Bao Cao Muoi

DANH SÁCH BẢNG

Hình Tên hình Trang

Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic .........................................4

Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt một số loài của chi Lactobacillus ......................6

Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt một số loài Pediococcus ............................10

Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm ....................................23

Bảng 3.2 Thành phần môi trường MRS rắn/Lít ..............................................27

1

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tên hình

Trang

Hình 1.1 Hình thái tế bào của Lb. axitophilus và Lb. plantarum ...................5

Hình 1.2 Hình thái tế bào của Leuconostoc mesenteroides .............................8

Hình 1.3 Hình thái tế bào của Pediococcus halophilus và Aerococcus

urinaeequi....................................................................................................... 9

Hình 1.4 Hình thái tế bào của Bifidobacterium .............................................11

Hình 3.1. Hình thái tế bào và nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic sử

dụng trong thí nghiệm ....................................................................................24

Hình 4.1. Thời gian tăng OD 0,3 của các chủng vi khuẩn lactic trong môi

trường MRS có 0,3% muối mật .....................................................................33

Hình 4.2. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic ở pH 2 .............36

Hình 4.3 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC1 trên đĩa

peptri .............................................................................................................38

Hình 4.4 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC2 trên đĩa

peptri...............................................................................................................39

Hình 4.5 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC5 trên đĩa

peptri...............................................................................................................40


peptri...............................................................................................................41


peptri ..............................................................................................................42

Hình 4.8. Đường cong tăng trưởng của chủng MC9 .....................................43

Hình 4.9. Trình tự một đoạn gen rDNA 16S của chủng MC9 và Lactobacillus

fermentum SFCB2-3 ......................................................................................45

Hình 4.10. Cây phân loại dựa trên trình tự rRNA 16S ..................................46

2

CÁC TỪ VIẾT TẮT

Lb Lactobacillus

Lc Lactococcus

MRS Man, Rogosa, Sharpe

CFU Colony Forming Unit

WHO World Health Organization

FAO Food and Agriculture Organization

OD Optical Density

3

MỤC LỤC

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU ........................................................................................1

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................3

2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic.....................................................................3

2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn..................................................3

2.1.2 Các nhóm vi khuẩn lactic ........................................................................3

2.1.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic ...............................................................12

2.2 Hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của người ........................................12

2.2.1 Đặc điểm chung của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người ....................12

2.2.2 Chức năng các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường tiêu hóa người 13

2.3 Tổng quan về probiotics ..........................................................................14

2.3.1 Khái niệm probiotics .............................................................................14

2.3.2 Những tính chất có lợi của probiotics ...................................................16

2.3.3 Các tiêu chuẩn sàng lọc một chủng vi khuẩn làm probiotics ...............19

2.4. Khả năng tồn tại và sinh trưởng của vi khuẩn lactic trong đường tiêu hóa

người ..............................................................................................................20

2.5 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic

trên thế giới ....................................................................................................21

2.6 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic

ở Việt Nam .....................................................................................................21

PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............23

3.1 Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................23

3.2 Thiết bị, hóa chất sử dụng ........................................................................26

3.2.1 Thiết bị ..................................................................................................26

3.2.2 Hóa chất ................................................................................................26

3.3 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................26

3.31. Phương pháp hoạt hóa giống ...............................................................26

3.3.2. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh .........................................................27

3.3.3. Phương pháp bảo quản giống .............................................................27

4

3.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào trong môi trường lỏng .............28

3.3.5. Phương pháp khảo sát khả năng chịu muối mật ..................................29

3.3.6. Phương pháp khảo sát khả năng chịu axit ...........................................30

3.3.7. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng .................................30

3.3.8 Phương pháp xử lí số liệu .....................................................................31

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ....................................................32

4.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật ..............................................32

4.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu axit .......................................................34

4.3. Xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của MC9 .............43

4.4. Kết quả định danh ...................................................................................44

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................49

5

6

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.

Xã hội càng phát triển thì việc nâng cao sức khỏe, phòng chống bệnh

tật lại càng được chú trọng. Lo sợ trước các tác động có hại của việc điều trị

bệnh bằng kháng sinh, con người ngày càng ưa thích những phương pháp giữ

gìn sức khỏe, phòng tránh và điều trị bệnh tật có nguồn gốc tự nhiên, tạo ra sự

cân bằng, ổn định trong cơ thể. Một trong số những phương pháp phổ biến

rộng rãi nhất hiện nay là sử dụng các chế phẩm probiotic.

Probiotic là chế phẩm gồm các vi sinh vật sống, chủ yếu là vi khuẩn

lactic. Đây là những vi khuẩn sống tự nhiên trong đường tiêu hóa của con

người và các loài động vật khác. Chúng có nhiều tác động có lợi cho sức khỏe

như giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh trong

đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giảm nồng độ cholesterol trong máu và giảm

nguy cơ bị ung thư.

Để thường xuyên duy trì những tác động này, có thể bổ sung thêm từ

nguồn thực phẩm lên men có chứa chúng như sữa chua, tôm chua, nem chua

hoặc từ các chế phẩm chuyên dụng. Hiệu quả của chúng sẽ càng được tăng

cường khi các chủng vi khuẩn lactic trong đó đã qua những nghiên cứu sàng

lọc để đảm bảo chúng có tiềm năng probiotic mạnh.

Một trong những tính chất quyết định tiềm năng probiotic của các

chủng vi khuẩn này là khả năng tồn tại, thích nghi được với môi trường trong

đường tiêu hóa động vật. Chúng phải chịu được môi trường axit ở dạ dày và

thích nghi được với nồng độ muối mật ở ruột và các tác động của các enzyme

trong đường tiêu hóa.

Những năm gần đây, các loại thực phẩm có các vi sinh vật probiotic rất

được ưa chuộng ở Việt Nam. Tuy nhiên, chưa có nhiều các nghiên cứu phân

lập và khảo sát tiềm năng probiotic của hệ vi sinh vật lên men lactic ở nước

ta. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn chủng có khả năng chịu

axit và muối mật cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm

lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế”, nhằm xác định được một số

chủng có khả năng tồn tại và thích nghi trong đường tiêu hóa động vật, làm

7

tiền đề cho các nghiên cứu tuyển chọn các dòng vi khuẩn lactic có tiềm năng

probiotic để ứng dụng vào sản xuất.

8

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.

2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic

2.1.1. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn là những những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản.

Chúng có thể hô hấp hiếu khí hoặc yếm khí, trong cấu tạo tế bào của chúng

không có diệp lục tố [5]. Ngoài những đặc điểm chung trên thì đối với mỗi

nhóm vi khuẩn khác nhau luôn có những đặc điểm riêng đặc trưng cho nhóm

đó. Vi khuẩn lactic cũng vậy chúng cũng có những đặc điểm sinh lí sinh hóa

khác so với các nhóm vi khuẩn khác và trong mỗi loài sự khác nhau đó càng

thấy rõ hơn. Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái

nhưng nhìn chung tất cả những vi khuẩn lactic đều có những đặc điểm sau.

2.1.1.1. Đặc điểm sinh lí

- Đó là những vi khuẩn gram dương, nói chung là bất động, không sinh

bào tử.

- Chúng là những vi khuẩn kị khí tùy nghi, vi hiếu khí, là loại cơ thể

độc nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như kị khí, chúng có khả năng

sinh trưởng được khi có mặt oxi.

- Chúng không chứa các cytochrom, catalase và nitratoredutase âm tính

2.1.1.2. Đặc điểm sinh hóa

- Dinh dưỡng của nhóm vi khuẩn lactic khá phức tạp do khả năng tổng

hợp các chất cần cho sự sống của chúng rất yếu. Không một đại diện nào

thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết

chứa glucose và NH4+. Đa số chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin,

tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin), và các axit amin, các

bazơ purin và pirimidin [5].

- Chúng có khả năng lên men tạo axit lactic bằng cách phân giải nguồn

hydrat cacbon có trong môi trường.

