BÀI 13 - ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

BÁO CÁO TH C HÀNHỰBÀI 13

Đ NH L NG VI SINH V T B NGỊ ƯỢ Ậ Ằ PH NG PHÁP Đ M TR C TI PƯƠ Ế Ự Ế

( BU NG Đ M H NG C U )Ồ Ế Ồ Ầ

I. NGUYÊN T CẮ

Ph ng pháp đ m tr c ti p là ph ng pháp đ nh l ng d a trên s quan sát vàươ ế ự ế ươ ị ượ ự ự đ m tr c ti p s l ng t bào vi sinh v t b ng kính hi n vi và bu ng đ m.ế ự ế ố ượ ế ậ ằ ể ồ ế

1.Đ I T NGỐ ƯỢ

Vi sinh v t đ n bào có kích th c l n: n m men, t o đ n bào, bào t n m m cậ ơ ướ ớ ấ ả ơ ử ấ ố d quan sát d i kính hi n vi.ễ ướ ể

2. H N CHẠ Ế

Không phân bi t đ c t bào vi sinh v t s ng và ch t trong m u.ệ ượ ế ậ ố ế ẫ Không phân bi t đ c các t bào vi sinh v t và h t v t th .ệ ượ ế ậ ạ ậ ể H n ch đ i v i huy n phù có m t đ th p do l ng dung d ch đem đ mạ ế ố ớ ề ậ ộ ấ ượ ị ế

nh .ỏ Đ chính xác không cao.ộ Không thích h p m u có m t đ vi sinh v t th p.ợ ẫ ậ ộ ậ ấ

L U Ý:Ư

Tùy m c đ có m t c a vi sinh v t trong m u ban đ u, dung d ch đem đ m c nứ ộ ặ ủ ậ ẫ ầ ị ế ầ đ c pha loãng đ n m c phù h p ( s t bào ph i l n h n ho c b ng 2 vàượ ế ứ ợ ố ế ả ớ ơ ặ ằ không quá 10 t bào ). Nguyên t c pha loãng:ế ắ

Dung d ch pha loãng m u th ng là NaCl 0.9% hay photphat đ m đã đ c vôị ẫ ườ ệ ượ trùng.

1 TR N THANH TÙNG – MSSV: 10243221| Ầ


II. D NG C , MÔI TR NG, HÓA CH TỤ Ụ ƯỜ Ấ

D ng c phòng thí nghi m.ụ ụ ệ N c mu i sinh lý 0.9%.ướ ố N c c t vô trùng.ướ ấ C n 96ồ o. Ch ng n m men: ủ ấ Saccharomyces cerevisiae.

III. TI N HÀNH THÍ NGHI MẾ Ệ

S D NG BU NG Đ M H NG C UỬ Ụ Ồ Ế Ồ Ầ

1. C U T O BU NG Đ MẤ Ạ Ồ Ế

Bu ng đ m là m t phi n kính trong, dày,ồ ế ộ ế hình ch nh t.ữ ậ

Gi a là ph n lõm, ph ng, có k m t ho cữ ầ ẳ ẻ ộ ặ hai khung đ m g m 400 ô nh . Bên ngoàiế ồ ỏ có ghi tên lo i bu ng đ m, và ghi các thôngạ ồ ế s kĩ thu t nh hình bên.ố ậ ư

Hình 13.1 Bu ng đ m h ng c uồ ế ồ ầ

2. C U T O KHUNG Đ MẤ Ạ Ế



Hình 13.2 C u t o khung đ mấ ạ ế

3. CÁCH TI N HÀNHẾ

Hình 13.3 Cách ti n hànhế



QUY TRÌNH:

4. CÁCH Đ M T BÀO TRONG BU NG Đ MẾ Ế Ồ Ế


Mẫu

Đồng nhất

Pha loãng

Chọn nồng độ pha loãng

Bơm dịch mẫu vào BĐHC

Đếm trực tiếp trên KHV

Tính kết quả


Hình 13.4 Cách đ m t bào trong bu ng đ mế ế ồ ế

Hình 13.5. Nh ng t bào đ c đ m ( màu đen ) và không đ c đ m ( màu xanh )ữ ế ượ ế ượ ế trong 1 ô l nớ

5. CÔNG TH C TÍNHỨ

G i A là s l ng t bào đ m đ c trong 80 ô nhọ ố ượ ế ế ượ ỏ

S l ng t bào trong 1 mmố ượ ế 3 đ c tính theo công th c:ượ ứ

S t bào trong 1 mmố ế 3 =

A×4000×ĐPL5×16

Trong đó:

A: S l ng t bào trong 80 ô nhố ượ ế ỏ 4000 = 400 x 10 ( 1/400 mm2: di n tích 1 ô nh ; 1/10 mm: chi u cao tệ ỏ ề ừ

m t bu ng đ m đ n t m lamelle )ặ ồ ế ế ấ ĐPL: đ pha loãngộ

IV. NH NG ĐI M C N L U ÝỮ Ể Ầ Ư



Ch đ m đ c t ng s t bào, không th bi t t bào nào còn s ng, t bàoỉ ế ượ ổ ố ế ể ế ế ố ế nào đã ch t.ế

N ng đ d ch huy n phù pha loãng sao cho m t đ m i ô nh không quáồ ộ ị ề ậ ộ ỗ ỏ 10 t bào.ế

S d ng xong ph i r a bu ng đ m ngay và lau khô.ử ụ ả ử ồ ế Đ đ t đ chính xác cao, s t bào trung bình đ m đ c trong 1 ô nh : 2 ≤ể ạ ộ ố ế ế ượ ỏ

a ≤ 10.

