Aula 10 - CROMATOGRAFIA L QUIDA [Modo de … · PLANAR COLUNA. Ex de interação analito -FE Equilíbrio FE Equilíbrio FE ––FM ( FM (partiçãopartição na na crom crom. Líquido

Cromatografia Líquida

Analítica V: Analítica V: Aula 10

ATENÇÃOATENÇÃO À SEQUENCIA DAS PRÁTICAS:À SEQUENCIA DAS PRÁTICAS:

Prof. Rafael SousaDepartamento de Química Departamento de Química -- [email protected]@ufjf.edu.br

Notas de aula: www.ufjf.br/baccanNotas de aula: www.ufjf.br/baccan

Para a Prática de 08/11 cada grupo deverá trazer: Para a Prática de 08/11 cada grupo deverá trazer: -- um pacote de um pacote de M&MM&M (embalagem marrom, de 104 g)(embalagem marrom, de 104 g)-- um par de luvas de procedimentoum par de luvas de procedimento

CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA LÍQUIDALÍQUIDA (C(CLL))

KromaKroma = cor= cor

em Inglêsem Inglês

GregoGregoGraphiaGraphia = escrever= escrever

1903 1903 –– 1906:1906:M M TsweetTsweet coloriu uma coluna de CaCOcoloriu uma coluna de CaCO33 com uma com uma

mistura de pigmentos vegetaismistura de pigmentos vegetais

GregoGrego

Início da cromatografia

CaCO3 (s)

Éter de petróleo(solvente)

Mistura de Mistura de substânciassubstâncias((amostraamostra))

Diferentes interaçõesDiferentes interações

Mistura de substâncias coloridas foi separada Mistura de substâncias coloridas foi separada ((carotenocaroteno , , clorofilaclorofila e e xantofilaxantofila ))

CaCO3 (s)

(adsorvente)Tempo

Diferentes interaçõesDiferentes interaçõesAdsorvente / solvente

PrincípioInteração diferenciada dos componentes da amostra com umaInteração diferenciada dos componentes da amostra com uma

FASE ESTACIONÁRIA FASE ESTACIONÁRIA e uma e uma FASE MÓVEL FASE MÓVEL

sólidosólidoou

líquidolíquido

líquidolíquidoougásgás

CromCrom. líquida (CL). líquida (CL)

Crom. gasosa (CG)

SólidoSólido

líquido sobre líquido sobre um sólidoum sólido

FASEFASEESTACIONÁRIAESTACIONÁRIA

CONFIGURAÇÃOCONFIGURAÇÃOEXPERIMENTALEXPERIMENTAL

PLANARPLANAR

COLUNACOLUNA

Ex de interação analito - FE

Equilíbrio FE Equilíbrio FE –– FM (FM (partiçãopartição na na cromcrom. Líquido. Líquido--líquido)líquido)

�� Diferente para as substâncias diferentesDiferente para as substâncias diferentesPolaridade

Tamanho

Cromatografia planar

Suporte da FE: papel especial OU Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente divididosólido finamente dividido

FM (capilaridade) FM (capilaridade) �� separaçãoseparação

�� Fácil realizaçãoFácil realização�� Análises quali e Análises quali e quantitativasquantitativas

�� Baixo custoBaixo custo�� BaixasBaixas

-- Resolução Resolução ee-- RepetibilidadeRepetibilidade-- ReprodutibilidadeReprodutibilidade

Cromatografia em coluna

Convencional Convencional (Clássica)(Clássica)

SolventeSolvente

Fase estacionáriaFase estacionária

Líquida de alta eficiência Líquida de alta eficiência (CLAE)(CLAE)

Fase estacionáriaFase estacionária

Suporte inerteSuporte inerte

-- Colunas verticais (FM Colunas verticais (FM -- gravidade)gravidade)-- Análises quali e quantitativasAnálises quali e quantitativas-- Baixo custoBaixo custo-- Baixa Baixa frequênciafrequência-- Desempenho regularDesempenho regular

-- Colunas e FM Colunas e FM –– altas pressõesaltas pressões-- Análises quali e quantitativasAnálises quali e quantitativas-- Desempenho analítico satisfatórioDesempenho analítico satisfatório-- Rapidez analítica, automaçãoRapidez analítica, automação-- Custo elevado ...Custo elevado ...

Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

-- Amplamente utilizadaAmplamente utilizada-- Dentre as modalidade mais importantesDentre as modalidade mais importantes-- Vem se desenvolvendo desde a década de 70Vem se desenvolvendo desde a década de 70

NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTANÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTANÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTANÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA

�� Necessidade de calibraçãoNecessidade de calibração

RESULTADO : Amostras RESULTADO : Amostras xx PadrõesPadrões((cromatogramacromatograma))

Subdivisões da CLAE

�� Tipo de FE (Tipo de FE (MECANISMOMECANISMO de separação)de separação)

Cromatografia líquidoCromatografia líquido--sólido: sólido: CLCLSS�� FE é um FE é um sólidsólid o (adsorção)o (adsorção)

