5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Radikal Bebas

2.1.1 Definisi Radikal Bebas

Radikal bebas adalah suatu molekul yang pada lapisan

elektron terluarnya tidak mempunyai elektron berpasangan.

Akibatnya radikal bebas akan selalu berusaha mengambil elektron

dari molekul atau senyawa lain di sekitarnya. Apabila radikal bebas

mengambil elektron dari protein, lemak, asam nukleat dari suatu sel

maka komponen protein, lemak dan asam nukleat dari sel tersebut

akan berubah dan fungsi sel tersebut akan terganggu. Asam nukleat

seperti DNA jika terkena radikal bebas akan berubah basa Guanin

(G) menjadi 8-OhdG dimana akan berpotensi mengalami mutasi

(Munoz & Costa, 2013). Simbol untuk radikal bebas berupa sebuah

titik yang berada didekat simbol atom (R•). Reactive Oxygen

Species merupakan senyawa pengoksidasi turunan oksigen yang

bersifat sangat reaktif yang terdiri atas kelompok radikal bebas dan

kelompok non radikal. Kelompok radikal bebas misalnya

superoxide anion, hydroxyl radicals, dan peroxyl radicals.

Kelompok non radikal seperti hidrogen peroksida dan organic

peroxides. Selain itu terdapat pula radikal bebas lain seperti

6

hydroperoxyl, alkoxyl, karbonat, karbon dioksida, atomic chlorine

dan nitrogen dioksida (Ardhie, 2011).

2.1.2 Tahap Pembentukan Radikal Bebas

Secara umum terdapat tiga tahapan pembentukan radikal

bebas antara lain sebagai berikut (Winarsi, 2011):

1. Tahap Inisiasi adalah fase awal pembentukan radikal bebas,

misalnya:

Fe++

+ H2O2Fe+++

OH- + •OH

2. Tahap Propagasi adalah fase pemanjangan rantai radikal,

misalnya:

R3_H + R2• R3• + R2_H

3. Tahap Terminasi adalah tahap dimana terjadi reaksi antara

senyawa radikal satu dengan senyawa radikal lainnya atau

dengan penangkap radikal, misalnya:

R2• + R2• R2_R2

2.1.3 Sumber Radikal Bebas dalam Sel

Sumber radikal bebas dapat dari lingkungan maupun

sumber endogen. Radikal bebas dari lingkungan dapat berupa

paparan sinar ultraviolet, asap rokok, asap dari pembakaran bahan

bakar fosil dan lain-lain. Sumber radikal bebas endogen berasal

dari metabolisme energi di mitokondria seperti peroksida

(Winarsi,2007). Perubahan oksigen yang kita hirup oleh sel tubuh

7

secara kontan menjadi senyawa reaktif dikenal sebagai senyawa

oksigen reaktif atau Reactive Oxygen Species (ROS). Hal ini dapat

berlangsung saat proses sintesa sinergi oleh mitokondria atau

proses detoksifikasi yang melibatkan enzim sitokrom P-450 di hati

(Halliwell dan Gutteridge,2007).

2.1.3.1 Membran sel

Protypic NADPH oksidase ditemukan pada fagosit

yang terlokalisasi di membran plasma dan fagosom. Hal ini

terdiri dari gp91 phox dan subunit kecil p22 phox yang

membentuk b558 flavocytochrome dimana merupakan inti

katalitik dari NADPH oksidase dalam menghasilkan O2.

Beberapa homolog dari gp91 phox sekarang disebut NOX2

(NOX1-5) dan yang lebih jauh terkait dengan DUOX1/2

(dualoksidase). NOX2 terutama diekspresikan di sel

polimorfonuklear, makrofag dan sel endotel, tetapi ekspresi

ini juga dibuktikan pada tipe sel lainnya termasuk sel dari

CNS, sel otot polos, fibroblast, kardiomiosit, otot rangka,

hepatosit, dan sel induk hematopoietik. NOX1 paling tinggi

diekspresikan di epitel kolon dan juga terdeteksi dalam

perut bagian bawah pada sel otot polos, sel endotel,

plasenta, sel pulau langerhans, dan sel jenis lainnya serta

terlokalisasi terutama pada membran plasma dari caveolae,

tetapi juga pada awal endosom atau inti sel (Winarsi,2007).

8

NOX3 diekspresikan di jaringan janin, tetapi juga

ditemukan pada telinga dalam, sel HepG2 pada makrofag

celline tikus RAW264.7 dan pada endotel paru mencit.

NOX4 diekspresikan sangat luas pada berbagai jaringan,

terutama di ginjal, tetapi juga pada kebanyakan jaringan dan

sel lain termasuk sel endotel, sel otot polos, fibroblast dan

hepatosit. Berbeda dengan kebanyakan NOX, NOX4

terutama terlokalisasi di retikulum endoplasma maupun di

luar membran inti. Ekspresi NOX5 telah terdeteksi di testis,

prostat, limpa, limfonodi, tetapi juga di sel endotel dan sel

otot polos dan terutama terlokalisasi di retikulum

endoplasma. Protein DUOX 1/2 paling tinggi diekspresikan

di tiroid, tetapi juga dalam epitel paru-paru dan saluran

pencernaan terutama di retikulum endoplasma dan

membran plasma (Winarsi,2007).

Kebanyakan NOX dan dua anggota DUOX

membutuhkan subunit sitosol untuk aktivasi yang lengkap.

NOX2 merupakan subunit sitosol p40phox, p47phox,

p67phox maupun monomerik GTPaseRac. NOX1 dan

NOX3 dapat diatur oleh NOXO1 (homolog p67 phox) dan

NOXA1 (homolog p47 phox) sementara DUOX1 dan

DUOX2 membutuhkan regulator mereka yaitu DUOXA1

dan DUOXA2. Selain protein regulasi, aktivasi NOX5 dan

9

DUOX1/2 membutuhkan kalsium dan NOX5 juga

membutuhkan calmodulin (Winarsi,2007).

2.1.3.2 Mitokondria

ROS terutama dihasilkan di mitokondria dengan

jumlah ROS yang lebih sedikit pada perempuan

dibandingkan dengan laki-laki. Perbedaan hal tersebut dapat

dilihat juga pada kadar enzim antioksidan perempuan yang

terinduksi oleh kerja estrogen. Rantai transport elektron

dalam mitokondria merupakan sumber penting dari

pembentukan O2 yang secara primer disebabkan oleh

bocornya elektron dari kompleks I (NADH-CoQ reduktase)

dan kompleks III (Sitokrom c reduktase). Selain itu asetil

KoA juga akan menghasilkan enzim piruvat dehidrogenase

(PDH) dan enzim-enzim pada siklus krebs seperti α-

ketoglutarate dehidrogenase (KGDH) yang bersumber dari

O2-. Hal ini menunjukkan bahwa enzim redoks p66Shc

terlibat dalam reduksi langsung dari oksigen menjadi H2O2

di dalam ruang intermembran dengan menurunkan

ekuivalen melalui oksidasi sitokrom C (Winarsi,2007).

2.1.3.3 Retikulum Endoplasmik

Retikulum endoplasmik merupakan tempat dengan

jumlah ROS yang tinggi. ROS yang terlokalisasi di

retikulum endoplasmik berasal dari hasil oksigenase yang

terlokalisasi di retikulum endoplasmik dan endoplasmic

10

oxidoreductin 1 (ERO1). Selain itu, disisi lain juga NADPH

yang terlokalisasi di retikulum endoplasmik seperti NOX4,

NOX5, dan DUOX1/2 dapat berkontribusi terhadap

pembentukan ROS di dalam retikulum endoplasmik

(Winarsi,2007).

2.1.3.4 Lisosom

Lisosom merupakan organel yang terlibat dalam

degradasi material ekstraseluler dan intraseluler yang

berhubungan dengan fagositosis, endositosis, dan

autophagy. Degradasi asam hidrolase memerlukan pH

sekitar 4,8 dan untuk menghasilkan pH tersebut lisosom

mengandung rantai redoks yang mirip dengan rantai

transport elektron pada mitokondria yang terlibat dalam

distribusi proton dan akan menghasilkan ROS sebagai

produk akhirnya (Winarsi,2007).

2.1.3.5 Peroksisom

Peroksisom berperan pada beberapa proses

metabolik termasuk beta oksidasi asam lemak rantai

panjang, bagian oksidatif dari jalur pentosa fosfat,

biosintesis fosfolipid, metabolisme purin dan poliamin

maupun oksidasi asam amino dan poliamin. Banyak enzim

yang terlibat dalam jalur ini yaitu flavin dependent oxidase

yang menghasilkan H2O2. Proses utama pembentukan

H2O2 adalah beta oksidasi asam lemak sedangkan

11

munculnya peroxisomal xanthine oxidase tidak hanya

untuk menyediakan H2O2 tetapi juga O2. Pembentukan

H2O2 ini dapat meningkatkan pembentukan ROS lain yang

dapat merusak sel sehingga harus didegradasi menjadi zat

non reaktif melalui enzim katalase yang mengubah H2O2

menjadi O2 dan H2O (Winarsi,2007).

2.1.4 Sifat Radikal Bebas

Radikal bebas memiliki dua sifat yaitu memiliki reaktivitas

yang tinggi karena memiliki kecenderungan menarik elektron dan

dapat mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal. Sifat

kecenderungan untuk menarik elektron merupakan sifat radikal

bebas yang mirip dengan oksidan sehingga disebut juga penerima

elektron. Namun tidak setiap oksidan adalah radikal bebas. Reaksi

rantai (chain reaction) terbentuk karena kedua sifat radikal bebas

diatas yang apabila menjumpai molekul lain akan membentuk

radikal baru lagi. Radikal hidroksil merupakan senyawa yang

paling berbahaya karena memiliki reaktivitas yang sangat tinggi

(Halliwell dan Gutteridge,2007).

Awal dari kerusakan-kerusakan sel terjadi apabila radikal

bebas sempat bertemu dengan enzim atau asam lemak tak jenuh

yang disertai dengan penurunan mekanisme pertahanan tubuh.

Kerusakan tersebut dapat berupa kerusakan deoxyribonucleic acid

pada inti sel, kerusakan membran sel, kerusakan protein, kerusakan

12

lipid peroksida, dan proses penuaan (Halliwell dan

Gutteridge,2007).

2.2 Antioksidan

Antioksidan merupakan molekul yang bertindak sebagai

pertahanan terhadap kerusakan oksidatif (Masaki, 2010). Berdasarkan

mekanisme pertahanannya, antioksidan dapat dibagi menjadi tiga yaitu

antioksidan primer, sekunder dan tersier. Antioksidan primer menetralisir

dengan mendonasikan 1 elektronnya sehingga kehilangan 1 elektron dan

menjadi radikal bebas baru namun sifatnya relatif stabil dan akan

dinetralisir oleh antioksidan lainnya misalnya vitamin E, vitamin C, asam

α lipoat, CoQ10, dan flavonoid. Antioksidan sekunder bekerja dengan

mengikat logam, menyingkirkan berbagai logam transisi pemicu ROS dan

menyingkirkan ROS misalnya transferin, albumin, dan laktoferin.

Antioksidan tersier bekerja mencegah penumpukan molekul yang telah

rusak sehingga tidak menimbulkan kerusakan lebih lanjut misalnya enzim

metionin sulfaoksida reduktase memperbaiki kerusakan DNA, enzim

proteolitik memproses protein yang teroksidasi dan sebagainya (Ardhie,

2011).

Proses oksidasi dapat dihambat/diperlambat oleh antioksidan.

Proses oksidasi merupakan peristiwa alami yang terjadi di alam dan dapat

terjadi dimana-mana tak terkecuali di dalam tubuh kita. Apabila terjadi

reaksi oksidasi dimana menghasilkan radikal bebas (OH-) sebagai hasil

sampingannya maka tanpa adanya antioksidan, radikal bebas ini akan

13

menyerang molekul-molekul lain disekitarnya yang pada akhirnya akan

membentuk reaksi berantai yang sangat membahayakan. Berbeda halnya

apabila terdapat antioksidan, maka radikal bebas tersebut akan segera

bereaksi dengan antioksidan membentuk molekul yang stabil dan tidak

berbahaya sehingga reaksi pun berhenti sampai disini (Halliwell dan

Gutteridge,2007).

2.2.1 Klasifikasi Antioksidan

Antioksidan dapat diklasifikasikan berdasarkan sumbernya,

interaksinya, dan kelarutannya. Berdasarkan sumbernya terdapat

antioksidan endogen dan eksogen. Antioksidan endogen dapat

dibagi menjadi enzimatik (misalnya SOD, G6PD, dan sitokrom

oksidase serta peroksidase) dan non enzimatik (misalnya

glutathione, bilirubin, plasmin, transferin dan lain-lain.

Antioksidan eksogen misalnya vitamin C, vitamin E, zinc,

selenium, dan lipoic acid.

Berdasarkan interaksinya dapat dibagi menjadi tiga yaitu

enzimatik, pencegah dan pemutus reaksi rantai. Antioksidan

enzimatik bekerja dengan cara mengkatalisasi pemusnahan radikal

bebas. Antioksidan pencegah bekerja mengikat ion logam transisi.

Antioksidan pemutus reaksi rantai bekerja sebagai donor elektron

yang kuat dan bereaksi dengan radikal bebas sebelum merusak

molekul sasaran.

Berdasarkan kelarutannya terdiri dari antioksidan larut

dalam lemak (vitamin A, vitamin E dan CoQ10), antioksidan yang

14

larut dalam air (vitamin C dan glutathione), antioksidan yang larut

dalam lemak dan air (alpha lipoic acid) (Krutmann dan Humbert,

2011).

2.2.2 Mekanisme Kerja Antioksidan

Antioksidan dapat dibagi menjadi dua golongan berdasarkan

mekanisme pencegahan dampak negatif oksidan antara lain sebagai

berikut (Murray, 2009):

1. Antioksidan Pencegah

Merupakan antioksidan yang dapat mencegah terbentuknya

radikal yang paling berbahaya bagi tubuh yaitu radikal hidroksil.

Yang termasuk dalam golongan ini adalah:

a. Super Oxide Dismutase (SOD) berada di dalam mitokondria (Mn

SOD) dan dalam sitoplasma (Cu Zn SOD).

b. Catalase (Cat) dalam sitoplasma, dimana catalase ini mampu

mengkatalisir H2O2 menjadi H2O dan O2. Komplemen Cat adalah

Fe.

c. Gluthation peroxidase yang merupakan salah satu golongan

enzim peroksidase dimana enzim ini dapat meredam H2O2

menjadi H2O melalui siklus redoks glutation.

d. Senyawa yang mengandung gugus sulfhidril seperti glutation,

sistein, kaptopril yang dapat mencegah timbunan radikal

hidroksil dengan mengkatalisir menjadi H2O

2. Antioksidan Pemutus Rantai (Chain Breaking)

15

Merupakan zat yang dapat memutus rantai reaksi

pembentukan radikal bebas asam lemak pada membran sel dan

mencegah peroksidasi lemak sehingga tidak terjadi kerusakan sel.

Antioksidan pemutus rantai ini dapat digolongkan menjadi

antioksidan endogen yaitu glutation, sistein dan eksogen yaitu

vitamin C, vitamin E serta beta karoten (Widowati,2010).

2.3 Stres Oksidatif

Jika radikal bebas jumlahnya melebihi antioksidan maka akan

menimbulkan keadaan yang disebut stres oksidatif. Keadaan ini

mengakibatkan jumlah radikal bebas menjadi berlebihan yang selanjutnya

akan bereaksi dengan lemak, protein, asam nukleat seluler, sehingga

terjadi kerusakan lokal dan disfungsi organ tertentu. Jadi, stres oksidatif

dapat dipandang sebagai gangguan keseimbangan antara produksi oksidan

dan pertahanan antioksidan atau destruksi oleh ROS seperti anion

superoksida (O2-), radikal hidroksil (OH•), hidrogen peroksida (H2O2),

radikal nitrit oksida (NO•) dan peroksinitrit (ONOO-•). Salah satu efek

lanjutan dari stres oksidatif adalah memicu terjadinya kanker.

Saat ini konsep stres oksidatif juga harus mencakup perubahan

stres nitrosative menjadi stres metabolik yang berperan dalam peristiwa

seluler dan ekstraseluler. Pada keadaan fisiologis Reactive Oxygen

Intermediate (ROI) dan Reactive Nitrogen Intermediate (RNI) secara

konstan diproduksi. ROI dan RNI dapat bereaksi dengan protein,

karbohidrat dan lemak yang mengakibatkan perubahan homeostasis

16

intraseluler dan interseluler yang memicu kematian sel dan regenerasi.

Sistem pertahanan antioksidan mungkin saja mengalami kewalahan oleh

berbagai faktor patologi atau lingkungan sehingga sebagian kecil ROS

dapat selamat dari kehancuran dan membentuk radikal hidroksil yang lebih

reaktif. Peningkatan ROS- menimbulkan kerusakan pada DNA dan

biomolekul lainnya sehingga dapat merusak fungsi normal sel dan

menyebabkan penuaan serta berbagai penyakit (Rahman dkk., 2012).

Studi di Framingham stres oksidatif dan resistensi insulin

berhubungan dengan panjang telomer dan perlu diketahui telomer yang

panjang berperan sebagai barier yang penting dalam kelainan pemisahan

saat mitosis sel (aberrant segregation) sehingga melindungi sel dari

aneuploidi yang merupakan salah satu hallmark dari kanker (Munoz &

Costa, 2013).

2.4 Telomer

Telomer merupakan struktur protektif pada ujung kromosom sel

eukaryotik yang terdiri dari tandem arrays of hexameric repeats

(TTAGGG) yang dapat berikatan dengan protein spesifik. Telomer

memiliki peran penting dalam mempertahankan integritas struktur dari

genom yang dapat mencegah kromosom dari nukleolitik mengalami

kerusakan, bergabung, dan rekombinasi atipikal. Telomer pada sel somatik

manusia dapat mengalami pemendekan sepanjang 30-200 bp setiap proses

mitosis sehingga panjang telomer dapat menjadi indikator riwayat mitosis

(Wang dkk.,2015)

