlmasnda da yararlanlan sistemler olma zellii tamaktadr.
Belirtilen bir ok yararlarna karn, bitki doku kltrleri aracl ile ticari anlamda
ikincil rn retiminde ulalan baarlarn ok snrl olduu da dnlmektedir. Bu
konu zerine, ikincil rnlerin biyosentezi konusundaki bilgi eksikliklerinin yan sra,
kltre alnacak bitki tr ve dokular ile kltr koullarna ilikin bilgilerin bir araya
getirilemeyii, ksacas yukarda da deinilen disiplinleraras alma sisteminin
uygulanamay da etkili olmaktadr. Doktora tez almasnda, tarmsal neminin yan
sra, salk ve ila sektr iin deerli bir ikincil rn olan resveratrol retebilmesi ile
de deer kazanan asmalarda, kallus kltr yntemi ile asma dokularnda ultraviyole
(UV) nn aa karc etkisinden yararlanarak resveratrol retilmesi ve baz
genotiplerin resveratrol retme kapasitelerinin belirlenmesi amalanmtr. Bu amala,
lkemizin nde gelen krmz araplk zm eitleri olan Kalecik karas (Klon 12) ve
kzgz ile Van ili evresine zg Erci ve uluslararas nemde yabanc bir krmz
araplk eit olan Cabernet Sauvignon eitlerinin kallus kltrlerinde, UV nna kar
resveratrol retim kapasiteleri belirlenmitir. Bylece kallus dokularnda resveratrol
retimi zerinde, UV n uygulama sresi, inkbasyon sresi ve kallus yann etkisi
genotipler dzeyinde incelenmitir.
4
2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ZETLER 2.1 Fitoaleksinler Bitkiler bulunduklar veya yetitirildikleri ortamlarda biyotik veya abiyotik kkenli stres
faktrleri ile kar karya kalmaktadr. Bu faktrler tarafndan meydana gelen uyarlar,
hcre zarnda bulunan alclar tarafndan alglanmakta, sinyal olarak hcre ierisinde
gerekli yerlere iletilmekte ve sonrasnda bitkide bu faktrlere kar bir tepki meydana
gelmektedir. Bu kar tepkinin rn olan ikincil rnlerin, bitkilerin bulunduklar
ekosistem ile uyumlu ve salkl bir yaam srmelerinde rol oynadklar bilinmektedir.
kincil rnlerin bitki metabolizmasndaki son derece karmak ve eitli olan bu rolleri
hakknda ulalan bilgiler ok snrl olmakla birlikte bunlarn; antimikrobiyal,
antifungal ve antiviral etki ile patojenlere kar savunma mekanizmalarnn harekete
geirilmesi (fitoaleksin etkisi) ve tohum imlenmesini engelleyici veya toksik etkiler
meydana getirerek dier baz bitkiler ile oluabilecek rekabetin engellenmesi (Verpoorte
et al. 1999), tozlanma ajanlar ve simbiyotikler iin de ekim mekanizmalarnn
oluturulmasnda rol oynadklar bilinmektedir.
eitli snflandrma biimleri bulunmakla birlikte, ikincil rnler biyosentez yollarna
gre genel olarak byk molekl ailesine ayrlarak incelenmektedir. Bunlar: (1)
fenolikler, (2) terpenler ve steroidler ile (3) alkaloidlerdir (Bourgaud et al. 2001).
Fenolik maddeler ailesi iinde yer alan gruplardan birisi olan stilbenler, antioksidan
aktivitelerinin yan sra fitoaleksin olarak da grev yapan molekllerdir. Phytoalexin,
Yunanca bir terim olup; phyton: bitki, alexein: koruyucu anlamndadr (rsek and
Kirly 1986, Bavaresco and Vezzulli 2006).
Fitoaleksinleri biriktirme yetenei ok sayda bitki trnde incelenmi ve kk
farkllklar dnda sentezin yapsal olarak benzerlik gsterdii belirtilmitir (Bavaresco
and Fregoni 2001). Fitoaleksinlerin biyosentezi temel metabolizma yolunu
iermektedir (rsek and Kirly 1986). Bunlar,
5
a) Asetat-mevalonat yolu
b) Asetat-melonat yolu
c) ikimik asit yolu
Bitkide fitoaleksin sentezi bir etki-tepki mekanizmas sonucu olduundan, bu
maddelerin sentezini uyaran farkl etkilerin olabilecei dnlmtr. Bitkilerde
fitoaleksin sentezini tevik edici maddelere ilk olarak uyarc (inducer) ismi
verilmitir. Daha sonra, bu maddeler aa karc (elisitor) maddeler olarak
tanmlanmtr (Keen 1975). Elisitrler, biyotik (bakteri, mantar vb. hastalk yapc
mikroorganizmalar) ya da abiyotik (yaralama, ultraviyole (UV) nlar, alminyum,
bakr, gm gibi metal iyonlar) kaynakl olabilmektedirler. Smith (1996), biyotik ya
da abiyotik elisitrlerin, bitkide savunma sistemini uyardn ve bitkilerin elisitr
uyarmn takiben fitoaleksinleri sentezlediini bildirmitir. Ayn zamanda elisitrler,
fitoaleksinlerin biyosentezinde rol olan enzimleri harekete geiren bileiklerdir.
2.2 Asmalarda Stilben Fitoaleksinleri
Asmalarda stilbenlerin varl ilk olarak Langcake and Pryce (1976) tarafndan baz V.
vinifera L. genotiplerinde belirlenmitir. Botrytis cinerea ile bulatrlm baz zm
eitlerine ait yapraklarda, bulama blgesinin hemen snrnda yer alan salkl
hcreler, 366 nanometre (nm) dalga boyunda UV n altnda incelendiinde, bunlarn
parlak mavi floresans renk oluturduklar grlm ve rengi veren bileiin trans-
resveratrol olduu bildirilmitir.
Asmalarda en yksek miktarda sentezlenen temel ikincil rn bileii trans-resveratrol
(3,4',5-trihidroksi-stilben) olmakla birlikte, bir ou resveratroln dimer, trimer veya
tetramer yapsnda olan baka stilben bileikleri de belirlenmitir. Bu bileiklerin en
nemlileri olarak; trans- ve cis-piceid (resveratrol glikoziti), -viniferin (trans-
resveratrol dimeri), pterostilben (trans-3,5-dimetoksi-4'-tetrahidroksistilben),
piceatannol (trans-3,3',4,5'-tetrahidroksi-stilben) ve pallidol (trans-resveratrol dimeri)
molekllerinden sz edilmektedir (Bavaresco et al. 2002).
6
Stilbenlerin ana iskelet yapsn bir metilen kprs ile birlemi olan iki aromatik halka
oluturmaktadr (Soleas et al. 1997). ekil 2.1 de baz asma stilbenlerinin molekl
yaplar verilmitir.
trans-pterostilben
trans- resveratrol
piceid (polydatin)
trans--viniferin
ekil 2.1 Asmada bulunan baz stilben grubu fitoaleksinlerin kimyasal yaplar
Stilbenlerin biyosentezi; ekil 2.2de de grld zere, genel fenilpraponoid
metabolizmasnda yer alr ve fenilaleninden, sinamik asit ve koenzim A (CoA)
esterlerine dnm sz konusudur. Biyosentezde, Stilben sentaz (STS) ve Kalkon
sentaz (CHS) anahtar grevi gren iki nemli enzimdir (Bavaresco and Vezzulli 2006).
7
Fenilalenin
Fenil alenin amonya-liyaz
Sinamik asit Ligninler
4-kumarat:CoA-ligaz
Sinamat 4-hidroksilaz
Asetat melonat 3 x Malonil-CoA + 4-Cumaril-CoA
Stilben Sentaz Kalkon Sentaz
Resveratrol Kalkonlar
Resveratol trevleri Flavonoller Tanenler Antosiyaninler
ekil 2.2 Stilben fitoaleksinlerinin biyosentez yolu, (Bais et al. 2000).
2.3 Resveratrol Moleklnn zellikleri ve Asmalardaki Fizyolojik Rol
Asmalarda ilk tanmlanan stilben olan resveratrol, Vitaceae familyas bitkilerinde
zellikle fungitoksik zellii ile savunma mekanizmasnn bata gelen fitoaleksin
molekl olmasnn yan sra, insan sal zerindeki olumlu etkilerinin anlalmasnn
ardndan zerinde en fazla allan ikincil rnlerden biri haline gelmitir.
ekil 2.1de molekl yaps aklanm olan resveratroln, baz kimyasal zellikleri
aada verilmitir (Haneke 2002).
8
Ak kimyasal ad : 3,4',5-trihydroxy-trans-stilbene
Kapal forml : C14H12O3Molekl arl : 228.25 g/mol
znrlk : Su, metanol ve asetonda kolayca zlr
Kaynama noktas : 253-255C
Fiziksel yaps : Kat-toz
Renk : Hafif grimsi beyaz
UV absorbans deeri :
trans- iin[UVmax (EtOH) nm () 308 (30000)]
cis- iin [UVmax (EtOH) nm () 288 (12600)]
Resveratroln, trans- ve cis- olmak zere iki izomeri bulunmaktadr. Doal olarak
asmalarda bulunan formu trans- izomerdir. Cis- izomer, zm tanelerinde nadiren
grlr. Bu durumu aklayan iki hipotez sz konusudur. Bunlardan ilki; cis-resveratrol
glikozitinin hidrolize olmas (Vrhovsek et al. 1997), ikincisi ise n izomerizasyonu
uyarmas ve trans-resveratroln cis- forma dnmesidir (Versari et al. 2001). Dier
yandan cis- izomerin araplarda nemli miktarlarda bulunduu dikkat ekmektedir.
