Bakterije Mlečne Kiseline, Plesni i Fagi Iz Grožđa i Vina

TEHNOLOKI FAKULTET, NOVI SAD

Biologija proizvodnih mikroorganizama

- SEMINARSKI RAD -

Bakterije mlene kiseline, plesni i fagi iz groa i vina

PROFESOR: STUDENT:

prof. dr Sinia L. Markov MSc Marina Raji

Septembar, 2014.

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA Bakterije mlene kiseline, plesni i fagi iz groa i vina

SADRAJ

1. Bakterije mleno-kiselog vrenja....................................................................................1 1.1. Uvod.............................................................................................................................1 1.2. Ekologija......................................................................................................................3 1.3. Fiziologija....................................................................................................................4 1.4. Aktivnost u motu i vinu..............................................................................................5 1.5. Karakteristike rodova i vrsta mleno-kiselih bakterija koje su u vezi sa vinom..........7

1.5.1. Rod Lactobacillus...............................................................................................7 1.5.2. Rod Leuconostoc..............................................................................................11 1.5.3. Rod Oenococcus...............................................................................................13 1.5.4. Rod Pediococcus..............................................................................................14 1.5.5. Rod Weissella...................................................................................................16

1.6. Zakljuak....................................................................................................................17 2. Plesni groa..................................................................................................................18

2.1. Uvod...........................................................................................................................18 2.2. Peronosporomicete.....................................................................................................19

2.2.1. Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl. & De Toni: plamenjaa vinove loze...................................................................................................................19

2.3. Askomicete.................................................................................................................21 2.3.1. Erysphe necator Schwein. (emend. Uncinula necator (Schw.) Burr)

(Erysiphales): prakasta plesan vinove loze.....................................................21 2.3.2. Botrytis cinerea Pers.: Fr. (Helotiales): gomilasta trule botritisa...................23 2.3.3. Pseudopezicula tracheiphila (Mll.-Thurg.) Korf & Zhuang (Helotiales):

crvena pale lia..............................................................................................25 2.3.4. Phomopsis viticola ( Sacc.) Sacc (Diaporthales): fomopsis i crna pegavost

(eskorioza)........................................................................................................26 2.3.5. Elsino ampelina Shear (Myringiales): antrakoza............................................28 2.3.6. Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz (Dothideales): crna bu..............28 2.3.7. Penicillium expansum Link (Eurotiales): zelena trule....................................29

2.4. Aspergillus spec. (Eurotiales): Aspergillus bu.....................................................31 2.4.1. Coniella petrakii B. Sutton (Diaporthales): bela bu.......................................31 2.4.2. Alternaria alternata (Fr.: Fr.) Keissler (Pleosporales): trule Alternaria........32 2.4.3. Cladosporium herbarum (Pers.) Link (Capnodiales): Cladosporium bu.......32 2.4.4. Trichothecium roseum (Pers.) Link (Hypocreales): ruiasta bu...................33

2.5. Zigomicete..................................................................................................................33 2.5.1. Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Lind. (Mucorales): rizopusna trule.................33


2.5.2. Mucor spp. (Mucorales): trule mukora...........................................................34 2.6. Zakljuak....................................................................................................................34

3. Fagi gljivica i bakterija.................................................................................................36 3.1. Uvod...........................................................................................................................36 3.2. Kvasci ubice i fermentacija vina................................................................................36 3.3. Virusne infekcije mogu prouzrokovati fenotip ubice u kvascima.............................37

3.3.1. dsRNK virusi i ekspresija fenotipa ubice u kvascima iz vina..........................37 3.3.2. Proizvodnja virusnog preprotoksina i sazrevanje toksina................................39 3.3.3. Endocitoza i intracelularni transport toksina....................................................40 3.3.4. K28 utie na sintezu DNK i progresiju elijskog ciklusa, i indukuje

apoptozu............................................................................................................41 3.3.5. Letalitet smrtonosnih toksina virusa koji oteuju membranu.........................41

3.4. Imunitet na toksine osigurava samozatitu u kvascima inficiranim smrtonosnim virusima......................................................................................................................43

3.5. Fagi u vinu i malolaktika konverzija........................................................................44 3.6. Generalne osobine enofaga........................................................................................44 3.7. Interakcije enofag domain.....................................................................................45 3.8. Zakljuak....................................................................................................................46

4. Literatura.......................................................................................................................47


1

1. BAKTERIJE MLENO-KISELOG VRENJA

1.1. Uvod

Louis Pasteur je u periodu izmeu 1857. i 1863. godine prouavao fermentaciju bakterija mlene kiseline. Deset godina nako toga Joseph Lister je izolovao prve iste kulture ovih bakterija (Bacterium lactis). Iako se fermentisanje hrane primenjuje vie od 5000 godina starter kulture za proizvodnju sira i kiselog mleka opisane su 1890-ih godina. (Schlegel 1999; Stiles i Holzapfel 1997). Prvu monografiju o bakterijama mlene kiseline je objavio S. Orla-Jensen 1919. godine. Tipine bakterije mlene kiseline koje rastu pod standardnim uslovima (nelimitirajue koncentracije glukoze, limitacija faktora rasta i kiseonika) su Gram-pozitivne, nesporogene, katalaza negativne u odsustvu porforinoida, aerotolerantne, acidotolerantne, organotrofne i striktno fermentativne tapiaste ili kokoidne bakterije koje produkuju mlenu kiselinu kao glavni krajnji proizvod. Nemaju citohrome i ne mogu da sintetiu porfirine. Ove karakteristike mogu da variraju pod odreenim uslovima. U prisustvu hema mogua je katalaza i proizvodnja citohroma, tako da se mlena kiselina moe dalje metabolisati, to rezultuje niim koncentracijama mlene kiseline kao krajnjeg proizvoda. Deoba elija se deava u jednoj ravni, osim kod pediokoka. elije su uglavnom nepokretne. Imaju potrebu za kompleksnim faktorima rasta kao to su vitamini i aminokiseline. Bakterije mlene kiseline su karakterisane prema sposobnosti da proizvode mlenu kiselinu iz glukoze kao glavni kataboliki krajnji produkt. Neki bacili, kao to su Actinomyces israeli i bifidobakterije, mogu da proizvode mlenu kiselinu kao krajnji produkt, ali ove bakterije nisu nikada, ili su veoma retko izolovane iz mota i vina. Bakterije mlene kiseline (LAB Lactic Acid Bacteria) su grupisane u granu Clostridium Gram-pozitivnih bakterija, dok Bifidobacterium priradaju aktinomicetama. Grupisane su u jedan red i 6 familija. Od 32 opisana roda, samo 22 vrste koje se nalaze u 5 rodova izolovane su iz vina u mota (Tabela 1). Homofermentativne vrste LAB produkuju < 85% mlene kiseline kao jedini krajnji produkt, dok heterofermentativne vrste proizvode mlenu kiselinu, CO2 i etanol/acetat. Najmanje polovina ugljenika u krajnjem proizvodu je u vidu laktata. Heterofermentativne LAB koriste pentoza fosfatni put, koji se alternativno naziva jo i put fosfoketolaze ili fosfoglukonata. Homofermentativne LAB koje su u vezi sa vinom, ukljuuju pediokoke i grupu I laktobacila. Obligatni heterofermentativni LAB iz vina podrazumevaju Leuconostoc, Oenococcus, Weissella i grupu III laktobacila.

Tabela 1. Taksonomski prikaz bakterija mlene kiseline iz grane Clostridium (Garrity GM 2005)

Razdeo Klasa Red

Familija Rod Vrste izolovane iz vina i mota

Firmicutes Bacilli Lactobacillales

I. Lactobacillaceae I. Lactobacillus

Lb. brevis Lb. buchneri Lb. casei Lb. curvatus Lb. delbrueckii Lb. diolivorans Lb. fermentum Lb. fructivorans


2

II. Paralactobacillus III. Pediococcus

Lb. hilgardii Lb. jensenii Lb. kunkeei Lb. mali Lb. nagelii Lb. paracasei Lb. platarum Lb. vini

P. pentosaceus P. parvulus P. damnosus

II. Aerococcaceae I. Aerococcus II. Abiotrophia III. Dolosicoccus IV. Eremococcus V. Facklamia VI. Globicatella VII. Ignavigranum

III. Carnobacteriaceae I. Carnobacterium II. Agitococcus III. Alkalibacterium IV. Allofustis V. Alloiococcus VI. Desemzia VII. Dolosigranulum VIII. Granulicatella IX. Isobaculum X. Lactosphaera XI. Marinilactibacillus XII. Trichococcus

IV. Enterococcaceae I. Enterococcus II. Atopobacter III. Melissococcus IV. Tetragenococcus V. Vagococcus

V. Leuconostocaceae I. Leuconostoc II. Oenococcus III. Weisella

Lc. mesenteroides O. oeni W. paramesenteroides

VI. Streptococcaceae I. Streptococcus II. Lactococcus


3

Tabela 2. Diferencijalne karakteristike rodova bakterija mlene kiseline izolovanih iz vina (Knig i sar. 2008)

Rod Morfologija Fermentacija ugljenih hidrataa Izomer mlene

kiseline

Lactobacillus tapii, kokobacili,

pojedinane elije ili u lancima

homo- ili heterofermentativni,

fakultativno heterofermentativni

D, L, DL

Leuconostoc b sferne ili lentikularne elije u parovima ili

lancima heterofermentativni D

Oenococcus b sferne ili lentikularne elije u parovima ili

lancima heterofermentativni D

Pediococcus sferne elije u parovima ili tetradama

homofermentativni ili fakultativno

heterofermentativni c DL, L

Weissella sferne, lentikularne, nepravilnog oblika heterofermentativni D, DL

a Nelimitirajue koncentracije glukoze i faktora rasta ali limitiran kiseonik

b Diferencijacija vrsta Leuconostoc i Oenococcus koje su u vezi sa vinom data je u Tabeli 3

c Fakultativno heterofermentativne vrste: P. pentosaceus, P. acidilactici, P. claussenii

1.2. Ekologija

Bakterije mlene kiselina rastu uglavnom u nutritivno bogatim sredinama. Mogu se nai na istrulelom bilju i vou, u mlenim proizvodima, fermentisanom mesu i ribi, na repi, krompiru, kiselom kupusu, ukiseljenom povru, piu, biljkama, vodi, sokovima, mulju kao i telesnim dupljama (usta, genitalije, intestinalni i respiratorni trakt) ljudi i ivotinja. Oni predstavjaju deo zdrave mikrobiote ljudskih creva. Osim dentalnog karijesa kojeg uzrokuju, laktobacili se inae smatraju apatogenim. Lb. plantarum bi mogao da se povee sa endokarditisom, septikemijom i apscesom. Neke vrste se koriste kao starter kulture u fermentaciji hrane. Zbog poveanja kiselosti hrane oni spreavaju njeno kvarenje i rast patogenih mikroorganizama (Hammes i sar. 1991). Neki LAB imaju ulogu probiotika, predstavljaju potencijalno benefitne bakterije u ekosistemu creva ljudi i ivotinja (Tannock, 2005). LAB se takoe mogu nai i na grou, u groanom motu, vinu i pivu. Neoteeno groe sadri


4

kvasaca. U nekim sluajevima je u toku procesa proizvodnje vina poeljna fermentacija jabune kiseline od strane LAB, ali one mogu takoe i da stvore neprijatan ukus vina. Rodovi Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus i Bifidobacterium nisu izolovani iz mota i vina.