V. BÁO CÁO TH C T PỰ Ậ

Trình bày nguyên t c và cách ti n hành c a ph ng pháp đ nh l ng viắ ế ủ ươ ị ượ sinh v t b ng ph ng pháp đ m tr c ti p.ậ ằ ươ ế ự ế

NGUYÊN T C:Ắ

Ph ng pháp đ m tr c ti p là ph ng pháp đ nh l ng d a trên s quan sát vàươ ế ự ế ươ ị ượ ự ự đ m tr c ti p s l ng t bào vi sinh v t b ng kính hi n vi và bu ng đ m.ế ự ế ố ượ ế ậ ằ ể ồ ế

Đ m s l ng t bào vi khu n có trong m t đ n v th tích c aế ố ượ ế ẩ ộ ơ ị ể ủ phòng đ m, t đó suy ra s l ng t bào có trong 1ml dung d ch, nhân v i đ pha loãngế ừ ố ượ ế ị ớ ộ để bi t s t bào cóế ố ế trong dung d ch ban đ u.ị ầ

CÁCH TI N HÀNH:Ế

Pha loãng huy n phù t bào vi sinh v t sao cho trong m i ô l n ch t 10 -ề ế ậ ỗ ớ ỉ ừ 50 t ế

bà o ). L c m nh d ch huy n phù t bào (đã pha loãng), dùng pippet Pasteur đắ ạ ị ề ế ể

hút d ch ị huy n phù này.ề Đ y bu ng đ m b ng m t phi n kính m ng.ậ ồ ế ằ ộ ế ỏ Nh nhàng dùng đ u pippet (ch a m t gi t huy n phù vi sinh v t), đ tẹ ầ ứ ộ ọ ề ậ ặ

vào c nh ạ bu ng đ m (n i ti p giáp v i phi n kính m ng). D ch huy n phù sẽồ ế ơ ế ớ ế ỏ ị ề đi vào bu ng ồ đ m nh c ch mao d n. Bu ng đ m đ c chu n b đúngế ờ ơ ế ẫ ồ ế ượ ẩ ị khi ch có vùng ỉ không gian n m gi a lá kính và bu ng đ m đ c ph b iằ ữ ồ ế ượ ủ ở d ch huy n phù t bào, ị ề ế c ò n c á c r ã n h c h u n g q u a n h thì k h ô n g b d í n h t.ị ướ

Di chuy n nh nhàng khung đ m đ d ch huy n phù tràn đ y các khoang.ể ẹ ế ể ị ề ầ Khi đó, d c h n m tr o n g k h o a n g c ó đ d à y k h o n g 0 .1 m m.ị ằ ộ ả

Đ t bu ng đ m lên kính hi n vi, s d ng v t kính x10 đ tìm bu ng đ m.ặ ồ ế ể ử ụ ậ ể ồ ế Ch nh ỉ

th t rõ, sau đó chuy n qua v t kính x40 đ đ m.ậ ể ậ ể ế Đ i u c h n h c n g đ á n h sá n g b n g c a s p đ c ó th q u a n s á t r õ r à nề ỉ ườ ộ ằ ử ậ ể ể

g c t b à o ả ế l n các đ ng k . Tuỳ vào s l ng t bào mà có th ch n cáchẫ ườ ẻ ố ượ ế ể ọ đ m t t c các t ế ấ ả ế bào có trong ô trung tâm hay ch đ m các t bào có trongỉ ế ế



m t s ô vuông l n đ i ộ ố ớ ạ di n . Thông th ng ta ch n 1 ô trung tâ m và 4 ô n mệ ườ ọ ằ ngoài bìa.

B t đ u đ m t bào sau khi nh gi t d ch t 3 - 5 phút; ph i đ m các tắ ầ ế ế ỏ ọ ị ừ ả ế ế bào n m ằ t r ê n 2 đ n g k k n h a u đ c c h n c a t n g ô .ườ ẻ ề ượ ọ ủ ừ

Ph ng pháp đ nh l ng vi sinh v t b ng cách đ m tr c ti p th ng ápươ ị ượ ậ ằ ế ự ế ườ d ng cho nh ng đ i t ng vi sinh v t nào? Gi i thíchụ ữ ố ượ ậ ả

Đ I T NGỐ ƯỢ

Vi sinh v t đ n bào: n m men, t o đ n bào, bào t n m m c,...ậ ơ ấ ả ơ ử ấ ố

GI I THÍCH:Ả

Nh ng vi sinh v t nêu trên có kích th c l n.ữ ậ ướ ớ D quan sát d i kính hi n vi.ễ ướ ể Chúng th ng t n t i v i m t đ cao trong m u v t c n ki m tra.ườ ồ ạ ớ ậ ộ ẫ ậ ầ ể Đa s không c n nhu m màu ( n u là vi khu n th ng nhu m xanhố ầ ộ ế ẩ ườ ộ

metylen ho c màu phù h p v i vi khu n đó ).ặ ợ ớ ẩ Do quan sát b ng kính hi n vi v t kính x40, nghĩa là đ phóng đ i lênằ ể ở ậ ộ ạ

400 l n nên ch có th đ m đ c nh ng vi sinh v t có kích th c l n.ầ ỉ ể ế ượ ữ ậ ướ ớ


Documents

BÀI 13 - ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP