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TRABALHO DE INVESTIGAÇÃO
AVALIAÇÃO DE ALGUNS TIPOS DE POPULAÇÃO BACTERIANA EM RISSÓIS DE CARNE E DE PEIXE À
VENDA NA CIDADE DO PORTO
CURSO DE CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO DA
UNIVERSIDADE DO PORTO
Helena Margarida Ávila Campos Marques
Porto 1993
AGRADECIMENTO
Gostaria de deixar uma palavra de profunda gratidão ao Prof. Dr. Freitas da
Fonseca e ao Dr. Passos Gonçalves, por todo o apoio prestado durante a realização
deste trabalho.
1
INDICE :¾ ft>
ex
I - Introdução
II - Objectivos
III - Material e métodos
1 - Matérias primas
1.1 - Amostragem
1.2 - Método de colheita de amostras
1.3 -Parâmetros
1.3.1 - Microrganismos Aeróbios Mesófilos
1.3.2 - Staphylococci
1.3.3 - Coliformes totais
1.3.4 - Coliformes fecais
7
7
8
8
9
9
10
10
2 - Método de examinação
2.1 - Material
2.2 - Meios de cultura
11
11
12
2
2.3 - Técnica 13
2.3.1 - Preparação da amostra
2.3.2-Diluição
2.3.3 - Sementeira
2.3.4 -Incubação
13
14
15
17
2.4 - Leitura 18
IV - Resultados 20
V - Discussão 22
VI - Conclusão 28
Bibliografia 29
Anexo 30
DvV £*- <&
(2 % w 4 1 ¾ ¾
o1
#*£» U n f v * ' _ <<
PO ft ■•
I - INTRODUÇÃO
O presente trabalho refere-se a um estudo realizado no Serviço de Microbiologia
da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto.
O produto escolhido para análise foi o rissol pronto a ser consumido. Esta opção
foi tomada em virtude de este alimento ser bastante procurado nos estabelecimentos da
cidade do Porto, de ser um produto que carece de muito manuseamento, e ainda, devido
ao facto de não ser do conhecimento geral o nível de salubridade que este tipo de produto
apresenta.
Como é sabido, quando não são cumpridas as mais elementares regras de higiene
no manuseamento e na conservação dos produtos alimentares, estes podem tornar-se
perigosos, visto que, se contaminados, é fácil a proliferação dos microrganismos (3).
Apesar do progresso da ciência e da tecnologia, a contaminação bacteriana dos
alimentos é, hoje em dia, um dos maiores problemas de saúde mundial. As toxi-infecções
alimentares são talvez o maior problema de saúde no mundo contemporâneo e uma
importante causa na redução da produtividade económica. No entanto, só uma pequena
percentagem dos casos chega ao conhecimento dos serviços de saúde e ainda menos é o
número de casos investigados. Mesmo assim, os dados disponíveis indicam que toxi-
infecções alimentares estão a aumentar no mundo inteiro (5).
4
Dado este conjunto de factores, parece-me ser oportuna a realização de um
trabalho com estas características.
II - OBJECTIVOS
A qualidade do alimento é influenciada por múltiplos factores, entre os quais a
higiene do equipamento, o ambiente - ar e água - , e pelo pessoal que manuseia
directamente o produto (3). Por isso, não é objectivo deste trabalho identificar a
proveniência dos microrganismos analisados, mas sim fazer um levantamento da qualidade
microbiana e higiénica dos rissois à venda em estabelecimentos da cidade do Porto, depois
de previamente embalados para serem consumidos no exterior do estabelecimento. Não
foram assim efectuadas análises ao pessoal nem ao equipamento, até por impossibilidade
prática de efectuar tais operações.
O número de amostras colhidas em cada ponto de amostragem não foi de cinco,
como recomenda a FAO (2) , mas sim de uma, dado não ser comportável executar todas
as análises, uma vez que foram efectuadas pela autora deste trabalho e também porque
este número só seria necessário se se quisesse determinar a qualidade higiénica dos rissois
fornecidos nesse preciso local.
5
Por razões que se prendem com a natureza e as implicações deste trabalho,-não se
referem os nomes dos estabelecimentos onde foram efectuadas as colheitas das amostras.
6
Ill - MATERIAL E MÉTODOS
1 - Matérias primas
1.1 - Amostragem
Para a realização deste trabalho, foram feitas recolhas em 36 estabelecimentos da
cidade do Porto, num total de 59 amostras. A escolha dos locais foi aleatória, tentando-se,
no entanto, demarcar zonas onde o consumo fosse provavelmente superior.