1.3. Fiziologija

Ugljeni hidrati se koriste kao izvor ugljenika i energije putem homofermentativnog ili heterofermentativnog ciklusa. eeri ili oligosaharidi se usvajaju sistemom fosfotransferaze (PTS phosphotransferase system) ili preko sistema permeaze. Homofermentacija heksoza omoguena je Embden-Meyerhof-Parnas putem, dok se heterofermentacija odigrava pomou 6-P-glukonat/fosfoketolaza ciklusa rezultujui laktatima, etanolom/acetatom i CO2 kao krajnjim proizvodima. Pentoze se fermentiu putem 6-fosfoglukonat/fosfoketolaze i daju mlenu kiselinu, siretnu kiselinu/etanol i CO2. Neki laktobacili kao to je Lb. salivarius (Raibaud i sar 1973) ili Lb. vini (Rodas i sar. 2006) mogu da fermentiu pentoze homofermentativno. Neki sojevi mogu da produkuju acetat, etanol i formijat iz piruvata pod uslovima ekstremno niskih koncentracija supstrata i u striktno anaerobnim uslovima (Hammes i Vogel 1995). Bakterije mlene kiseline proizvode D(-) ili L(+) mlenu kiselinu ili racemsku smeu izomera mlene kiseline (Kandler 1983). Embden-Meyerhof-Parnas ciklus koriste laktobacili grupe I (obligatno homofermentativni laktobacili: Lb. delbrueckii, Lb. mali, Lb. nagelii, Lb. vini) i II (fakultativno heterofermentativni laktobacili: Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. jensenii, Lb. paracasei, Lb. plantarum) i pediokoki, dok se laktobacili grupe III (obligatno heterofermentativni laktobacili: Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. diolivorans, Lb. fermentum, Lb. fructivorans, Lb. hilgardii, Lb. kunkeei), Leuconostoc i Oenococci slue 6-fosfoglukonat/fosfoketolaza putem. Promene u sastavu krajnjih produkata mogu biti uzrokovane faktorima spoljanje sredine. U zavisnosti od uslova rasta, krajnji proizvodi homofermentacije mogu se znaajno izmeniti. Nakon izomerizacije i/ili fosforilacije, pored glukoze mogu se fermentisati i druge heksoze kao to su manoza, fruktoza i galaktoza. Galaktoza se koristi u ciklusu tagatoze npr. kod Lb. casei. Pri anaerobnim uslovima Lb. casei moe da metabolie piruvat do formijata i acetata/etanola (piruvat format liaza putem) u uslovima limitacije glukoze. Krajnji proizvodi su laktat, acetat, format i etanol (kombinovana kisela fermentacija). S druge strane pri aerobnim uslovima Lb. plantarum moe da kovertuje piruvat do CO2 i acetil fosfata pomou piruvat oksidaze (Sedewitz i sar. 1984). Enzimi koji sadre flavin, kao to je NADH:H2O2 oksidaza i NADH:H2O oksidaza (Condon, 1987) mogu da se pojave u bakterijama mlene kiseline. Kiseonik ima ulogu eksternog elektron akceptora. Kao primeri mogu se navesti kiseonik zavisna fermentacijea glicerola P. pentosaceus i fermentacija manitola od strane Lb. casei. Za Lb. plantarum predloen je metabolizam laktata koji je zavisan od kiseonika, ukljuujui NAD+ - zavisnu i/ili NAD+ - nezavisnu laktat dehidrogenazu, piruvat oksidazu i acetat kinazu (Murphy i sar. 1985). Laktobacili reaguju na kiseonik. Neke bakterije mlene kiseline koriste visoke intracelularne koncentracije mangana za zatitu od superoksida (30-35 mM) (Archibald, 1986). Theobald i sar. (2005) su otkrili da koncentracije mangana od 68 M ili 34 mM u hranljivoj podlozi stimulie rast O. oeni.


5

Ukoliko se viak piruvata redukuje do mlene kiseline, citrat moe dovesti do formiranja diacetil/acetona. Oksaloacetat takoe moe imati ulogu elektron akceptora i dovesti do formiranja sukcinske kiseline kada Lb. plantarum raste na manitolu (Chen i McFeeters, 1986). Lb. brevis i Lb. buchneri mogu da koriste glicerol kao elektron akceptor u anaerobnim kofermentacijama gde glukoza vodi do laktata, acetata, CO2 i 1,3-propandiola (Schtz i Radler, 1984a, b). Fruktoza se moe fermentisati putem 6-fosfoglukonat/fosfoketolaza ciklusa i imati ulogu elektron akceptora kako bi u prinosu bio manitol kod Lb. brevis (Eltz i Vandemark, 1960). Jabuna kiselina se moe koristiti kao jedini izvor energije za Lb. casei kada je u prinosu acetat, etanol i CO2, ili se moe konvertovati do L-laktata i CO2 (fermentacija jabune kiseline) od strane O. oeni (Radler 1975). Biosinteza aminokiselina u bakterijama mlene kiseline je ograniena. Neki imaju peptidaze i mogu da hidrolizuju proteine. Bakterije mlene kiseline takoe mogu da uspostavljaju i hemijsku komunikaciju u elijama (Nakayama i Sonomoto 2002).

1.4. Aktivnost u motu i vinu

Pokazalo se da groe ima veoma raznovrsnu mikrobioloku ekologiju koja ukljuuje filamentozne plesni, kvasce i bakterije sa razliitim fiziolokim karakteristikama i efektima tokom proizvodnje vina (Jaomanjaka i sar., 2013). Ove zajednce su gotovo podlone oscilacijama u sastavu, sloenosti i raznolikosti i mogu se nai u svim fzama procesa proizvodnje vina: na bobicama groa, u motu tokom fermentacije i u vinu (Renouf i sar., 2007; Barata i sar., 2012; Martins i sar., 2012).

Bakterije mlene kiseline imaju ulogu u fermentaciji i prezervaciji hrane, kao i u digestiji unutar creva ljudi i ivotinja. Zahvaljujui svojoj toleranciji na etanol i kiselu sredinu, LAB mogu da rastu u motu. Uglavnom ih inhibie koncentracija etanola vea od 8 vol%, mada O. oeni tolerie i 14 vol% a Lb. brevis, Lb. fructivorans i Lb. hilgardii mogu se nai i u zrelim vinima gde je koncentracija etanola i do 20 vol%. Sojevi P. damnosus koji proizvode sluz rastu u sredini i do 12 vol% etanola. Bakterije mlene kiseline koje su izolovane iz vina rastu na temperaturama izmeu 15 i 45 oC u laboratorijskim uslovima, pri emu je optimalni rast u osegu od 20 do 37 oC. Najbolji rast u motu tokom fermentacije jabune kiseline se postie na oko 20 oC. Tokom prvih dana fermentacije mota brojnost bakterije mlene kiseline se povea sa 102 na 104-105 CFU/mL. Nakon alkoholne fermentacije i tokom fermantacije jabune kiseline, broj elija u titru moe dostii do 107-108 CFU/mL (Riberau-Gayan i sar. 2006a, b). Titar (CFU/mL) razliitih vrsta bakterija mlene kiseline tokom alkoholne fermentacije odreivali su Lonvaud-Funel i sar. (1991): O. oeni 3,4106 (13-og dana sadraj alkohola 18 vol%); Lc. mesenteroides 9,6104 (6-og dana sadraj alkohola 9 vol%); P. damnosus 3,8104 (treeg dana sadraj alkohola 7 vol%); Lb. hilgardii 8,0104 (treeg dana sadraj alkohola 7 vol%); Lb. brevis 2,0104 (treeg dana sadraj alkohola 7 vol%) i Lb. plantarum 2,0104 (treeg dana sadraj alkohola 7 vol%).

Bakterije mlene kiseline energiju dobijaju uglavnom iz fermentacije eera. Kao izvore energije i ugljenika koriste dve glavne heksoze iz vina, glukozu i fruktozu. U tom smislu oni predstavljaju konkurente kvascima koji produkuju etanol, kao to je Saccharomyces cerevisiae. Heterofermentativni LAB u vinu mogu da koriste i pentoze (arabinozu, ksilozu, ribozu) koje se mogu nai u manjim koncentracijama u vinu.


6

LAB metaboliu i tri glavne kiseline iz vina: tartarnu, jabunu i limunsku. Citrati se konvertuju u laktate, siretnu kiselinu i CO2 i acetoin. Malat se konvertuje do L-laktata i CO2 (malolaktika kiselina). Bioloka redukcija pomou starter kultura O. oeni je bitan korak u proizvodnji vina, pogotovo u severnijim zemljama, gde mot moe imati visoke koncentracije kiseline. Malolaktiki enzim naen je u mnogim bakterijama mleno kiselog vrenja koje se javljaju u vinu (npr. Lb. casei, Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. delbruechii, Lb. hilgardii, Lb. plantarum, Lc. mesenteroides i O. oeni). O. oeni se koristi za smanjenje sadraja jabune kiseline jer je visokotolerantan na etanol i kiselinu. Fermentacija jabune kiseline i upotreba eera rezultuje proizvodnjom stabilnijeg vina. Tartarat se moe konvertovati do laktata, citrata i CO2 pomou homofermentativne bakterije Lb. plantarum, i do acetata i CO2 ili fumarne kiseline (sukcinske kiseline) heterofermentativnom bakterijom Lb. brevis (Radler i Yannissis 1972).

Bakterije mlene kiseline produkuju i razliite biogene amine. O. oeni, P. cerevisiae i Lb. hilgardii (Landete i sar. 2005; mangani i sar. 2005) su primeri za proizvodnju biogenih amina. Najvaniji je histamin koji nastaje dekarboksilacijom histidina. COST Akcija 917 (200-2001) Evropske Unije Bioloki aktivni amini u hrani predlae propisane dozvoljene koncentracije za histamin (npr. Francuska: 8 mg/L, Nemaka: 2 mg/L) u vinima. Biogeni amini mogu prouzrokovati zdravstvene probleme (Coton i sar. 1998) i izmeniti senzorne karakteristike vina (Lehtonen 1996; Palacios i sar 2004). Heterofermentativne vrste kao to su Lb. higardii i O. oeni, kao i fakultativno heterofermentativne vrste poput Lb. plantarum, oslobaaju amonijum iz arginina.

LAB utiu na ukus vina jer mogu da proizvode siretnu kiselinu, diacetil, acetoin, 2,3-butandiol, etil-laktat, dietil-sukcinat i akrolein. Oni izazivaju smanjenje intenziteta boje i do 30%. U nemakim vinima dozvoljene gornje granice za siretnu kiselinu su 1,08 g/L belog vina, odnosno 1,20 g/L crvenog vina, dok npr. Beerenauslese (prepoznatljiv nemaki kvalitet) moe sadrati i vee koncentracije. Prirodni sadraj siretne kiseline je 0,3-0,4 g/L i postaje od znaaja u senzornim osobinama pri koncentracijama iznad 0,6 g/L. Njeni potencijalni proizvoai su aerobne bakterije siretne kiseline, fakultativno anaerobne heterotrofne bakterije mlene kiseline, kvasci pri oteanim uslovima fermentacije i Botrytis cinerea na inficiranim grozdovima. Fruktoza se redukuje do manitola ili se konvertuje u eritrol i acetat. Heterofermentativne bakterije mlene kiseline mogu da proizvedu vee koncentracije siretne kiseline (> 0,6 g/L), pogotovo u sluaju odsustva pantotenske kiseline (Richter i sar 2001). LAB mogu da konvertuju sorbinsku kiselinu, koja se koristi zbog antifugalih svojstava, u 2-etoksi-3,5-heksadien (miris na geranijum) (Crowel i Guymon 1975). Glicerol se konvertuje do 1,3-propandiola ili alilalkohola i akroleina, to daje gorak ukus (Schtz i Radler 1984a, b). O. oeni dovodi do neprijatnog ukusa od cisteina i metionina. Cistein se transformie u vodonik-sulfid ili 2-sulfanil-etanol, a metionin u dimetil-disulfid, propan-1-ol i 3-(metasulfafnil)-propionsku kiselinu. Oni poveavaju kompleksnost bukea. Takva vina imaju zemljani ukus i ukus crvenog bobiastog voa (Ribreau-Gayon i sar. 2006a, b). Bakterije mlenokiselog vrenja mogu da proizvedu miris koji podsea na mieve (mievina). Neke vrste Lactobacillus kao to su Lb. brevis, Lb. hilgardii i Lb. fermentum proizvode 2-acetiltetrahidropiridin (granica percepcije: 1,6 ng/L) iz etanola i lizina (Heresztyn 1986). Takoe ovom kvarenju ukusa mogu da doprinesu i acetil-1-pirolin i 2-etiltetrahidropiridin (Costello i Henschke 2002). Etil-karbamat, za kojeg se sumnja da je kancerogen, nastaje iz uree i etanola posredstvom O. oeni i Lb. hilgardii (Uthurry i sar 2006).

Proizvodnja polisaharida (Claus 2007) dovodi do uguavanja mota, to dovodi do problema prilikom filtracije. P. damnosus poveava viskozitet, stvara se glukozni homopolimer.