2.1.2. Các nhóm vi khuẩn lactic

Năm 1857 Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết

quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm 1878

9

Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium

lactics.Về sau các nhà khoa học đã liên tiếp phân lập được nhiều loài vi khuẩn

lactic khác nhau [1]. Và các loài vi khuẩn này được xếp chung vào họ

Lactobacteriaceae.

Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic [2]

Giống

Tế bào Kiểu lên

men

%

G+C

Tài liệu dẫn

Hình Sắp xếp

Streptococcus

Leuconostoc

Pedicoccus

Lactobacillus

Bifidobacterium

Cầu

Cầu

Cầu

Que

Khác

nhau

tùy loài

Chuỗi

Chuỗi

Tứ cầu

Chuỗi

Nhiều

dạng

Đồng hình

Dị hình

Đồng hình

Đồng hình

và dị hình

Lactic và

acetic

34- 46

36- 43

34 -42

32 -53

55 -67

Schleifer 1986

Farrow và cộng

sự 1989

Schleifer 1986

Kandler và welss,

1986

Scardovi, 1986

Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng bao gồm rất nhiều chi khác nhau.

Việc phân loại các chi này dựa trên sự khác nhau về hình thái của vi khuẩn

(Tế bào của chúng có thể hình que hoặc hình cầu) và khả năng sinh trưởng và

phát triển trên các điều kiện pH khác nhau (4,4; 9,6); ở các nhiệt độ khác nhau

(100 C; 45 0C) cũng như khả năng lên men đồng hình hay dị hình của chúng.

Người ta đã tiến hành phân loại và chia nhóm vi khuẩn lactic thành 5 chi chủ

yếu sau (Thể hiện trên bảng 1.1).

Sự tập hợp của 5 chi này vào cùng một nhóm vi khuẩn lactic đã được

khẳng định qua phương pháp phân loại phân tử [2]. Ngoài ra có một số loài vi

khuẩn sinh nội bào tử có khả năng lên men tạo axit lactic thuộc chi Bacillus,

Tuy nhiên, các loài này không được xem là vi khuẩn lactic do các đặc điểm

sinh lý và hóa sinh của chúng.

10

2.1.2.1. Lactobacillus

Giống Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic, gồm

khoảng 80 loài [27]. Với mức độ khác nhau rất nhiều về hình thái, đặc điểm

sinh hóa và sinh lý. Sự không đồng nhất thể hiện ở phổ tỉ lệ mol G+C rất

rộng, từ 32-55% [27]. Chúng là những trực khuẩn không sinh bào tử thuộc

lớp vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong điều kiện kỵ

khí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí. Những trực khuẩn này thường đứng

riêng lẻ hoặc thành chuỗi, thủy phân đường saccharosa mạnh tạo axit lactic,

không khử nitrat, chúng phân giải gelatin, indole và H2S. Chúng phát triển

mạnh trong môi trường có tính axit, tùy loài mà pH dao động từ 4,5 đến 6,4.

Đây là những vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axitamin. Người ta

có thể tìm thấy Lactobacillus trong các sản phẩm sữa, thịt, hoặc trong nước

sạch, bùn, bề mặt thực vật, trái cây. Các loài thuộc chi này cũng là một phần

quan trọng trong hệ thống vi sinh đường ruột ở người và động vật bậc cao, có

trong khoang miệng, đường ruột và âm đạo.

Nhiều kết quả nghiên cứu phân loại sinh hóa và lai DNA cho thấy

Lactobacillus là một nhóm rất đặc biệt.

11

INCLUDEPICTURE "http://bp0.blogger.com/_FlhB437Wa_U/SClyFlwHv7I/AAAAAAAAArc/TeX5R_U81vA/s400/acidp.jpg" \* MERGEFORMATINET

Hình 1.1 Hình thái tế bào của (a) Lb. axitophilus và (b) Lb. plantarum

a

http://bp0.blogger.com/_FlhB437Wa_U/SClyFlwHv7I/AAAAAAAAArc/TeX5R_U81vA/s1600-h/acidp.jpg

Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt một số loài của chi Lactobacillus [2]

(Theo Bottazzi, 1988)

Nhóm Loài GC%

ADN

Loại peptido

Glycane

Dạng

axit

lactic

Nơi sống chính

I

Lb.delbrueckii subsp.delbruceckii

Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus

Lb delbrueckii subsp lactics

Lb.acidophilus

Lb.gasseri

Lb.helveticus

49-51

49-51

49-51

34-37

33-37

38-40

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

D

D

D

DL

DL

DL

Mặt thực vật

Sữa chua

Fomat

Miệng, âm đạo

Miệng, âm đạo

Fomat

II

Lb.casei subsp Casei

Lb. casei subsp pseudoplantarum

Lb casei subsp Tolereas

Lb.casei subsp rhamnosus

Lb. sake

Lb.bavaricus

Lb. Plantarum

45-47

45-47

45-47

45-47

42-44

42-44

44-46

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

m-ADP

L

DL

L

L

DL

L

DL

Dạ dày đv nhai lại

Fomat, rơm rạ ủ

Mồm, âm đạo

Ruột non người

Bề mặt thực vật

Bề mặt thực vật

Thực vật,fomat

III

Lb.bifementans

Lb. brevis

Lb buchneri

Lb. kefir

Lb.reuteri

Lb. fermentum

Lb.confusus

Lb. Viridescens

Lb. Sanfrancisco

44-46

45-47

44-46

40-42

40-42

52-54

45-47

45-47

36-38

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Lys –Asp

Orn-D-Asp

Lys-Ala

Lys-Ala-Ser

Lys-Ala

DL

DL

DL

DL

DL

DL

DL

DL

DL

Fomat

Thực vật,fomat

Thực vật,fomat

Kefir

Ruột non

Thực vật,fomat

Thực vật

Ccác sản phẩm thịt

Các loại bánh

12

Giống Lactobacillus được chia làm 3 nhóm (Bảng 1.2) [6]:

Nhóm 1: Được gọi là Thermobacterium, lên men đồng hình và ưa

nhiệt. Không lên men glucose và đường pentosa. Những vi khuẩn này có

fructose 1,6 diphosphate aldolasa, chúng phát triển ở 450C.

Nhóm 2: Được gọi là Streptobacterium, đây là những trực khuẩn lên

men đồng hình và ưa ấm, nhiều loại của nhóm này có khả năng lên men dị

hình. Các hexosa được lên men theo con đường EMP tạo thành axit lactic,

nhưng các pentosa có thể lên men dị hình.

Nhóm 3: gồm những trực khuẩn có tên gọi là Betabacterium, chúng là

những vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc. Chúng sinh axit lactic, axit acetic,

CO2 và ethanol.

2.1.2.2. Streptococuss

Đây là những vi khuẩn gram dương bao gồm các cầu khuẩn, đa số lên

men đồng hình và bất động. Sau khi phân chia chúng thường tạo thành chuỗi,

sống hoại sinh trong đất, bề mặt cây, da người, ruột… Chi này cũng là một

chi rất lớn trong vi khuẩn lactic, bao gồm nhiều nhóm khác nhau.

Ngoài Lactococcus thì trước đây người ta đã xếp thêm Enterococcus

vào chi Streptococcus. Mặc dù ngày nay đã có sự phân tách và tạo thành

những chi mới, chi Streptococcus vẫn là một chi rất lớn và khó phân loại một

cách hoàn hảo. Enterococcus không có vai trò quan trọng trong công nghệ

thực phẩm. Một số loài trong chi này, ví dụ như E. faecalis có thể là những vi

khuẩn gây bệnh cơ hội, vì thế không được ưa chuộng trong chế biến thực

phẩm. Người ta quan tâm nhiều đến khả năng kháng kháng sinh và khả năng

chuyển một số tính trạng thông qua các yếu tố di truyền có khả năng dịch

chuyển. Tuy nhiên, vẫn có nhiều nghiên cứu sử dụng E. faecium và E.

faecalis làm probiotic do nhiều loài trong chi Enterococcus cư trú tự nhiên

trong đường ruột của động vật bậc cao và người [10] [36] .