(Mattivi et al. 1995, Lamuela-Ravents et al. 1995). Bu durumun arap yapm srasnda
trans-resveratroln izomerizasyonundan kaynakland ileri srlmektedir (Jeandet et
al. 1993).
Resveratrol, asmann yaprak, iek dokular ve tanelerinde fitoaleksin olarak
sentezlenmektedir. Buna gre sz konusu dokularda resveratroln sentezlenebilmesi
iin bitkinin bir stres faktr ile karlamasnn gerekli olduu, uyarc etkisinin
bulunmad durumlarda bu dokularda resveratrol retiminin gereklemedii veya eser
miktarda gerekletii belirtilmitir (Hoos and Blaich 1988, Fregoni et al. 2000).
Yapraklarda alt / st yaprak dokusundaki hcreler, tanelerde ise tane kabuk hcreleri,
resveratroln sentezlendii yerlerdir. Dier taraftan, asmalarn odunsu ksmlarnda;
gvde, bir yal dallar, kk, ekirdek ve yar odunsu salkm saplarnda resveratroln
yap maddesi olarak bulunduu ve bu organlar rmelere kar koruduu, uyarc bir
faktr etkisi altnda da sentezlenmenin olduu belirtilmitir (Ector et al. 1996,
Bavaresco et al. 1997a, Bavaresco et al. 2000, Bavaresco et al. 2003).
9
Yaplan aratrmalarda, Vitaceae familyasna ait btn trlerde resveratroln
sentezlenebildii belirlenmitir. Tr ve eitlerin sentez yeteneklerinin ve retim
miktarlarnn farkl olduu nemle vurgulanmaktadr. Ancak, ba koullarnda
resveratrol ve dier stilben fitoaleksinlerinin retiminde, genotipin etkisi bir ok faktr
tarafndan etkilenmekte ve bamsz bir deerlendirme yaplamamaktadr.
Resveratroln fungal hastalklara zellikle Botrytise dayanm ile ilikilendirildii ilk
aratrmalarda; hastalklara dayankl tr ve eitlerin stilben fitoaleksin ieriinin,
dolaysyla resveratrol ieriinin hassas tr ve eitlere gre daha yksek olmas
beklenmitir. Bu beklentinin karland aratrma sonular bulunmaktadr. Bu
sonulara gre Vitis cinsinin dier trlerinin veya trler aras melezlerinin, V. vinifera L.
trnden daima daha yksek resveratrol sentezleyebildii bildirilmitir. (Creasy and
Coffee 1988, Jeandet et al.1991, Bavaresco et al. 1997b). Bu bulgulara karlk, tr ve
eitlerde hastalklara kar dayankllk ile resveratrol ierii arasnda ters ilikinin
olduu belirtilen aratrma sonular da bulunmaktadr. (Soleas et al. 1995a ve b).
Tane kabuunda veya yapraklarda sentezlenen resveratrol deriimine bal olarak ortaya
konulan bu sonularn yan sra; tr veya eitlerden elde edilen araplardaki resveratrol
dzeyi de hastalklara dayanm ile ilikilendirilmitir. Lamikanra et al. (1996), 5 adet V.
rotundifolia (Muskadin), 8 adet V. vinifera ve 2 adet V. labrusca zmne ait 18 farkl
Amerikan arabnda trans- ve cis- resveratrol deriimini incelemilerdir. Aratrclar,
hastalk etmenlerine kar en dayankl tr olan V. rotundifoliadan retilen araplarn
resveratrol ieriinin (4.9 and 13.4 mg/l), genel olarak hastalk etmenlerine kar hassas
tr olan V. viniferadan retilen araplarn resveratrol ieriinden (1.1 and 4.5 mg/l)
daha yksek olduunu belirtmilerdir.
spanyada yetitirilen 7 beyaz araplk zm eidine ait 13 arapta (V. vinifera)
resveratrol ve piceid deriimini aratran Romero-Prez et al. (1996), eitlerin bilinen
hastalklara dayankllk dzeyleri ile stilben fitoaleksin ieriklerinin uyumlu olduunu
belirlemilerdir. Elde edilen sonulara gre Chardonnay (0-0.225 mg/l) en hassas eit
10
olarak belirlenirken, en dayankl eit Xarello (0.802-1.089 mg/l) olmu ve bunu
Parellada (0.235-0.523 mg/l) eidi izlemitir.
Kopp (1998), beyaz araplarda ve fermente olmam zm sularnda, resveratrol
deriiminin ok az olduuna dikkat ekmekle birlikte, maserasyonun hi uygulanmad
ya da snrl uyguland bu rnlerde krmz araba gre ok daha dk dzeyde
resveratrol bulunduunu belirtmektedir. Bu konuda kapsaml bir alma, Okuda and
Yokotsuka (1996) tarafndan yaplmtr. Aratrclar, Botrytis bulamam ve ayn
koullardan hasat edilen, 16 beyaz, 17 pembe veya krmz zm eidinde, tane
kabuunda resveratrol miktarndaki deiimi incelemilerdir. Beyaz ve krmz
eitlerin tane kabuklarnda saptanan resveratrol miktarlar arasndaki farkn nemli
olmadn belirlemilerdir. ncelenen eitler toplu olarak deerlendirildiinde,
resveratrol miktarnn tanede 0.5 g/g (Pizzutello bianco)-14.1 g/g (Mller-Thurgau)
arasnda deitiini ifade etmileridir. Bu sonuca gre en yksek ve en dk deerler
iki beyaz eitten elde edilmitir. Ayn aratrmada baz eitlerin ra ve sonrasndaki
araplar resveratrol ierii bakmndan incelendiinde, genel olarak araplardaki
resveratrol miktarnn radakinden daha yksek olduu ve krmz araplarn, beyaz
araplardan ortalama alt kat daha yksek resveratrol ierdii belirlenmitir. Bu
durumun maserasyon srasnda kabuun kalma sresi ile ilikili olduu da aklanmtr.
2.4 Asmalarda Resveratrol ve Dier Stilben Fitoaleksinlerinin Uyarlmasna Neden
Olan Etmenler
2.4.1 Biyotik elisitrler
Fitoaleksinler, bitkilerin hastalk etmenlerine kar savunma mekanizmalarnn doal
antimikrobiyal rnleridir. Bu rnlerin aa kmasnda, bulamay meydana getiren
patojenin alglanmasnn yan sra, bu algya kar aa kan ve fitoaleksin birikimini
uyaran baz sinyal molekller de etkili olmaktadr. Buna gre genel bir kural olarak,
bitkilerde fitoaleksin bileiklerinin sentezlenmesi, uyarc (elisitr) etkisi ile gerekleen
metabolik olaylarn sonucudur.
11
Fitoaleksin sentezi ve birikimini balatan faktr, bir patojen etkisine bal olarak
meydan geliyorsa biyotik elisitr (uyarc) kavram ile tanmlanrken; bitki patojen ile
bulak olsun veya olmasn sinyal molekl etkisi abiyotik elisitr (uyarc) olarak
adlandrlmaktadr.
Asmalar, yalnz stilben fitoaleksinleri sentezlemeleri ve biriktirmeleri ile tanmlanan
trlerdir. Bu byk aileye ait bitkilerin, salkl ve zarar grmemi dokularnda,
zellikle yapsal organlarnda stilben bileiklerinin tespit edildiini gsteren aratrma
sonular bulunmakla beraber (Bavaresco and Fregoni 2001), fizyolojik olarak etkili
miktarlar, uyarc (elisitr) etkisine bal stres mekanizmalar sonucunda retilmektedir.
Asmalarda, resveratrol ve dier stilben bileiklerinin sentezini balatan ve artran
biyotik ve abiyotik uyarclara ilikin aratrmalar, aada gruplandrlarak
incelenmitir
Stilben fitoaleksinlerinin sentezlenmesi biyolojik bir etmene bal olarak
gerekletiinde, sz konusu etmenler biyotik uyarclar (elisitr) olarak
tanmlanmaktadr. Bu grupta fungal ve bakteriyel hastalk etmenleri yer almaktadr.
Asmalarda biyotik uyarclar olarak bata Gri kf (Botrytis cinerea) olmak zere;
Mildiy (Plasmopara viticola), Klleme (Uncinula necator), Tane rkl (Rhizopus
stolonifer), Kk rkl bakterileri (Bacillus ssp.) ve Aspergillus ssp. incelenmitir.
Biyotik elisitrler genel olarak genotiplerin hastalklara kar dayanm zelliinin
belirlenmesi amacyla incelenmitir. Bulamadan sonra fitoaleksinlerin retim hz ve
miktar ile hastala tolerans arasnda iliki kurulmaya allmtr. Temel yaklam,
fitoaleksin birikiminin dayankl genotiplerde hzl ve yksek miktarda, hassas
genotiplerde ise daha yava ve dk miktarlarda gerekletii eklindedir (Bavaresco
and Fregoni 2001).
12
Gri kf (Botrytis cinerea Pers.)
Asmalarda fitoaleksin sentezinin gereklemesine ilikin ilk bulgular, Botrytis
bulamas sonucundadr. Langcake and Pryce (1976), Botrytis cineraea ile bulam
yapraklarn (V. vinifera L. eitlerinden Cabernet Sauvignon, Gordo, Sultana, Clare,
Mller-Thurgau, Riesling x Sylvaner) stilben deriimlerini nce Tabaka Kromatografisi
(TLC) ile belirlemilerdir. Aratrclar, Bortytis bulamam salkl yapraklarda stilben
bileiklerinin sentezlenmediini, bulak yapraklarda ise deriimin 50-396 g/g YA
arasnda deitiini belirtmilerdir.