Destes 36 estabelecimentos, as colheitas foram divididas da seguinte forma : em
cada um de 24 locais foi adquirido 1 rissol de carne e um rissol de peixe, enquanto que em
5 locais foi só recolhido 1 rissol de carne e noutros 6 , 1 rissol de peixe. Isto ficou a déver
se ao facto de nem todas as casas terem à venda ambas as variedades.
A denominação de rissol de carne e rissol de peixe é utilizada dado o rissol de
carne poder ser de vitela, galinha, e o de peixe poder ser de camarão, berbigão, entre
outros.
7
1.2 - Método de colheita de amostras
É de primeira importância que as amostras dos produtos para exame
bacteriológico reflitam as condições microbiológicas, no momento da colheita das
amostras.
Como o objectivo deste estudo é o de saber o estado higio-sanitário em que se
encontram os rissóis que são adquiridos para consumir fora do estabelecimento (o que
pressupõe a manipulação necessária para embalagem, pelo pessoal do estabelecimento), a
técnica de colheita utilizada foi a seguinte: nos locais seleccionados para o efeito, era
pedido um rissol de carne e um de peixe, ou só um dos dois, conforme o previamente
descrito. De seguida era solicitado o seu embrulho em separado. As amostras eram então
transportadas para o Serviço de Microbiologia, numa caixa térmica, para que não
ocorresse variação da temperatura original.
Uma vez aí chegadas, cerca de 20 a 30 minutos após a colheita, as amostras foram
imediatamente refrigeradas, sendo de seguida analisadas.
1.3 - Parâmetros
A prática utilizada durante muitos anos, e que continua a ser seguida, é a
de determinar a qualidade higiénica dos alimentos pela presença de certos microrganismos
indicadores (4) .Entende-se por microrganismos indicadores, o grupo de microrganismos
8
cuja presença na comida, acima de certos limites numéricos, indica que o alimento foi
exposto a práticas de higiene menos correctas, passíveis de poderem provocar toxi-
infecções alimentares e ainda de permitirem a proliferação de espécies patogénicas.(2) (4).
Assim, usaram-se como parâmetros microbiológicos dos produtos colhidos:
Microrganismos Aeróbios Mesófilos, Staphylococci, Coliformes totais e Coliformes
fecais.
1.3.1 - Microrganismos Aeróbios Mesófilos
Os Microrganismos Aeróbios Mesófilos não estão necessariamente relacionados
com a qualidade bacteriológica dos alimentos, visto muitos patogénicos não crescerem
com as condições de cultura utilizadas. No entanto, é frequentemente usado como
indicador padrão de higiene e temperatura empregue na preparação, distribuição e
armazenamento dos alimentos (1).
1.3.2 - Staphylococci
A presença destes microrganismos na comida é, geralmente, originária da pele,
boca e fossas nasais dos manipuladores de alimentos. A presença de um elevado número
de Staphylococci é, geralmente, um bom indicador de que a higiene e a temperatura
utilizada não foi adequada (2).
9
Estes microrganismos são capazes de crescer num meio com uma elevada
percentagem de cloreto de sódio (7), como é o caso dos rissóis.
1.3.3. - Coliformes totais
O grupo dos coliformes contêm espécies cujo habitat é o intestino e outros cujo
habitat pode ser o solo ou a água. São indicadores úteis de processamento e higiene
insatisfatórios, visto a sua presença em largo número nos alimentos indicar que pode ter
ocorrido oportunidade para a proliferação, permitindo a multiplicação de outros
microrganismos.(1) (2).
1.3.4 - Coliformes fecais
A sua presença nos alimentos tem sempre uma conotação de falta de higiene. O
termo Coliformes fecais é relativamente recente e surgiu da necessidade de encontrar
métodos que rapidamente indicassem a presença de Escherichia coli ou espécies com ela
relacionadas , sem haver necesidade de se obterem culturas puras e utilizar o método
IMViC. Os Coliformes fecais são considerados todos aqueles de entre os Coliformes
totais que são capazes de crescer e de fermentar a lactose a temperaturas superiores ao
normal, ou seja, acima de 44 °C +/- 1 °C. Estes comportam na sua maior parte
Escherichia coli e são usados como indicadores de uma provável contaminação de origem
fecal (2).