2.1.2.3. Leuconostoc

Chi Leuconostoc là những vi khuẩn hình cầu, gram dương, phần lớn

chúng lên men dị hình theo con đường Hecxoso-monophosphat tạo D-lactic

từ glucose. Một số loài Leuconostoc cùng với Lactobacillus gây nên quá

trình lên men malolactic, đây là quá trình lên men thứ hai sau lên men rượu

13

vang, nó làm chua rượu vang, quá trình xảy ra mạnh trong vang còn nhiều

axit tactric và axit malic. Vì vậy rất dễ nhầm lẫn giữa Leuconostoc với

Lactobacillus lên men dị hình có hình thái dạng cầu-que. Do đó đã có sự tách

ra một số loài từ cả chi Lactobacillus và Leuconostoc đề hình thành nên chi

mới: Weissella, gồm các vi khuẩn “giống như Leuconostoc”, đó chính là các

loài trước đây được xem như Ln.paramesenteroides; Lb.confusus;

Lb.viridesens …[27]. Chi này vì thế có cả dạng hình cầu và que. Người ta

nhận thấy loài Ln. oenos, còn được gọi là Leuconostoc ở rượu, có khả năng

chịu nồng độ rượu và axit cao, vì thể đã được tách ra tạo thành một chi mới,

Oenococcus. Trong khi việc phân biệt giữa Oenococcus và Leuconostoc khá

đơn giản, thì việc phân biệt giữa Weissella và Leuconostoc vẫn là một vấn đề

nan giải.

2.1.2.4. Pediococcus

Pediococcus là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic gồm những tứ cầu

hoặc song cầu lên men lactic đồng hình, tạo axit lactic dạng DL hoặc (L+),có

khả năng chịu axit và thủy phân protein yếu. Hầu hết chúng không có khả

năng sử dụng lactosa và được đặc trưng bởi GC% ADN từ 34-42 %. Người ta

phân biệt Pediococcus bởi khả năng chịu nhiệt, chịu pH, chịu NaCl và khả

năng lên men đường (Bảng 1.3).

14

Hình 1.2 Hình thái tế bào của Leuconostoc mesenteroides

Trong công nghệ thực phẩm vai trò của chúng vừa có ý nghĩa tích cực

vừa tiêu cực. Chẳng hạn như và P. pentosaceus được sử dụng làm giống nuôi

cấy khởi đầu trong sản xuất xúc xích và ủ thức ăn gia súc [27]. Chúng cũng

có thể có vai trò quan trọng góp phần vào sự chín của phomat. Ngược lại thì

P. damnosus lại là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của

chúng có thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl/acetoin, làm cho bia có vị giống

bơ.

Ngoài Pediococcus thì Aerococcus, Tetragenococcus cũng tạo nên các

vi khuẩn lactic dạng tetrad (4 cầu khuẩn liên kết thành bộ 4). Trong đó chi

Aerococcus nhìn chung chỉ có vai trò thứ yếu trong công nghệ thực phẩm.

Còn chi Tetragenococcus ban đầu được coi là Pediococcus halophilus.

Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt một số loài Pediococcus [2]

15

Hình 1.3 Hình thái tế bào của Pediococcus halophilus(a) vàAerococcus urinaeequi(b)

a b

Đặc điểm

Pc.dam

nosu

s

Pc.dam

nvu

lus

Pc.in

opinatu

s

Pc.dextrin

icus

Pc.pen

tosaceus

Pc.axitolactici

Pc.h

alophilu

s

Pc.u

rinaequ

i

- Sinh trưởng ở pH 4,5

- Độ mặn cao nhất có

thể chịu (%)

- Lên men :

Lactoza

Maltoza

Melezitoza

Riboza

Saccharoza

Trehaloza

Dextrine

Amidon

- Thủy phân agrinin

+

< 4

-

+/-

+/-

-

+/-

+

-

-

-

+

6.5

-

+

-

-

-

+/-

-

-

-

ND

4-6.5

+/-

+

+

-

-

-

+/-

-

-

-

4

+/-

+

-

-/+

+/-

-

+

+

-

+

6.5

+/-

+

-

+

-

+

-

-

+

ND

6.5

+/-

-

-

+

-

+/-

-

-

+

-

18

-

+

+

+

+

+

-

-

-

-

6.5

+/-

+

-

ND

+

+

+

-

-

+: dương tính; -: âm tính; +/-: khác nhau tùy chủng; ND: không xác định.

Ngoài đặc điểm là chịu được nồng độ muối rất cao (18%) thì chúng còn

một đặc điểm nữa để phân biệt với các vi khuẩn lactic khác là chúng cần nồng

độ muối khoảng 5% để phát triển. Chi này có vai trò quan trọng trong các loại

thực phẩm có hàm lượng muối cao, như nước chấm đậu nành.

2.1.2.5. Bifidobacterium

Chi Bifidobacterium là những trực khuẩn kị khí không sinh bào tử,

Gram dương, bất động. Khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn có thể

phân nhánh dạng chữ Y, V tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy chuyền

chúng trở thành những trực khuẩn thẳng hoặc hơi uốn cong với những hạt dự

trữ nhuộm màu xanh metylen. Vì vậy khi phát hiện vào năm 1899, vào đầu

thế kỉ XX chi này chi được xem như thuộc vào chi Lactobacillus. Theo khóa

phân loại Bergey năm 1920, chúng có tên là Lactobacillus bifidus. Năm 1967,

16

Devries và Stouthamer đã chứng minh sự có mặt của enzyme fructose-6-

phosphate phosphoketolase. Ở nhóm vi khuẩn này và sự vắng mặt của hai

enzyme là aldolase và glucose-6-phosphatase dehydrogenase – hai enzyme có

mặt trong Lactobacilli. Từ đó người ta kết luận rằng việc phân loại nhóm

bifido trong chi Lactobacillus là không hợp lý. Ngày nay, nhóm này được xếp

thành một chi riêng biệt, chi Bifidobacterium, thuộc họ Actinomycetaceae, có

25 loài [2].

Chúng lên men lactic dị hình sản phẩm chính của chúng là axit acetic

và axit lactic, cùng với một lượng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic và

một điều đặc biệt khác nữa là trong quá trình lên men không sản sinh ra khí

CO2. Là những cơ thể catalasa âm,nitrat dương, indol và gelatine âm. Chi này

chủ yếu sống ở trên cơ thể động vật bậc cao, có thể gặp chúng ở trong khoang

miệng và đường tiêu hóa của động vật và cả ở côn trùng, thậm chí ở cả bùn,

chúng là vi sinh vật tiên phong trong hệ tiêu hóa của người. Chúng có ứng

dụng quan trọng trong việc sản xuất các chế phẩm vi sinh làm probiotic.

2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic

17

Hình 1.4 Hình thái tế bào của Bifidobacterium

Vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghiệp bảo quản, chế

biến thực phẩm và thức ăn gia súc [5]. Từ lâu nhân dân ta đã biết bảo quản và

chế biến các sản phẩm rau quả bằng cách muối chua để kéo dài thời gian sử

dụng. Chính các vi khuẩn lactic là tác nhân chủ yếu tham gia qua trình lên

men chua. Chúng có khả năng lên men đường tạo axit lactic trong môi trường

kỵ khí làm cho pH giảm xuống dưới 5, làm ức chế các loại vi khuẩn gây thối

phát triển. Ngày nay, vi khuẩn lactic được sử dụng trong sản xuất sữa chua,

phomat, lên men các sản phẩm rau quả, thịt, hải sản.

Ngoài ra, nhóm vi khuẩn này còn có nhiều đặc tính có tiềm năng

probiotic nên đã được nhiều nhà nghiên cứu đã và đang quan tâm. Việc sử

dụng các chủng vi khuẩn lactic trong phòng ngừa và điều trị bệnh cũng như

phục hồi và duy trì sức khỏe ngày càng phổ biến. Ngày nay, chúng còn được

sử dụng trong điều trị làm tăng hệ miễn dịch, giảm cholesterol, ngăn ngừa ung

thư [20] [21]. Các chủng vi sinh vật được sử dụng làm probiotic thương mại

hiện nay đều thuộc nhóm vi khuẩn lactic, ở hai chi là Lactobacillus và

Bifidobacterium [16]. Trong đó Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được

sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực probiotic [20] [19]. Những loài này đều

được xem là các vi khuẩn không gây bệnh ở người. Hiện nay đang có một số

nghiên cứu sử dụng cả Enterococcus, Streptococcus để làm probiotic [14]

[36]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm probiotic có

nguồn gốc từ vi khuẩn lactic còn rất hạn chế.