7

Monomerna jedinica koja se ponavlja je -1,3 vezan disaharid glukoze koji nosi -1,2 vezanu glukoznu grupu [3)--D-Glcp-(1,3)-[-D-Glcp-(1,2)]--D-Glcp-)1] (Llaubres i sar 1990; Dueas i sar. 2003). Viskozitet, koji zavisi od brojnih faktora kao to su koncentracija etanola i temperatura, postaje primetan pri 107 CFU.

Bolesti izazvane mlenom kiselinom javljaju se pri visokim koncentracijama eera kada bakterije mlene kiseline rastu tokom alkoholne fermentacije u sredini sa povienim pH vrednostima i niskim sadrajem azota. Mogu se proizvesti vee koncentracije siretne kiseline, to koi aktivnost kvasaca. Najee LAB ne nestaju niti se razmnoavaju za vreme alkoholne fermentacije, osim Oenococci koje preivljavaju i pri veoma niskim CFU. Ustanovljeno je da masne kiseline (heksanoinska, oktanoinska i dekanoinska kisleina) koje oslobaaju kvasci tokom rasta, imaju negativan uticaj na razvoj bakterija (Lonvaud-Fune i sar. 1988). Oenococci mogu da rastu tokom stacionarne faze ili faze odumiranja kvasaca nakon alkoholne fermentacije, kada osloboeni sadraj iz elija kvasaca stimulie bakterijski rast. U ovoj fazi oenococci imaju uticaj na lizis elija kvasaca jer proizvode glukozidaze i proteaze.

Razlaganje eera i kiselina doprinosi mikrobnoj stabilizaciji vina jer se time uklanjaju izvori ugljenika i energije. Niske koncentracije diacetila poveavaju aromatsku kompleksnost. Bakterije mlene kiseline potencijalno proizvode antimikrobne komponente (Rammelberg i Radler 1990; Blom i Mrtvedt 1991) kao to su siretna kiselina, poviene koncentracije CO2, vodonik peroksid, diacetil, piroglutaminska kiselina i bakteriocini koji spreavaju rast drugih vrsta bakterija i kvasaca. Brevicin iz Lb. brevis inhibira rast O. oeni i P. damnosus (Rammelberg i Radler 1990).

Fermentacija jabune kiseline i korienje nutrienata (heksoze i pentoze) kao i produkcija bakteriocina (De Vuyst i Vandamme 1994) dovode do stabilizacije vina.

1.5. Karakteristike rodova i vrsta mleno-kiselih bakterija koje su u vezi sa vinom

1.5.1. Rod Lactobacillus

Lactobacillus je jedan od vanijih rodova u okviru mikrobiologije hrane, imaju ulogu u proizvodnji stone prehrane i ljudskih namirnica, kao i probiotika svojstava. U oktobru 2008. ovaj rod je sadrao ukupno 174 validno opianih vrsta (ukljuujui i podvrste (DSMZ 2008). Vrste roda Lactobacillus su iroko rasprostranjeni na fermentativnom materijalu. Laktobacili doprinose ukusu fermentisane hrane tako to proizvode diacetil, H2S i amine. Oni igraju ulogu kako u proizvodnji, tako i u kvarenju hrane (kiselog kupusa, silae, mlenih proizvoda, mesa, proizvoda od ribe) i pia (piva, vina, sokova) (Kandler i Weiss 1986; Hammes i sar. 1991).

Laktobacili su Gram-pozitivni nepokretni ili slabo pokretni tapii (npr. Lb. mali) koji ponekad mogu imati i formu kokobacila. esto formiraju lance. Tendencija za formiranjem lanaca varira od vrste do vrste, ponekad i meu sojevima. Uglavnom zavisi od faze rasta i pH sredine. Duina i zakrivljenost tapia zavisi od sastava podloge i parcijalnog pritiska kiseonika. Peritrihne flagele se javljaju samo kod nekoliko vrsta, ali se gube prilikom rasta na


8

vetakoj podlozi. Oni su acidofilni i dobro rastu u kiseloj sredini. Maksimalan pH na kojem mogu da rastu je oko 7,2.

Mureinski omota sadri razliite tipove peptidoglikana grupe A (Lys-D-Asp, Orn-D-Asp, Lys-Ala, Lys-Ala2, Lys-Ala-Ser, Lys-Ser-Ala2). Linearni polisaharidni lanci peptidoglikana se sastoje od naizmenino poreanih N-acetilglukozamina (NAG) i N-acetilmuraminske kiseline (NAM), povezanih -1,4-glikozidnom vezom. Oni stvaraju ravan ugljenohidratni kostur (http://e-skola.biol.pmf.unizg.hr/, 2014). Popreno umreavanje nastaje povezivanjem svakog lanca NAM sa 4 odreene aminokiseline (kratkim peptidima), a takvi puoredni tetrapeptidi mogu se meusobno povezivati poprenim peptidnim (pentaglicinskim) mostovima (Slika 1). esto su izuavani i polisaharidi. Tejhojna kiselina vezana za membrane je prisutna kod svih vrsta, dok je za elijski zid vezana samo kod nekih vrsta (Schleifer i Kandler 1972).

Slika 1| ematski prikaz peptidoglikana. eeri su prikazani utom, tetrapeptidi crvenom i pentaglicinski mostovi plavom bojom. (preuzeto sa e-skola.biol.pmf.unizg.hr)

Sadraj G + C u DNK varira od 32 do 53 mol%.

Laktobacili su striktno fermentujui organizmi. ive u anaerobnim uslovima ali mogu i da toleriu kiseonik. Imaju kompleksne nutritivne zahteve za ugljenim hidratima, amino kiselinama, peptidima, masnim kiselinama, derivatima nukleinskih kiselina, vitaminima i mineralima.

Neke vrste poseduju pseudokatalaze neki sojevi mogu da usvajajau porforinoide i oslobaaju katalaze, nitrit-reduktaze i aktivatore citohroma. Energiju dobijaju heterofermentativnom ili homofermentativnom fermentacijom ugljenih hidrata u prisustvu ili odsustvu kiseonika. Kao izvor energije takoe moe da poslui i konverzija karbamil-fosfata u CO2 i NH3 tokom degradacije arginina. Poseduju oksidaze i peroksidaze koje sadre flavin radi izvoenja oksidacije sa kiseonikom kao krajnnjim elektron akceptorom. Putevi za fermentaciju eera su Embden-Meyerhof put u kojem se konvertuje 1 mol heksoze u 2 mol mlene kiseline (homolaktika fermentacija) i put fosfoketolaze (heterolaktika fermentacija) koja rezultuje 1 molom mlene kiseline, etanolom/acetatom i CO2. Piruvat koji nastane tokom fermentacije heksoze moe se konvertovati u laktat, ali isto tako i u druge proizvode kao to su siretna


9

kiselina ili diacetil, etanol i formijat/CO2. U prisustvu kiseonika, laktat se moe konvertovati do piruvata i rezultovati siretnom kiselinom i CO2 ili acetatom i formatom. Konverzija glicerola u 1,3-propandiol uz uee glukoze kao elektron donora prouavana je na Lb. brevis izolovanom iz vina (Schtz i Radler 1984a, b). Homofermentativne vrste poseduju fruktoza-1,6-difosfat (FDP) aldolaze, dok heterofermentativne vrste imaju fosfoketolaze. Fakultativni heterofermentori imaju inducibilne fosfoketolaze. Heterofermentativne vrste mogu takoe da koriste i pentoze kao supstrate. Neke homofermentativne vrste koriste pentoze heterofermentativno (Rodas i sar. 2006).

Saharoza se takoe koristi prilikom formiranja dekstrana pomou dekstran saharaze. Fruktoza moe da poslui kao elektron akceptor, tada kod heterofermentativnih vrsta nastaje manitol. Monomerni eeri i saharidi usvajaju se od strane permeaza ili putem fosfotransferaze. Unutar elija oni se razlau pomou glukozidaze. Galaktoza-6-fosfat iz laktoza-6-fosfata se fermentie tagatoza-6-fosfatnim putem (Kandler 1983). Razlau nekoliko organiskih kiselina kao to su limunska kiselina, vinska ili jabuna kiselina (Radler 1975). Neke amino kiseline se dekarboksiluju do biogenih amina.

U zavisnosti od stereospecifinosti laktat dehidrogenaze ili prisustva inducibilne laktat racemaze, laktat moe imati D(-) ili L(+) konfiguraciju. Laktat dehidrogenaze se mogu razlikovati u pogledu elektroforetske pokretljivosti i kinetikih svojstava. Neki enzimi su alosterini sa FDP i Mn2+ kao efektorima.

esto se mogu nai plazmidi koji su u vezi sa rezistencijom na lekove ili sa metabolizmom laktoze (Smiley i Fryder 1978). Izolovani su fagi dvostrukog lanca DNK (Sozzi i sar. 1981) i pojava lizogenije je iroko rasprostranjena (Yokokura i sar. 1974). Sojevi koji produkuju bakteriocine (laktocini) mogu se nai u homofermentativnim i heterofermentativnim vrstama. Od vrsta koje su izolovane iz mota, Lb. plantarum pripada grupi D (antigen: ribitol tejhojna kiselina), Lb. fermentum grupi F i Lb. brevis grupi E (Archibald i Coapes 1971).

Kombinacija fiziolokih, biohemijskih i molekularnih testova je neophodna kako bi se nedvosmisleno identifikovale vrste roda Lactobacillus (Pot i sar. 1994; Hammes i Vogel 1995). Ukupno 115 validno objavljenih vrsta roda Lactobacillus moe se podeliti u 9 grupa (Yang i Woese 1989; Collins i sar 1991; Hammes i sar. 1991; Hammes i Vogel 1995; Dellaglio i Felis 2005). Od oko 174 opisane vrste/podvrste, 16 je naeno u motu i vinu (Ribreau-Gayon i sar. 2006a, b; Fugelsang i Edwards 2007). Tipska vrsta je Lactobacillus delbrueckii DSM 20074T.

Lb. brevis Morfologija: tapii, 0,7-1,0 x 2,0-4,0 m, pojedinane elije ili u lancima. Rasprostranjenost: mleko, sir, silaa, kiselo testo, stajsko ubrivo, usta, intestinalni trakt ljudi i pacova, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 20054.

Lb. buchneri Morfologija: tapii, 0,7-1,0 x 2,0-4,0 m, pojedinane elije ili u kratkim lancima. Karakteristike: kao to je opisano za Lb. brevis, uz dodatnu fermentaciju maltoze i karakteristino elektroforetsko ponaanje L-LDH i D-LDH. Rasprostranjenost: mleko, sir, biljni materijal, usna duplja, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 20057.


10

Lb. casei Morfologija: tapii, 0,7-1,1 x 2,0-4,0 m. Karakteristike: kao to je opisano za Lb. brevis, uz dodatnu fermentaciju maltoze i karakteristino elektroforetsko ponaanje L- i D-laktat dehidrogenaze (L-LDH i D-LDH.) Rasprostranjenost: mleko, sir, mleni proizvodi, silaa, kiselo testo, stajsko ubrivo, intestinalni trakt ljudi i pacova, usta, vagina, otpaadni mulj, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 20011.

Lb. cellobiosus Lb. fermentum.

Lb. curvatus Morfologija: tapii u obliku zrna pasulja, 0,7 0,9 m x 1,0 2,0 m, u parovima, kratkim lancima ili zatvorenom prstenu, ponekad su pokretni. Karakteristike: LDH se aktivira pomou FDP i Mn2+; racemaza mlene kiseline. Rasprostranjenost: silaa, kiseli kupus i testo, stajsko ubrivo, mleko, mesni proizvodi, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 20019 (podvrsta curvatus).

Lb. delbrueckii Morfologija: tapii, 0,5-0,8 x 2,0-9,0 m, pojedinane elije ili u kratkim lancima. Rasprostranjenost: mleko, sir, kvasci, kaa itarica, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 20072 (podvrsta lactis).

Lb. diolivorans Morfologija: tapii, dimenzija 1,0 x 2,0-10,0 m, pojedinane elije, u parovima ili kratkim lancima. Rasprostranjenost: silaa kukuruza, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 14421.

Lb. fermentum Morfologija: tapii razliiti duina, prenika 0,5-0,9 m, pojedinane elije ili u parovima. Rasprostranjenost: kvasci, mleni proizvodi, kiselo testo, fermentativni biljni materijal, ubrivo, otpadni mulj, usta i feces ljudi, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 20052.