10
2 - Método de examinação
2.1 - Material
O material utilizado para a realização deste trabalho foi o seguinte:
- Pipetas de 1 ml graduadas, de escoamento total
- Placas de Petri
- Almofarizes
- Balões de Erlenmeyer
- Pinças
- Balança electrónica de precisão
- Banho-Maria regulado para 45 °C +/- 1 °C
- Contador de colónias
- Incubadoras: 30 °C +/- 1 °C
37 °C +/- 1 °C
44 °C +/- 1 °C
11
2.2 - Meios de cultura
Os meios de cultura foram seleccionados de acordo com os usados no Instituto
Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Assim, foram utilizados os seguintes meios:
Quadro 1 : Meios de cultura utilizados
Microrganismos indicadores Meio de cultura
Microrganismos Aeróbios Mesófilos Plate Count Agar (PCA) ou Glucose Tryptone Yeast Extract Agar
Staphylococci Bacto Manitol Salt Agar
Coliformes totais Bacto Brilliant Green Bile 2%
Coliformes fecais Bacto Brilliant Green Bile 2%
Como diluente, foi utilizado Água Peptonada.
12
2.3 - Técnica
2.3.1 - Preparação da amostra
Colocou-se o
almofariz previamente
esterilizado no prato da
balança, sendo de
seguida introduzido o
rissol (Fot 1). Anotou-
se o seu peso. De modo
a permitir homogeneizar
melhor a amostra,
adicionou-se uma
pequena quantidade de
água peptonada
quantificada (Fot. 2).
Procedeu-se então à
homogeneização, com a
ajuda de um pilão (Fot
3). Após esta operação,
foi colocado novamente
o almofariz na balança.
Estas operações
foram efectuadas com
todos os cuidados de
assepsia.
hi.]
13 Fot-3
2.3.2 - Diluição
De seguida, foi
retirado do almofariz ,
com a ajuda de uma
pinça esterilizada, uma
quantidade, pesada, do
homogeneizado (Fot 4)
e introduzida num balão
contendo 50 ml de água
peptonada (Fot 5).
O balão foi então
mexido com movimentos
circulares de modo a
permitir uma melhor
mistura (Fot 6).
2.3.3 - Sementeira
Após a preparação
da amostra e das
diluições, a sementeira
por shake, foi executada
do seguinte modo:
Pipetou-se (Fot
7) uma quantidade
definida da diluição
(Quadro 2) a analisar
para um tubo de ensaio
contendo 10 ml do meio
(Fot 8), que foi
previamente fundido em
Banho-Maria e
estabilizado à temperatura
de 45 - 50 °C,
homogeneizando em
seguida com movimentos
cuidadosos de modo a
evitar a formação de
bolhas de ar e assegurar
uma mistura homogénea.
Verteu-se o
conteúdo do tubo de
Pot-f
ht. 8
15
ensaio para uma Placa de
Petri (Fig. 9).
Tot. 9 Quadro 2 : Quantidades de diluição utilizadas na sementeira
Microrganismos indicadores Quantidade pipetada (ml)
Microrganismos Aeróbios Mesófllos 0,1*
Staphylococci 1
Coliformes totais 1
Coliformes fecais 2
Após a solodificação do agar, colocou-se uma segunda camada de 5 ml de Plate Count Agar, com a finalidade de impedir o desenvolvimento de colónias invasoras.
16
2.3.4 - Incubação
As placas foram colocadas nas respectivas incubadoras (Fot 10 e 11), em "
posição de incubação ", nas seguintes condições:
Quadro 3 : Condições de incubação
Microrganismo indicador Temperatura de incubação (°C)
Período de incubação ( h )
Microrganismos Aeróbios Mesófilos
30 °C 72
Staphylococci 37 °C 24
Coliformes totais 30 °C 24
Coliformes fecais 44 °C 24
17
2.4 - Leitura
A contagem foi executada, ao fim dos tempos de incubação previamente
estabelecidos, com o auxílio de um contador de colónias, e tendo como pressuposto que
os microrganismos presentes numa amostra misturada com agar, formam colónias visíveis
e separadas (Fot 12,13,14 e 15): unidades formadoras de colónias (u.f.c.) (2).
Fui- \L frt.fc
u.n Fot. 15
18
A fórmula empregue foi a seguinte:
Sendo : A= peso, em gramas, do rissol
C= quantidade do homogeneizado retirado do almofariz
D= soma, em gramas, do peso do rissol + peso de água peptonada
introduzida
E= quantidade do inoculo introduzido no meio
1= n° de colónias (u.f.c.)
J = 5 0 * I / E , sendo J o número de colónias existentes no total dos 50 ml de
homogeneizado
K = A / ( D * C ) , sendo K a quantidade de rissol existente no homogeneizado
Então L - J/K , sendo L o número de u.f.c. por grama de alimento
analisado.