2.2. Hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của người

2.2.1. Đặc điểm chung của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người

Hệ tiêu hóa của chúng ta chỉ chiếm một khoảng không gian khá khiêm

tốn trong ổ bụng nhưng diện tích bề mặt tiêu hóa của ruột lớn rất lớn. Người

ta ước đoán trong ruột chúng ta có hằng hà sa số các loài vi sinh vật khác

nhau, gấp hàng chục lần tổng số tế bào trong cơ thể một người trưởng thành.

[19].

Khi mới sinh ra, đường tiêu hóa của chúng ta không có bất kì một vi

sinh vật nào kể cả vi khuẩn, do những tiếp xúc đầu tiên với môi trường, từ

sữa mẹ... vi khuẩn bắt đầu xâm nhập. Những cá thể vi khuẩn này sau khi thoát

18

qua được dạ dày đến ruột sẽ tăng sinh nhanh chóng, tồn tại và phát triển, dần

dần tạo nên quần thể vi sinh vật với sự cân bằng tự nhiên.

Khi trưởng thành, vi sinh vật đường ruột ổn định và cân bằng hơn. Tuy

nhiên cũng có thể bị mất cân bằng do ảnh hưởng của môi trường, vệ sinh an

toàn thực phẩm, bia rượu, thuốc kháng sinh, thuốc hóa trị liệu, hoặc ngay cả

căng thẳng công việc... Vì vậy rối loạn đường ruột vẫn thường xuyên xảy ra.

Với người già, vi sinh vật có lợi có xu hướng giảm nhưng vi sinh vật

gây bệnh lại tăng, do đó người già thường xuyên bị rối loạn tiêu hóa như tiêu

chảy, táo bón, viêm đại tràng, sình bụng, đi phân sống..., giảm khả năng hấp

thụ dinh dưỡng, giảm đề kháng, bệnh tật, kể cả ung thư ruột kết.

Về mặt khoa học, chúng được biết là một hệ vi sinh vật sống. Chúng

sinh sôi nảy nở trong đường ruột non, đại tràng của người và phần lớn chúng

tồn tại mà không cần oxy [19]. Hàng trăm ngàn tỷ vi sinh vật sống này là sự

cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại. Bắt đầu từ dạ dày, vi khuẩn

gần như bằng không, chỉ có vi khuẩn gây loét dạ dày Helicobacter pylori là

có thể hiện diện, số lượng tăng dần ở ruột non và ruột già. Trong đó sự có mặt

của vi khuẩn có lợi đóng vai trò vô cùng quan trọng cho chức năng tiêu hóa

và giúp cân bằng hệ vi khuẩn ruột.

2.2.2. Chức năng các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường tiêu hóa

người

Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường đường ruột của chúng ta là

những vi sinh vật sống có hại, có lợi và các loài trung tính khác nhau.

Các vi sinh vật có lợi chủ yếu trong đường ruột của chúng ta là các loài

cộng sinh Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus,

Bacillus và nấm men [11] [19].

Các tác động của nhóm vi khuẩn có lợi :

Chúng đem lại lợi ích bằng cách tái lập sự cân bằng tự nhiên trong hệ

tiêu hóa, giúp đường ruột khỏe mạnh bằng cách bám chặt, chiếm lĩnh

thành ruột và cạnh tranh chất dinh dưỡng với vi khuẩn có hại; ngăn

ngừa vi khuẩn có hại tấn công và phát triển, tăng cường chức năng

chống đỡ của niêm mạc ruột, giúp khống chế vi khuẩn gây hại.

19

Một số loại vi khuẩn sinh ra các chất kháng khuẩn như bacteriocins

giúp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh. Ngoài ra vi khuẩn cộng sinh

còn giúp tăng cả phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng

cách kích thích các tế bào phản ứng miễn dịch (macrophages,

lymphocytes), tăng cường sự sản xuất ra các thành phần miễn nhiễm

(cytolines, immunoglobulins, interferon).

Một số vi sinh vật có lợi khác trong ruột non lại hạn chế hấp thu

cholesterol, giúp giảm cholesterol trong máu; sản sinh ra các enzym

khắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrat, làm thuận tiện hơn việc hấp

thụ năng lượng từ các chất dinh dưỡng.

Vi sinh vật có lợi giúp tăng khả năng dung nạp lactose nhờ kích thích

sản sinh lactaze.

Bên cạnh lợi ích của vi khuẩn có lợi thì luôn có sự tồn tại của các vi

khuẩn có hại như Escherichia coli, Shigella, Staphylococcus aureus,

Clostridium, Veillonella… [19]. Các vi khuẩn có hại này khi xâm nhiễm vào

đường ruột sã gây ra các tác động xấu đến sức khỏe mgười tiêu dùng như ngộ

độc thực phẩm ( Salmonella), viêm nhiễm đường ruột (Campylobacter), rối

loạn tiêu hóa (Enterotoxigenic E. coli, Enterotoxigenic E. coli, Enteroinvasive

E. coli, Enterohaemorrhagic E. coli)…

Tuy nhiên khi nào vi khuẩn có lợi và vi khuẩn trung tính này cạnh tranh

nhau để giành lấy không gian trong đường ruột thì vi khuẩn có hại không có

cơ hội nhân lên. Thường thì hệ vi khuẩn trong đường ruột của chúng ta rất

bền vững. Ngay cả khi hệ khuẩn ruột bị rối loạn rất nặng do dùng kháng sinh

hoặc tiêu chảy thì chúng vẫn có thể phục hồi một cách nhanh chóng khi

nguyên nhân gây nên rối loạn này được loại bỏ. Tuy vậy đôi khi vẫn có

trường hợp những vi khuẩn có hại chiếm ưu thế trong đường ruột.

2.3. Tổng quan về probiotic

2.3.1. Khái niệm probiotic

Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người

không phải là mới. Hàng nghìn năm về trước, trước khi tìm ra thuốc kháng

sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi

chẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men. Các nhà khoa học đầu tiên, như

20

Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất

dinh dưỡng và dược tính của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày

(Oberman, 1985) [10]. Còn đối với nhà sinh lý học người Nga, Eli

Metchnikoff (1907) thì "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với

thực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh

vật trong người của chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật

hữu ích " [21].

Một vài năm trước bài thảo luận cuả Metchnikoff, Pastuer và Joubert

(1877) [10], trong khi quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã nhận

thấy sự tiêu thụ vi khuẩn không gây bệnh có thể kiểm soát các vi khuẩn gây

bệnh. Ngoài ra, cùng thời gian này, Henry Tissier, một bác sĩ khoa nhi người

Pháp đã phân lập Bifidobacterium, một thành viên của nhóm vi khuẩn lactic,

từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ (Tissier, 1906) [18] và nhận thấy

chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi và

Shimamura, 1993).

Như vậy nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotic đã được thành

lập từ rất lâu và việc nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ

ăn uống đã được tiếp tục suốt các thế kỷ vừa qua.

Vậy thì probiotic là gì?

Từ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”.

Tuy nhiên, định nghĩa về probiotic đã phát triển rất nhiều theo thời gian. Lily

và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotic như hỗn hợp được tạo thành

bởi một động vật nguyên sinh có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của đối

tượng khác [21]. Sau đó, Parker (1974) đã áp dụng khái niệm này đối với

phần thức ăn gia súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc

góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó.

Định nghĩa chung này sau đó chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông định

nghĩa probiotic như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh

hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của

nó [21]. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi

khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung

trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe

21

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=Hippocrates&action=edit

http://en.wikipedia.org/wiki/Eli_Metchnikoff

http://en.wikipedia.org/wiki/Eli_Metchnikoff

của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có

của vật chủ” (Havenaar và Huis in't Veld, 1992) [21] [10].