Cromatografia líquida de fase ligada: Cromatografia líquida de fase ligada: CLCLFLFL��FE é um FE é um líquido ligado quimicamentelíquido ligado quimicamente a um suporte sólidoa um suporte sólido

(partição)(partição)

Cromatografia líquidoCromatografia líquido--líquido: líquido: CLCLLL�� FE é um FE é um líquidolíquido que recobre um sólido (partição) que recobre um sólido (partição)

Cromatografia por exclusão: Cromatografia por exclusão: CECE

�� FE é um gel que recobre um sólido com FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controladaporosidade controladaAplicação importante: análise de polímeros (GPC)

Cromatografia de troca iônica: Cromatografia de troca iônica: CTICTI

�� FE sólida contém grupos NRFE sólida contém grupos NR33++ (para (para

troca aniônica) ou grupos SOtroca aniônica) ou grupos SO33-- (para (para

troca catiônica)troca catiônica)Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc)

Cromatografia por afinidade: Cromatografia por afinidade: CACA

�� FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivaFE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletivacom com proteínaproteína s e s e anticorposanticorpos

Cromatografia quiral: Cromatografia quiral: CQCQ

�� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirFE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagir�� FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirFE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagirseletivamente com seletivamente com compostos quiraiscompostos quirais

PARA CASAPARA CASA :

Pesquisar Pesquisar duasduas substâncias que são determinadas por substâncias que são determinadas por CACA e e duasduas que o são por que o são por CQCQ

Separação e Sinal analítico

FMFM

FMFM

FMFM

FMFM

FMFM

FM + componente separadoFM + componente separadoFMFM FM + componente separadoFM + componente separado

CromatogramaCromatograma

Tempo de retençãoTempo de retenção

Sin

alS

inal

Entendendo o cromatograma

Diferentes espécies Diferentes espécies �� SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: trtr(tr= tempo de retenção � medida em função do tempo)medida em função do tempo)

aspartame

be

nza

ldeí

do

Resposta do detector


saca

rin

a

be

nza

ldeí

do

InformaçõesInformaçõesqualiquali eequantitativasquantitativas

Tempo de retençãoTempo de retenção



Muita interaçãoPouca interação

Análise quantitativa

Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picosQuantidades iguais de substâncias diferentes geram picoscromatográficos com áreas diferentescromatográficos com áreas diferentes

�� Necessidade de calibração:Necessidade de calibração:

�Relaciona-se as áreas dos picos com as concentraçõe s

� Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES

Configuração instrumentalComponentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta

eficiência:

Reservatóriode FM

Colunacromatográfica

Detector

Registrador

�� CCada componente: função no processo analíticoada componente: função no processo analítico

Sistema de bombeamento

de FM

Válvula deamostragem

Sistema de Sistema de bombeamentobombeamento

ReservatórioReservatóriode FMde FM

Válvula deVálvula deamostragemamostragem

ColunaColunacromatográficacromatográfica

DetectorDetector RegistradorRegistrador

frasco de frasco de plástico plástico

ououvidrovidro

FMFMÁguaÁgua

++Solvente(s) Solvente(s) orgânico(s)orgânico(s)

nn--hexanohexanoAcetonitrilaAcetonitrilaMetanolMetanolMetilMetil--tt--butilbutil--éteréterClorofórmioClorofórmioDiclorometanoDiclorometanoTetrahidrofuranoTetrahidrofuranoTetrahidrofuranoTetrahidrofurano22--propanolpropanol

eliminação deeliminação departículas maiorespartículas maiores

que 5 que 5 µmµm

retirada de gasesretirada de gasesDissolvidosDissolvidos

UltrasomUltrasomouou

BorbulhamentoBorbulhamento gases inertesgases inertes

USOUSO(preparação diária)(preparação diária)

CUIDADOSCUIDADOS






�� Impulsionar a Impulsionar a FMFM para dentro da coluna com para dentro da coluna com vazão constante vazão constante e e reprodutívelreprodutível

� BOMBAS DE ALTA PRESSÃO

Composição constanteComposição constante(eluição ISOCRÁTICA)(eluição ISOCRÁTICA)

Composição variávelComposição variável(eluição por GRADIENTE)(eluição por GRADIENTE)

Bomba de seringaBomba de seringa

Bomba pneumáticaBomba pneumática

Amostras complexasAmostras complexasCompostos de polaridade

muito diferente

Bomba recíprocaBomba recíproca

Proporção doProporção doSolvente mais polarSolvente mais polar






ExEx : Bomba recíproca (: Bomba recíproca (uma das mais usadasuma das mais usadas))

Para coluna

DesvantagensDesvantagens ::

Vazão pulsada Vazão pulsada �� amortecedoramortecedorCavitação (bolhas) devido à compressãoCavitação (bolhas) devido à compressão

Vantagem:Vantagem:

Mudança da fase móvelMudança da fase móvel






Dispositivo de aço Dispositivo de aço inoxidável com inoxidável com uma alça de amostragem uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na colunaque permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna

ALÇA ALÇA TROCÁVEL TROCÁVEL �� Volumes de 2 a 1000 µL






Coluna Coluna �� tubo de aço inoxidável tubo de aço inoxidável �� separaçãoseparação