Lb. fructivorans Morfologija: tapii, 0,5-0,8 x 1,5-4,0 m (nekad i do 20 m) pojedinane elije, u parovima, lancima ili dugakim zakrivljenim filamentima. Rasprostranjenost: pokvareni majonez, dresing za salatu, siretni konzervans, pokvareni sake, desertna vina i aperitivi. Tipski soj: DSM 20203.

Lb. heterohiochii Lb. fructivorans.

Lb. hilgardii Morfologija: tapii, 0,5-0,8 x 2,0-4,0 m, pojedinane elije, kratki lanci ili dugakim filamentima. Rasprostranjenost: uzorci vina


11

Tipski soj: DSM 20176.

Lb. jensenii Morfologija: tapii, 0,6-0,8 x 2,0-4,0 m, pojedinane elije ili u kratkim lancima. Rasprostranjenost: vaginalni sekret, krvni ugruci, groani mot/vino. Tipski soj: DSM 20557.

Lb. kunkeei Morfologija: tapii, veliine 0,5 x 1,0-1,5 m. Karakteristike: slaba aktivnost katalaze. Rasprostranjenost: komercijalna vina u kojima se i dalje odvija spora alkoholna fermentacija. Tipian soj: DSM 12361.

Lb. leichmannii Lb. delbrueckii podvrsta lactis.

Lb. mali Morfologija: izdueni tapii, 0,6 x 1,8-4,2 m, pojedinane elije, u parovima ili nepravilnim grupama. Karakteristike: pokretne pomou nekoliko peritrihnih flagela, aktivnost pseudokatalaze na MRS podlozi koja sadri 10% glukoze. Menahinoni sa preteo 8 ili 9 rezidua izoprena. Rasprostranjenost: sok jabuke, cider i mot vina. Tipski soj: DSM 20444.

Lb. nagelli Morfologija: tapii, 0,5 x 1,0-1,5 m. Karakteristike: redukcija nitrata. Rasprostranjenost: delimino fermentisana vina sa sporom alkoholnom fermentacijom Tipski soj: DSM 13675.

Lb. paracasei Morfologija: tapii, 0,8-1,0 x 2,0-4,0 m, pojedinane ili u lancima Rasprostranjenost: mleni proizvodi, silaa, ljudi, kliniki otpad, groani mot/vino Tipski soj: DSM 5622 (podvrsta paracasei).

Lb. plantarum Morfologija: tapii, 0,9-1,2 x 3,0-8,0 m, pojedinane elije, u parovima ili kratkim lancima. Karakteristike: nitrate mogu da redukuju u uslovima limitacije glukoze i pri pH iznad 6,0. Proizvode pseudokatalaze, pogotovo u uslovima limitacije glukoze. Mogue je prisustvo ribitol- ili glicerol-tejhojne kiseline u elijskom zidu. Rasprostranjenost: mleni proizvodi, silaa, kiseli kupus, ukiseljeno povre (turija), kiselo testo, stajsko ubrivo, intestinalni trakt i stolica, otpadni mulj, groa i mot. Tipski soj: DSM 20174.

Lb. trichodes Lb. fructivorans.

Lb. vermiforme Lb. hilgardii.


12

Lb. vini Morfologija: tapii, 0,49-0,82 x 1,36-2,8 m, pojedinane elije, u parovima ili kratkim lancima, pokretne. Karakteristike: homofermentativno koriste ribozu i arabinozu, katalaza negativne, ne proizvode egzopolisaharide od saharoze. Rasprostranjenost: fermentativni groani mot. Tipski soj: DSM 20605.

Lb. yamanashiensis Lb. mali.

1.5.2. Rod Leuconostoc

Leuconostoc vrste dobro napreduju na biljkama, ponekad i u mleku, mlenim proizvodima, mesu, eernoj trsci i drugim namirnicama koje se mogu fermentisati. Jedna vrsta, Lc. mesenteroides, izolovana je iz mota. Ova bakterija nije hemolitika i nepatogena je za biljke i ivotinje (Garvie 1986a). Leuconostoc su heterofermentativne koki bakterije koje produkuju samo D-mlenu kiselinu iz glukoze i ne mogu da proizvode amonijum iz arginina (Bjrkroth i Holzapfel 2003).

elije leukonostoka su sfernog ili lentikularnog oblika, u parovima ili lancima. eeri se fermentiu 6-P-glukonat/fosfoketolaza putem, gde kao krajnji produkti nastaju D-mlena kiselina, etanol/acetat i CO2. Tokom fermentacije jabune kiseline malat se cepa na L-laktat i CO2. elije su neproteolitike i ne redukuju nitrate.

Bakterije rastu na podlozi sa glukozom kao izdueni koki. Mogu se nai kao pojedinane elije, u parovima, ili mogu obrazovati kratke do srednje dugake lance. Na vrstoj podlozi elije su u obliku kratkih tapia.

Leuconostoc imaju dosta zajednikih osobina sa heterofermentativnim laktobacilima (Dellaglio i sar 1995).

Leuconostoc bakterije, pogotovo Lc. mesenteroides, iz saharoze kao supstrata proizvode dekstrane koji su od industrijskog znaaja. Garvie (1960) je podelio Leuconostoc vrste u 6 razliitih gupa prema njihovoj sposobnosti fermntacije 19 ugljenih hidrata. Elektroforetska pokretljivost enzima, npr. LDH, redosled elijskih proteina, elijske masne kiseline, kompozicija baze DNK i homologi niz DNK primenjeni su za diferencijaciju vrsta (Dellaglio i sar. 1995). Mogue je da metabolizam citrata od strane Lc. mesenteroides, podvrste mesenteroides ima veze sa plazmidima (Cavin i sar. 1988). Nisu naene druge fenotipske karakteristike koje su plazmidno kodirane, dok plazmidi bakterija Lactobacillus i Pediococcus kodiraju usvajanje eera, proteinaze, nizin, proizvodnju bakteriocina, rezistenciju na lekove, formiranje sluzi, hidrolizu arginina i rezistenciju na bakteriofage (Dellaglio i sar. 1995).

Leuconostoc bakterije imaju ulogu u organoleptikom kvalitetu i teksturi namirnica poput mleka, putera, sira, mesa i vina. Takoe mogu da dovedu i do kvarenja hrane usled proizvodnje diacetila iz citrata. Ovi sojevi se koriste kao starter kulture u proizvodnji mlenog putera i sira. Iz glukoze proizvode gas, to moe promeniti teksturu fermentisane hrane. Zahvaljujui svom sporom rastu i sposobnosti zakieljavanja sredine, oni predstavljaju


13

manju grupu bakterija mlene kiseline u hrani. Meutim kada su prisutni antibiotski agenti, postaju predominantni. Utiu na organoleptika svojstva vina. Lc. mesenteroides, podvrsta mesenteroides izolovana je iz mota groa tokom alkoholne fermentacije (Wibowo i sar. 1985).

Sadraj G + C u DNK varira od 37 do 41 mol%.

Rod Leuconostoc sastoji se od ukupno 24 vrste, zajedno sa podvrstama (Oktobar 2008, DSMZ 2008). Samo Lc. mesenteroides ima ulogu u vinu i motu. Neke od karakteristika su prikazane u Tabeli 3. Tipina vrsta je Lc. mesenteroides DSM 20343T.

Tabela 3 | Diferencijalne karakteristike vrsta rodova Leuconostoc, Oenococcus i Weissella koje se mogu nai u vinu (Knig i sar. 2008).

Karakteristika Lc. mesenteroides O. oeni W. paramesenteroides Kiselina iz saharoze + - + Formiranje dekstrana + - - Rast pri pH < 3,5 - + n.d. Rast u 10% etanola - + n.d. NAD+-zavisna Glc-6-P-DH + - n.d. Mureinski omota Lys-Ser-Ala2 Lys-Ser2,

Lys-Ala-Ser Lys-Ser-Ala2,

Lys-Ala2 n.d. bez podataka

Lc. mesenteroides podvrsta mesenteroides Morfologija: kokoidne elije u mleku, izdueni kokoidi na podlozi koja sadri glukozu. Pojedinane elije ili u parovima i kratkim do srednjim lancima. esto su tapiaste na vrstim podlogama. Karakteristike: iz saharoze proizvode egzopolisaharide u velikim koliinama (dekstran). Opisani su njihovi fagi (Sozzi i sar. 1978). Rasprostranjenost: silaa, fermentisane masline, mlinovi za eer, meso, mleko, mleni proizvodi, groani mot i vino. Tipski soj: DSM 20343.

1.5.3. Rod Oenococcus

Oenococci su izolovani iz mota i vina (Gravie 1986a). Obrazuju sferne ili lentikularne elije, u parovima ili lancima. Mureinski omota je tipa A. Interpeptidni most se sastoji od Lys-Ala-Ser ili Lys-Ser-Ser. Samo NAD+ slui kao koenzim za glukoza-6-fosfat dehidrogenazu (Bjrkroth i Holzapfel 2003).

Oenococci su odvojeni od roda Lauconostoc na osnovu sekvencijalne analize 16S rDNK (Slika 2.; Dicks i sar. 1995; Schleifer i Ludwig 1995a, b). Samo dve vrste O. oeni i O. kitahareae (Edno i Okada 2006) su opisane i mogu se lako raspoznati. O. kitaharae (tipian soj: DSM 17330T) izolovan je iz ostataka destilovanog komposta japanskog pia sou. L-malat se nee dekarboksilovati do L-laktata i CO2 u prisustvu fermentativnih eera. elije ne rastu u sredini sa pH < 4,5 kao ni u 10% etanola. Sok paradajza ne stimulie rast. DNK sadraj G + C varira od 41 do 43%.


14

O. oeni moe da raste pri pH=3,0 i u sredini sa 10% etanola. U ovim uslovima proizvode se proteini toplotnog stresa i specijalni membranski lipidi (Coucheney i sar. 2005).

Homologija DNK sa ostalim rodovima bakterija mlene iseline je relativno niska, uz neku srodnost sa rodovima Leuconostoc i Weissella (Stiles i Holzapfel 1997). Prepoznatljiva filogenetska pozicija (Slika 2) je usled dosta razliite 16s DNK sekvence, to moe indikovati brz razvoj rRNK (Yang i Woese 1989), to e nije moglo odobriti poreenjem sekvenci gena DNK-zavisne RNK-polimeraze (Morse i sar. 1996). Oenococci se mogu razlikovati od manje acidotolerantnih Leuconostoc vrsta prema usvajanju saharoze. laktoze i maltoze kao supstrata (Garvie 1986a).

O. oeni moe da usvaja heksoze glukozu i fruktozu, dok neki sojevi mogu i trehalozu (Garvie 1986a). L-arginin se razgrauje do CO2, amonijaka i ornitina. O. oeni moe da vri fermentaciju jabune kiseline (Caspritz i Radler 1983), to je takoe ustanovljeno i kod rodova Lactobacillus, Leuconostoc i Pediococcus. Fermentacija jabune kiseline dovodi do nastanka membranskog potencijala i gradijenta protona. Citratni metabolizam O. oeni moe dovesti do stvaranja PMF (Proton Motive Force) uestvovati u odgovoru na stresne uslove (Olgun i sar., 2009). Uz pomo F1F0 ATPaze moe se dobija se energija (Poolman i sar. 1991).

Slika 2 | ematski prikaz filogenetskog stabla bakterija mlene kiseline i srodnih rodova (Axelsson 2004)

Oenococci ispoljavaju visok stepen mutagensti usled izostanka reparacije mismatch gena mutS i mutL (Marcobal i sar. 2008), to moe dovesti do formiranja novih sojeva. O. oeni reaguje na promene u njihovom neposrednom okruenju tako to vre metaboliko reprogramiranje, koje dovodi do poveane otpornosti na elijskom nivou (Wen-ying i Kang Zhen-kui, 2013). Razvijene su specifine metode za brzo detektovanje ili diferencijaciju sojeva O. oeni u motu i vinu (Kelly i sar. 1993; Viti i sar 1996; Zavaleta i sar 1997; Frhlich 2002; Frhlich i Knig 2004; Larisika i sar. 2008). Tokom poslednjih nekoliko godina


15

razvijene su i nove molekularne metode identifikacije O. oeni za njihovu specifinu detekciju u vinu (Marques i sar. 2010). Tipski soj je O. oeni DSM 20252T.

O. oeni Morfologija: sferne, lentikularne elije u parovima ili lancima. Karakteristike: rastu na pH < 3,0 i 10% etanola Rasprostranjenost: mot/vino Tipski soj: DSM 20252T.

