Upload
phamkhanh
View
219
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Autoantitestekkimutathatóságának határai, jelenlétük zavaró hatása az
immunanalitikai módszerekre
Dr. Toldy Erzsébet Ph.D.Szombathely, Vas Megye és Szombathely Markusovszky
Kórháza, Szombathely, PTE Diagnosztikai és Menedzsment Intézet, Pécs
MOLSZE Vándorgyűlés Bük, 2005.
Autoimmunitás
• Fiziológiás immunműködés szerves részeként
- mint biológiai jelenség az élő működés lényegi része
• Kóros immunműködés gyanánt- a szervezet homeosztazisát súlyosan veszélyeztető
jelenség (európai népesség 1-3%-át érinti)
Fiziológiás autoimmunitás:immunologiai homunculus
Magasabb rendű szervezet annak érdekében, hogy ne indulhasson el saját antigénjével szemben autoimmunreakció fenntart egy csekély mértékű autoimmunitást.- CD5+ B sejtek
- kicsiny affinitású proliferatív IgM típusúautoantitest termelődés
Egészség vége? Betegség kezdete?
Az egyensúly fenntartását biztosító tényezők:
• immuntolerancia: védelem a saját antigénstruktúrával szemben
• anti-idiotípus hálózat
fiziológiás autoimmunitás
pathologiás autoimmunitás
Anti-idiótípus reguláció
Anti idiótípus- antitest
Antigéndeterminánsok
Antitest
Anti-anti-idiótípus- antitest
Patológiás következmény
AUTOIMMUN BETEGSÉG
Fiziológiás védelem
Antigének:„saját ?” és „nem saját?”
Antisomatogén = ellenanyagtermelést kiváltó(Detre László, 1960, NY)
• Autoantigén „saját”: a szervezetet saját felépítő struktúrái, melyek felismerésére a T és B sejtek specifikus receptorokkal rendelkeznek, s immunválaszt (autoantitestet) fejlesztenek ki velük szemben.
• Heterophyl antigén „Nem saját”: az emlős szervezet számos építőeleme homológiát mutat az evolució távoli fajait és egyedeit felépítő molekuláris elemekkel.- autoimmun kórképek kialakulásának egyik oka lehet az autoantigén struktúra megváltozása külső antigén hatására.
• Keresztrokonságok miatt valójában heteroimmunitás →autoimmunitás
Ig típus Termelődés Szérumszint
TermTerméészetesszetes IgM CD5+ B1 sejt ng/mlalacsony affinitás
PatolPatolóógigiááss IgG, IgA, IgM B2 sejt mg/mlmagas affinitás
Az autoimmunitás ellenanyagai
Autoantitest meghatározások korlátai
Az eredmények meglehetősen módszerfüggők, ok:
legkülönfélébb: - analitikai és klinikai szenzitivitás,
- analitikai és klinikai specificitás,
- referencia érték,
- ál pozitív értékek eltérő %-ban
• alkalmazott antigén, anti human-Ig-antitest
• alkalmazott méréstechnika
Specifikus antitesteket meghatározó módszerek
• Immunfluoreszcencia
• Counter immunelektroforézis
• Radiális immundiffúzió
• Agglutináció
• Immunoblot
• Immuno-assay (ELISA, ECLIA, CLIA, RIA, RRA)
Szisztémás autoimmun markerek: ANA -IF
0 10 20 30 40 50 60 70 80
<60 éves egészséges felnőtt populációban
>60 éves egészséges felnőtt populációban
graviditas
SLE-és betegek egészséges rokonai körében
anaemia perniciosa
Psoriasis vulgaris
Virus hepatitisek
Alkohol indukálta cirrhosis
autoimmun thyreoiditis
Rheumatoid artritis (RA)
Myastenia Gravis
Primér biliáris cirrhosis
Autoimmun haemolitikus anaemia
Mononukleosis
Immun trombocytophenia
leukémia
Szervspecifikus autoimmun markerek: pajzsmirigy antitestekantitestek
TPO-antitestek• TPO izoformák: eltérően expressálódnakTPO1 (105 KD) – domináns formaTPO2 (100 KD) –GB-ban kisebb• Antigenitás: két epitópC2-fragmens (85 aminosav)- főbb epitópC21-fragmens (99 aminosav)- Hashimotoban: 52-60%TPO epitopok találhatók a Tg –molekulában is.• TPO antitestek: Gátolják az enzimet, aktiválják a komplementrendszert,
direkt cytotoxikusak.
TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. Al (UK): 2003-as tanulmány 13 assay
klinikai értékelés: 178 klinikailag ismert eset
0
20
40
60
80
100
Szenzitivitás Specificitás Leletazonosság
minimum
maximum
% 8094 91
100 100100
1,5
39,6
min.1,3
max.33,4
01020304050
Intra-assay Inter-assay
CV
%
TPO-antitestek meghatározása: Analitikai összevetése:mérések közötti eltérések
Mérések száma: 13 x 10
Célérték : 1000 U/ml
Célérték: 500 U/ml
Célérték: 250 U/ml
100
300
500
700
900
1100
1300
1500
1700
1. 2. 3. referens preparátum (U/ml)
TPO
Ab
U/m
l
TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA
Pontosság vizsgálata
13 módszerből 8-nak inkorrekt a kalibrációja
1
1 10
11
104 1
2
23
1
3
12
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
Lipaemia
zava
r
13 m
ódsze
rben
Haemoli
sis za
var
12 m
ódsze
rben
Hyperp
rotei
naemia
Zavar
3 mód
szerb
enHyp
erbilir
ubinaemia
Zavar
13 m
ódsze
rben
TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA
Matrix effektus vizsgálata
Viz
sgál
t mi n
ta á
l -poz
it ivi
t ási
gya
kori
sága
Antitest interakciók az
immun-analitikában
Immunglobulinok okozta keresztreakciók feltételei
1.) Az analitre nézve antigénkötő-molekularésszel rendelkező – specifikus- antitestek jelenléte a szérumban.
2.) A zavaró specifikus antitest koncentrációviszonya a módszer méréstartományát elérő, vagy azt meghaladó legyen.
3.) Aspecifikus immunglobulinok kóros mennyiségi arányai.
Interferenciáért felelős antitest típusok
I. Heterophyl antitestek
II. Human anti-animal-antitestek
III. Reuma faktor
IV. Specifikus antitestek az analit ellen
I. Interferenciáért felelős antitestek: Heterophyl antitestek
- immunogenitásuk rosszul definiálható- a beteg anamnézisében az állati fehérjével
történő expozició nem igazolható- multispecifikus: Rf és két v. több faj
immunglobulinjával aktivitást mutat - prevalencia: 0,5-12%
II. Interferenciáért felelős antitestek Specifikus anti-human-animal-
antibodies (HAAAs)- Izotípusuk lehet: IgG, IgM, IgA, IgE - immunogenitásuk jól definiálható- a beteg anamnézisében az állati fehérjével történő
expozició igazolható és az állatfaj azonos a tesztben alkalmazott állati immunglobulinnal
- endogén antitest további besorolását a faj határozza meg: pl. HAMA, HARA
- szérumkoncentrációi: µg/L-g/L is lehet!- évekig perzisztálhatnak a keringésben- előfordulásuk: 1-80% is lehet.
Az egér-antigének ellen keletkezőhumán antitestek előfordulási gyakorisága a keringésben I.
05
101520253035
Egészségesvéradó
N=1008
RA N=54
Sjögren s.N=45
SLE N=54
P.M.Autoimmun
N=70
P.M. cc.N=15
Gya
kori
ság
(%) Tévesen
magas
CK-MB, cTr
Az egér-antigének ellen keletkező humán antitestek előfordulási gyakorisága II:
Iatrogén okok.
Gya
kori
ság
(%)
01020304050607080
Ovarium cc.CA-125-mouse Ab N=32
Egyéb cc.Radiologiai Ab
N=61
IL-6 Ab-el kezeltRenal cell met. Myeloma mult.
N=12
Kricka: Clin. Chem. 1999.
Az IgG struktúrája és a human anti-animal antitestek
Human anti-izotípiás antitest
Állati antitest Human anti-idiotípiás antitest
Human anti-anti idiotípiás antitest
Kricka Clin. Chem. 1999.
Antitest interakciók az immunometrikus módszerekben
Szilárd fázis
Capture Ab (animal)
AntigenAnti-
animal AbAnti-
animal Ab
jelölt Ab (animal)
jelölt Ab (animal)
jelölt Ab (animal)Anti-
animal Ab
Capture Ab (animal)
Capture Ab (animal)
Helyes Tévesen pozitív Tévesen negatív
Interferenciáért felelős antitestek III.Rheumatoid faktor (Rf)
Eredetük: a humán IgG Fc fragmense ellen képződnekIzotípusuk: főként IgM
Előfordulásuk:
a normál populációban (idősebb kor): 5-10%,
autoimmun betegekben gyakrabban.
Rheumatoid arthritis kezdeti stádium (első év): 40-60%
Később (2.-3. Évben) : 80%
Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötődnek.
