BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

Untuk mengetahui pengaruh dan bioindikator pencemaran insektisida

organofosfat terhadap jumlah dan keanekaragaman organisme tanah pertanian

terutama bakteri tanah, dilakukan tahapan penelitian seperti tampak pada Gambar

3.1.

Identifikasi Masalah

Penentuan Lokasi Sampling

Survey Pendahuluan

Analisis Data

Analisa Laboratorium

Pengawetan Sampel

Sampling

Total Plate Count dan Identifikasi

Bakteri Dominan

Wawancara Pola Penggunaan Insektisida

Pemeriksaan Parameter

Insitu

Kesimpulan

Pengukuran Residu Insektisida

Gambar 3.1 Tahapan Penelitian

3-1

3-2

3.1 Identifikasi masalah

Identifikasi masalah pada penelitian ini dititikberatkan pada kemungkinan

timbulnya permasalahan terhadap keanekaragaman bakteri yang terdapat didalam

tanah akibat pemaparan insektsida organofosfat dalam tanah pertanian.

3.2 Pemilihan Daerah Studi Dan Pola Pemakaian Penyemprotan Pestisida

Daerah yang dijadikan objek penelitian ini diambil dari dua jenis pertanian yaitu

pertanian organik dan non organik. Lahan pertanian non organik yang dijadikan

objek penelitian berlokasi di daerah lahan pertanian Desa Sukapura, Kecamatan

Sukasari, Kabupaten Bandung dan sebagai pembanding pengambilan sampel

dilakukan di Pertanian Organik Cisarua Bogor. Perbedaan pada kedua daerah

studi ini adalah dari penggunaan insektisida. Pada lahan pertanian di Desa

Sukapura digunakan insektisida jenis organofosfat sedangkan pada pertanian

organik Cisarua tidak digunakannya insektisida.

Identifikasi pola pemakaian insektisida organofosfat di lahan pertanian non

organik Desa Sukapura, Kecamatan Sukasari, Kabupaten Bandung dilakukan

dengan cara wawancara dengan petani pengolah lahan untuk mengetahui jenis

insektisida organofosfat yang digunakan, dosis formulasi dan periode

penyiramannya.

3.3 Penentuan Titik Sampling

Pengambilan sampel tanah dengan metode acak stratifikasi. Penentuan lokasi dan

titik pengambilan sampel tanah berdasarkan pada luas dan kondisi tanah.

Pengambilan sampel tanah juga berdasarkan penggunaan lahannya. Titik

pengambilan sampelnya dapat dilihat pada Gambar 3.3 dan Gambar 3.4.

Untuk menentukan posisi pengambilan sampel tanah (petak lahan) digunakan alat

GPS (Global Positioning System) ketelitian posisi alat ini mencapai 20 m.

Penentuan titik sampling pemetaan lahan dilakukan dengan menggunakan alat

“GPS MAP 60” untuk menentukan posisi bumi batas persil setiap lahan. Setiap

3-3

koordinat bumi dari titik batas persil petak lahan direkam ke dalam memori alat,

kemudian ditransfer ke komputer dengan menggunakan program “Expert GPS”.

Gambar 3.2 Alat Receiver GPS (GPS MAP 60)

Gambar 3.3 Titik Sampling Lahan Desa Sukapura, Kecamatan Kertasari,

Kabupaten Bandung

3-4

Gambar 3.4 Titik Sampling Lahan Pertanian Organik

3.4 Pengambilan sampel tanah

Sampel tanah diambil pada kedalaman 0-10 cm dengan menggunakan alat ”Soil

Sampler”. Sampel tanah yang diambil di lapangan haruslah representatif, artinya

sampel tanah tersebut harus dapat mewakili suatu areal atau luasan tertentu.