17

Struktur telomer terdiri dari pengulangan TTAGGG pada ujung

kromosom. Urutan nukleotida ini universal dan konsisten diantara

sebagian besar spesies, namun panjang telomer spesifik terhadap spesies

dan bervariasi antara 4 ribu dan 15 ribu nukleotida. Pada ujung 3’ telomer

tidak mempunyai untai anti paralel dan panjang untai tesebut bervariasi

antara 100-200 nukleotida pada manusia. Untai tunggal tersebut

membentuk struktur hairpin loop yang dinamakan T-loop, dan dikelilingi

berbagai jenis protein yang bersama-sama berfungsi menutup DNA serta

membantu mencegah fusi ataupun kerusakan ujung kromosom. Struktur

penutup ini juga dapat membentuk struktur G-quadruplex dari 2 atau 4

untai tunggal. Struktur loop dari akhir telomer ini dipertahankan oleh

sejumlah protein telomer spesifik yang membentuk kompleks 6 protein

yang disebut telosome atau kompleks multiprotein shelterin. Shelterin

mengandung protein yang berikatan secara langsung dengan single-

stranded TTAGGG seperti POT1 atau double-strand telomeric repeats

yakni faktor-faktor yang berikatan dengan telomer seperti TRF1 dan

TRF2. Protein ini dihubungkan oleh tiga protein tambahan yaitu TIN2,

TPP1, dan RAP1 (Gambar 1). Kompleks shelterin menentukan fungsi

proteksi telomer secara umum yang disebut ”capping function”, antara

lain: mencegah kromosom DNA dikenali sebagai double-stranded breaks

dan mulainya respon kerusakan DNA, menjaga kromosom akhir dari

degradasi enzimatik, mencegah end-to-end fusion kromosom (Hoffmann

dan Spyridopoulos, 2011).

18

Gambar 2.1. Struktur Telomer. Double-stranded telomeric repeats

diikat oleh kompleks multiprotein yang dikenal sebagai shelterin atau

telosome, terdiri dari TRF1, TRF2, TIN2, RAP1, POT1 dan TPP1

Pada saat replikasi telomer memendek karena ketidakmampuan

DNA polymerase bekerja pada ujung 3’ yang berupa untai tunggal.

Pemendekan telomer yang kritis dapat berupa hilangnya protein penutup

sehingga berakibat disfungsi telomer dengan konsekuensi fusi kromosom

dan instabilitas genomik. Namun ketika pemendekan telomer mencapai

titik kritis, maka terjadi cell cycle arrest, senescence dan apoptosis.

Peristiwa ini dapat dianggap sebagai mekanisme proteksi, namun jika sel

mampu melewati cell cycle arrest maka sel akan mengalami keganasan

(Bermadotte dkk., 2016). Kecepatan pemendekan telomer bergantung pada

keseimbangan antara stres oksidatif intraseluler dan pertahanan

antioksidan (Salpea.,dkk,2010).

Apabila suatu sel mengalami kondisi seperti inflamasi, stres

oksidatif dan penuaan maka akan menyebabkan terjadinya pemendekan

19

telomer. Pada telomer banyak terkandung guanin sehingga apabila

mengalami stres oksidatif akan menyebabkan telomer menjadi sangat

sensitif terhadap kerusakan terutama pada urutan GGG. Selain itu, telomer

juga sangat sensitif terhadap radikal hidroksil sehingga menyebabkan

pemecahan DNA (García-Calzón dkk., 2015).

2.5 Penyakit-Penyakit Berhubungan dengan Stres Oksidatif

Stres oksidatif mampu memberikan banyak efek terutama kearah

inflamasi, dimana secara molekuler radikal bebas yang tinggi dapat

mengaktifkan faktor-faktor transkripsi yang sensitif dengan reaksi redoks

sehingga pada akhirnya memicu reaksi kaskade inflamasi dan peningkatan

radikal bebas (Munoz & Costa, 2013).

Stres oksidatif diketahui berhubungan dengan stres pada sel-sel

yang berhubungan dengan penyakit seperti penyakit kardiovaskuler

diabetes melitus tipe 2, obesitas dan sindorm metabolik. Pada diabetes

mellitus tipe 2 terjadi stres oksidatif pada sel-sel beta pankreas yang

mengakibatkan menurunnya ekspresi glucose transporter 4 (GLUT4)

sehingga mempengaruhi onset penyakit (Munoz & Costa, 2013). Selain

itu, peningkatan stres oksidatif juga berhubungan dengan penyakit

pradiabetes dan sindrom metabolik. Pada kondisi hiperglikemi terjadi

peningkatan produksi reactive oxgen species (ROS) akibat meningkatnya

input menuju ke rantai transport elektron mitokondria. Produksi ROS yang

berlebih ini dapat memicu jalur yang bertanggung jawab terhadap

kerusakan sel yang diinduksi oleh hiperglikemia (Salpea.,dkk,2010).