19
IV - RESULTADOS
1 - Microrganismos Aeróbios Mesófilos
Sí
45000 40000 35000 30000 25000
J *i 20000 3
15000 10000 5000
0 llljajlikfjM, aJ in 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissois
ai
LJ u.f.c. (r. carne) M, u.f.c. (r. peixe)
Gráfico 1 : Microrganismos presentes nos rissois de carne e de peixe.
6000
5000
2 - Staphylococci
1
4000 M
o 3000
2000
1000 I t - " f
i I, BLdBjl|3 i1 " " i 1 ™i' ' i P i il I 1 H—\ 1 1 i i —I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissois
1 u.f.c. (r. carne) M u.f.c. (r. peixe)
Gráfico 2 : Microrganismos presentes nos rissois de carne e de peixe.
20
3 - Coliformes totais
4500
so
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
I I
-
á, pL 1) J 1 1 M | « 3 | 1- XL a i — « i — i —i^i««f H h
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissóis
LI u.f.c. (r.carne) H u.f.c. (r. peixe)
Gráfico 3 : Microrganismos presentes nos rissois de carne e de peixe.
4 - Coliformes fecais
1400
1200
1000
M 800
600
400
200 I
H 1 1 1 1 1 1 1 h J- +—H 1 1 1 (- Í 1 H 1 1 H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissois
lij u.f.c. (came) i i u.f.c. (peixe)
Gráfico 4 : Microrganismos presentes nos rissóis de carne e de peixe.
21
V - DISCUSSÃO
1 - Os valores médios, aproximados, de microrganismos presentes nos rissóis, por
grama de amostra, foram os seguintes:
1.1 - Microrganismos Aeróbios Mesófilos
45000
40000 ■■
35000
30000 su - 25000
-! 20000 ■■
15000 T
10000
5000
Mjía^El^r l , ■,Ji,n H = ^ —.r-M.i-i ■s
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissois
u.f.c. (r. came) u.f.c. (r. peixe) Vai. médio u.f.c. r. carne
yal. médio u.f.c. r. peixe
Gráfico 5 : Valor médio de microrganismos presentes nos rissóis.
5000
4000 ■■ M o 3000 3
2000
1000 +
1.2 - Staphylococci
I
i r"\< »1 ■»)■ " V □_,—o» * — i — i — p H 1 1- t h—"f ^ t-w,r-«l,„a,l 1 t «wir-iwir-wur-M,!
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissois
J u.f.c. (r. came) u.f.c. (r. peixe) Vai. ffiedio u.f.c. r. came
Val. médio u.f.c. r. peixe
Gráfico 6 : Valor médio de microrganismos presentes nos rissóis.
22
1.3 - Coliformes totais
M
4500 y
4000
3500 +
3000
2500 --
2000 -•
1500 -
1000
500
0
n
^_m^ V-xa^ 1 |__sas
1 2 3 4 5 6 7
M J ' H P*—I ^ 1 a
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1 ' I1' ™l 1 1 1—™f
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissois
u.f.c. (r.carne) u.f.c. (r. peixe) Vai. médio u.f.c. r. came
Val. médio u.f.c. -r. peixe
Gráfico 7 : Valor médio de microrganismos presentes nos rissóis.
1.4 - Coliformes fecais
1400
1200
1000
em 800
600
400 --
200 --
ft 1 I 0 I1 ' I l l I I I I I I " I 1 ■' I I I I " I I I I l " n l l1 ' I m \ I I I — I l \ m \
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
rissois
í-l -ff' ■ ■'■■'] u.f.c. (came) wÊÊÊmË u.f.c. (peixe) Vai. médio u.f .c-
r. came Val. médio u.f.c. r. peixe
Gráfico 8 : Valor médio de microrganismos presentes nos rissóis.
23
2 - Dos rissóis analisados, e em relação a cada um dos microrganismos
indicadores, a comparação estabelecida com os "Parâmetros para apreciação
microbiológica dos alimentos pronto a comer" do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo
Jorge (INSA) (anexo 1), é o seguinte:
100000 -
10000 •
1000 -
100 -
10 -
0 -
• <>
2.1 - Microrganismos Aeróbios Mesófilos NAO ACEiTAVU
01
0
D
100000 -
10000 •
1000 -
100 -
10 -
0 -
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• • 0 .
• 0
•
•
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•
0
0
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0
•
• 0 0 0
0 . » . 0
AUifA'vfcU
100000 -
10000 •
1000 -
100 -
10 -
0 -
• <>
tx)M
100000 -
10000 •
1000 -
100 -
10 -
0 -) 5 10 15
rissois 20 25 30
! « u.f.c. (r. ° u.f.c. (r. carne) peixe)
)0 ! « u.f.c. (r. ° u.f.c. (r. carne) peixe)
100 1000( )0 1000000 ;
Gráfico 9 : Microrganismos presentes nos rissóis.