Với Tannock et al., 2000 thì probiotic là “vi sinh vật sống có lợi cho

vùng ruột, góp phần vào việc cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và có tác

động tốt đến sức khỏe của người tiêu dùng ” [38].

Tóm lại, đó là những vi khuẩn tốt sống trong đường tiêu hóa và ngay cả

trong âm hộ. Thí dụ điển hình về probiotic là vi khuẩn Bifidobacterium và vi

khuẩn Lactobacillus trích từ hệ vi sinh đường ruột [19].

2.3.2. Những tính chất có lợi của probiotic

Probiotic được coi như là một thực phẩm chức năng rất được ưa chuộng

bởi các tính năng của nó mang lại. Những tác động chủ yếu của các chủng vi

khuẩn probiotic tới sức khỏe con người gồm những mặt chính như sau:

Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản

chúng bám vào thành ruột

Probiotic khi được bổ sung vào cơ thể, các vi sinh vật này sau khi vượt

qua các rào cản về lý học và hóa học trong hệ dạ dày- ruột non thì chúng sẽ

tiến hành bám dính vào thành ruột để thực hiện các chức năng có lợi cho cơ

thể vật chủ. Chúng cạnh tranh nơi ở với vi khuẩn gây bệnh, ngăn cản không

cho các vi khuẩn này bám vào thành ruột, từ đó làm giảm số lượng vi khuẩn

ngăn chặn các mầm bệnh [21].

Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được hữu hiệu hơn

Đối với những người thường bị chứng bất dung nạp đường lactose

trong các sản phẩm sữa do trong ruột không có enzyme tiêu hóa loại đường

này thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa được dễ dàng hơn [21].

Giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh

Việc sử dụng probiotic để phòng ngừa tiêu chảy gây ra bởi thuốc kháng

sinh rất được quan tâm.

Sự phát triển một cách rộng rãi và đặc hiệu cao của thuốc kháng sinh đã

khiến cho ngành y học quá tin tưởng vào phương pháp trị liệu kháng sinh.

Tuy nhiên, tác động loại bỏ của thuốc kháng sinh không phân biệt được mầm

bệnh thật sự và hệ vi sinh vật có lợi trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị liệu

kháng sinh cũng dẫn đến thay đổi hệ cân bằng của ruột và gây ra một vài ảnh

22

hưởng xấu mà có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngừng sử dụng cách điều

trị này.

Bên cạnh đó, sự xuất hiện nhanh của nhiều chủng vi khuẩn kháng lại

kháng sinh chẳng hạn như Enterocci kháng vancomycin và Staphylococcus

aureus kháng methicillin là một vấn đề đáng quan tâm. Hơn nữa, một vài

bệnh lây nhiễm lại gia tăng và trở nên trầm trọng hơn trong điều trị thuốc

khág sinh. Ví dụ, bệnh tiêu chảy có thể do Clostridium difficile, một mầm

bệnh cơ hội, hoạt động và tăng nhanh khi có sự mất cân bằng của hệ vi sinh

vật trong ruột thông thường diễn ra trong suốt quá trình điều trị kháng sinh

[21]. Mặc dù bệnh này nói chung được điều trị thành công với một loại thuốc

kháng sinh thứ hai, tuy nhiên một vài bệnh lây nhiễm vẫn tái diễn mặc cho

các phương pháp trị liệu kháng sinh khác (Sanders, 1999).

Về sau việc sử dụng probiotic đã cải thiện đáng kể hệ vi sinh vật nội

sinh (Markowitz và Bengmark, 2002) bằng cách thay thế các vi khuẩn có ích

bị mất. So với các nhược điểm như đắt, tính hóa học và xâm hại ruột của

thuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotic là an toàn, nguồn gốc tự nhiên, và

phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào.

Ngoài tác dụng giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng

sinh thì việc sử dụng probiotic còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ tiêu chảy

gây ra bởi các loại virut gây bệnh [21].

Tăng cường hệ miễn dịch

Probiotic như một vị thuốc chứa các phân tử chống viêm cho đường

ruột. Đồng thời góp phần đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào vật chủ để giảm

các phản ứng viêm bằng cách tạo các phản ứng miễn dịch cho cơ thể.

Ngừa ung thư ruột

Một vài nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật probiotic có thể ngăn

chặn hoặc làm chậm quá trình ung thư ruột. Theo như các ghi nhận trước đó

thì các thành viên của hệ vi sinh vật đường ruột có khả năng sản sinh ra chất

gây ung thư nitrosamines. Do dó việc sử dụng Lactobacilii và

Bifidobacterium về mặt lí thuyết có thể giảm bớt được mức độ sản sinh ra các

chất gây ung thư này (Hosada et al, 1996). Tuy nhiên cũng quá sớm để đưa ra

23

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=Clostridium_difficile&action=edit

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=B%E1%BB%87nh_ti%C3%AAu_ch%E1%BA%A3y&action=edit

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=Methicillin&action=edit

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=Staphylococcus_aureus&action=edit

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=Staphylococcus_aureus&action=edit

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=Vancomycin&action=edit

http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/index.php?title=Enterocci&action=edit

kết luận cuối cùng về hiệu quả của probiotic trong việc ngừa ung thư ruột[ 21]

[34]

Giảm cholesterol trong máu.

Hàm lượng cholesterol trong huyết thanh ảnh hưởng rất lớn đến các

bệnh về tim mạch. Nếu hàm lượng này cao hơn 1mmol so với mức bình

thường thì người bệnh đang ở mức độ nguy hiểm của các bệnh về tim mạch

(>35%) và có thể gây chết người nếu cao hơn 45 %. Vì vậy chỉ cần giảm 1 %

hàm lượng cholesterol trong máu là có thể giảm được mức độ nguy hiểm của

các bệnh về tim mạch từ 2 đến 3 % (Masnon etal, 1992) [27]. Và việc sử dụng

các sản phẩm probiotic có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong

máu [34] [10]. Một trong những bằng chứng đầu tiên đó là việc sử dụng

probiotic lactobaccilii trong các sản phẩm có ảnh hưởng tốt đến tim mạch,

bao gồm cả khả năng ngăn ngừa và điều trị các hội chứng thiếu máu cục bộ

của tim (Oxman et al, 2001) và giảm đáng kể hàm lượng cholesterol trong

máu (De Roos và Katan) , 2000 [18].

Giảm thiểu hiện tượng dị ứng.

Lb. rhamnousus GG đã được thử nghiệm trên hai đối tượng có mức độ

dị ứng cao đó là phụ nữ 6 tuần trước khi sinh và trẻ sơ sinh trong vòng 6

tháng. Kết quả cho thấy có sự giảm có ý nghĩa về mức độ dị ứng (Kalliomaki

et al , 2001). Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của probiotic trong việc tạo

ra các phản ứng giúp cơ thể chống lại các chất lạ xâm nhập vào cơ thể và

ngăn ngừa hiện tượng dị ứng xảy ra. Trong các nghiên cứu y học khác về

bệnh dị ứng của trẻ em với sữa bò, người ta thấy rằng chứng viêm da di ứng

này có thể giảm bớt khi sử dụng thực phẩm probiotic của chủng Lb.

rhamnousus và B. lactics BB-12 (Majamaa và Isolauri, 1996; 1997; Isolauri et

al, 2000) [18].

Ngoài các ứng dụng chính trên thì probiotic theo như các nghiên cứu

khác còn có khả năng thuyên giảm triệu chứng đường ruột của hội chứng ruột

bị kích thích, nhiễm nấm âm đạo, nhiễm Helicobacter pylori ở dạ dày, bệnh

viêm ruột, và nhiễm trùng đường tiết niệu [21] [34].

24

2.3.3. Các tiêu chuẩn sàng lọc một chủng vi khuẩn làm probiotic

Không phải bất cứ loài vi khuẩn, nấm men hay vi sinh vật đơn bào nào

cũng có khả năng sử dụng làm probiotic. Chính số lượng và sự đa dạng của

các loài vi sinh vật làm cho việc sàng lọc trở nên khó khăn. Vì vậy để quá

trình sàng lọc có hiệu quả hơn trong ứng dụng thì đòi hỏi phải tiến hành cả thí

nghiệm in vitro và in vivo [19].