1.5.4. Rod Pediococcus

Pediokoki se javljaju na biljnom materijalu, vou i u fermentisanoj hrani. Nepatogeni su za biljke i ivotinje. elije su sfernog oblika i nikad nisu izduene, kao to mogu biti Leuconostoc i Oenococci. Prenik elija je 0,36-1,43 m. Deoba se vri u dva pravca u jednoj ravni. Formiraju kratke lance od parova elija ili tetrada (Garvie 1986b). Pediococcus su homofermentativne LAB koje formiraju tetrade u vinu. Nepokretne su i ne formiraju spore niti kapsule (Simpson i Tachuchi 1995). Murein pripada tipu A, sa interpeptidnim mostom koji se sastoji od L-Lys-Ala-Asp (Holzapfel i sar. 2003).

Fermentiu glukozu Embden-Meyerhof-Parnas putem do DL- ili L-laktata. Mogu da koriste irok spektar ugljenih hidrata kao to su heksoze, pentoze, disaharidi, trisaharidi i polimeri poput skroba. Sve vrste koje su u vezi sa vinom rastu iskljuivu u prisustvu ugljenih hidrata. Za transport glukoze koriste fosfotransferaza sistem (PTS). Vrste koje proizvode DL-laktat poseduju L- i D-LDH. Piruvat moe biti konvertovan do acetoina/diacetila uglavnom od strane P. damnosus. P. pentosaceus i P. damnosus mogu da razgrauju malat. Oni su neproteolitiki i ne redukuju nitrate. Pediokoke su katalaza negativne i ne redukuju nitrate. Neki sojevi P. pentosaceus produkuju pseudokatalaze.

Sadraj G + C u DNK je izmeu 34 i 44%.

Mogu imati plazmide koji kodiraju produkciju bakteriocina i fermentaciju ugljenih hidrata. P. pentosaceus ima tri razliita plazmida za fermentaciju rafinoze, melobioze i saharoze.

Pediococci uestvuju u kvarenju piva (P. damnosus) i uzrokuju neprijatan ukus u vinu usled proizvodnje diacetila. P. halophilus, koji do sada nije pronaen u motu/vinu, koristi se za proizvodnju soja sosa. Pediococci se koriste kao starter kulture u proizvodnji sira i kobasica (P. acidilactici, P. pentosaceus). Igraju ulogu u procesu sazrevanja sira, mogu da proizvode bakteriocin (pediocin) koji moe da sprei kvarenje mesa. P. damnosus je jedan od glavnih uzroika kvarenja piva u toku proizvodnje, jer moe da proizvede diacetil, to daje puterast ukus.

Ove vrste se diferenciraju prema eerima koje fermentiu, hidrolizi arginina i sposobnosti rasta pri razliitim pH vrednostima (4,5-7,0), zatim prema konfiguraciji mlene kiseline koju proizvode (Axelsson 2004) i tipu ribozoma (Satokari i sar. 2000). P. pentosaceus proizvodi pseudokatalaze bez hema (Engessar i Hammes 1994).

Rod Pediococcus sadri 11 vrsta (Oktobar 2008, DSMZ 2008). etiri vrste su naene u motu ili vinu (P. damnosus, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus). Neke karakteristike ovih vrsta date su Tabeli 4. Tipina vrsta je P. damnosus DSM 20331T.


16

Tabela 4 | Diferencijalne karakteristike vrsta roda Pediococcus koje su naene u vinu Karakteristika P. damnosus P. parvulus P. pentosaceus

Mol% G + C 37 42 40,5 41,6 35 39 Rast na: 35 oC - + +

6% NaCl - + + pH= 8,0 - - +

Hidroliza arginina - - + Kiselina iz arabinoze - - +

Pediococci se mogu identifikovati pomou multiplex PCR metode (Pfannebecker i Frhlich 2008).

P. damnosus Morfologija: tetrade Karakteristike: ne fermentiu ribozu, ne hidrolizuju arginin, ne rastu na 37 oC niti na pH=8, iz glukoze produkuju DL-mlenu kiselinu. Rasprostranjenost: pivo i vino Tipski soj: DSM 20331

P. inopinatus Morfologija: tetrade Karakteristike: P. inopinatus se razlikuje od P. parvulus po elektroforetskoj pokretljivosti L- i D-LDH. Rasprostranjenost: fermentisano povre, pivo i vino. Tipski soj: DSM 20285.

P. parvulus Morfologija: tetrade prenika 0,7 x 1,1 m, pojedinane, u parovima, tetradama ili nepravilnim grozdovima. Karakteristike: rastu na pH=4,5 i ne usvajaju laktozu, skrob i pentoze, ne hidrolizuju arginin, produkuju DL-mlenu kiselinu iz glukoze. Rasprostranjenost: biljni materijal, kiseli kupus, fermentisano povre, cider, pivo i vino. Tipski soj: DSM 20332.

P. pentosaceus Morfologija: tetrade Karakteristike: fermentiu pentoze i maltozu, hidrolizuju arginin, rastu na temperaturi do 45 oC, koriste se za inokulisanje polusuvih kobasica, krastavaca, graka ili fermentaciju sojinog mleka i silae. Rasprostranjenost: biljni materijal i vino. Tipski soj: DSM 20336.

1.5.5. Rod Weissella

Na osnovu rDNK analize Lc. paramesenteroides (Lc. paramesenteroides grupa) izvrena je reklasifikacija u W. paramesenteroides. Pet heterofermentativnih laktobacila (Lb. confusus, Lb. halotolerans, Lb. kandleri, Lb. minor, Lb. viridescens) takoe su pripisani rodu Weissella


17

(Collins i sar. 1993; Bjrkroth i Holzapfel 2003). Bakterije iz roda Wissella su sferne, lentikularne ili u obliku nepravilnih tapia. To su heterofermentativne vrste koje proizvode D,L- mlenu kiselinu, dok W. paramesenteroides produkuje samo D-mlenu kiselinu iz glukoze. Izolovani su iz hrane i mesa. Weissella proizvode zelenkaste oksidovane porfirine u mesnim proizvodima tako to akumuliraju H2O2. Rod Weissella sadri 12 validno opisanih vrsta (Oktobar 2008, DSMZ 2008). W. paramesenteroides je jedina vrsta ovog roda koja je izolovana iz mota/vina.

Tipska vrsta je W. viridescens DSM 20410T.

W. paramesenteroides Morfologija: sferne, lentikularne Karakteristike: u uslovima niske koncentracije glukoze mogu da produkuju pseudokatalaze Rasprostranjenost: mot i vino. Tipski soj: DSM 20288T.

1.6. Zakljuak

Bakterije mlene kiseline su iroko rasprostranjene u sredinama sa kompleksnim nutritivnim zalihama kao to je biljni material ili voni sokovi, kao i u ivotinjama. Utiu na aromu, kvalitet, konzistenciju i bezbednost hrane. Od 1900-ih proizvodnja fermentisane hrane i konstantna potranja za starter kulturama bakterija mlene kiseline viestruko je porasla (Myr-Mkinen i Bigret 2004). Oni igraju vanu ulogu u fermentaciji hrane koja sadri eer. Zbog zakieljavanja i proizvodnje inhibitornih komponenti doprinose ouvanju hrane. S druge strane, mogu dovesti do stvaranja neprijatnog ukusa (npr. diacetil) i prouzrokovati sluzavost proizvodnjom egzopolisaharida.

Posebno u severnim oblastima proizvodnje vina, groe moe sadrati visoke koncentracije kiseline sa nepoeljnim organoleptikim svojstvima. Do sada se u proizvodnji vina, u cilju smanjenja sadraja jabune kiseline, uglavnom kao starter kulture koriste O. oeni i ponekad Lb. plantarum.


18

2. PLESNI GROA

2.1. Uvod

Vinova loza moe biti napadnuta brojnim vrstama plesni i njima slinih organizama koji su slini gljivicama, koji napadaju bobice i dovode do gubitka kvaliteta vina i smanjaju ukus. Usled pojave patogena na vinovoj lozi, inficirano tkivo biva uniteno i javlja se nekroza. Kada je velika povrina luka pogoena bolestima vinove loze, smanjuje se koliina vina koja se moe dobiti i opada kvalitet grozdova. Pored lia, veina patogena vinove loze napada i cvasti, grozdove i bobice, to dovodi do smanjenja prinosa. Infekcija bobica rezultuje propadanjem tkiva voke, ali specifini efekti na kvalitet same bobice zavise od faze sazrevanja u kojoj je groe bilo kada je dolo do infekcije. Neki patogeni direktno unitavaju vono tkivo enzimima, drugi ometaju sazrevanje, a brojne plesni proizvode neprijatne ukuse i mikotoksine.

Bolesti vinove loze se pri odreenim uslovima mogu rapidno proiriti, i dovesti do pojave manje ili vie ozbiljnih epidemija. Kako bi se izbegao gubitak kvaliteta i prinosa, patogeni se moraju drati pod kontrolom odgovarajuim tehnikama uzgajanja groa i primenom proverenih fungicida. Pored patogenih plesni koje uzrokuju bolesti vinove loze, bobice kolonizuju i ubikvitarne epifitne plesni koje kao nutrijente koriste eere i amino kiseline koje cure iz bobica.

U optem smislu, patogeni vinove loze se dele u dve glavne grupe, patogeni od velike ekonoske vanosti, koji su dominantni, kao to su Plasmopara viticola, Erysiphe necator i Botrytis cinerea, i one koje se javljaju uglavnom lokalno i povremeno. Pored toga, druge bolesti vinove loze koje su od znaaja, uzrokuju plesni drveta koje uglavnom napadaju okot i grane (Fischer i Kassemeyer 2003). Od svih plesni za koje je dokumentovano da napadaju vinovu lozu, neke se mogu svrstati u bezopasne epifite, dok su druge zapravo antagonisti patogenim plesnima, npr. Trichoderma i Ulocladium (Schoene i Khl 1999; Li i sar. 2003). Spomenuto je da neke plesni produkuju mikotoksine (Tabela 5) koji mogu biti manje ili vie toksini za ljude, a neke mogu da oslobaaju i komponente koje su toksine za kvasce. Pored toga, identifikovan je veliki broj gljivica koje kolonizuju povrinu bobica u razliitim fazama sazrevanja i razvoja groa.

Tabela 5 | Taksonomija plesni izolovanih sa groa, iz mota i vina koje produkuju mikotoksine znaajne za zdravlje ljudi (Serra i sar. 2005)

Takson Mikotoksin Aspergillus ochraceus Ohratoksini Aspergillus alliaceus Aspergillus niger aggregate Aspergillus carbonarius Penicillium verucosum Trichothecium roseum Trihotecin Penicillium expansum Patulin

Konzumiranje hrane koja je visoko kontaminirana mikotoksinima postala je jedan od glavnih uzronika hepatokancera, endemske nefropatije na Balkanu, defekta neuralne cevi i akutnih smrtnih bolesti irom sveta (IARC 1993, Maresca i Fantini 2010). Do danas su razvijene razliite strategije za smanjenje nivoa ohratoksina A (OTA) tokom prerade groa


19

dehidratacijom i u procesu proizvodnje vina (Covarelli i sar. 2012). Bejarano i sar. (2010) doli su do zakljuka da je nivo OTA 24% manji u grou koje je sueno u kontrolisanim uslovima u klimatizovanim komorama u odnosu na ono koje je sueno prirodnim putem na sunevoj svetlosti.

2.2. Peronosporomicete

2.2.1. Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl. & De Toni: plamenjaa vinove loze

Opti aspekti: Plamenjaa je najozbiljnija bolest vinove loze, pogotovo u toplim i vlanim klimatskim uslovima. Na divljim sojevima groa ovo je uroeni patogen, npr. Vitis aestivalis u jugo-istonim delovima Amerike. Evropske sorte Vitis vinifera prvi put su dole u kontakt sa ovim patogenom oko 1878. godine kada su prvi simptomi zabeleeni u oblasti Bordoa. Usled visoke osetljivosti evropskih sorti, plamenjaa vinove loze se rairila tokom narednih par godina i uzrokovala pandemiju na regijama kultivisanja vinove loze irom Evrope. Amerike sorte vinove loze, kao to su Vitis riparia, Vitis rupestris, Vitis rotundifolia i Vitis amurensis pokazale su se kao rezistentnije na ovu bolest u odnosu na Vitis vinifera, to je verovatno mogue zbog due evolucije sa patogenom (Boso i sar. 2014). Plamenjaa se danas javlja u svim regionima gde se gaji vinova loza a koji imaju vlanu i toplu klimu tokom vegetativnog perioda (npr. Evropa, Istona i deo Severne Amerike, Novi Zeland, Kina i Japan). Ukoliko nema padavina u toku prolea i leta, u nekim podrujima se smanjuje irenje ove bolesti (Australija, Kalifornija i ile). Zabeleene su varijacije osetljivosti izmeu razliitih podvrsta V. vinifera, pa ak i meu klonovima iste podvrste (Boso i sar., 2006; Boso i Kassemeyer, 2008; Boso i sar., 2011a; Boso i sar., 2011b; Alonso-Villaverde i sar., 2011a, van Zeller de Macedo Basto Gonalves i sar., 2011; Yu i sar., 2012).