20

Pada penyakit kardiovaskuler terjadi stres oksidatif pada sel-sel

endotel dalam pembuluh darah sehingga terbentuk peroksinitrit yang

mempengaruhi produksi nitrit oksida (NO) mengakibatkan terganggunya

vasodilatasi pembuluh darah dan pada akhirnya terjadi penyakit

kardiovaskuler. Selain itu stres oksidatif juga dapat mempengaruhi

ekspresi suatu gen melalui mekanisme epigenetik dimana stres oksidatif

berinteraksi dengan keluarga enzim dioksigenase sehingga mempengaruhi

status metilasi histon (Munoz & Costa, 2013).

Diabetes mellitus (DM) merupakan masalah besar karena berbagai

komplikasi yang ditimbulkan pada berbagai organ dimana komplikasi

tersebut disebabkan oleh meningkatnya pembentukan advanced glycation

end products (AGEs), dan radikal bebas yang lain (Kataya, 2007;

Srinivasan, 2007). Radikal bebas yang meningkat pada DM disertai

dengan penurunan fungsi antioksidan endogen, seperti misalnya

superoxide dismutase (SOD) dan catalase, sehingga terjadi stres oksidatif

(Maritim et al.,2003). Pemberian antioksidan pada penderita DM dapat

mengatasi komplikasi makrovaskular, mikrovaskular serta mengatasi

kerusakan jaringan akibat stres oksidatif (Lean, 1999; Kataya, 2007).

2.6 Apoptosis

2.6.1 Peran p53 Sebagai Sensor Stres Oksidatif

Protein p53 diinduksi oleh kerusakan DNA melalui aktivasi

ATM/ATR dan Chk1/Chk2 kinases, selanjutnya p53 akan

menginduksi terperangkapnya siklus sel, menstimulasi perbaikan

DNA dan melindungi stabilitas genomik produksi p53 yang disebut

21

“guardian of the genome”. Stres oksidatif, hipoksia, kehilangan

nutrisi atau aktivasi onkogen juga akan memicu p53 melalui

mekanisme pembentukan dan menstimulasi ekspresi gen p53-

dependent, serta memfasilitasi terjadinya stres. Paparan stres yang

terlalu sering menyebabkan p53 dapat menstimulasi jalur

pengeliminasian sel melalui induksi dari kematian sel. Hasil dari

pro-survival atau pro-death ditentukan oleh sensitivitas dari

promoter. Respon terhadap stres yang lemah atau sedang, p53

menstimulasi ekspresi dari gen pro-survival yang melindungi sel

dari kerusakan. Promoter dari gen ini sangat sensitif terhadap

aktivasi p53 yang rendah dan biasanya aktivasi ini terjadi sangat

cepat setelah terjadinya stres. gen pro-apoptosis teraktivasi sebagai

respon stres yang intens dan perlambatan yang signifikan jika

dibandingkan dengan gen pro-survival.

Meskipun protein p53 ditekan oleh Mdm2 dibawah kondisi

non stres dan mempunyai waktu paruh sekitar 20 menit, hal ini

dapat secara mudah diaktivasi oleh stres multiple. Stres ringan

dapat diinduksi oleh kesalahan dalam replikasi DNA, akumulasi

ROS atau penurunan kadar ATP. Hal ini menyebabkan modifikasi

p53 melalui fosforilasi dan beberapa mekanisme lainnya seperti

asetilasi, metilasi, ubiquitilasi, neddylasia atau summoylasi. p53

dapat juga diaktivasi oleh mekanisme redox-dependent yang

melibatkan faktor redoks Refl. Sebagai hasilnya, hal ini dapat

memicu stimulasi gen p53-dependent yang terlibat dalam supresi

22

ROS dan meningkatkan metabolisme. Aktivasi p53 oleh stres yang

berat dapat memicu kematian sel atau terperangkapnya siklus sel

secara permanen.

2.6.2 Fungsi p53 Sebagai Antioksidan

ROS menyebabkan kerusakan DNA oksidatif yang

meningkatkan kecepatan mutagenesis dan ketidakstabilan

kromosom. Selain itu p53 menghambat oksidasi DNA dan

mutagenesis melalui supresi ROS. ROS juga terlibat dalam aktivasi

jalur signaling pengontrol pertumbuhan sel, proliferasi, viabilitas,

dan transformasi seperti kaskade PI3K-AKT, JAK-STAT, PLC-

PKC, MAPK atau IKK-NF-κB. Mereka juga memiliki peran

penting dalam stimulasi angiogenesis dan transisi epitel-mesenkim

yang mana kedua hal ini merupakan tahap yang penting dari

perkembangan kanker. Dengan demikian akumulasi ROS pada sel

kanker bertanggung jawab untuk angka mutagenesis yang tinggi

dalam onkogen dan gen suppressor tumor, stimulasi proliferasi sel

dan transformasi malignant dan akhirnya untuk angiogenesis,

invasi dan metastasis.

