Aspectos fundamentais de EM

• Ionizar é preciso:(a) ionização da amostra direta ou indiretamente;(b) método tradicional: ionização por impacto de elétrons resultando na formação de M+ seguida de fragmentação induzida por excesso de energia interna do íon molecular;(c) ionização química: método mais suave de ionização resultante de uma reação, em fase gasosa, entre íons e moléculas neutras;(d) outros métodos mais recentes.

• Analisar m/z é preciso:Cenas dos próximos capítulos!!

• Analito depositado

numa “matriz” orgânica,

que possui absorção

intensa no do laser (

= 337 nm para laser de

N2);

• Dessorção por um laser

pulsado (ns) de alta

intensidade;

• Matrizes típicas: ácido

2,5-dihidroxibenzóico;

ácido 3,5-dimetóxi-4-

hidroxicinámico; ácido

5-clorosalicílico;

• Espectro resultante

inclui íons (M+H)+, e

outros com prótons

adicionais, retirados da

matriz.

MALDI

Espectro de um anticorpo monoclonal

Rel

ativ

e A

bu

nd

ance

Mass (m/z)

0

10000

20000

30000

40000

50000 100000 150000 200000

MH+

(M+2H)2+

(M+3H)3+

MALDI TOF spectrum of IgG

Espectro (MALDI) de poli-metil metacrilato <M> = 7100 Da

Espectro de

complexo de

Pt obtido por

ionização

MALDI

Positive-ion (a) and negative-ion (b) MALDI mass spectra of CS-D tetra with pmg.

Polysulfated-Derived Oligosaccharides

Aplicações de MALDI

• Identificação de proteínas de elevada massa molecular

( > 100.000 Da).

• Espectros apresentam proteínas grandes com íons

[M+H]+, [M+2H]2+, e [M+3H]3+.

• Proteínas pequenas apresentam espectros apenas

com [M+H]+.

• Alta sensibilidade.

• Espectros de polímeros sintéticos.

• Imagem por espectrometria de massas!!

IMS allows for distinction of different molecular species of β-amyloid plaques in an

Alzheimer's disease model.

Seeley E H , and Caprioli R M PNAS 2008;105:18126-18131

©2008 by National Academy of Sciences

Métodos de ionização a pressão atmosférica

• APCI: ionização química a pressão atmosférica.

• APPI: ionização química por fotoionização.

• ESI: electrospray

• DESI: electrospray por dessorção

• DART: (direct analysis in real time).

APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

Formação de íons em APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

Aplicações de APCI

Tipo de amostras

• Substancias de polaridade e massa molecular

mediana: PAH, PCB, ácidos graxos,

esteroides, ftalatos,...

• Substancias sem sítios ácidos ou básicos.

• Substancias contendo heteroátomos: uréias,

carbamatos, ..

• Substancias a serem evitadas: substancias

instáveis a temperaturas mais altas, massa

molecular elevada,...

Exemplos de

espectros obtidos

por APCI no modo

positivo e no

modo negativo

Positive APCI spectra

of n-octane in synthetic

air at

30 °C, Vcone 1 V and at

different n-octane

concentrations of (a) 6

ppm, (b) 30 ppm, (c) 65

ppm, (d) 90 ppm, and

(e) 150 ppm

APPI (atmospheric pressure photoionization)

Espectro de

massas obtido no

modo negativo por

APPI

Espectro de massas de íons positivos obtido por APPI de petróleo

venezuelano (cortesia do líder imortal HC)

Comparação entre métodos de ionização:

exemplo da cafeína

Comparação entre métodos de ionização:

exemplo da budesonida (anti-inflamatório)

Extraindo íons da solução...

ESI – electronspray ionization

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +++

+

+

+ +

+

++

+

++

++

+

++

+ +

+

++

++

+

++++

+

+

++

++

+++

+

++

+

++++

+

+ ++++

++

+++++++

+++

++ +++ ++

+ ++

+

++

+

+

+

+++

+

++

++++

++++++

+++

+

+

++

+

++

+

+

+++

++++

+++

+

++

++++++

+++

++++++

++++

++++++

++++

++

+++++

+++

++

+ + + + + + + + +++

++ +

+++

++

++

+ + + + + + + + +++

++

1-10 kV

Solução

~10-5M

Capilarborossilicato

N2 paradessolvatação

Regiões de vácuoPressão atmosférica

Cone deTaylor

fissão

íonssolvatados

íonssem

solvente

ver

CRM (charge residue) vs. IDM (ion desorption)

IDM - Íons desorvidos da

superfície da gotícula

CRM - Íons perdem

solventes até

dessolvatarem

completamente

Procedimento típico em ionização “electrospray”

• Substancia dissolvida numa mistura, p.ex. agua-metanol, é injetada diretamente, ou por HPLC, ou por eletroforese capilar.

• Íons são formados a partir das gotas a pressão atmosférica e formam um jato por expansão livre. O mecanismo exato ainda é objeto de especulações. Amostragem ocorre através de um “skimmer”, e introduzidos no alto vácuo do espectrômetro.

• Íons provenientes de macromoléculas possuem freqüentemente um numero elevado de cargas.

• Espectros de massa medem a relação m/z e portanto íons com carga múltipla podem ser detectados mesmos com instrumentos menos sofisticados.

• A medida de distribuição de cargas não é sempre trivial. O número de cargas pode depender do pH, da presença de sais, desnaturação da proteína, quebra de ligações S-S, etc.

Solução NaBF4 em metanol/água

Fe(CN)64- e Fe(CN)6

3-

Fe(CN)64- e Fe(CN)6

3-

ESI de macromoléculas

Espectro de massas pela técnica de “electrospray” de uma enzima: espectro indica as cargas dos íons e M = 17828 2.0

Da

MHnn+

M=?

n=?

Variação do espectro de massa por electrospray, em função do pH, da mioglobina

Múltiplas cargas

carga

ms mr

Múltiplas cargas

ms mr

MH1414+ M = 16954 Da

r =14

Determinação do número de cargas e de M em espectros contendo íons com cargas múltiplas

a) Em espectros “electrospray”, a massa de um íon m1 com carga z1 pode ser equacionada em termos da massa da molécula (M) e da massa do próton (mp)

m1z1 = M + z1mp

b) Escolhendo outro pico no espectro, separado por (j-1) picos em ordem crescente de m/z, podemos equacionar a massa m2 como

m2(z1 – j) = M + (z1 – j) mp

c) Resolvendo as duas equações,

)(

)(

)(

11

12

2

1

p

p

mmzM

mm

mmjz

DESI (desorption electrospray ionization)

DESI (desorption electrospray ionization)

Métodos muito recentes

DESI

Espectro de massas obtido por DESI de traços de urina em

papel

DART (direct analysis in real

time)

Ionização DART: distinguindo entre a amostra autentica e o “genérico”

Comparação dos métodos de ionização

pola

ridad

e

n-hexano

CH2Cl2

metanol

H2O