Các nghiên cứu in vitro được sử dụng để đánh giá các đặc tính của vi

sinh vật, làm cơ sở cho việc sàng lọc các chủng có tiềm năng làm probiotic.

Còn thí nghiệm in vivo đòi hỏi nhiều thời gian và số lượng lớn động vật cho

việc thử nghiệm, do đó, phương pháp này chỉ có thể sử dụng sau khi đã chọn

lọc được một số chủng có tiềm năng làm probiotic (Martins và cộng sự ,

2008) [31].

Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic phải chịu sự tác động

đồng thời hay liên tiếp các điều kiện bất lợi như sốc nhiệt nhẹ (nhiệt độ cơ

thể), tính axit của dịch dạ dày, các enzyme trong dịch tụy, lysozyme và muối

mật (Klaenhammer và Kullen, 1999)[26] và khả năng ức chế sự phát triển của

các vi sinh vật gây bệnh, khả năng cạnh tranh sự bám dính với vi khuẩn gây

bệnh và giảm sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh vào đường ruột.Trường hợp

probiotic không có nguồn gốc từ đường tiêu hóa của động vật thì vấn đề này

rất cần được quan tâm.

WHO và FAO trong tuyên bố chung về tiêu chuẩn probiotic đã giới

thiệu một số tiêu chuẩn chủ yếu như sau [22]:

- Khả năng chịu pH thấp của dạ dày.

- Khả năng chịu muối mật.

- Khả năng phân giải muối mật.

- Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh.

- Khả năng bám dính đường ruột.

- Khả năng bám dính biểu mô âm đạo (chuyên dùng cho cho sản phẩm

probiotic giúp cân bằng hệ vi sinh niệu – sinh dục.

Đây cũng là các kiểm nghiệm in vitro đang được dùng rộng rãi trong

quá trình sàng lọc các chủng vi khuẩn làm probiotic trên thế giới.

25

Sau khi hoàn thành các thí nghiệm in vitro chúng ta sẽ có được các

nhận xét sơ khảo về đặc tính của các chủng đang test, làm cơ sở cho quá trình

sàng lọc các các chủng có tiềm năng probiotic [22] [28]. Từ đó tiến hành các

thí nghiệm in vivo tiếp theo trên động vật và đối tượng cuối cùng là con người

[22].

2.4. Khả năng tồn tại và sinh trưởng của vi khuẩn lactic trong đường tiêu

hóa người

Hệ tiêu hóa của con người là một hệ thống các cơ quan, đó là một ống

dài từ miệng đến hậu môn, gồm thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già. Khi ta

nuốt, đồ ăn được thực quản dẫn xuống dạ dày. Dạ dày co bóp, trộn lẫn đồ ăn

với dịch vị, gồm axit và men tiêu hóa. Sau đó đồ ăn được đẩy xuống ruột non,

dưới tác dụng của nhiều men tiêu hóa khác, thức ăn được chuyển thành các

chất dễ hấp thu hơn và được ruột non hấp thu vào máu, còn các chất bã được

đẩy xuống ruột già. Ruột già hút bớt nước, làm đặc chất bã, đóng khuôn và co

bóp để thải chất bã ra ngoài. Tuy nhiên đi kèm với thức ăn vào miệng là rất

nhiều loại vi khuẩn kể cả vi khuẩn có lợi và có hại từ môi trường.

Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng vi khuẩn lactic là những vi sinh vật

có số lượng và khả năng tồn tại trong ruột người khá cao. Điển hình đó là các

vi khuẩn lactic ở 2 chi Bifidobacterium và Lactobacillus [19] [21].

Rất nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có lợi

được bổ sung vào cơ thể duới dạng probiotic [30] [13]. Trở ngại đầu tiên của

các chủng probiotic này là dịch axit trong dạ dày, nó có thể hủy diệt một số

lượng lớn các vi sinh vật đi vào trong cơ thể. Để có thể tồn tại được đòi hỏi

các chủng probiotic phải còn sống sau 2giờ - 4giờ trong dạ dày dưới điều kiện

pH thấp. Trong trường hợp những vi khuẩn này vượt qua được rào cản hóa

học là lớp dịch có tính axit tương đối mạnh của dạ dày thì mối tương tác giữa

chúng với các vi khuẩn trong ruột cũng sẽ làm hạn chế sự lây lan của vi khuẩn

xâm nhập có hại.

Sau đó là khả năng chịu muối mật trong ruột non cũng như các enzyme

trong ruột non. Những dòng được xem là kháng muối mật tốt là những dòng

có khả năng tăng trưởng tốt trong môi trường có các nồng độ muối mật trong

khoảng 0,15 – 0,3% [33].

26

2.5. Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn

lactic trên thế giới

Hiện nay, có rất nhiều nghiên phân lập và tuyển chọn các dòng vi

khuẩn lactic để làm probiotic [10] [36]. Và một trong những tiêu chuẩn quan

trọng nhất được chú ý nghiên cứu khi chọn lọc chủng probiotic là khả năng

sống sót và thích nghi trong đường tiêu hóa, với 2 đặc điểm nổi bật là chịu

axit và chịu muối mật [ 35]

M. T. Liong và N. P. Shah (2005) [33] tiến hành khảo sát khả năng chịu

axit và muối mật của 11 chủng Lactobacillus và cho kết quả khả quan về khả

năng chịu axit và muối mật của các chủng này, thời gian trung bình để tăng

OD lên 0,3 đơn vị trong khoảng từ 2,3 đến 4,6 giờ (tính trong pha logarit).

Khả năng sống sót ở pH 2 giảm rất mạnh và thay đổi lớn tùy theo chủng. Sau

120 phút ủ ở pH 2, hai tác giả này nhận thấy lượng tế bào sống đã giảm từ

khoảng 10 (log CFU/ml) xuống còn từ 4,2 đến 7,5 (log CFU/ml) tùy theo

chủng .

Suskovic và cộng sự (2000) [22] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng

của các loại muối mật lên khả năng tăng trưởng của chủng probiotic M92, kết

quả cho thấy chủng bị giảm khoảng từ 40-60 % khả năng tăng trưởng trong

môi trường muối mật.

Khalil và cộng sự (2007) [24] cũng đã khảo sát tiềm năng probiotic của

một số chủng vi khuẩn lactic phân lập ở Ai Cập, kết quả cho thấy khả năng

chịu axit và muối mật tốt nhất rơi vào các chủng thuộc các loài

Bifidobacterium longum, Lb. fermentum, Lb. plantanum.

2.6. Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn

lactic ở việt Nam.

Ở Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về khả năng chịu muối mật còn ít

và phạm vi nghiên cứu còn hạn chế. Các nghiên cứu in vitro về các chủng có

tiềm năng probiotic như của Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu (2009) [7].

Nghiên cứu khả năng sống trong môi trường đường tiêu hóa của động vật một

số chủng vi sinh vât nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất

probotic. Nhóm tác giả đã phân lập được một số chủng nấm men có khả năng

thích nghi cao với các điều kiện đường ruột và có thể làm probiotic. Tuy

27

nhiên, hiện nay các sản phẩm probiotic có chứa vi khuẩn lactic vẫn được ưa

chuộng hơn do có nhiều ưu điểm vượt trội.

Các tác giả Nguyễn Vũ Tường Vy, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa

(Bộ môn Vi sinh Ký sinh – Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM) (2007) [9]

thực hiện khảo sát vi sinh vật probiotic gồm vi khuẩn Lactic (Lactobacillus

aci-dophilus, Lactobacillus casei, Streptococus fae-calis), vi khuẩn tạo bào tử

Bacillus subtilis và nấm men Saccharomyces boulardii nhằm khảo sát khả

năng chịu đựng axit, muối mật và kháng sinh của một số vi sinh vật là nguyên

liệu sản xuất probiotic dùng đường uống. Tuy nhiên, các tác giả vẫn chưa

phân lập được các chủng sống sót được ở pH 2 sau 2 giờ. Kết quả cho thấy

sau 2 giờ tất cả các chủng đều mất khả năng sống ở pH 2.