2.2 - Staphylococci 100000
10000 -
1000 -
Mo Aí£ÍfA'VEÍ.
o o o
0> 0 • • •
10 -
•
•
0
0 0
•
• 0
•
1 -
a - • — 1 — • 0 — 0 — 0 — 0 — 0 — 0 — 0 — 0 — 0 — -1 — 0 — • —
jUiTJÍVEt
— — 1 — • 1
15
rissois
20 25 60 M 30
• u.f.c. (r. carne) u.f.c. (r. peixe) 106 100 000
Gráfico 10 : Microrganismos presentes nos rissóis.
24
2.3 - Coliformes totais 10OOO0 -
10000 -0 o.
1000 -
oi 10° ' o
» 0 • , 0
-, • 6 io - • • 0 "~
<*-1- AtfhKvci.
0.1 -
0.01 -
( ) 5 10 15 20 25 ^t)M 30
rissois
1 1 u.f.c. (r.carne) 1 1 u.f.c. (r.carne) y u.f.c. (r. peixe) 1000 100000
Gráfico 11 : Microrganismos presentes nos rissóis.
2.4 - Coliformes fecais
10000
1000
100
10
1
0.1 -
0.01
o 10 15
/ rissois
Mftv
20
* u.f.c. (carne) ° u.f.c. (peixe)
10 10«
mo ALtiT/vV-CL
ALEÍTAVEL
25 oOM 30
Gráfico 12 : Microrganismos presentes nos rissóis.
25
Tendo em conta que na cidade do Porto existem cerca de 300 estabelecimentos
deste género (6) , considera-se que a amostra é representativa de cerca de 12 % dos
locais.
A salubridade dos rissóis depende em longa escala onde é adquirido, como se pode
verificar pelos gráficos apresentados (Gráfico 1, 2, 3 e 4), não se podendo por isso dizer
que é indiferente o local onde é feita a sua aquisição.
De qualquer modo, verifica-se que, quanto a valores médios, a probabilidade de se
encontrar um rissol com valores mais elevados de microrganismos analisados, é maior nos
rissóis de peixe, excepto no que diz respeito aos Microrganismos Aeróbios Mesófilos.
(Gráfico 5, 6, 7, e 8).
26
Na comparação com os "Parâmetros para apreciação microbiológica de alimentos
prontos a comer", do INSA, constata-se que as percentagens são as seguintes:
Microrganismos Aeróbios Mesófilos
-Mau : 0% -Não aceitável: 47,6% -Aceitável: 52,4% -Bom: 0%
Staphylococci
-Mau: 11,9% -Não aceitável: 32,2% -Aceitável: 18,6% -Bom: 37,3%
Coliformes totais
Mau: 0% Não aceitável: 8,5% Aceitável: 33,9% •Bom: 57,6%
Coliformes fecais
Mau: 8,5% Não aceitável: 3,4% Aceitável: 6,8% ■Bom: 81,3%
27
Deste modo, é de assinalar que, fazendo a soma dos parâmetros "mau" e "não aceitável", a percentagem de rissóis com estes valores é de aproximadamente 48%, 44%, 9% e 12%, respectivamente para Microrganismos Aeróbios Mesófilos, Staphylococci, Coliformes totais e Coliformes fecais.
VI - CONCLUSÃO
Este trabalho possibilitou-me pôr em prática algumas das noções adquiridas
durante a frequência do Curso de Ciências da Nutrição.
Proporcionou-me ainda adquirir alguma prática de investigação laboratorial,
trabalho este que se revela fascinante.
Embora tenham havido algumas limitações ao desenvolvimento deste trabalho,
penso que os objectivos propostos foram alcançados.
Após a realização deste trabalho, constatei que existem dados suficientes para o
prosseguir, numa outra área, visto os valores encontrados depesos, em gramas, dos rissóis
serem muito diferentes.
28
BIBLIOGRAFIA
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microbiological quality. Academic Press, 1991
2 - FAO. Food and nutrition paper. Manual of good quality control.4 Microbiological
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3 - Frazier, W. C, Food Microbiology, 2a edição, 1967
4 - Jay, James M. .Modern food microbiology, Second edition, 1978
5 - WHO. WHO Commission on health and environment. Report of the panel on food and
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6 - Páginas amarelas, Região Porto - Lista Telefónica Nacional. - Telefones de Lisboa e
Porto, SA 1992-1993
7 - BrocK, Thomas D. Basic Microbiology with applications. Prentice-Hall, 1986.
29
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