Capacidade: Capacidade: dimensõesdimensões

ФФi= 1 i= 1 –– 20 mm20 mm

L= 3 L= 3 –– 25 cm25 cm

FEPartículas com Partículas com ФФ na faixa de na faixa de µmµmUso de partículas pequenasUso de partículas pequenas�� melhor separação (aumenta N)

+

FM

DUAS DUAS COMBINAÇÕESCOMBINAÇÕES

Fase reversa Fase reversa

Fase normalFase normal

FE apolar (baixa polaridade)FE apolar (baixa polaridade)FM polar FM polar

FE polarFE polarFM apolar (baixa polaridade) FM apolar (baixa polaridade)

EFICIÊNCIA DA COLUNA EFICIÊNCIA DA COLUNA �� RESOLUÇÃO RESOLUÇÃO

�� REPRESENTAÇÃOREPRESENTAÇÃO: N: N“Número de pratos teóricos”

trtr2 2

Determinada pelo nDeterminada pelo noo de etapas de equilíbrio entre o soluto na de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FMFE e o soluto na FM

Sin

al d

o de

tect

orS

inal

do

dete

ctor

N = N = 16 16 trtr

WW

�� Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separaçãoQuanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação

�� Não implica em rapidez ! (Não implica em rapidez ! (Altura do prato (H): Altura do prato (H): H= L / NH= L / N))

Sin

al d

o de

tect

orS

inal

do

dete

ctor

Tempo de retenção Tempo de retenção

Detecção dos componentes conforme saem da colunaDetecção dos componentes conforme saem da coluna

�UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA

�� Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE)






-- Que respondem à concentraçãoQue respondem à concentração�� sinal proporcional à concentraçãosinal proporcional à concentraçãoEx: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluoresc ência

MAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEISMAIS “GERAIS” PORÉM MENOS SENSÍVEIS

-- Que respondem à massa Que respondem à massa �� sinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de temposinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de tempoEx: Detectores eletroquímicos e de condutividade el étrica

MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADI ENTEMAIS SENSÍVEIS MAS NÃO “PERMITEM” ELUIÇÃO COM GRADI ENTE

Considerações práticas

�� Várias configurações instrumentais podem ser empreg adasVárias configurações instrumentais podem ser empreg adas

determinação de vários tipos de substâncias(mesmo em amostras complexas )

sistema à alta pressão: sistema à alta pressão: checar vazamentoschecar vazamentos

As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamAs condições instrumentais e de preparo de amostra influenciamno resultadono resultado

para minimizar os erros experimentais pode-se utiliza r padrõesinternos

(substância com características físico-químicas sem elhantes às do analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida )

Questões

11-- DescrevaDescreva osos componentescomponentes básicosbásicos dede umum equipamentoequipamento parapara cromatografiacromatografia líquidalíquidadede altaalta eficiênciaeficiência (CLAE)(CLAE) ee explique,explique, brevemente,brevemente, aa funçãofunção dede cadacada umum delesdeles..

22-- OsOs cromatogramascromatogramas X,X, YY ee ZZ referemreferem--sese aa umauma misturamistura dede compostoscompostos presentespresentes ememanalgésicosanalgésicos ee foramforam obtidosobtidos emem umauma mesmamesma coluna,coluna, masmas utilizandoutilizando fasesfases móveismóveisdiferentesdiferentes ee emem modomodo isocráticoisocrático (X(X:: 7070%% MeOHMeOH// 3030%% HAcHAc;; YY:: 6060%% MeOHMeOH// 4040%% HAcHAc;;ZZ:: 4040%% MeOHMeOH// 6060%% HAcHAc)).. ConsiderandoConsiderando essasessas informações,informações, respondaresponda qualqual éé oocompostocomposto maismais polarpolar ee qualqual dasdas fasesfases móveismóveis vocêvocê utilizariautilizaria parapara fazerfazer essaessa mesmamesmaseparaçãoseparação..

X Y Z

Referências

SkoogSkoog,, DD.. AA..,, Holler,Holler, FF.. JJ.;.; NiemanNieman,, TT.. AA..PrinciplesPrinciples ofof InstrumentalInstrumental AnalysisAnalysis55thth eded..,, SaundersSaunders CollegeCollege PublishingPublishing:: Philadelphia,Philadelphia, 19981998

Harris,Harris, DD.. CC..AnáliseAnálise QuímicaQuímica QuantitativaQuantitativaAnáliseAnálise QuímicaQuímica QuantitativaQuantitativa77aa eded..,, LTCLTC –– LivrosLivros TécnicosTécnicos ee CientíficosCientíficos Editora,Editora, 20082008

Collins,Collins, CC.. HH..,, Braga,Braga, GG.. LL..,, BonatoBonato,, PP.. SS..FundamentosFundamentos de de CromatografiaCromatografia11aa eded..,, EditoraEditora UNICAMPUNICAMP:: Campinas,Campinas, 20062006

Documents

Aula 10 - CROMATOGRAFIA L QUIDA [Modo de … · PLANAR COLUNA. Ex de interação analito -FE Equilíbrio FE Equilíbrio FE ––FM ( FM (partiçãopartição na na crom crom. Líquido