Bolest napada sve zelene delove vinove loze, naroito listove, cvasti i mlade bobice. U zavisnosti od kulture groa i starosti listova, lezije su ukaste i uljaste. Ukoliko su noi vlane, uljaste take i sporulacija se javljaju na donjim delovima povrine lista, vide se kao guste bele tufne. Kasnije na mestima gde se javila sporulacija dolazi do nekroze i lie koje je izrazito inficirano na kraju otpadne. Gubitak listova dovodi do smanjenja akumulacije eera u bobicama i smanjuje otpornost na mraz izdancima i pupoljcima za prezimljavanje. Cvasti i grozdovi sa mladim bobicama su veoma osetljivi, i ukoliko doe do infekcije oni postaju braon, sue se i na kraju otpadaju. Iako bobice vremenom tokom sazrevanja postaju manje osetljive, infekcije drki mogu se proiriti na starije bobice koje zatim postaju suve i braon, bez sporulacije.

Taksonomija: Uzronik bolesti plamenjae vinove loze je Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl. & De Toni, koja pripada Oomycetes i prema trenutnoj taksonomiji, lan je familije Peronsoporomycetes (Dick 2002). Ova familija je drugaija od carstva pravih gljiva (Mycota) i deo je Chromista, kraljevstva u koje se ubrajaju heterogeni mikroorganizmi, izmeu ostalih tu su i autotrofne Chrysophyceae (zlatne alge) i Bacillariophyceae (dijatomeje). Kao i kod svih Chromista elijski zid P. viticola sastoji se od glukana, i formiraju se biflagelarne zoospore. U okviru familije Peronosporomycetes P. viticola pokazuje neke primarne karakteristike Chromista, izmeu ostalog deo ivotnog ciklusa ovog organizma vezan je za vodu. Kao i P. viticola, veina Peronosporomycetes su biljni patogeni, kao to je uobiajeni izaziva kasne plamenjae krompira, Phytophthora infestans.


20

Biologija i epidemologija: P. viticola je biotrofini patogen koji se veoma dobro prilagodio lanovima roda Vitis. Razvija se u kolonizovanom tkivu vinove loze, u obliku tubularnih, viejedarnnih hifa, koje obrazuju glubularnu haustoriju. Haustorija prodire kroz elijski zid i ulazi u spoljanju membranu odakle crpi nutrijente iz elije domaina. Bespolno razmnoavanje odvija se putem sporangija u obliku limuna koje se formiraju na razgranatim sporangioforama tokom noi sa visokom vlagom. Svaka sporangija daje 4 do 10 biflagelatnih zoospora koje se oslobaaju im sporanigije dou u kontakt sa vodom (Kiefer i sar. 2002). Aseksualni razvoj zoospora, kao i vegetativnih hifa je diploidan. Polna reprodukcija poinje leti, kada se razvijaju gametangije. U mukom anteridijumu, kao i u enskoj oogoniji, odvija se mejoza i haploidni nukleus iz anteridijuma spaja se sa onim iz oogonije pri emu se formira diploidna oospora. P. viticola je heterotalusna tako da se oploenje moe desiti samo izmeu dva razliita tipa hifa. Oospora koja je nastala ima debeo zid i prezimljava na opalom liu. Postaje zrela na prolee kada u kontaktu sa vodom klija i formira primarnu sporangiju, koja proizvodi 30-60 zoospora. Klijanje se javlja tokom vegetativnog period od prolea im temperatura bude iznad 10 C do sredine leta, uz to da kia mora obezbediti potrebnu koliinu vlage (Hill 1989). Iz primarne sporangije zoospore se oslobaaju i ire tokom intenzivnih padavina.

Osloboene zoospore, kako iz oospora tako i iz aseksualnih sporangija, kreu se u vodenom filmu koji pokriva povrinu biljke domaina nakon kie i rose, i privruju se oko stoma. Odbacuju svoje flagele i incistiraju se stvarajui elijski zid (Riemann i sar. 2002). Na kraju se iz svake cistine spore pojavljuje infekciona cevica (Slika 3) koja prodire u stome i formira sub-stomalne mehurie u sub-stomalnim pukotinama, gde se iri u primarnu hifu (Kiefer i sar. 2002). Pri optimalnim uslovima, period od oslobaanja zoospore do penetracije je manji od 90 min. Iz sub-stomalnog mehuria hifa raste u meuelijskom prostoru tkiva domaina. Hife se granaju i formiraju micelijum koji kolonizuje tkivo domaina (Unger i sar. 2007). Period od prve infekcije do prve pojave uljastih mrlja period inkubacije, zavisi od temperature i vlanosti. Uglavnom se sporulacija odigrava na kraju inkubacionog perioda, u toku prve noi kada se stvore pogodni uslovi za sporulaciju (Rumbolz i sar. 2002).

Slika 3 | Incistirane zoospore Plasmopara viticola sa penetracionim klinom zakaene za stomu; Low-Temperature-SEM (Kassemeyer H.-H. i Dggelin M., University of Basel)

U pogodnim uslovima, inkubacioni period je veoma kratak i P. viticola moe da sporulie nakon 3 do 4 dana nakon infekcije. im je tkivo domaina potpuno kolonizovano micelijumom P. viticola, poinje sporulacija. Ona zahteva 95100% relativne vlanosti i najmanje 4 sata tame na >12,5 C. Optimalna temperatura za sporulaciju je 1822 C, tako da


21

se pojava bolesti moe uoiti odmah ujutru, nakon tople kine noi kada je najvei prinos sporangija. Na indukciju sporulacije utie period izloenosti sunevom svetlu, ali sporangiofore i sporangije se formiraju samo u toku noi (Rumbolz i sar. 2002).

Na poetku sporulacije formira se sekundarni sub-stomalni mehuri iz kojeg raste hifa iz stome. Nastala hifa se grana i formira tipine sporangiofore (Slika 4). Konano, sporangije se razvijaju na vrhovima grana i oko 7 h nakon poetka sporulacije prisutne su zrele sporangije. Neposredno nakon formiranja, sporangije se odvajaju od sporangiofora i ire se putem vetra. Uslovi za uspenu infekciju mogu se preraunati ukoliko se imaju u vidu odnosi izmeu temperature i perioda vlanosti listova (Huber i sar. 2003).

Slika 4 | Sporangiofore sa sporangijama Plasmopara viticola; Low-Temperature-SEM (Kassemeyer H.-H., Boso S. i Dggelin M., University of Basel)

2.3. Askomicete

2.3.1. Erysiphe necator Schwein. (emend. Uncinula necator (Schw.) Burr) (Erysiphales): prakasta plesan vinove loze

Opti aspekti: Prakasta plesan vinove loze javlja se u vinogradima irom sveta i uzrokuje ozbiljne gubitke u prinosu i kvalitetu, pogotovo u toplim i suvim klimatskim uslovima. Ova bolest vinove loze je potekla iz Severne Amerike, u Evropi je prvi put detektovana sredinom XIX veka. Bolest se proirila u Evropi za relativno kratko vreme i postala je ekonomski znaajna epidemija. Nakon otvaranja pupoljaka, prvi simptomi su vidljivi kao bele ili sive prakaste mrlje na listovima i vrhovima izdanaka, koji bivaju uvijeni i zguvani, u fazi od 3 do 6 listova. Simptomi prisustva E. necator javljaju se samo ako se infekcija odigrala u roku od 2-3 nedelje nakon cvetanja (Gee i sar. 2008). Ovi uvijeni izdanci javljaju se na osetljivim sortama kao to su Chardonnay, Cabernet Sauvignon, Carignane, Portugieser, Vernatsch (Trollinger). Mladi listovi, cvasti i mlade bobice su veoma osetljive neposredno nakon cvetanja, mada stariji listovi i bobice sve do poetka sazrevanja takoe mogu biti inficirani (Ficke i sar. 2002). Mladi listovi i bobice mogu biti potpuno prekrivene belim prakastim tufnama, dok se na starijim listovima mogu uoiti male kolonije na gornjoj strani lista. Inficirani listovi ostaju zeleni tokom dueg vremenskog perioda ali je njihova funkcionalna efikasnost smanjena. Vrhovi izdanaka, cvasti i mladi grozdovi takoe bivaju prekriveni beliastim ili sivkastim mrljama. Inficirane cvasti postaju zguvane i nekrotiu.


22

Izdanci postanu zakrljali a lie pouti. Kao rezultat ometenog razvoja koice na bobicama koje su inficirane, javljaju se pukotine na koi od stadijuma kada su bobice veliine graka. Te pukotine predstavljaju ulaz za sekundarne invazivne vrste kao to su kvasci i bakterije koji produkuju siretnu kiselinu (Slika 5). Bobice koje su potpuno narasle mogu biti inficirane na poetku procesa sazrevanja. Sa ovim kasnim infekcijama one e sazreti ali micelijum prakaste trulei utie na kvalitet vina jer ima ukus na bu. Pored toga, patogen prodire kroz kou bobica i olakava stvaranje infekcije gomilastom trulei.

Taksonomija: Izaziva prakaste bui vinove loze, Erysiphe necator Schwein. (emend. Uncinula necator (Schw.) Burr) je Ascomycete koja pripada Erysiphales koja obuhvata irok spektar biljnih patogena (Blanger i sar. 2002). Kao i kod svih Ascomycetes, elijski zid E. necator sastoji se od hitina, polimera N-acetilglukozamina.

Slika 5 | Infekcija bobice Erysiphe necator plesni sa procepom koice

Biologija i epidemologija: Kao i sve prakaste plesnive gljivice, E. necator je biotrofna plesan sa ogranienim izborom biljaka domaina, inficira samo vinovu lozu (Vitis). Gljivica raste epitelno na epidermisu zelenog tkiva biljke, formirajui micelijum. E. necator prezimljava kao hifa skrivena u pupoljcima, ili u obliku askospora na plodovima (Rgner i sar. 2002; Rumbolz i Gubler 2005). I hife koje prezime, i askospore deluju kao primarni inokulum. Tokom formiranja zimskih pupoljaka u prolee, hife kolonizuju unutranje delove pupoljka i ostaju sakrivene sve do sledeeg prolea. Nakon cvetanja, hife koje su prezimile kolonizuju mlade listove i izdanke, formirajui manje ili vie upadljive zguvane izdanke. Prakasti omota na ovakvim uvijenim listovima uglavnom se sastoji od konidiofora sa lancima konidija (Pearson i Goheen 1988; Agrios 1997). Askospore se formiraju nakon kariogamije u askogenim hifama, tokom toplih i suvih vremenskih uslova u kasnom letu i jeseni. E. necator je heterotalusna i da bi dolo do polnog razmnoavanja moraju se spojiti dva razliita tipa hifa.

Askospore se nalaze u askusu ugraene su u kleistotecije. One imaju kukaste dodatke koji im omoguavaju da se zakae na telo voke, odn. koru. U prolee, tokom padavina, kleistotecije se otvaraju i pomou specijalnog mehanizma askospore se izbacuju iz askusa. Askospore se kao i konidije aktivno vezuju za povrinu biljke domaina i klijaju pri optimalnoj temperaturi izmeu 20 i 27 C u roku od 4 sata (Rumbolz et al. 2000). Nije neophodna voda za njihovo klijanje, ali poviena relativna vlanost vazduha pospeuje ovaj proces. Cevica klice formira apresorijum koji ojaava kaenje patogena za epidermis domaina (Slika 6). Ispod


23

apresorijuma, penetraciona kuka prodire kroz kutikulu i elijski zid (Rumbolz i sar. 2000). Na vrhu penetracione kukice, formira se haustorijum koji prodire u epidermis elije i crpi nutrijente iz domaina. im se obezbedi izvor nutrijenata, druga hifa se pojavljuje iz konidije i tako zapoinje kolonizacija domaina. Temperature od 18 do 28 C pospeuju rast hifa i formiranje micelijuma. U toku narednih 56 dana formiraju se konidiofore koje rastu pod pravim uglom sa povrine domaina. Sa bazalne elije konidiofore razvijaju se konidije koje se zatim permanentno odsecaju. Konidije su prilagoene na prenoenje putem vetra i ire se na velikim razdaljinama. Visoke temperature i vlaga u toku noi pogoduju produkciji velikog broja konidija. U veini sluajeva, epidemije poinju na prolee, usled infekcija askosporama ili se javljaju uvijeni izdanci kada se otvori 3 do 6 listova. Zbog visoke osetljivosti mladih listova, cvasti i mladih bobica u toplim i suvim uslovima incidenca bolesti i ozbiljnost infekcije rastu i do stadijuma bobica (Ficke i sar. 2002).

Slika 6 | Proklijale konidije Erysiphe necator na povrini lista vinove loze; LTSEM (Low Temperature-SEM) (Rumbolz, J., Kassemeyer H.-H., Dggelin M. i R. Guggenheim, University of Basel)

2.3.2. Botrytis cinerea Pers.: Fr. (Helotiales): gomilasta trule botritisa

Opti aspekti: Botrytis cinerea je fitopatogen od ekonomskog znaaja koji uzrokuje truljenje brojnih useva, voa i ukrasnog bilja. U sluaju vinove loze B. cinerea moe dovesti kako do velikih gubitaka tako i do poboljanja kvaliteta. Da li e nastati oteenje ili profit zavisi ne samo od stepena sazrevanja u kom se nae groe prilikom zaraze, ve i od vremenskih uslova. U suvim i toplim klimatskim uslovima inficiranje zrelih bobica moe poboljati kvalitet, pogotovo u kulturama belog groa. U tom sluaju sadraj iz groa se koncentrie usled prodora gljivice kroz koicu. Pored toga, B. cinerea proizvodi glukonsku kiselinu koja doprinosi istananosti ukusa vina. Kao posledica, kasne infekcije zrelih bobica poboljava se proizvodnja desertnih vina kao to su Trockenbeerenauslesen, Sauternes i Tokay. S druge strane, ukoliko se infekcija groa javi u ranoj fazi sazrevanja, u kombinaciji sa dugotrajnom vlagom na grozdovima, smanjuje se kvalitet, tj. dolazi do propadanja bobica. Invazija moljaca na grozdove poveava anse za stvaranje gomilaste trulei jer mesta na kojima se larva hrani na bobicama predstavljaju otvore za ulaz B. cinerea. Na poetku infekcije B. cinerea, bobice belog groa postaju obojene od svetlo ruiaste do svetlo braon, dok bobice crnog groa menjaju boju u nijanse od crvene do ljubiaste. Kasnije se pojavljuje svetlo sivi micelijum na povrini (Slika 7), da bi u naprednoj fazi infekcije bobice


24

postale braonkaste i trule. Na inficiranim bobicama B. cinerea proizvodi velike koliine lakaza koje oskidiu antocijane i flavonoide do smeih produkata oksidacije. Lakaze su veoma stabilne i mogu dospeti u mot i vino gde se kao rezultat javlja smea boja vina i crvena vina posebno gube svoju karakteristinu boju. Morales-Valle i sar. (2011) ispitivali su efekte samog porekla B. cinerea i u kombinaciji sa Penicillium expansum, na zemljastu aromu vina iz panije i Portugala.

Slika 7 | Gomilasta trule uzrokovana B. cinerea; konidiofore se uzdiu iz pora i pukotina na koici trulih bobica i stvaraju sive jastuie

Taksonomija: telemorfna Botrytis cinerea Pers.: Fr., Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel spada u Heliotales (Ascomycetes). B. cinerea javlja se uglavnom u svom anamorfnom obliku, dok je teleomorfna B. fuckeliana veoma retka (Gams i sar. 1998; Elad i sar. 2004).

Biologija i epidemologija: B. cinerea je ubikvitarna i ima irok spektar biljaka domaina. Gljivica moe da ivi saprofitno na organskom otpadu i da proizvodi sklerocije u cilju dugoronog preivljavanja. B. cinerea prezimljava i kao micelijum i kao sklerocija na granicama i drkama lia koje se nalaze na zemlji. Konidije koje se produkuju na sklerocijama tokom perioda povienih temperatura u toku ranog prolea smatraju se izvorima glavnog inokuluma. Konidije su kratkoivei oblici razmnoavanja tokom sezone, ire se putem vetra, kie i insekata. Na povrini biljke koja je domain, konidije klijaju 1-3 sata nakon inokulacije formirajui razliite strukture za penetraciju. U prisustvu eera cevice klica B. cinerea proizvode apresorijum (Elad i sar. 2004). Kako bi prodrle u tkivo domaina B. cinerea radije prolazi kroz rane i prirodne otvore, npr. specijalne strukture na cvetovima kroz koje se dopremaju eeri i drugi nutrijenti (Keller i sar. 2003; Viret i sar. 2004).

Kada spore proklijaju na cvetnom tkivu cvasti ili kasnije u toku sezone na bobicama koje sazrevaju, B. cinerea moe da pree iz saprofitnog u nekrotropni nain ivota. Ova plesan proizvodi razne enzime poput lipaza, pektinaza i kutinaza koje omoguavaju patogenu da prodre u epidermis tkiva domaina. Penetracija B. cinerea u tkivo domaina voena je kuteolitikim enzimima koji pokreu programiranu smrt elije u epidermisu i osnovnim elijama pre nego to se dogodi invazija hifa na njih. Proteini efektori B. cinerea koji deluju kao patogenski faktori i uestvuju u indukciji elijske smrti, olakavaju invaziju i neophodni su za uspenu infekciju. Tako da je patogen sa njima u stanju da zavre bolest i zaokrue svoj ivotni ciklus (Elad i sar. 2004).


25

Cvetovi su podloni infekciji jer aica cveta predstavlja prirodni otvor i izvor eera koji olakava kolonizaciju cveta od strane patogena (Keller i sar. 2003; Viret i sar. 2004). Poveana osetljivost bobica koje sazrevaju oslanja se na nekolilko faktora: (1) odbrana domaina, npr. ekspresija stilbena slabi usled sazrevanja koje je u toku, (2) koliina fugistatskih proantocijanidina smanjuje se nakon poetka sazrevanja, (3) struktura kutikule i epidermisa menja se sa odmaklim sazrevanjem semena i stvaraju se mikro pukotine koje omoguavaju curenje eera (Kretschmer i sar. 2007). Klijanje konidija, rast cevice klica, prodiranje i kolonizacija tkiva domaina najvaniji su procesi infektivnog ciklusa. Klijanje konidija i infekcije javljaju se pri uslovima veoma visoke relativne vlanosti vazduha (>94%) ak i na suvim bobicama; mada dugi periodi vlage doprinose razvoju B. cinerea i raste incidenca bolesti.

Slika 8 | Prva faza razvoja Botrytis cinerea 17 h nakon inokulacije, Low-Temperature-Scanning-Electron-Microscopy (Jger, B., Jackw, J., Kassemeyer H.-H. i Dggelin M., University of Basel)

Na temperaturi 2024 C i u prisustvu vlage, cevice klica se mogu videti ve nakon 48 h, i pri takvim uslovima hife rastu i do 4 mm dnevno (Slika 8). Nakon prodiranja u tkivo domaina hife rastu i granaju se, tako se formira gust sivi micelijum na kojem se obrazuju konidiofore sa konidijama (Person i Goheen 1988; Agrios 1997). Klijanje konidija i rast micelijuma sa formiranjem konidija takoe se mogu javiti i pri niim temperaturama ak do 5C, ali se u tim uslovima stvaranje infekcije i razvoj patogenosti odlau. Epidemije sa ozbiljnim infekcijama i visokom incidencom bolesti javljaju se u uslovima uestalih padavina nakon poetka procesa sazrevanja.

2.3.3. Pseudopezicula tracheiphila (Mll.-Thurg.) Korf & Zhuang (Helotiales): crvena pale lia

Opti aspekti: Crvena pale lia je lokalno ogranien i javlja se uglavnom u vinogradima na toploj klimi sa preteno kamenitim zemljitem. U nekim podrujima bolest dovodi do velikih gubitaka na godinjem nivou, dok se u drugim javlja samo sporadino ili se ne javlja uopte. Lezije na listovima su u poetku ute na belom grou i svetlo crvene do crvenkasto-smee na sortama crnog groa. Zatim se crvenkasto-braon nekroze razvijaju u centru lezije, ostavljajui samo malu marginu utog ili crvenog tkiva izmeu nekroze i zelenog dela lista. Lezije su uglavnom ograniene na glavne ile i ivicu lista, iroke su nekoliko centimetara. Rane infekcije javljaju se na prvom do estom listu mladih izdanaka, to rezultuje manjim


26

gubicima. Kasne infekcije napadaju listove sve do 10 ili 12 pozicije na izdancima, to rezultuje ozbiljnim unitavanjem listova. Pored toga, plesan napada cvasti i bobice, i uzrokuje njihovo truljenje i isuivanje (Mohr i sar. 2005).

Taksonomija: Gljivica koja uzrokuje crvenu pale lia, Pseudopezicula tracheiphila (Mll.-Thurg.) Korf & Zhuang (syn. Pseudopeziza tracheiphila Mll.-Thurg.) pripada telemorfnoj Phialophora tracheiphila (Sacc. & Sacc.) Korf od Helotiales (Ascomycetes) (Korf i sar. 1986).

Biologija i epidemologija: Izvorni inokulum bolesti na prolee jesu askospore koje se polnim putem formiraju u askusu. P. tracheiphila ima dva tipa razmnoavanja koji pokazuju bipolarni heterotalusni sistem razmnoavanja. Apotecije koje se formiraju uglavnom na opalom liu u prolee, imaju askus sa askosporama. Apotecije se mogu formirati i na listovima koji su inficirani u tekuoj sezoni, tokom kasnog leta ili jeseni. U zavisnosti od vremenskih uslova, apotecije sa zrelim askosporama mogu biti prisutne tokom sezone (Perarson i sar. 1991). Primordijum kod apotecija sazreva im temperature porastu na kraju zime. Razvoj apotecja zahteva dovoljnu vlagu na opalom liu. Pod toplim i vlanim uslovima askospore se oslobaaju i pre nego to se sam pupoljak otvori. Velike koliine padavina i produena vlanost zemljita doprinose stvaranju infekcije i dovode do nastanka ozbiljnih bolesti. Mladi listovi su podloni infekciji nakon to dospeju na visinu od oko 5 cm, ali se verovatnoa stvaranja infekcije poveava nakon stadijuma od 6 listova. Nakon inkubacionog perioda od 2 do 4 nedelje, plesan napada vaskularne elemente na inficiranim listovima, to dovodi do pojave simptoma bolesti (Reiss i sar. 1997).

Plesan ostaje latentna ukoliko nije u mogunosti da napadne elemente sudova, u tom sluaju moe se izolovati i sa listova koji ne pokazuju nikakve simptome oboljenja. Uslovi koji su neophodni da bi gljivica napala vaskularni sistem nisu dovoljno poznati, ali ini se da su zemljite i snabdevenost vodom, koji iszazivaju privremeni stres kod loze, bitni faktori. Incidenca i zbiljnost bolesti zavise od koliine apotecija na opalom liu koje se nalazi na zemljitu vinograda, i od osloboenih askospora. Praenje oslobaanja askospora sredstvima za hvatanje spora omoguava prognoziranje razvoja bolesti. Na sladnom agaru mogu se formirati anamorfni oblici, sa hijalinom, septama i kratkim konidioforama koje su grublje nego kod vegetativnih hifa. Konidiogene elije su pljosnatog oblika, sa dobro definisanim okovratnikom tankog zida. Konidije su jednoelijske, elipsoidne, od hijalina. Hife rastu karakteristiano sinusoidno, to slui za dijagnostikovanje bolesti kada se posmatraju ile obolelih listova.