Setelah titik sampling diketahui maka sampel tanah diambil dengan menggunakan

botol vial yang steril dan plastik bersegel. Untuk mendapatkan sampel tanah yang

representatif digunakan ”Metode Komposit Terganggu”. Satu sampel komposit

yang mewakili satu petak lahan, terdiri dari 5 sampel tanah individu, diambil pada

permukaan yakni pada kedalaman 0-10 cm. Parameter–parameter seperti

temperatur, pH, dan kelembaban, serta cuaca dicatat. Untuk mengambil kelima

sampel individu, digunakan metode sistematik (sistem diagonal) seperti

ditunjukkan pada Gambar 3.5 dan cara pengambilan sampelnya dapat dilihat pada

Gambar 3.6.

3-5

Gambar 3.5 Pengambilan sampel komposit dengan metode sistematik

Gambar 3.6 Cara pengambilan sampel dilapangan

3.5 Pengawetan sampel tanah

Sampel tanah segar yang diambil diawetkan pada plastik bersegel kemudian

disimpan di dalam cool box selama perjalanan dari lapangan ke laboratorium. Di

laboratorium, disimpan pada suhu 3-5°C serta diusahakan tidak terpapar sinar

matahari. Hal ini dilakukan agar menghambat aktivitas metabolisme dan

mencegah terjadinya fotodegradasi serta volitilisasi residu insektisida dari sampel

tanah.

3.6 Metode Analisis Residu insektisida organofosfat

a. Metode Ekstraksi yang digunakan adalah Metode ekstraksi insektisida dari

tanah yang digunakan adalah Metode Shaker. Metode ini adalah

penyederhanaan dari Metode 5-1 yang dibakukan oleh Komisi Pestisida

3-6

pada tahun 1997, sebagai metode standar untuk menganalisis multiresidu

pestisida organoklor dan organofosfat dalam berbagai matriks hasil

pertanian. Validitas dan reabilitas dari metode yang disederhanakan ini

dapat diuji dengan membuat recovery sample atau sampel yang diperkaya,

untuk mendapatkan nilai perolehan kembali.

Prinsip kerjanya adalah Residu senyawa organofosfat dari cuplikan tanah

diekstraksi dengan pelarut organik aseton. Residu terlarut dibersihkan

secara kromatografi pada kolom kromatografi Florisil, dielusi dengan

campuran n-heksan dan aseton. Setelah dipekatkan, residu dalam eluat

ditetapkan secara kromatografi gas.

b. Metode Analisis Gas Kromatografi atau Chromatograph Gas (CG)

Konsentrasi residu dihitung dengan cara mengukur puncak kromatogram.

Analisis kuantitatif ini dilakukan dengan membandingkan tinggi atau luas

puncak kromatogram dari senyawa klorpirifos yang dianalisis dengan

tinggi atau luas puncak kromatogram dari reference atau standar baku

kemudian dimasukkan rumus perhitungan (Komisi Pestisida, 1997):

contohberat ksi terekstrasampel vol.standar ikonsentras

standar Tinggicontoh Tinggi

××

Analisis kromatografi gas dilakukan di Laboratorium Residu Bahan Agro

Kima, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan

Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.

Gambar 3.7 Gas Kromatografi

3-7

3.7 Analisis Sifat Fisik – Kimia Tanah

Pengukuran pH dan temperatur dan juga kadar air pada titik pengambilan sampel.

Untuk mengetahui kemungkinan insektisida organofosfat terdegradasi dalam

tanah dan juga kondisi lingkungan yang mendukung pertumbuhan bakteri.

3.8 Perhitungan Total plate count bakteri tanah

Perhitungan koloni dilakukan dengan cara lempeng pembiakan (Plate Count).

Hasil hitungan yang dapat dianggap adalah 30 – 300 koloni pada setiap lempeng

pembiakan dengan tingkat pengenceran tertentu (Usman, 1986). Sedangkan

menurut Salle (1961), perhitungan dengan menggunakan plate count beragam dari

200.000 hingga 100.000.000 per gram tanah.