Như vậy ở Việt Nam mặc dù chưa có nhiều nghiên cứu nhưng thông

qua các nghiên cứu trên cho thấy probiotic đã trở thành một đối tượng được

chú ý nhiều trong cộng đồng khoa học và sản xuất. Việt Nam có một tiềm

năng rất lớn về đa dạng vi sinh vật chưa được khai thác. Trong đó, Huế vốn

đã nổi tiếng với các sản phẩm lên men chua lactic truyền thống, và có thể

tiềm ẩn những chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic mạnh. Do đó,

chúng tôi chọn đề tài “Tuyển chọn chủng có khả năng chịu axit và muối

mật cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm lên men

lactic trên địa bàn thành phố Huế” nhằm sơ bộ khảo sát một số đặc điểm

ban đầu để chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic.

28

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.

3.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 12 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các sản

phẩm lên men lactic truyền thống (tôm chua, nem chua, dưa cải chua, măng

chua, nước chua trong sản xuất đậu phụ) trên địa bàn thành phố Huế, đã được

phân lập và định danh ở mức độ chi tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh,

Viện Tài nguyên môi trường và Công nghệ sinh học Huế. (Bảng 3.1, Hình

3.1)

Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm

STT Nguồn phân lập Tên chủng Catalase/Gram Kết quả định danh

1

Tôm chua

T9 - / + Lactobacillus

2 T10 - / + Lactobacillus

3

Nem chua

N1 - / + Lactobacillus

4 N5 - / + Lactobacillus

5 N10 - / + Leuconostoc

6 Dưa cải chua DC1 - / + Lactobacillus

7 DC2 - /+ Lactobacillus

8

Măng chua

MC5 - /+ Lactobacillus

9 MC9 - /+ Lactobacillus

10 MC10 - /+ Lactobacillus

11 Dịch Whey đậu

phụ

NC10 - /+ Lactobacillus

12 NC13 - /+ Lactobacillus

- : Catalase âm tính + : Gram dương tính

29

DC1 DC2

N1 N5

N10 NC10

30

NC13 MC5

MC9 MC10

T9 T10

Hình 3.1 Hình thái tế bào và nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic

sử dụng trong thí nghiệm

31

3.2. Thiết bị ,hóa chất sử dụng

3.2.1. Thiết bị

Tủ ấm Incubactor MiR.262 - Nhật

Tủ lạnh Sanyo - Nhật.

Máy đo pH Hanna - Ý.

Máy đo quang phổ quang phổ kế UV/VIS - Nhật.

Tủ cấy Labgard - Nhật

Và một số thiết bị thông dụng của phòng thí nghiệm.

3.2.2. Hóa chất

NaH2PO4.H2O

Na2HPO4.7H2O

Pepton

NaCl

HCl

No.3, Merck ( Sodium chocolate và sodium deoxycholate)

Các hóa chất được cung cấp bởi Meck

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống

Nguyên tắc :

Giống ban đầu thường được bảo quản trong điều kiện lạnh -30 oC. Khi

sử dụng để nuôi cấy và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo cần phải hoạt hóa

để giống có được khả năng sinh trưởng và phát triển bình thường.

Tiến hành:

Lấy 100µl dịch rã đông của giống vi khuẩn cho vào eppendoft có chứa

900µl dịch pepton 0,1%. Đem ủ trong 1giờ ở tủ ấm 370 C. Sau đó sử dụng cấy

chuyền qua các môi trường phục vụ nghiên cứu.

Thành phần dịch pepton 0,1%; pH 7,2

Pepton 1g

NaCl 0,5g

Nước cất đủ 1lít

3.3.2. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh

32

Nguyên tắc:

Trong môi trường lỏng vi khuẩn có khả năng tiếp xúc các chất dinh

dưỡng dễ dàng hơn, khả năng phát triển ổn định và từ đó thu được sinh khối

cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tiến hành:

Dùng que cấy tròn lấy 1 khuẩn lạc đơn đánh đều vào eppendoft có chứa

1 mL MRS lỏng, nuôi ở tủ ấm 37 0C trong 24 giờ.

Bảng 3.2. : Thành phần môi trường MRS rắn/Lít [7, 37]

( Môi trường MRS lỏng không bổ sung agar)

Thành phần Số lượng (g)

Pepton

Cao thịt

Cao nấm

Glucose

Sorbitan monooleate (Tween 80)

K2HPO4

MgSO4.7H2O

MnSO4 .4H2O

(NH4 )2 C6H6O7

CH3COONa.3H2O

Agar

Nước cất

10

8.0

4.0

20.0

1.0

2.0

0.2

0.05

2.0

5.0

15.0

Đủ 1l

Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH môi trường về 6,2.

Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong 15 phút.

3.3.3. Phương pháp bảo quản giống

Giống được bảo quản để nhằm mục đích sử dụng thường xuyên trong

nghiên cứu thí nghiệm và bảo quản lâu dài [4] [17].

Để bảo quản giống các chủng vi khuẩn lactic, chúng tôi tiến hành như

sau:

* Bảo quản thường xuyên: giống được cấy chuyền trong eppendorf có

chứa 1ml môi trường MRS lỏng và ủ ở 37oC trong 24 giờ, sau đó được giữ

lạnh 4oC. Giống bảo quản có thể được sử dụng cấy tăng sinh để thu sinh khối

33

nghiên cứu mà không cần phải hoạt hóa, tuy nhiên giống này chỉ sử dụng

trong khoảng 10 ngày và phải thường xuyên cấy chuyền.

* Để bảo quản giống lâu dài chủng cũng được nuôi tăng sinh giống như

bảo quản thường xuyên, sau đó li tâm thu sinh khối ở tốc độ 5000 vòng/phút,

loại bỏ dịch nổi, bổ sung 1ml môi trường MRS có glycerol (30%) vào

eppendoff và giữ ở -30oC.

3.3.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong môi trường lỏng

3.3.4.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp (phương pháp Koch)

Nguyên tắc : Mẫu có chứa sinh khối vi sinh vật khi được pha loãng ở

nồng độ thích hợp và trang lên môi trường rắn thì mỗi tế bào vi khuẩn sẽ phát

triển thành một khuẩn lạc đơn. Do đó, đếm số khuẩn lạc đơn sẽ xác định được

số tế bào ban đầu trong dịch pha loãng và qua đó tính được số tế bào ban đầu

trong dịch gốc. Số tế bào được xác định bằng đơn vị log CFU/ml.

Tiến hành : Mẫu được pha loãng liên tiếp theo tỉ lệ pha loãng 10 lần

thành các mẫu từ 100 đến 10-5 bằng pepton 0,1% và lấy 50µl trang trên đĩa

petri đường kính 10cm có chứa môi trường MRS. Mẫu được ủ 48h ở 37oC và

đếm số khuẩn lạc đơn. Kết quả được tính như sau :

Log CFU/ml = log (Ai . Di / V) (3.1)

Trong đó:

Ai là số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa

Di là độ pha loãng

V là dung tích huyền phù cho vào mỗi đĩa

3.3.4.2. Phương pháp đo mật độ quang [1] [8]

Nguyên tắc : Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ

lửng sẽ bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với

cường độ tia sáng đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ

phản ánh một cách tương đối lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường. Ngoài

ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng, do đó, lượng

ánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môi trường lỏng. Để

đánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế bào như các hạt

rắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch có tế bào nuôi cấy, đối

34

chiếu với môi trường lỏng không có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của

sinh khối vi khuẩn.

Lượng ánh sáng bị hấp thụ tỉ lệ tuyến tính với mật độ tế bào theo định

luật Lumber-Beer, điều kiện nghiệm đúng của định luật là ở mức OD thấp

(dưới 1), do đó, cần tiến hành pha loãng để mẫu đo luôn có OD thấp hơn 1.

OD thật sự của dịch được tính lại bằng cách nhân với độ pha loãng.

Tiến hành :

Chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MRS lỏng trong eppendorf

1ml. Sinh khối được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 600nm với mẫu

trắng (blank) là môi trường MRS không nuôi cấy. Mẫu được pha loãng (nếu

cần) bằng môi trường MRS lỏng.