Bolest koja je veoma slina ovoj, zove se ugaona pale lista opisana je u Njujorku (Person i sar. 1988). Plesan koja izaziva ugaonu pale lista u Severnoj Americi proizvodi manje apotecije nego P. tracheiphila, i askusi su oblika iroke palice produkuju 4 spore, nasuprot plesni iz Evrope koja ima 8 spora. Amerika verzija je opisana kao posebna vrsta, P. tetraspora Korf, Pearson & Zhuang (anamorfni Phialophora-tip).

2.3.4. Phomopsis viticola (Sacc.) Sacc (Diaporthales): fomopsis i crna pegavost (eskorioza)

Opti aspekti: Pojava Phomopsis na drci i pege na listovima prvi put su uoeni u Kaliforniji 1935. a rairile su se irom Evrope tokom vie od 50 godina. Stvarni gubitak na kvalitetu usled bolesti u veini godina je neznatan. Mada, kada su kina prolea, javljaju se znaajne


27

infekcije koje uzrokuju nastanak lezija na mladicama. Dodatno, infekcije mladica utiu na formiranje osnove cveta i lista, i kao posledica te godine ne dolazi do listanja. Uestale infekcije utiu na plodnost bazalnih delova drke i skrauju ivotni vek vina. U hladnijim i kinim uslovima tokom sazrevanja bobica, infekcije se javljaju samo povremen. Prvi simptomi na mladicama su tamno braon do crne tufne koje se mogu videti u stadijumu kada mladica ima 3 do 6 listova. Te takaste mrlje se izduuju i kora puca usled sekundarnog rasta izdanaka. Veliki broj taaka na bazama izdanaka postaje krastav i crn. Izdanci koji su teko inficirani mogu ostati zakrljali i na kraju umiru. Tokom zime, inficirane grane pobele i pojavljuju se crne takice. Infekcije grozdova dovode do stvaranja crnih taaka na drci. Ali te lezije se inaktiviraju u procesu sazrevanja grozdova. Kie u jesenjem periodu u retkim sluajevima reaktiviraju lezije i uzrokuju infekcije bobica. Inficirane bobice imaju braon takice koje se brzo uveavaju i uzrokuju stvaranje gomilaste trulei.

Taksonomija: Phomopsis viticola (Sacc.) Sacc. (Sphaeropsis viticola Cooke) pripada redu Diaporthales (Ascomycetes). Telomorfizam kod roda Diaporthe je, prema dosdanjim saznanjima, veoma redak u kulturama za proizvodnju vina (Agrios 1997; Gams i sar. 1998).

Biologija i epidemologija: Ph. viticola prezimi na inficiranim drkama, a crne pustule koje se javljaju na pobelelim drkama tokom perioda hibernacije su piknidije (Slika 9) u kojima se razvijaju piknospore. Infekcije se uglavnom jaljaju na prolee im sazreju piknospore u piknidijama i kad izbiju zelene mladice. Tokom kinih perioda piknospore izlaze u velikim koliinama iz piknidija koje su ugraene u crvolike rese. Piknospore (Slika 10) se ire prskanjem kapljica kie na mladice koje klijaju, a infekcija se javlja ukoliko se voda due vreme zadri na zelenom tkivu biljke. Prolongirana vlanost mladica i mladih izdanaka iz pupoljaka izaziva raspadanje u fazi kada imaju 6 listova, favorizujui infekciju Ph. viticola. Broj bazalnih pupoljaka koji se inficiraju gljivicama varira u zavisnosti od uestalosti padavina i vlanosti zemljita na kojem raste. Nakon infekcije, micelijum raste u zaraenom tkivu domaina, ali uglavnom se kolonizuju izdanci i pupoljci. Tokom leta Ph. viticola je manje aktivna, ali ukoliko je jesen vlana micelijum se moe reaktivirati te je tako mogua i infekcija bobica (Agrios 1997; Mohr i sar. 2005).

Slika 9 | Drka sa Phomopsis viticola pyknidia Slika 10 | Piknospore Phomopsis viticola i hife sa karakteristinim septama; Diferencijalni kontrast (63x)


28

2.3.5. Elsino ampelina Shear (Myringiales): antrakoza

Opti aspekti: Antrakoza se u ranijim vremenima rairila po evropskim vinogradima i pre nego to je plamenjaa identifikovana kao najopasnija bolest vinove loze. Zahvaljujui redovnoj upotrebi fungicida danas se antrakoza javlja samo sporadino u uslovima veoma visoke vlanosti u netretiranim vinogradima. Inficirani izdanci pokazuju svetlo braon mrlje sa crno-ljubiastim ivicma. Crne krune lezije javljaju se na listovima koji su u stadijumu nekroze i vremenom prerastaju u male rupe. Bobice koje su zaraene imaju ulubljene krune lezije sa crno-ljubiastim ivicama (ptiije oi) koje pucaju i na kraju se raspadaju. Infekcije drke uzrokuju nekrozu grozda uz pojavu ptiijih oiju na stabljici (Mohr i sar. 2005). Infekcije izdanaka i listova smanjuju snagu vina, prinos i kvalitet, i skrauju ivotni vek biljke. Trule bobice se moraju ukloniti jer mogu uticati na kvalitet mota i vina (Magarey i sar. 1993; Sosnowski i sar. 2007).

Taksonomija: Plesan koja uzrokuje antrakozu, Elsino ampelina Shear (sin. Gloesporium ampelophagum (Pass) Sacc., Ramularia ampelophagum Pass., Sphaceloma ampelinum de Bary) pripada familiji Elsinoaceae koja sadri 10 rodova (Gams i sar. 1998). Elsinoaceae i Myrangiaceae zajedno spadaju u red Myrangiales koji pripada veoj klasi Dothideomycetes (Ascomycetes).

Biologija i epidemologija: E. ampelina prezimi kao sklerocija na drkama koja se formira tokom jeseni na lezijama izdanaka. Sklerocije razvijaju strome na kojima se, usled vlanih uslova, formiraju acervule u obliku koljke iz kojih na prolee izlaze konidije (Agrios 1997). Konidije su prekrivene elatinoznim slojem i obezbeuju primarni inokulum na poetku vegetativnog perioda. Konidije se ire usled kie, a za njihovo klijanje neophodna je vlanost povrine na kojoj se nalaze u toku 12 h. U vreme sazrevanja plodova formiraju se askusi i askospore se stvaraju na lezijama. Razmnoavanje se pospeuje tokom padavina, tako da se bolest moe javiti na manje ili vie udaljenim takama u vinogradu (Brook 1992).

2.3.6. Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz (Dothideales): crna bu

Opti aspekti: Crna bu koju uzrokuje Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz [anamorf: Phyllosticta ampelicida (Engleman) Van der Aa], je jedna od najvanijih bolesti groa na svetu (Molitor i Berkelmann-Loehnertz, 2011). Poreklom je iz Severne Amerike, a u Evropi je zabeleena poslednjih 30-ak godina. Ova bolest uglavnom se avlja na naputenim vinogradima, kao i na rezistentnim kulturama groa koje se koristi za proivodnju vina i nije tretirano fungicidima. Danas se crna trule u nekim regionima ni ne pojavljuje, ali ukoliko se posmatra ira slika, ova bolest je sve uestalija. Tipini simptomi su svetlo braon nekrotine lezije na listovima, sa crnim obodima, dostiu prenik i do 10 mm. Unutar nekrotinih delova nalaze se crne takice koje su jedva vidljive golim okom. Na izdancima, drkama grozdova i listova javljaju se ulegnute crne lezije. Inficirane mlade bobice prvo dobijaju blede tufnice koje vremenom rstu u koncentrinim crvenosmeim lezijama. Za par dana inficirana bobica postaje plavo-crna i prekrivena crnim takicama (Slika 11). Na kraju se bobice konano smeuraju i sue, ali ostaju privrene za drke. esto se od par inficiranih bobica moe inficirati i ceo grozd. Velika uestalost pojave crne trulei moe unititi lie celog stabla i kao rezultat dovesti do znaajnog gubitka kvaliteta groa. Infekcije grozdova imaju uticaj na kvalitet bobica i takvo groe nije pogodno za prozvodnju vina (Pearson i Goheen 1988; Mohr i sar. 2005).


29

Taksonomija: Crnu bu izazivaju Guignardia biwellii (Ellis) Viala & Ravaz (syn. Greeneria uvicola (Berk. & M.A. Curtis) Punith., Botryosphaeria bidwellii (Ellis) Petr.) koji pripadaju Dothideales redu u sklopu Dothideomycetes (Ascomycetes) obuhvatajui i neke druge fitopatogene kao to su Ascochyta, Didymella, Botryosphaeria i Phoma (Agrios 1997; Gams i sar. 1998).

Slika 11 | Bobica inficirana crnom bui (Guignardia bidwellii)

Biologija i epidemologija: G. bidwellii moe preko zime da opstane na grozdovima koji su potpuno prekriveni gljivicom, kao i na drkama. Askusi sa askosporama se na prolee razvijaju u peritecije na zaraenim grozdovima. Askospore se aktivno izbacuju iz askusa i raznose vetrom tokom perioda malih koliina padavina. Za klijanje askospora neophodna je produena vlanost povrine domaina. Sva mlada tkiva vinove loze, ukljuujui izdanke, cvasti i bobice, mogu biti inficirana. U poetku je te infekcije teko primetiti, ali uz progresivni razvoj gljivica, mogu se vremenom uoiti nekrotine take, koje se razvijaju u nekrotine lezije. Unutar nekrotinih lezija na listovima, izdancima i bobicama, razvijaju se piknidije sa piknosporama u toku sezone. Piknospore se oslobaaju u kinom periodu i inficiraju groe. U kasno leto inicira se polni ciklus razmnoavanja na inficiranim bobicama i formiraju se peritecije koje prezimljavaju na grozdovima koji su potpuno prekriveni plesnima (tzv. mumificirani grozdovi) (Jermini i Gessler 1996; Hoffman i sar. 2002; Longland i Sutton 2008).

2.3.7. Penicillium expansum Link (Eurotiales): zelena trule

Opti aspekti: Zelena trule je sekundarna bolest koja se javlja na zrelim bobicama, nakon njihovog oteenja ili inficiranja gomilastom trulei. Javlja se u toplim i vlanim godinama, kada groe prevremeno dospe u fazu sazrevanja. U poslednje vreme se incidenca pojavljivanja zelene bui poveala, to bi se moglo objasniti visokim letnjim temperaturama i estim padavinama tokom sazrevanja grozdova. Beli jastuii koji se javljaju na obodu raspuklina, uveavaju se i menjaju boju u zelenkastoplavu (Slika 12). Inficirane bobice omekavaju i menjaju boju u maslinasto zelenu do svetlo braon. U poodmakloj fazi infekcije bobice propadaju i skupljaju se u suvim uslovima. Usled meusobnog stiskanja grozdova i tako nastalih oteenja, pojava zelene bui je ea kod zbijenih i zatvorenih grozdova. Kod takvih grozdova mogu se nai itava gnezda propalih bobica (Mohr i sar. 2005). Tako da su sorte sa zbijenim granicama podlonije infekciji od onih sa rastresitim granama. Pored toga,


30

u godinama kada je visok prinos gusto zbijenih grozdova, zelena bu se ee javlja. Od jedne inficirane bobice moe se zaraziti itav grozd i na kraju dolazi do potpunog prekrivanja grozdova zelenom bui. Zelena bu produkuje mikotoksine (Abrunhosa i sar. 2001; La Guerche i sar. 2004; Serra i sar. 2006; Pardo i sar. 2006) npr. patulin koji se razgrauje tokom fermentacije i sulfurizacije. Bobice koje su zaraene zelenom bui imaju neprijatan ukus, ak i ako se nau u malom broju, daju vinu ukus na bu. Pored toga, Morales-Valle i sar. (2011) dokazali su da Botrytis cinerea moe da indukuje proizvodnju geosmina u P. expansum na grou koji u vinu stvara neprijatan ukus zemlje.

Taksonomija: Za stvaranje zelene bui odgovoran je uglavnom Penicillium expansum Link; ali i druge vrste roda Penicillium se takoe mogu detektovati na zaraenim bobicama (Serra i Peterson 2007). Rod Penicillium smatra se lanom Deuteromycotina ali prema trenutnoj taksonomiji pripadaju Eurotiales (Ascomycetes) (Ag

Documents

Bakterije Mlečne Kiseline, Plesni i Fagi Iz Grožđa i Vina