Botrytisin zarar verdii (Vitis vinifera eitlerinden Clare, Gordo, Mller-Thurgau,
Cabernet Sauvignon, Sultana ve Riesling x Sylvaner) yapraklardaki stilbenik bileikleri
inceleyen Langcake and McCarthy (1979), bulamann meydana geldii alann hemen
dn evreleyen salkl dokularda resveratrol deriimini daha yksek bulmulardr
(34.5 g/g YA). Bu bulgu, resveratroln bulamaya kar oluturulan savunma
mekanizmasnn bir rn olduunu gstermitir. Botrytise dayanm konusunda
bilgilere ulamak amacyla aratrclar, hastalk etmeni ile yaprak dayanklln
ilikilendirmeye almlardr. Serada yetitirilen V. vinifera L. eitlerinin farkl
pozisyonlardaki srgnlerinden alnan farkl yalardaki yapraklar, hastalk etmeni ile
bulatrlp, hastaln yaylmas iin bir sre bekletildikten sonra, bu yapraklardaki
resveratol retim dzeyi Gaz Kromatorafisi (GC) ve spektrofotometre ile belirlenmitir.
Elde edilen bulgulara gre yaprak yann artmas ile birlikte, resveratrol retim miktar
da art gstermi ve B. cinereaya kar dayanm artmtr.
Langcake (1981), V. vinifera L.ya ait Botrytis bulam ve bulamann 10 mm kadar
yaylm olduu gen ve yal asma yapraklarnda srasyla, resveratrol deriimini 4.79-
9.40 g/g YA, -viniferin deriimini 9.59-15.83 g/g YA, -viniferin deriimini ise 26.7-72.4 g/g YA olarak bulmutur. Buna gre olgunlama ile birlikte yapraklarda
resveratrol deriiminin artt ve bylece Botrytise kar dayanklln olutuu bir kez
daha aklk kazanmtr.
13
Botrytis hastal karsnda trlerin ve eitlerin resveratrol retim kapasitelerinin farkl
olduu bulunmutur. Amerikan asmalar ve trler aras melezlerin, V. vinifera trnden
daha fazla resveratrol retebildikleri belirlenmitir (Blaich et al. 1982, Creasy and
Coffee 1988, Jeandet et al.1991, Bavaresco et al. 1997b).
Dier taraftan, Botrytis hastalna bal resveratrol retim kapasitesinin vinifera
eitleri arasnda da farkl olduu izlenmitir. Pinot noir, Chardonnay ve Cabernet
Sauvignon eitlerinin in vitro bitkilerinin yapraklarnda resveratrol retim kapasitesini
inceleyen Jeandet and Sbaghi (1992), Pinot noir, Chardonnay ve Cabernet Sauvignonda
srasyla; 67 mu g/g , 82 mu g/g ve 151 mu g/g resveratrol belirlemilerdir. Bu verilere
gre Pinot noir, Chardonnay eitlerini Botrytis hastalna kar hassas, bu eitlere
kyasla iki kat daha fazla resveratrol retebilen Cabernet Sauvignon eidini orta
dzeyde dayankl olarak tanmlamlardr.
Ancak bu genel ilikinin kurulamad aratrmalar da bulunmaktadr. Sbaghi et al.
(1995), 13 Vitis tr ve eidinde, in vitro koullarda elisitr aracl ile uyarlan
resveratrol retimi ile Botrytis cinerea etmenine dayanm arasndaki ilikileri
incelemilerdir. Aratrmada, resveratrol retim kapasitesi ile Botrytise dayanm
arasnda 11 tr ve eitte dorusal bir iliki bulunmutur. Genotipler ierisinde yalnz V.
labrusca tr ile Carignan (V. vinifera L.) eidi bu dorusal ilikiyle uyumlu
bulunmamtr. Dayanakl bir tr olan V. labruscann yapraklarnda, beklenenden daha
dk dzeyde resveratrol deriimi (246 g/g) belirlenmitir. Dier taraftan hassas
olarak bilinen Carignan eidinde ise beklenenden daha yksek dzeyde resveratrol
deriimi (382 g/g) gzlenmitir. Aratrclar bu sonucun artc olmadn, gri kf
etmenine dayanmn birok gen tarafndan kontrol edildiini ve salkm yaps gibi eit
zelliklerinin de gri kfe dayanmda nemli rol oynadn bildirmilerdir. Bununla
birlikte aratrclar, bu iki genotip gz ard edildiinde resveratrol deriiminin gri kfe
dayankl ve hassas genotiplerin seilmesinde iyi bir markr olarak kullanlabileceine
de dikkat ekmilerdir.
14
Botrytis hastal karsnda resveratroln tane kabuu, meyve eti ve ekirdekte
retilebilme dzeylerini inceleyen almalarda btn koullarda en yksek resveratrol
seviyesi, hastalkl alana en yakn salkl kabuk dokularnda belirlenmitir. Bunu
ekirdekler izlerken, resveratroln meyve etinde iz miktarda sentezlenebildii tespit
edilmitir. Pinot noir, Gamay ve Chardonnay zm eitlerine ait grnte salkl
zm taneleri B. cinerea ile bulatrldnda, resveratrol miktarlar tane kabuunda 4-7
g/g YA, ekirdekte 1 g/g YA, meyve etinde ise 0.1 g/g YA olarak belirlenmitir
(Jeandet et al. 1995a).
Bavaresco et al. (1997b), B. cinereaya dayankl Castor (V. rupestris B-38) ve hassas
Huxelrebe (V. vinifera L.) eitlerinin tanelerinde bulama sonras, stilben
fitoaleksinlerinin genel olarak tane geliimi boyunca azaldn, olgunluk aamasnda
ise miktarlarn en dk dzeye indiini belirlemilerdir. Ancak, dayankl trdeki
trans-resveratrol ve -viniferin dzeyinin hassas trlerden daha fazla olduu sonucuna ulamlardr. Castor eidinde olgun tanede trans-resveratrol 5 g/g YA, -viniferin 6.6 g/g YA olarak belirlenirken, Huxelrebe eidine ait olgun tanelerde ulalan deerler
srasyla; 2.1 ve 3.3 g/g YA olmutur.
Mildiy ( Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl.& de Toni)
Bacln nemli hastalklarndan biri olan Mildiynn (Plasmopara viticola)
fitoaleksin retiminde uyarc bir faktr olduu Langcake and Pryce (1976) tarafndan
belirlenmitir. Yapraklarda, fitoaleksin retimi ile hastalk etmenine dayanm arasndaki
ilikiyi inceleyen Langcake (1981), P. viticola ile bulatktan sonra V. vinifera
yapraklarnda resveratrol birikiminin en fazla 10 g/g YA dzeyine ulaabildiini, buna
karlk, V. riparia yapraklarnda stres rnlerinin daha hzl ve daha yksek miktarda
biriktirilebildiini belirlemitir. Bu trde baskn stilben bileiinin -viniferin (100 g/g YA ) olduu izlenmitir. Bylece, V. ripariann mildiyye dayankl bir tr olmas,
hzl ve yksek stilben birikimi ile ilikilendirilmitir.
15
Pezet et al. (2003), mildiy bulam Chasselas (V. vinifera) yapraklarnda ilk kez
resveratroln dehidromeri ve -viniferinin izomeri olan -viniferini tanmlamlardr. Aratrclar -viniferinin (156 g/g YA), resveratrol (50 g/g YA) ve -viniferine (87 g/g YA) gre daha fungitoksik bir stilben bileii olduunu ileri srmlerdir.
Tane rkl (Rhizopus stolonifer Ehrenb.)
zm tanelerinde hasattan sonra rmelere neden olan etmenlerden olan Rhizopus
stolonifer fungusunun stilben fitoaleksinlerini uyarmadaki etkisini, resveratrol ve
pterostilben deriimleri dzeyinde inceleyen Sarig et al. (1997), zm tanelerinde ar
olgunluk ve rme ile birlikte fitoaleksin bileiklerinin azalmaya baladn tespit
ederek, rklk etmenlerinin tek bana hasattan sonra elisitr etkisi gsteremeyeceini
belirtmilerdir. almada, hasat sonrasnda UV-C uygulamas ile birlikte rme
etmenlerine kar koyabilecek stilben bileiklerinin retiminin uyarlabilecei
belirlenmitir. Aratrclar, hasat sonrasnda Rhizopus stolonifer bulatrlan tanelere
UV-C uygulamas yaplmasnn da ardndan, 18 saat sonra resveratrol, 40 saat sonra
pterostilben bileiklerinin yksek deriim deerlerinde sentezlendiini belirlemiler;
hasattan sonraki rmelere kar, stilben sentezini uyarc UV-C veya ozon
uygulamalarnn etkili koruyucu nlemler olabileceini vurgulamlardr.
Klleme (Uncinula necator (Schw.) Burr. - Oidium tuckeri Berk.)
Klleme hastalnn elisitr olma etkisini yaprak (Langcake and Pryce 1976) ve
tanelerde (Romero-Prez et al. 2001) inceleyen aratrmalarda, resveratrol ve piceid
bileiklerinde artlar meydana geldii izlenmi olmakla birlikte, stilben bileikleri ile
kllemeye dayanm arasndaki ilikinin kurulmas ynndeki bulgulara henz
ulalamamtr.
16
Bacillus ssp.
Asmalarda bakterilerin biyotik elisitr etkileri de aratrlmtr. Ancak bu grup
etmenlerde ulalan sonular toprak bakterilerine aittir. In vitro koullarda Bacillus ssp.
(B-781) ile bulatrlan V. vinifera ve V. rupestrise ait bitkiciklerde stilben retiminin
artt gzlenmitir (Paul et al. 1998). In vitro bitkiciklerin yapraklarnda resveratrol
birikimi artm, bitkiler bakterilere ramen yaama gcn devam ettirmitir. In vitro
bitkilerin yapraklarnda llen resveratrol miktar V. viniferada 78.3 g/g YA, V.
rupestris de 31.0 g/g YA olmutur.
Aspergillus spp.
Tanelerde stilben elisitr olarak Aspergillus funguslarnn roln aratran Bavaresco
et al. (2003), A. carbonarius, A. ochraeus ve A. japonicusun trans-resveratrol sentezini
uyarabildiini, ayn zamanda A. ochraeusun, stilben bileikleri ierisinde gl bir
fungitoksik bileik olan piceattanol sentezini de aa kardn belirlemilerdir.
2.3.2 Abiyotik elisitrler
Stilben fitoaleksinlerinin, hastalk etmenleri dnda, abiyotik stres faktrleri tarafndan
da uyarlmas, bitkilerde metabolizma sonucu doal olarak var olan molekller etkisi ile
sentezlenebilecei gibi dardan yapay uygulamalarla da ayn uyarc etkilerin elde
edilmesi mmkn olmaktadr. Larronde et al. (2003), abiyotik elisitrleri, bitkilerde
kaltsal olan hastalklara dayanm mekanizmalarn altran, klasik pestisit
uygulamalarna alternatif veya tamamlayc etkenler olarak yorumlamlardr.
Asmalarda stilben fitoaleksinlerinin sentezi ve birikimine neden olduu belirlenen
abiyotik elisitrler zerindeki almalar aada verilmitir.
17
2.3.2.1 Ultraviyole (UV) n
Bitkilerde DNA protein ve ATPase hasarlar ve henz tam aklanamam bir ok
sistemde hasar meydana getiren UV (B,C) nlarnn, patojen ataklarna benzer biimde
enzim, flavanoid ve fitoaleksin biyosentezlerini harekete geirdii, savunma
mekanizmas ile ilgili gen ekspresyonlarn balatt ve PR (pathogenesisrelated)
proteinlerin sentezini uyard bilinmektedir (Chappel and Hahlbrok 1984, Green and
Fluhr 1995, Nawrath et al. 2002, Cantos et al. 2000, Melzoch et al. 2001, Bonomelli et
al. 2004).
UV nnn asmalarda stilben fitoaleksinlerinin retimine olan etkileri konusunda ok
sayda aratrma bulunmaktadr. UV nnn baarl bir elisitr olarak asma
yapraklarnda (Langcake and Pryce 1977, Pryce and Langcake 1977, Pool et al. 1981,
Barlass et al. 1987, Sbaghi et al. 1995, Douillet-Breuil et al. 1999, Pezet et al. 2003) ve
tanelerinde (Creasy and Coffee 1988, Jeandet et al. 1991, Threlfall et al. 1999, Adrian
et al. 2000, Moriartry et al. 2001, Versari et al. 2001., Cantos et al. 2000, 2003,
Takayanagi et al. 2004) fitoaleksin birikimini balatt ve artrd belirlenmitir.
254 nmlik UV-C n, asmalarda resveratrol uyarm iin uygulanabilir en etkili doz
olarak ifade edilmitir (Barlass et al. 1987). Yapraklara yaplan uygulamalarda, alt
(abaksial) ve st (adaksiyal) yzey uygulamalarnn etkisinin farkl olduu, ancak alt
yzeylerin nlanmasnn stilben fitoaleksinlerinin retimini uyard gr,
(Langcake and Pryce 1976, 1977, Pool et al. 1981), Adrian et al. (1996) ve Srdi et al.
(2000)un asma yapraklarnn her iki yzeyinde de resveratrol sentezlendiini
belirlemeleri ile geerliini yitirmitir.
Douillet-Breuil et al. (1999), V. rupestris, V. cinerea, V. labrusca ve V. vinifera
yapraklarnn alt yzeylerine 15 dakika 254 nm UV n uygulamasndan sonra
fitoaleksin sentezini incelemilerdir. Uygulamay takiben zellikle resveratrol ve -viniferin sentezinin uyarld ve Amerikan trlerindeki birikimin daha yksek dzeyde
gerekletii bulunmutur. rnein, nlamadan sonra, 48 saat ierisinde resveratrol
18
seviyesi V. rupestris de 750 g/g YAa ularken, V. viniferada en yksek deer 200
g/g YA olarak tespit edilmitir.
zm eitlerinin tanenin olgunlama dneminde gri kfe dayanm bakmndan farkl
zellikler gstermesi, UV n etkisinden yararlanma olaslnn aratrlmasna neden
olmutur. Creasy and Coffee (1988), ba ve sera koullarnda yetitirilen zmlere UV
n uygulam ve sonu olarak tane etinde fitoaleksin retimi belirlenemezken, tane
kabuklarnda az miktarda ve dzensiz stilben retimi izlenmitir.
UV nnn hasat sonrasnda zm tanelerine uygulanmas sonucunda da stilben
sentezinin artt belirlenmitir (Threlfall et al. 1999, Cantos et al. 2000, 2003,
Moriartry et al. 2001). Bu bulgu, sofralk zmlerde hasat sonras uygulamalarda yeni
yaklamlar ve teknikler asndan deerlendirilebilir.
Srdi et al. (2000), trler aras melezler ile V. vinifera eitlerinde resveratrol birikimini
en yksek dzeyde arttran abiyotik elisitrn UV n olduunu vurgulamlardr.
2.3.2.2 Kimyasal maddeler
Asmalarda stilben fitoaleksinlerinin sentezinde etkili olduu belirlenen kimyasal
maddelerin, yaprak veya tane kabuu hcrelerinde patojenler ile ilikili savunma
genlerinin uyarlmasnda sinyal molekl olarak grev yapmalar beklenmektedir. Bu
amala, fungal hastalk etmenlerine kar sistemik ilalarn gelitirilmesinde veya
zmlerin depolanmas srasnda kullanlan kimyasallar ile fizyolojik almalarda PR
genlerle ilikili olduu belirlenen isel organik maddelerin, dsal uygulamalardaki
elisitr etkileri aratrlmtr.
Fungal hastalk etmenlerine kar gelitirilen sistemik ilalarn ieriinde metal tuzlar,
zellikle civa, bakr ve alminyum etken madde olarak yer almaktadr. Asmalarda
alminyum klorrn (AlCl3) doal savunma mekanizmasn harekete geirme zelliini
aratran Adrian et al. (1996), Rupestris du Lot Klon T110 ve V. vinifera eitlerinden
19
Pinot noir eliklerinin AlCl3 ile muamele edilmesinden sonra, elde edilen srgnde
resveratrol birikim dzeyini incelemilerdir. Trler arasnda mildiyye dayanm
bakmndan bilinen farklla paralel sonular elde edilmitir. Rupestris du Lot
eidinde, incelenen tm AlCl3 deriimlerinde (7-90 mM arasnda), resveratrol
retiminin meydana geldii belirlenirken, Pinot noir eidinin daha yksek deriimlerde
(22-70 mM) resveratrol retimine balad saptanmtr. Elde edilen bu sonuca gre
aratrclar alminyumun, fitoaleksin birikimi yoluyla balarda mildiy mcadelesinde
kullanlabilecek ilalarda yer almasnn nemini vurgulamlardr.
Alminyumun bir dier kimyasal bileii olan, organik fosetil-Al (alminyum etil
fosfit), zellikle Oomycetes funguslarna kar sistemik fungusitlerin etkili maddesidir.
Fungusun metabolizmasna dahil olarak konuku-patojen etkileiminin fizyolojisini
deitirdii bilinen bu madde, Vitis trlerinde de Plasmopara viticolaya kar
kullanlabilecek bir bileik olarak tanmlanmtr (Baveresco and Fregoni 2001).
Balarda en yaygn olarak kullanlan tarmsal sava ilalar bakr ierikli olanlardr.
Ar metallerden olan bakrn elisitr etkisinin incelendii aratrma sonularndan ilki
Coulomb et al. (1999) tarafndan elde edilmitir. Mildiy ve gri kf hastalklarna kar
bordo bulamac ve bakr hidroksit uygulamas yaplan zm eitlerinde hasattan 21
gn sonra yaplan incelemelerde uygulama yaplmam olanlara gre daha yksek
stilben sentezi belirlenmitir .
Tinttunen and Lehtonen (2001), Fransada mildiyye kar yalnz bakr uygulamasna
izin verilen organik ba alanlarndan elde edilen 16 organik krmz arap ile geleneksel
yetitiricilikten elde edilen 16 krmz arab resveratrol ierii bakmndan
karlatrmlardr. Organik araplarda resveratrol deriimi ortalamas 5.6 mg/l olarak
llrken, normal araplarda 2.9 mg/l olarak llmtr. En yksek resveratrol
deriimi ise 14.5 mg/l ile Loire blgesinden salanan organik krmz araplardan elde
edilmitir.
20
Bitki fizyolojisi kavramlar ierisinde ozon, bitkiler iin hava kirlilik etmenlerinden biri,
dolaysyla bir stres faktr olarak tanmlanmaktadr. Ancak son yllarda ozonun, bitki
patojenlerine kar gelitirilen savunma mekanizmalarnda; etilen, salisilik asit gibi
nemli sinyal molekllerini uyard, oksidatif dayanm mekanizmalar ile ilgili
biyosentez yollarnn balamasnda uyarc olduu ve PR genleri zerinde etkili olduu
bildirilmektedir (Kangasjrvi et al. 1994, Sandermann et al. 1998).
Ozonun yukarda belirtilen etkilerini ayrntl olarak bildiren ve asmalarda stilben
fitoaleksinleri zerinde etkisi olmas gerektiini vurgulayan Sarig et al. (1996), ozon
etkisinden yararlanmak iin pratik adan en uygun dnem olarak hasat sonras
depolama aamasnda uygulama yaplmasn tercih etmilerdir. Aratrclar, Perlette,
Thompson Seedless, Zeiny ve Barlinka olmak zere drt sofralk zm eidinde
depolama srasnda zel koullarda ozon uygulamlardr. Tm eitlerde nemli
rklk etmenlerinden biri olan Rhizopus stoloniferin bulama durumu ile stilben
bileiklerinden resveratrol ve pterostilben retimini incelemilerdir. Sonuta, ozonun
rklk etmeninin geliimine kar baaryla kullanlabileceini ve buna paralel olarak
eitlerde her iki stilben bileii ynnden baarl bir retimin elde edildiini
gstermilerdir.
Napolyon zm eidinin 8 ppm dozunda ozon uygulamas ile depoland koullar,
kontroll atmosfer ve sekiz farkl depolama koulu ile karlatrlm, kalite kriterleri
kapsamnda, resveratrol ve piceid ieriindeki deiimler de incelenmitir. zmler
hasat edilip depoya alnrken llen piceid ve resveratrol deriimlerinin, depolama
sresi ve market koullarn simle eden sreler sonundaki deiimleri belirlenmitir.
Ozon uygulamasnda, piceid deiiminin ok az buna karlk, resveratroln balang
miktarndan 3-4 kat daha yksek olduu saptanmtr. Ayrca ozon uygulamas ile
kontroll atmosfer koullarnda yaplan muhafaza karlatrldnda; ozon
uygulamasnn resveratrol deriiminde 2 kat art meydana getirmesi ile yine ne kan
depolama koulu olduu ifade edilmitir (Arts-Hernandez et al. 2003).
21
Bitkilerde patojenlere kar yerel veya sistemik doal savunma mekanizmalarnn
harekete geirilmesinde, baz isel organik maddeler sinyal molekl olarak grev
yapmaktadr. Bu maddelerin banda salisilik asit (SA), etilen ve jasmonik asit (JA)
gelmektedir. Jasmonik asitin, kereviz yapraklarna gaz halinde uygulanmas sonucunda
furanokumarin fitoaleksininin biyosentezini artrmas sonucundan yola kan Larronde
et al. (2003), metil jasmonat (MeJa) uygulamasnn stilben birikimi zerindeki etkisini
belirlemek amacyla, Cabernet Sauvignon eidinin saks asmalarna, kontroll sera
koullarnda gaz formunda MeJa uygulamlardr. Yapraklarda piceid formunda stilben
birikimi meydana gelirken, tanelerde uygulama zamanna bal olmak koulu ile
resveratrol birikimi uyarlmtr. Aratrclar elde ettikleri bulgulara gre MeJan
asmalarn savunma mekanizmasnn kurulmasnda gaz formunda mesaj molekl olarak
altn vurgulamlardr.
sel bitki hormonlarna fonksiyonel olarak benzerlik gsteren ve doal savunma
mekanizmas ile ilgili bir dier bileik Benzotiadizol (BTH)dr. Dardan BTH,
uygulamalarnda stilben sentezi ynnde ilgin sonular elde edilmitir. Iriti et al.
(2004), Merlot zm eidine ait tanelere, 0.3 mM BHT uygulamas yaptklar
almada, resveratrol deriimini kontrolde 0.390 mg/kg olarak belirlerken, uygulama
yaplm tanelerde 0.546 mg/kg olarak belirlemilerdir. Aratrclar sonu olarak
BHTnin resveratrol sentezini kontrole gre %40 orannda artrdn vurgulamlardr.
Buna karn Bavaresco and Vezzulli (2006)ya gre ise BHT, asma yapraklarnda
stilben sentezini uyarmamaktadr.
Bitkilerde stres metabolizmasnn nemli rnlerinden bir dieri de Absizik asit
(ABA)dir. Bu zellii nedeniyle dardan ABA uygulamalarnn etkisinin aratrlmas
da ilgi ekici olmutur. Kyoho zm eidinin tanelerinde ABA uygulamasnn kontrol
grubuna gre resveratrol deriimini 1.2 kat artrd belirlenmitir (Ban et al. 2000).
22
2.3.3 Yetitiricilik faktrleri
Baclk kltr kavram kapsamndaki eitli yetitiricilik uygulamalar genellikle birer
stres faktr olarak asmalar etkilemektedir. Bu nedenle, yetitiricilik uygulamalarnn
fitoaleksin retimine katkda bulunma dzeyi ve etki mekanizmasnn belirlenmesi,
rnn nitelii ve kalitesi zerindeki etkileri nedeniyle nem tamaktadr. Yetitiricilik
faktrlerinin bamsz etkilerinin belirlenebilmesine uygun aratrmalarn planlanmas
olduka deer tamakla birlikte, ba koullarnda bamsz sonulara ulamak mmkn
olmamaktadr. Ancak, yetitiricilik koullarnn etkilerinin nemi dikkate alnarak nc
nitelikte almalar gerekletirilmektedir.
Ana etkisi
Bu blm, Resveratrol Moleklnn zellikleri ve Asmalardaki Fizyolojik Rol
bal altnda incelenmi olduu gibi tr ve eitler anlamnda asma genotiplerinin
fitoaleksin retim kapasitesi farkllk gstermektedir. Baclk anlamnda ise al bir
bitkide, analarn fitoaleksin retimi zerinde nemli etkilerinin olduu, resveratrol ve
dier stilbenik bileiklerin retiminin, su ve mineral madde almyla etkilenebilecei
bildirilmise de (Bavaresco and Vezzuli 2006), henz ana etkisi konusunda bamsz
aratrma verilerinin sunulduu kaynaklara ulamak mmkn olmamtr.
klim
klim farkl bileenleri ile bitkiler iin en nemli stres faktrlerinden biridir. Bu nedenle,
stilben sentezi zerinde de nemli etkilerinin olmas beklenmektedir.
klimin bir esi olarak, ba alanlarnn corafik konumu ile eitlerin resveratrol
retimini ilikilendirmi olan aratrma sonular bulunmaktadr. Lamuella-Ravents
and Waterhouse (1993), Kaliforniyann kuzeyinde ve gneyinde yetitirilen
zmlerden elde edilen araplarn resveratrol ieriklerini incelemiler ve serin
23
ekolojilerde (kuzey) yetitirilen zmlerden elde edilen araplarn, iyi gnelenen gney
ekolojilerde yetitirilen zmlerden elde edilen araplara gre daha yksek resveratrol
deriimine sahip olduunu belirtmilerdir.
Avrupada bacln en kuzey snrlarndan biri olarak gsterilen Bohemya ve Moravya
blgelerinde yetitirilen zmlerin; yaprak, tane kabuu ve araplarnda resveratrol
ieriinin olduka yksek olduu bildirilmitir. Resveratrol dzeyindeki artn,
blgedeki dk scakla bal olarak fungal hastalk etmenleri riskinin yksek olmas
ve bu alanlarda hava kirlilik etmenlerinin youn olmas sonucu meydana gelen stres
etkisinden kaynakland ileri srlmtr (Melzoch et al. 2001).
Anl et al. (2006), arap reticilerinin eit ve eidin elde edildii blgeyi belirttikleri
13 zm eidine ait 39 kalite krmz arapta resveratrol ve dier fenolik bileiklerin
deriimini incelemilerdir. Elde edilen bulgulara gre en yksek resveratrol deriimi,
Gneydou Anadolu blgesi eitleri olan kzgz-Boazkere paalnda
belirlenmitir (2.258 mg/l). En dk resverarol deriimi ise 0.421 mg/l ile Ada karas
zm eidinin arabndan elde edilmitir.
Resveratrol retimi zerinde kuraklk etkisi hl zerinde allan bir konudur.
Avrupada pek ok kurak alan baclk ile deerlendirilmeye allmakta, ayrca ba
alanlarnda sulama nerilmemektedir. Martinez-Ortega et al. (2000), spanyann
gneyinde 1986 ile 1993 yllar arasnda retilmi, 14 krmz, 11 beyaz ve 28 sherry
tipi ticari arapta yaptklar almada; kurak geen ylda krmz araplardaki toplam
resveratrol miktarn 0.038 mg/l, normal iklim koullarnda ise 1.164 mg/l olarak
gzlemilerdir. Bavaresco and Vezzulli (2006) yksek scaklklarn, dk scaklklara
gre resveratrol deriiminde azalmaya neden olduunu vurgulamlardr.
Yllk ya ve hasattan nceki nem miktar da stilben sentezi zerine etkili bir faktr
olarak deerlendirilmitir. Ya ile balardaki fungal hastalklar yakn ilikilidir
(Jeandet et al. 1995b). Tanelerdeki resveratrol sentezini balatmak iin plak gzle
24
belirlenemeyecek kadar dk fungus etkisi yeterlidir. Bu durumun oluabilmesi iin de
dk ya da orta dzeyde nem gereklidir.
Toprak
Resveratrol retimi zerine; bitkinin besin maddesi ihtiyac gz nne alndnda
topran etkili olmas beklense de, bu etkileri aklamaya ynelik almalar da olduka
snrldr.
Gbreleme
Balarn gbrelenmesinde azot, ana besin maddelerinden ve bitki fizyolojisini
dzenleyen minerallerden birisidir. Graham (1983)a gre azotun snrl olduu
koullarda, ikimate sentez yolu deierek stilben sentezini de ieren polifenol ve
alkoloid sentezi artmaktadr.
Bavaresco et al. (2001), 420 A anac zerine al Cabernet Sauvignon Klon R5 zm
eidine ait bitkilerde dk ve yksek azot uygulamalarnn tanede resveratrol
retimine etkisini aratrmlardr. Elde edilen bulgulara gre hi azot uygulanmayan
bitkilerin tanelerinde llen resveratrol deriimi; 0.4 mg/kg iken, 4 g azot
uygulananlarda bu deriim 0.2 mg/ga gerilemitir. 8 g ve 16 g azot uygulanan bitkilerin
tanelerinde ise resveratrol belirlenememitir.
Topraktaki kirecin stilben dzeyini etkilediini vurgulayan Bavaresco et al. (2005),
kirece hassas bir ana olan 3309 C zerine al Merlot zm eidine ait klonlar kireli
ve kiresiz topraklarda yetitirmilerdir. Elde edilen bulgulara gre zm eitlerinde
tanede stilben birikiminin uyarldn belirtmilerdir. Kiresiz topraklarda yetitirilen
zmlerin tanelerinde resveratrol deriimi 0.039 g/g YA olarak belirlenirken, kireli
topraklarda bu deer yaklak % 635lik bir artla 0.25 g/g YA olarak belirlenmitir.
25
Resveratrol deriimi zerine tropik bitkilerin z suyundan elde edilen ticari bir sv
gbre olan Trimin de etkisi incelenmitir. Enzimler, mineral maddeler ve vitaminler
bakmndan zengin bir bileik olan Trim, Barbera eidinin yapraklarnda trans-
resveratrol birikimini uyarmtr (Bavaresco and Vezzulli 2006).
Budama ve terbiye ekli
Budama iddeti ve asmalarn resveratrol dzeyi incelendiinde, asmalarda k
budamasnn resveratrol deriimini etkilemedii sonucuna ulalmtr (Bavavesco and
Vezzulli 2006).
Terbiye sistemleri, yapraklarn ve salkmlarn mikroklimasn deitirmektedir. Bu
nedenle resveratrol dzeyini etkileme olasl daha yksektir. Threlfall and Morris
(1996) ile Bertamini and Mattivi (1999)nin bulgular bu genel yaklam destekler
nitelikte olup, telli terbiye sistemlerinin, Cynthiana (V. aestivalis) ve Cabernet
Sauvignon araplarnda resveratrol seviyesini olumlu etkiledii belirlenmitir.
Glgeleme
Salkm glgeleme Kyoho eidinde resveratrol deriimini etkilememitir (Ban et al.
2000). Salkmlarn ksa sreli gne na maruz braklmas, scak yllarda resveratrol
sentezi iin tercih edilirken, bu uygulamann serin yllarda ters tepki verdii
belirlenmitir (Bertamini and Mattivi 1999).
Yaralama
Olgun tanelerin yaralanmas ile tanelerde stilben retiminin artt belirlenmitir. Buna
gre mekanik hasat srasnda tanelerin yaralanmasnn bir abiyotik elisitr davran
gsterebilecei dnlmektedir (Bavaresco et al. 1997b). Srdi et al. (2000), gen ve
26
olgun asma yapraklarnda yaralamann, yaralama yaplmam kontrol yapraklarna gre
resveratrol dzeyinde nemli bir arta neden olmadn belirtmilerdir.
2.4 Asmalarda in vitro Koullarda Resveratrol retme almalar
Aseptik koullarda, yapay bir besin ortamnda, btn bir bitki, hcre, doku veya organ
gibi bitki ksmlarndan yeni bir bitkinin retilmesi olarak tanmlanan bitki doku
kltrleri (Babaolu vd. 2001), ikincil rnlerin elde edilmesinde de baaryla
kullanlmaktadr (Knorr et al. 1993). Bu amala en yaygn kullanlan doku kltr
yntemleri, kallus kltrleri ve bunlardan elde edilen hcre sspansiyon kltrleridir.
Geleneksel yntemlerle ayn kalitede ve srekli retilemeyen ikincil rnler, in vitro
yntemler kullanlarak; ayn kalitede ve yksek saflkta srekli olarak elde
edilebilmektedir (Ramachandra and Ravishankar 2002). Ayrca ikincil rnlerin
biyosentez mekanizmalarnn belirlenmesinde in vitro yntemler iyi bir model sistem
oluturmaktadr.
Asmada in vitro koullarda resveratrol retimine ynelik almalar (Keller et al. 2000,
Commun et al. 2003, Tassoni et al. 2005, Bru et al. 2006, Zamboni et al. 2006) snrl
sayda olup, bu almalarda, en yksek resveratrol deriimini salayacak etkili elisitr
belirlemenin yan sra, stilben biyosentezi ve metabolizmasn dzenleyen ve artmasn
salayan faktrler de belirlenmeye allmtr.
Keller et al. (2000), Cabernet Sauvignon zm eidine ait kallus kltrlerinde, elisitr
olarak UV n uygulamasnn resveratrol deriimine etkisini incelemilerdir. Elde
edilen sonulara gre UV n uygulanmam kalluslarda, resveratrol iz miktarda
belirlenirken, UV n uygulamasndan 24 saat sonra kalluslarda resveratrol retimi
hzla artmaya balam (2.5 g/g YA) ve bu art 40. saate kadar devam etmitir (20 g/g YA). 72. saat sonunda ise resveratrol retimi belirgin bir ekilde azalma
gstermitir (12 g/g YA).
27
Commun et al. (2003), V. vinifera eitlerinden Chardonnay, Pinot noir ve Seyval ile
trler aras bir melez olan 41 B anacna ait protoplast kltrlerinde resveratrol retimi
zerine almlardr. Aratrclar, bu amala genotiplere ait bitkileri in vitro
koullarda yetitirmiler ve elde edilen bitkilerin yapraklarn eksplant olarak
kullanmlardr. almada yer alan genotiplere ait protoplast kltrlerinde, resveratrol
ilk 24 saat ierisinde atmaya balam ve en yksek resveratrol deriimi 2-7. gnde
llmtr (12 g 1x106 protoplast). Kltrn birinci haftasndan itibaren, resveratrol birikimi azalmaya balam ve 15. gnde en yksek resveratrol deriiminin %50si
kadar bir azalma ile sonulanmtr ( 6 g 1x106 protoplast) .
Tassoni et al. (2005), Barbera zm eidine ait hcre sspansiyon kltrlerinde,
resveratrol retimini salamak ve artrmak amacyla, JA (10 M), MeJa (10 M) ile Na-ortovanedat (0.1-1 mM) elisitrlerinin etkilerini incelemilerdir. Elde edilen
sonulara gre Na-ortovanedatn her iki deriimi de trans-resveratrol retimini
etkilemezken, MeJan olduka etkili bir elisitr olduu belirlenmitir. JAin ise
MeJatan daha az uyarc etkisinin olduu gzlenmitir.
Bru et al. (2006), Gamay rouge, Monastrell albine ve Monastrell gren eitlerine ait
hcre sspansiyon kltrlerinde deiik siklodekstrin (CD) uygulamalarnn (slfo-
CD, sikloheptamiloz (CD), 2-hidroksipropil-CD (HYPROB), Dimetil--siklodekstrin (DIMEB), maltosi-CD (G2-CD)) resveratrol retimi zerine etkilerini incelemilerdir. Uygulama yaplmam kontrol grubunda resveratrol retimi
belirlenememitir. En etkili elisitr DIMEB olarak belirlenirken, slfo-CDnin ise resveratrol retimini uyarmad gzlenmitir. En yksek resveratrol deriimi
Monastrell albine eidinde 14.8 mM olarak belirlenmitir.
Zamboni et al. (2006), V. vinifera eitlerinden Pinot noir ve Merzling ile V. amurensis
ve V. riparia x V. berlandieri melezine ait hcre sspansiyon kltrlerinde, resveratrol
retimine DIMEBin etkisini incelemilerdir. Resveratrol retimi kallus dokusu faznda
ve sznt faznda ayr ayr belirlenmitir. Uygulama yaplmayan kontrol gruplarnda
Pinot noir kltrleri hari, bir miktar resveratrol retimi gzlenmitir. En yksek
28
resveratrol deriimi, DIMEB uygulamasndan 48 saat sonra; V. riparia x V. berlandieri
melezine ait sspansiyon kltrlerinin sznt (911.25 g/g) ve doku faznda (622.90
g/g) elde edilmitir. En dk resveratrol retimi ise Merzling eidine ait kallus
dokularnda gzlenmitir (3.91 g/g).
2.5 Resveratroln Biyolojik Etkileri Resveratrol, ilk olarak 1930lu yllarn balarnda tbbi bir bitki olan Veratrum
grandifolium Loes. fil.de tanmlanm ve salk zerine etkileri, zellikle in ve Japon
bilim adamlar bata olmak zere, birok bilim adam tarafndan uzun yllar
aratrlmtr (Creasy and Creasy 1998). Polygonum cuspidatum bitkisinin kklerinden
ztlenen resveratrol, Japonya ve inde halk tarafndan kojo-kon adyla bilinen
geleneksel bir ila olarak; hipertansiyon, damar tkankl, cilt iltihab, alerji gibi birok
hastaln tedavisinde kullanlmaktadr. Arichi et al. (1982) ve Kimura et al. (1983)
fareler zerinde yaptklar almalarda, bu ilacn karacierde ya birikimini nlediini
ve kan-serum kimyasn dzenlediini belirlemilerdir.
Siemann and Creasy (1992)nin araplarda resveratrol tanmlamalaryla birlikte,
resveratroln salk zerine etkisi ile ilgili almalar da hz kazanmtr. Bu almann
ardndan, Renaud and de Lorgeril (1992)in koroner kalp hastalklar ve Fransz
Paradoksu zerine yaptklar alma dikkat ekicidir. Yksek oranda doymu ya
tketimi ile koroner kalp hastalklarndan lm oran arasnda pozitif bir iliki
olmasndan yola kan aratrclar, Fransada koroner kalp hastalklarndan lm
orannn dk olmasn lml arap tketimine (Fransz Paradoksu) dayandrmlardr.
Jang et al. (1997)a gre gnlk 375 ml krmz arap tketimi, araidonik asit
metabolizmasn dzenlemektedir. Dier yandan, Moriarty et al. (2001), Siyah Korint
zm eidine ait 50 adet tane tketiminin, resveratrol ieren bir kadeh arap ile ayn
dzeyde etkili olacan vurgulamlardr.
29
Resveratrol sya dayankl olmas nedeniyle, bir ok yiyecek eidinde aktif formunu
(trans-resveratrol) koruyabilmekte, az yoluyla alndktan hemen sonra sindirilmekte
ve hzla kana karmaktadr (Kuhnle et al. 2000, Bavaresco and Vezzulli 2006).
Resveratroln; antioksidan, antitmr ve antimutagen zellikleri nedeniyle insan sal
iin doal bir kimyasal koruyucu olduu belirtilmitir (Jang et al. 1997, Srdi et al.
2000, Moriarty et al. 2001). Resveratroln salk zerine olumlu etkileri aada
maddeler halinde verilmitir.
1. Koroner kalp hastalklar riskini azaltmaktadr (Frankel et al. 1993, Kopp 1998,
Cui et al. 2002).
2. Kanser balangcn geciktirmekte, geliimini yavalatmakta veya
engellemektedir (Falchetti et al. 2001).
3. Serbest radikal oluumunu engellemektedir (Kanner et al. 1994).
4. Trombosit toplanmasn engellemektedir (Kimura et al. 1985, Melzoch et al.
2001).
5. Dk younluklu lipoproteinlerin (LDL) oksidasyonunu nlemektedir (Frankel
et al. 1993, Belguendouz et al. 1998).
6. Triailgliserol dzeyini drmekte ve karacieri lipit peroksidasyonundan
korumaktadr (Blond et al. 1995, Kuhnle et al. 2000).
7. C vitaminine gre 20-50 kat daha fazla etkili bir antioksidan olduu iin immun
sistemi glendirmektedir (Celotti et al. 1996).
8. ltihaplanmay engelemeye yardmc olmaktadr (Jang et al. 1997).
9. Anti alerjiktir (Cheong et al. 1999).
10. Siklooksigenaz ve hidroperoksidaz fonksiyonlarn engellemektedir (Jang and
Pezzuto 1997).
Bunlarn yan sra; son yllarda resveratrolun Alzheimer hastal zerine etkisini
belirlemeye ynelik aratrmalar da yaplmaktadr (Falchetti et al.2001).
30
Gnmzde, resveratrol kapsl haline getirilerek ticari nem kazantr. Kanadada
Pharmascience irketi tarafndan retilen Resverin ile Amerika Birleik
Devletlerinde InterHealth adl irket tarafndan piyasaya srlm olan Protykin
trans-resveratrol, ieren rnler arasnda nem kazanmtr (Haneke 2002).
31
3. MATERYAL VE YNTEM
Bu alma, Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri Blmnde 2003-
2007 yllar arasnda yrtlmtr. Tez almasnn Kalecik karasna ait kk bir
blm, Ankara niversitesi Biyoteknoloji Enstits tarafndan desteklenen Asmada
in vivo ve in vitro Koullarda Resveratrol retim Veriminin Abiyotik Uyarclar ile
Artrlmas konulu projenin bir alt blmn oluturmaktadr.
almalar temel olarak; Ankara niversitesi, Ziraat Fakltesi, Bahe Bitkileri Blm,
Biyoteknoloji I Laboratuvar ve seras, Biyoteknoloji Enstits Laboratuvarlar ile Bilim
nsan Yetitirme Projesinden (BYEP) salanan destek ile Cattolica Del Sacro Coure
niversitesi (Universita Cattolica Del Sacro Coure Piacenza-talya) olanaklarndan
yararlanlarak gerekletirilmitir.
Tez almasnda kullanlan materyaller ve izlenilen yntemlere ilikin bilgiler aada
verilmitir.
3.1 Materyal
almada, krmz tane rengine sahip Kalecik karas (Klon 12), kzgz, Erci ve
Cabernet Sauvignon zm eitleri zerinde allmtr. Kalecik karas ve kzgz,
lkemizin nde gelen krmz araplk zm eitlerindendir (elik 2006). Erci, Van ili
ve evresine zg krmz bir eit olup; salkm ve tane morfolojisi dikkate alndnda
araplk-ralk deerlendirilmeye daha uygun olmakla birlikte, yrede sofralk veya
geleneksel amalar iin de kullanlmaktadr (Uyak 2002). Yabanc krmz araplk bir
zm eidi olan Cabernet Sauvignon ise tm dnyada yksek kaliteli araplk eitlerin
banda gelmesi ile tannmaktadr (elik 2006).
32
ekil 3.1de, zerinde allan zm eitlerinin olgun salkmlarnn grn, izelge
3.1de ise baz zellikleri sunulmutur.
Kalecik karas kzgz
Cabernet Sauvignon Erci
ekil 3.1 zm eitlerine ait olgun salkmlarn grn Kaynak: Kalecik karas, kzgz ve Cabernet Sauvignon zm eitlerine ait fotoraflar, Prof. Dr. Hasan elikten alnmtr.
33
izelge 3.1 zm eitlerine ait baz zellikler*
eitler zellikler
Kalecik karas kzgz Erci C. Sauvignon
iek tipi Erdii Erdii Erdii Erdii
Tane rengi Mavi puslu siyah Gri puslu siyah Mavimsi siyah Mavi-gri puslu siyah
Tane irilii Orta, 2-2.5 g ri, 6 g Kk-orta, 2 g Kk, 1.5 g
Salkm ekli Kanatl konik Kanatl konik Dall konik Konik-silindirik
Salkm irilii Kk-orta, 200 g ok iri, 450-550 g Orta, 250 g Orta, 230 g
Olgunlama Orta mevsim Ge Orta mevsim Ge
Kalite
zellii
Meneke-yakut renkli,
eide zg aromal,
dolgun ve dengeli
arab ile lkemizin en
tannm krmz
araplk eitlerinden
birisidir.
lkemizin en
kaliteli krmz
araplk
eitlerinden
birisidir.
araplk-ralk
bir eit olmakla
birlikte, eide
zg aromas
nedeniyle sofralk
olarak da
tketilmektedir.
Koyu renkli, yksek
tanenli, meneke
bukeli,
yalandrmaya
uygun yksek
kaliteli araplk bir
eittir.
* Uyak (2002) ve elik (2006)den yararlanlarak hazrlanmtr
3.2 Yntem
3.2.1 Kallus kltr almalar
3.2.1.1 Eksplantlarn eldesi
Kallus kltr almalarnda, yapraklar ve boum aralar eksplant olarak kullanlmtr. Eksplantlarn elde edilmesi iin zm eitlerinden, k dinlenme dneminde alnan ve +4 Cdeki souk hava deposunda, polietilen torbalar ierisinde muhafaza edilen kalemlik eliklerden hazrlanan iki gzl elikler kullanlmtr. Hazrlanan elikler serada 1:1:1 orannda kum, perlit ve torf ieren polietilen torbalara dikilmitir. Eksplant olarak kullanlacak yapraklar ve boum aralar srgnlerin orta blmnden alnmtr.
34
3.2.1.2 Eksplantlarn sterilizasyonu
Yaprak ve boum aralar nce eme suyunda, daha sonra saf suda ykanm, %0.01lik Tween 20 eklenmi, % 20lik sodyum hipoklorit zeltisinde 15 dakika bekletildikten sonra, steril saf su ile 5er dakika 3 kez alkalanarak durulanm ve dikime hazr hale getirilmitir.
3.2.1.3 Kallus kltrlerinin kurulmas
Kallus kltrlerinde besin ortam olarak, Gamborg B-5 kat temel besin ortam (Sigma
G5893) kullanlmtr (Gamborg et al. 1968). Saf su ierisine litreye 3.2 g hazr besin
ortam katlmasyla hazrlanan besin ortamnn pH deeri 5.7ye ayarlanmtr.
Bymeyi dzenleyici madde olarak, kallus geliimini artrc 1.0 M BAP (6-
benzilaminoprin) ve 0.1 M 2,4-D (2,4-diklorofenoksi-asetik asit) eklenmitir (Keller
et al. 2000). Daha sonra sakkaroz (%2) ve agar (% 0.8 ) ilave edilmi besin ortam,
otoklavda 121 Cde 20 dakika sreyle sterilizasyon ilemine tabi tutulmutur (Hatipolu 1997).