2.6.2.1 Enzim Antioksidan

MnSOD merupakan enzim yang bertanggung jawab

dalam penguraian superoksida (O2-) menjadi bentuk H2O2

yang kurang toksik dalam reaksi 2O2- +H2

+ = H2O2 + O2.

Superoksida diproduksi sebagai hasil dari fosforilasi

23

oksidatif mitokondria atau melalui aktivasi NADPH

oksidase. Mitokondria adalah sumber utama dari

superoksida dan ROS lainnya, dan diperkirakan sekitar 2%

oksigen dikonsumsi oleh mitokondria yang sehat dan

diubah menjadi bentuk O2-.

Disfungsi mitokondria oleh stres atau kontrol

integritas mitokondria yang tidak tepat menyebabkan

peningkatan kebocoran elektron dari rantai pernafasan.

Superoksida yang sangat reaktif mengakibatkan dirinya

menjadi sangat tidak stabil. Hal ini dapat merusak

makromolekul yang berbeda dalam mitokondria termasuk

lemak, protein dan DNA yang nantinya akan

mempengaruhi fungsi mitokondria dan menstimulasi

kebocoran elektron yang luas dan produksi ROS.

MnSOD yang berada dalam matriks mitokondria,

berperan penting dalam detoksifikasi O2- sehingga akan

menghasilkan H2O2 yang kurang reaktif. p53 mengaktivasi

ekspresi MnSOD melalui pengenalan langsung promoter

MnSOD pada posisi -2032—2009 dari gen manusia

Enzim antioksidan lain yang penting dan diatur oleh

p53 adalah GPx1 (Glutathione peroksidase 1). Enzim ini

bertanggung jawab untuk penguraian H2O2 melalui reaksi 2

GSH + H2O2 = GS-SG + H2O dimana GSH dan GS-SG

mengalami reduksi dan oksidasi dan merupakan

24

antioksidan seluler utama. Selenoprptein GPx1 memiliki

peran utama dalam penguraian H2O2, sebuah molekul yang

dapat berdifusi yang dapat bereaksi dengan makromolekul

yang berbeda termasuk membrane lipid, protein dan DNA.

p53 mengaktifkan ekpresi gen GPx1melalui ikatan -694—

720 dengan promoternya dan menstimulasi respon

antioksidan.

2.7 Sirsak (Annona muricata.L)

2.7.1 Taksonomi Sirsak dan Manfaat Daun Sirsak

Sirsak adalah anggota keluarga dari Annonaceae yang

terdiri dari 130 genus dan 2300 spesies. Sirsak berasal dari daerah

tropis di Amerika Selatan dan Utara dan saat ini sudah tersebar luas

di dunia baik daerah tropis maupun subtropis termasuk India,

Malaysia, dan Nigeria. Tanaman sirsak banyak hidup di daerah

dataran rendah dengan tinggi mencapai 5-8 meter di alam bebas

serta memiliki daun yang berwarna hijau tua. Selain itu tanaman

sirsak juga memiliki buah yang dapat dikonsumsi dan memiliki

ukuran yang besar dengan diameter yang bervariasi antara 15 dan

20 cm, berbentuk seperti jantung dan berwarna hijau (Gambar 1).

Klasifikasi dari tumbuhan sirsak adalah: (Maas, 1994)

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

25

Kelas : Dicotyledonae

Ordo : Polycarpiceae

Familia : Annonaceae

Genus : Annona

Spesies : Annona muricata L.

Gambar 2.2. (A) Annona muricata L.; (B) Daun ; (C) Bunga;

(D) Buah

A.squamosa dan A.reticulata merupakan spesies dari

tanaman sirsak yang banyak digunakan sebagai obat tradisional

dalam mengobati berbagai penyakit terutama kanker dan infeksi

parasit. Hampir semua bagian dari tanaman ini dapat dimanfaatkan

untuk kesehatan baik dari buah, daun, biji, akar dan bunga.

Daun sirsak secara tradisional digunakan untuk mengobati

nyeri kepala, insomnia, masalah hati, diabetes, hipertensi dan

sebagai antiinflasmasi, antispasmodik, dan antidisentri. Rebusan

daun sirsak memiliki efek parasitisida, antireumatik, dan

antineuralgia ketika digunakan secara internal. Daun yang telah di

26

masak tersebut secara topikal digunakan untuk abses dan reumatik

(de Sousa dkk., 2010). Selain itu di Amerika Selatan dan Afrika

tropis termasuk Nigeria, daun sirsak digunakan sebagai

ethnomedicine dalam melawan tumor dan kanker. Efek anti

inflamasi, hipoglikemi, sedatif, pelemas otot polos, hipotensi, dan

antispasmodik juga dikaitkan dengan daun, kulit pohon, dan akar

dari tanaman sirsak. (Maghadamtousi dkk.,2015)

2.7.2 Kandungan Daun Sirsak

Semua bagian dari tumbuhan sirsak memiliki beberapa

kandungan kimia antara lain alkaloid (ALK), megastigmanes

(MG), flavonol triglycosides (FTG), phenolics (PL), cyclopeptides

(CP), dan minyak essensial (Maghadamtousi dkk.,2015).