- Troponin T és I- CK-totál, CK-MB mass, - T4, T3- CEA, CA-15-3, CA-125, AFP- hCG, FSH, LH- Tg- Prolactin
Interferenciáért felelős antitestek IV. Specifikus antitestek az analit ellen
Módszerek az interakciót okozóantitestek kiszűrésére II.
Heterophyl ill. Rf és AAAT jelenlétekor
1.) Gyárilag az assay pufferhez blokkoló ágenst- borjú v. murin immunglobulin,- nem specifikus egér antitest (MAK33)- Biotinizált egyszárú antitest használata Warren D.J. et al. CEA Clin.Chem. 2005.
2.) A minta előkezelése az immuno-assay előtt:- kezelés PEG, alkohol, ammónium szulfát oldattal- Protein A kromatográfia, ultrafiltráció, - Gél diffúziós kromatográfia- Detergens szulfhydril ágens- Minták hőkezelése- Minták hígítása szériában (non linear response) - Alternatív módszer, - Recovery –teszt, vagy az antitestet közvetlenül mérő módszer. Pl. TgAb
Tg + Tg-visszanyerés (recoveryrecovery) mérése
Alacsony Tg Alacsony Tg visszanyervisszanyeréés s nem jnem jáár mindig r mindig egyegyüütt TgAb pozitivittt TgAb pozitivitáássalssal, ,
100% 100% nemnem zzáárjarja kiki az Abaz Ab pozitivitpozitivitáástst!!
Jelenlegi konszenzus:nincs értelme visszanyerési %-t
meghatározni!Szenzitív TgAb módszerrel a TgAb-t kell
mérni!
Kell-e szűrni antitest interferenciákra a laboratóriumban?
IGEN, ha.
• a populáció jelentős %-át érinti: pl macroprolactinaemia,• Az eredmény a döntéshozatalban meghatározó: pl. Tg• Az anamnesis megköveteli
Laboratóriumé a felelősség!
• 10 Rf-pozitív donor mintáját 74 analitre 66 laborban vizsgáltak
• 3445 eredményből 8,7 %-a volt tévesen pozitív.• 21 % -a közülük durván félrevezető téves pozitív lelet
volt. • A blokkoló reagenssel történő kezelés után 4,2%-ra
csökkentek a téves leletek.
Kell-e szűrni RF interferenciákra a laboratóriumnak ?
Marks V. et al. Clin. Chem. 2002.
Random hibával számolni kell és a klinikusokkal tudatni kell az interferenciák jelentőségét.
Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban?
Emerson J.F. et al. California, Clin Chem. 2003.
Következtetésük:- A minták előszűrése nem szükséges- A blokkoló reagens alkalmazásával csak 21% volt a
hiba korrigálható, míg hígítással csak ~3%.- Ismertté kell tenni az anamnesist
Vizsgált szérum: 160 Mért paraméterek: TSH, PSA, hCG, Cortisol
0,8-7 %-ban változott meg a lelet klinikai interpretációja
~3%
• Mivel ezek a vizsgálatok milliókra rúgnak a UKban, így a kellemetlen következmények ezreketérintenek. Ezért a korai kiszűrése lenne indokolt ezeknek az interakcióknak.
Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban?
(Ismail A. A, et al. Clin. Chem. 2002. )
Vizsgált szérum: 5310 28 esetben félrevezető FSH, LH, TSH vizsgálati eredmény született antitest interferencia miatt.
0,53 %
Törekvés a tökéletességreLuciant L. Leope: “Striving for Perfection” Clin. Chem. 48. 11. 2002
Harvard School of Public Health, Boston
Megelőzhető műtét~1 millió/év
~3,30%
A diagnosztikában és kezelésben elkövetett komplikációk száma
USA lakóssága: 247 millió
Vizsgált betegek száma: >30 millió/év>12 %
Megelőzhető halálok~71ezer/év
~0,24%
Labor
?
Laboratóriumi tesztek megbízhatósága
1000 tesztből 5 inkorrekt
0,5 %
Dícséretre méltó: a munka sajátjából adódik
Ugyanakkor kicsi hibák pusztítóak lehetnek!
A gyakorlat: a klinikai szakemberek jobban hisznek a teszteknek, mint a saját
itélőképességüknek!
Egészséges szkepticizmus hiánya!
Az antitest interakciók kiküszöbölése:
LEHETETLEN, DE….
…..együtt kell élni vele a következőképpen:
• Több módszert kell elérhetővé tenni
• Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait,- klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.
Ideális laboratóriumi szakember
• büszke a módszere magas szintű minőségére,
• de állandóan gondolkodik és tovább lát, tudatában annak, hogy óhatatlanul követ el hibát időről időre,
• egészséges szkepticizmussal fogadja az eredményeket
• készen áll a klinikai képbe nem illő hiba tisztázására.