Yaprak ve boum aralarna ait paralar, ierisinde 30 ml ortam bulunan 100x200
mmlik petri kaplarna dikilmitir. Her eit iin 15 petri ve her petri ierisinde 11
yaprak veya boum arasna ait eksplant bulunacak ekilde dikim yaplmtr (ekil 3.2).
Daha fazla yara alan oluturmak amacyla, boum aralar ortadan ikiye kesilerek
dikilmilerdir. ki farkl eksplant kaynan, kallus kalitesi bakmndan test etmek iin
yaplan bu n alma sonucunda, yaprak eksplantlarndan daha nitelikli kalluslarn
(beyaz renkli ve gevrek yapl) elde edildii belirlenmitir (ekil 3.3). Bu nedenle,
almann devamnda eksplant kayna olarak yapraklarn kullanlmasna karar
verilmitir. Karanlkta ve 25 Cde inkbe edilen kalluslar , 21 gn ara ile iki defa alt kltre alnmtr. kinci alt kltrden sonra kalluslar, taze ortamlara aktarlmtr. Bu
ortamlarda 12 ve 15 gn olmak zere iki farkl aamaya gelinceye kadar gelitirilmitir.
Bu aamalar almada kallus ya olarak nitelendirilmitir.
35
B A
ekil 3.2 Kallus kltrleri iin kullanlan eksplantlar (A: yaprak, B: boum aras)
ekil 3.3 Yaprak eksplantlarndan elde edilen kalluslar
36
3.2.2 Elisitr (Uyarc) uygulanmas
almada, elisitr olarak ksa dalga boylu UV nn etkisi incelenmitir. UV n
kayna olarak, Vilber-Lourmat T-15C UV-C lamba kullanlm ve Ortadou Teknik
niversitesi, Fen Edebiyat Fakltesi, Fizik Blmnde test ettirilerek, dalga boyunun
254 nm olduu belirlenmitir. Lambann almada kullanlabilmesi iin uygun bir
dzenek kurulmutur (ekil 3.4).
almada UV 10 (Bais et al. 2000, Keller et al. 2000, Moriarty et al. 2001,
Commun et al. 2003) ve 15 dakika (Langcake and Pryce 1977, Jeandet et al. 1991,
Jeandet et al. 1995a, Douillet-Breuil et al.1999, Adrian et al. 2000) olmak zere iki
farkl sre ile uygulanmtr. Bu amala, 12 ve 15 gn yal kltrlere, steril kabin
ierisinde petri kutularnn kapaklarnn almas ile uygulama gerekletirilmitir (ekil
3.5).
ekil 3.4 UV lambasnn kurulduu dzenek
37
ekil 3.5 Kalluslara UV nnn uygulanmas
UV kaynana en uygun mesafenin 10 cm olduu bildirildiinden (Bais et al. 2000 ve
Keller et al. 2000 ) bu uzaklk deeri esas alnmtr.
Uygulama yaplan kallus kltrleri, 25 Cde, karanlk koullarda 24, 48 ve 72 saat olmak zere farkl srede inkbe edilmitir. nkbasyon sresi olarak farkl
zamann incelenmesi Douillet-Breuil et al. (1999)a dayanlarak planlanmtr.
nkbasyon sonunda kalluslar 1g olacak ekilde tartlm, alminyum folyolara sarlm
ve analize kadar korumak amacyla 80 oCde saklanmaya alnmtr.
Herhangi bir uygulama yaplmayan Kontol kalluslar, ikinci alt kltrden sonra taze
ortama aktarlan 12 ve 15 gn yal kalluslardan 1 g rnek ierecek ekilde alnm ve
alminyum folyo ierisinde 80 oCde analiz zamanna kadar korunmutur.
38
3.2.3 Yksek basnl sv kromotografisi (HPLC) almalar
3.2.3.1 Kallus dokularndan resveratroln ztlenmesi
Resveratrol ztlenmesi, Keller et al. (2000) tarafndan belirtilen ynteme gre
gerekletirilmitir. Resveratrol ztlenmesi aamalar, ak emas halinde ekil 3.6da
verilmitir.
ztler, analiz edilinceye kadar kahverengi rnek ielerinde -20 Cde muhafaza edilmitir. ztlerin scakl oda scaklna ulatktan sonra, gzenek ap 0.45m
olan mikrofiltrelerden (millipore) renkli ielere szlm ve HPLC kolonuna 5 l
enjekte edilmitir.
3.2.3.2 Stok solsyonlarn hazrlanmas ve kalibrasyon
HPLCde resveratrol okumalarnn yaplabilmesi iin ncelikle standart maddeden stok
solsyonlar elde edilmitir. Bunun iin saf madde halindeki trans-resveratrol (Sigma -
R5010 ) standardndan 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 20, 30, 40 ppmlik seri zeltiler metanol
ile hazrlanmtr. Seri zeltilerde yaplan resveratrol okumalar ile standart kalibrasyon
erisi izilmitir (ekil 3.7). Resveratrol okumalarnn yapld HPLC aleti ve
kullanlan programa ilikin ayrntl bilgiler Blm 3.2.3.3de verilmitir.
39
Kallusun homojenize edilmesi 1 g donmu kallus dokusu/10 ml souk aseton
alkalaycda bekletme 30 dakika
Santrifj 10 dakika, 3000 devir/dakika
keltinin alnmas
ekil 3.6 Resveratrol ztlenmesinin aamalar
Azot gaz ile buharlatrma 40 Cde su banyosu iinde
Son hacmin tamamlanmas 2 mlye metanol ile
Santrifj 10 dakika, 3000 devir/dakika
keltinin zdrlmesi 5 ml aseton
5 ml metanol
40
y = 15980x - 3465R2 = 0,9994
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0 10 20 30 40 50
Resveratrol (ppm)
Ala
n
ekil 3.7 Resveratrol standart ile izilen kalibrasyon erisi
3.2.3.3 Resveratroln HPLC ile analizi
Resveratroln HPLC ile analizinde SSI LabAlliance Esence HPLC Workstation marka
HPLC cihaz, Jeandet et al. (1997)a uyumlu olacak ekilde Phenomenex/Luna guard
kolon (5 m, 12.5 x 4.6 mm, ID), Phenomenex/Luna C18 kolon (5 m, 250 x 4.6 mm,
ID) ve UV-VIS dedektr sistemi ile birlikte kullanlmtr. Trans-resveratrol lmleri
iin 330, 374 ve 380 nm olmak zere dalga boyunda tarama yaplm ve 330 nm
dalga boyunda deerler elde edilmitir.
Hareketli (mobil) faz olarak asetonitril (HPLC saflnda, Merk) ve su kullanlmtr.
lmlerde izlenen HPLC program aada verilmitir.
41
HPLC program:
zcler Zaman
(dakika) % A
Asetonitril
% B
Su
Basn
(bar)
0.00 10.00 90.00 200
18.00 85.00 15.00 200
23.00 85.00 15.00 200
30.00 10.00 90.00 200
35.00 10.00 90.00 200
zcler HPLC cihazna yerletirilmeden nce, 0.45 mlik gzenek apl membran
filtreden szlm ve havas alnmtr. Hareketli faz ak hz 1.0 ml/dakika olacak
ekilde ayarlanmtr.
3.2.3.4 Bileik tans ve hesaplama
Kromatogram zerindeki pikler, tutunma sresine (retention time) gre belirlenmitir.
Uygulanan analiz koullarnda, trans-resveratrol iin tutunma sresi 12.5 dakika
olmutur. Kallus rneklerinde trans-resveratrol tayini ile ilgili bir HPLC kromatogram
rnei ekil 3.8 de verilmitir. Kalibrasyon denkleminde deerler yerine konularak
gerek trans-resveratrol deriim deeri belirlenmitir.
42
ekil 3.8 HPLC kromatogram rnei
43
3.2.4 Sonularn istatistik deerlendirmesi Uygulamalar ve deneyler tekrarl olarak yaplmtr. eitlerde ve iki kallus yanda;
(12 ve 15 gn yal) UV n uygulama sresi ile inkbasyon sresi faktrlerinin
resveratrol deriimi zerine etkisi incelenmitir. Elde edilen lm deerleri,
Faktriyel Dzende Tekrarlanan lml Varyans Analizi Yntemi ile
deerlendirilmitir (Winer et al. 1991). Farkllklarn belirlenmesi amacyla, oklu
karlatrma yntemlerinden Asgari nemli Fark (AF) Yntemi kullanlmtr.
Farkllklar %1 nemlilik (anlamllk) dzeyinde (p
4. BULGULAR 4.1 UV In Uygulama Sresi ve nkbasyon Sresinin Resveratrol Deriimine
Etkisi
almada, zerinde allan zm eitlerinde, 10 ve 15 dakika sre ile UV n
uygulamalar ve farkl inkbasyon sresi sonunda elde edilen resveratrol uyarm, 12
ve 15 gn yal kalluslarda ayr ayr olmak zere incelenmitir. Varyans analizi
sonularna gre zm eitlerinin tmnde UV n uygulama sresi x inkbasyon
sresi etkileimi istatistik olarak nemli bulunmutur (p
izelge 4.1 Kalecik karas zm eidinde, 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri
nkbasyon Sresi (saat) Uygulama Sresi
(dakika) 24 48 72 Ortalama
10 A 1.82
* 0.02 b A 2.42* 0.04 a A 1.59* 0.02 c 1.94 0.15
15 A 1.95
* 0.06 b B 2.16* 0