Kandungan kimia yang menonjol dari A.muricata adalah alkaloid

(reticulin, coreximine, coclarine dan anomurine) dan minyak

essensial (-caryophyllene, -cadinene, epi-α-cadinol and -

cadinol).

Kandungan acetogenin dari keluarga Annonaceae termasuk

A.muricata saat ini telah banyak diteliti misalnya yang

teridentifikasi pada daun sirsak yaitu annomuricins A dan B,

gigantetrocin A, annonacin-10-one, muricatetrocins A dan B,

annonacin, goniothalamicin, muricatocins A dan B, annonacin A,

(2,4-trans)-isoannonacin, (2,4-cis)-isoannonacin, annomuricin C,

muricatocin C, gigantetronenin, annomutacin, (2,4-trans)-10R-

27

annonacin-A-one, (2,4-cis)-10R-annonacin-A-one, annopentocins

A, B dan C, cis- dan trans-annomuricin-D-ones, annomuricine,

muricapentocin, muricoreacins dan murihexocin C serta

annocatacin A dan B. Acetogenin ini memiliki sifat sitotoksik

terhadap sel tumor dan aktivitas molluscicidal (de Sousa dkk.,

2010). Daun sirsak telah terbukti menjadi sumber yang kaya

senyawa annonaceous acetogenin (AGEs) (Tabel.1)

(Maghadamtousi dkk.,2015).

2.7.3 Antioksidan dan Anti Inflamasi dalam Ekstrak Etanol Daun

Sirsak

Identifikasi antioksidan dari produk alam saat ini menjadi

suatu ketertarikan pada studi-studi terutama yang berperan dalam

mencegah efek destruksi dari ROS (Moghadamtousi dkk., 2015).

Daun Sirsak mengandung alkaloid dan minyak esensial serta

mempunyai sifat antioksidan dan anti-inflamasi (de Sousa dkk.,

2010). Aktivitas antioksidan dari daun A.muricata ditemukan lebih

kuat dibandingkan A.squamosa dan A.reticulata yang ditunjukkan

pada model in vitro yang berbeda, seperti ATBS, nitric oxide dan

radikal hidroksil. Biji dan daun dari tanaman ini dilaporkan

memiliki antioksidan enzimatik, termasuk katalase dan superoxide

dismutase dan antioksidan non-enzimatik, termasuk vitamin C dan

E (Moghadamtousi dkk., 2015).

Efek anti-inflamasi dibuktikan melalui percobaan paw

edema yang diinduksi dengan carrageenan pada tikus. Paw edema

28

dihasilkan oleh pelepasan mediator seperti histamin, serotonin,

bradykinin, substance P dan prostaglandin, namun pemberian

secara oral ekstrak daun sirsak dapat menghambat pembentukan

paw edema (de Sousa dkk., 2010).

29

Tabel 2.1.

Kandungan kimia isolat daun dari Annona muricata.

ALK: alkaloid; AGE: annonaceous acetogenin; MG:

megastigmane; FTG: flavonol triglycoside

Bagian

Tumbuhan

Kandungan Klas Aktivitas Biologis

Daun, pericarp annomuricin A AGE Toksisitas melawan, sel

kanker paru A549,

kanker payudara MCF-

7, kanker kolon HT-29

Daun annomuricin B AGE Toksisitas melawan sel

kanker paru A549,

kanker payudara MCF-

7, kanker kolon HT-29

Daun annomuricin C AGE Toksisitas melawan sel

kanker paru A549,

kanker payudara MCF-

7, kanker kolon HT-29

Daun annomuricin E AGE Toksisitas melawan sel

kanker pankreas MIA

PaCa-2 dan kanker

kolon HT-29

Daun annomutacin AGE Toksisitas melawan sel

kanker paru A549

Daun (2,4-cis)-10R-

annonacin-A-one

AGE Toksisitas melawan sel

kanker paru A549

Daun (2,4-trans)-10R-

annonacin-A-one

AGE Toksisitas melawan sel

kanker paru A549

Daun annohexocin AGE Toksisitas melawan sel

kanker yang berbeda

Daun annocatacin B AGE Toksisitas melawan sel

hepatoma

Daun anonaine ALK Neurotoksik

Daun quercetin 3-O-

rutinosid

FTG -

Daun annoionoside MG -

Sumber: Moughadamtousi dkk., 2015, hal.15628