Perhitungan Total Plate Count dilakukan dengan cara menghitung jumlah koloni

yang tumbuh diambil pada pengenceran yang menghasilkan jumlah koloni dengan

rentang 30-300sampel. Caranya 1 gram sampel tanah yang telah diambil

diencerkan dalam beberapa tingkat pengenceran. Kemudian dari masing-masing

pengenceran tersebut diambil dalam jumlah tertentu kemudian ditanam pada

media pertumbuhan. Gambar 3.8 merupakan cara pengenceran penanaman pada

agar cawan petri dan untuk perhitungan menggunakan colony counter yang dapat

dilihat pada Gambar 3.9.

3-8

Gambar 3.8 Prosedur pengenceran penanaman pada agar cawan petri

Gambar 3.9 Colony Counter

3-9

3.9 Identifikasi Bakteri Tanah

Sistem identifikasi bakteri adalah kunci untuk mengatur sifat-sifat bakteri dalam

suatu cara sehingga memudahkan identifikasi oganisme secara efisien. Sistem

identifikasi yang ideal sebaiknya mengandung sesedikit mungkin gambaran yang

diperlukan untuk diagnosis yang tepat. Kelompok-kelompok dipecahkan menjadi

sub kelompok atas dasar ada (+) atau tidaknya (-) spora. Proses yang

berkelanjutan mengenai berbagai macam mikroorganisme, menuntun para peneliti

sampai kepada sub kelompok terkecil yang terdiri dari organisme yang telah

dianalisis. Pada tahap awal proses ini, organisme ditetapkan menjadi sub

kelompok berdasarkan ciri khas yang tidak memperlihatkan hubungan simbiosis.

Isolasi langsung dengan menggunakan nutrient agar (NA) dilakukan sebelum

identifikasi bakteri dominan dalam tanah. Caranya sampel tanah diencerkan lalu

ditanam pada media nutrient agar. Setelah diperoleh koloni yang mampu hidup

pada media, maka setiap koloni yang diperoleh diisolasi dengan memperhatikan

morfologi dari koloni yang tumbuh. Koloni-koloni yang tumbuh dominan ditanam

kembali pada media nutrien agar dalam cawan petri dengan teknik menggores

(streak plate). Isolasi ini dilakukan beberapa kali. Setelah beberapa kali

pengulangan ditemukan isolat murni dari bakteri tanah tersebut. Tahap isolasi

merupakan tahap pemurnian dimana tujuannya adalah agar diperoleh koloni

bakteri murni yang tidak dikontaminasi oleh koloni lain. Setelah isolasi dilakukan

dilanjutkan dengan identifikasi isolat. Penyimpanan koloni bakteri dilakukan pada

suhu 40C dan siap untuk digunakan pada pengujian selanjutnya. Identifikasi

bakteri dilakukan terhadap isolat isolat yang diperoleh dengan berpedoman pada

buku Bergey’s determinative bacteriology (Holt, 1994) dan Manual For The

Identification Of Medical Bacteria (Cowan, 1974) dengan melakukan serangkaian

uji morfologi dan biokimia yaitu uji pewarnaan Gram, uji motilitas, pengamatan

bentuk sel, kemampuan tumbuh pada suhu 50C, 200C, dan 300C. Pengamatan

dilakukan juga pada warna koloni, ukuran koloni, bentuk koloni, untuk

menentukan jenis dari bakteri tanah tersebut.

3-10

Gambar 3.10 Uji Biokimia

3.10 Analisis

Analisis dilakukan terdahap residu insektisida organofosfat didalam tanah

kemudian dari hasil pengukuran residu insektisida organofosfat dan hasil

perhitungan total plate count serta jenis bakteri dominan yang berada dalam tanah

dilakukan analisa pengaruh dari insektisida organofosfat terhadap organisme

terutama bakteri dalam tanah dan juga membandingkan jumlah total bakteri sesuai

dengan pengunaan tata guna lahan serta menentukan bioindikator berdasarkan

hasil dari penelitian dan studi literatur.