3.3.5. Phương pháp khảo sát khả năng chịu muối mật [33] [11]

Nguyên tắc:

Khảo sát khả năng chịu muối mật của các chung vi khuẩn lactic trong

môi trường MRS lỏng có bổ sung 0,3% muối mật (No.3, Merck) dựa trên

phương pháp của Gilliand và Walker (1990) [15].

Các bước tiến hành: Quá trình khảo sát được tiến hành theo các bước

sau :

1. Hoạt hóa giống gốc chủng vi khuẩn cần khảo sát (phần 3.3.1)

2. Tiến hành nuôi cấy tăng sinh (phần 3.3.2)

3. Tiến hành phân phối giống sau khi tăng sinh vào các eppendoff (tỉ lệ

thể tích 1/10) trong môi trường MRS lỏng có bổ sung muối mật 0,3 %.

4. Ủ các eppendoff có chứa dịch vi khuẩn trên ở 370C và tiến hành lấy

mẫu ở 0 giờ, 4 giờ (mỗi giờ 3 eppendoff )

5. Đo OD sau mỗi mốc giờ tại bước sóng 600nm và tính kết quả theo

công thức 3.2

Tính kết quả : Mức độ chịu muối mật được xá định bằng thời gian

trung bình để tăng OD lên 0,3 đơn vị

(giờ) (3.2)

Trong đó: t : Thời gian tăng OD lên 0,3 đơn vị.

OD4: OD ở mốc thời gian 4 giờ.

ODo: OD ở mốc thời gian 0 giờ.

35

3.3.6. Phương pháp khảo sát khả năng chịu axit [33], [11]

Nguyên tắc:

Khả năng chịu axit của các chủng khảo sát được đánh giá qua lượng vi

khuẩn sống sót sau khi ủ ở pH 2, số tế bào vi khuẩn sống sót được xác định

theo phương pháp Kock (Do lượng tế bào sống sót ít nằm dưới ngưỡng đo

OD).

Tiến hành: Quá trình khảo sát được tiến hành theo các bước sau

1. Hoạt hóa giống gốc chủng vi khuẩn cần khảo sát (phần 3.3.1)

2. Tiến hành nuôi cấy tăng sinh (phần 3.3.2)

3. Ly tâm thu sinh khối ở 500 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng

4. Rửa sinh khối bằng đệm phosphate 0,1M pH 7 2 lần (1 lần 1ml

đệm/eppendoff)

5. Tái huyền phù trong 1ml đệm trên bằng votex

6. Trộn 1ml dịch sau khi tái huyền phù với 24,5 ml dung dịch có pH = 2

(Điều chỉnh dung dịch NaCl 0,2 % đến pH = 2 bởi HCl)

7. Phân phối vào 12 ống eppendoff (1ml dịch tái huyền phù/ống

eppendoff)

8. Tiến hành ủ các eppendoff có chứa dịch trộn trên ở các mốc thời gian

khác nhau (0 giờ, 1giờ, 2 giờ, 3 giờ)

9. Lấy mẫu sau mỗi mốc giờ (mỗi giờ 3 eppendoff), pha loãng từng

eppendoff thành các nồng độ khác nhau và chọn 3 nồng độ thích hợp

dàn đều (50µl) lên đĩa thạch MRS pH 6,2 (3 đĩa thạch cho 1 eppendoff)

10. Ủ các đĩa peptri ở 370 C trong vòng 48 giờ

11. Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc và tính kết quả theo công thức 3.1

3.3.7. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng

Cấy chuyền giống đã qua 24 giờ nuôi cấy vào các eppendoff có chưa

1ml môi truờng MRS lỏng pH 6,2 sao cho OD ban đầu đạt 0,05 ỏ bước sóng

600 nm.

Ủ mẫu trong tủ ổn nhiệt 37oC và lấy mẫu theo thời gian từng giờ 1

trong 8 giờ đầu, 2 giờ một lần trong 32 giờ tiếp theo và 8 giờ một lần trong 48

giờ sau đó, mẫu được đo sinh khối thông qua OD ở bước sóng 600nm.

36

3.3.8. Phương pháp xử lí số liệu [3]

Số liệu được tính trung bình, độ lệch chuẩn và xử lý ANOVA bằng

chương trình SAS 9.0.

37

PHẦN 4

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

4.

4.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật

Havenaar và cộng sự (1992) [18] đã chỉ ra rằng probiotic chỉ phát huy

tác dụng có lợi lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong ruột non. Môi

trường ruột non chứa pancreatine và muối mật là các yếu tố ức chế sinh

trưởng của vi sinh vật. Theo Gilliland và cộng sự (1984) [15], 0,15 - 0,3%

được xem là nồng độ quyết định để sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả

năng chống chịu muối mật.

Các chủng khảo sát được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường MRS

lỏng trong 24 giờ và được cấy chuyền vào môi trường MRS có bổ sung 0,3%

muối mật (No.3, Merck). Mẫu được lấy sau khi ủ 370C ở 0 giờ và 4 giờ, đo

OD ở bước sóng 600nm và kết quả được tính theo công thức 3.2.

Khả năng chịu muối mật được đánh giá thông qua thời gian tăng OD

lên 0,3 đơn vị. Thời gian càng ngắn thì chứng tỏ chủng có khả năng thích nghi

tốt và phát triển được trong môi trường có chứa muối mật (Hình 4.1).

Kết quả cho thấy tất cả các chủng khảo sát đều có khả năng tăng trưởng

được trong môi trường muối mật 0,3%, trong đó các chủng DC1, MC9,

MC10, DC2, MC5 có khả năng chịu muối mật cao nhất, tốc độ tăng OD lên

0,3 của chủng là khoảng từ 2,34 đến 3,24 giờ. Các chủng N1, N10, T9, T10,

N5 có tốc độ tăng OD 0,3 trong môi trường muối mật đạt trung bình, từ

khoảng 3,66 giờ đến 4,31 giờ. Nhóm có khả năng kháng muối mật kém là N5,

NC13 và NC10, các chủng này cần hơn 5 giờ để gia tăng OD lên 0,3 đơn vị

trong pha logarit.

38

Hình 4.1. Thời gian tăng OD 0,3 của các chủng vi khuẩn lactic trong môi

trường MRS có 0,3% muối mật

a, b, c, d, e: Các mức khác biệt có ý nghĩa khi xử lý ANOVA. Các giá trị có

cùng chữ cái xem như không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa p = 0,05.

Kết quả này tương đương với kết quả của Liong và cộng sự (2005)

[33]. Nhóm tác giả này đã tiến hành khảo sát khả năng tăng trưởng của vi

khuẩn lactic trong môi trường MRS có 0,3% dịch mật bò, kết quả cho thấy

thời gian tăng trưởng của các chủng khảo sát trong khoảng 2,36 (Lb. casei

ASCC 1520) đến 4,36 giờ (Lb. casei ASCC 290). Chủng DC1, MC9 trong thí

nghiệm của chúng tôi cũng có thời gian tăng trưởng tương đương với nhóm

kháng muối mật cao nhất của nhóm tác giả này.

Lin và cộng sự (2007) [28] khi nghiên cứu khả năng chịu muối mật bò

(0,3%) của các chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum phân lập từ lợn đã

cho thấy sau thời gian tăng OD 0,3 sau 4 giờ khảo sát là vào khoảng từ 1,3

39

giờ đến 4,1 giờ, trong số 20 chủng được khảo sát có đến 10 chủng có tốc độ

tăng OD lên 0,3 dưới 2 giờ, một chủng tăng mạnh nhất, chỉ mất trung bình 1,3

giờ để tăng OD lên 0,3 đơn vị, có hai chủng hầu như không phát triển được

trong môi trường có muối mật (OD không thay đổi đáng kể), các chủng còn

lại có thời gian tăng OD 0,3 vào khoảng 3 đến 4 giờ .

Mota và cộng sự (2006) [32] cũng đã tiến hành nghiên cứu khả năng

kháng muối mật của 3 chủng vi khuẩn Lb. acidophilus phân lập từ gà, kết quả

có 1 chủng hầu như bị ức chế hoàn toàn khi có dịch mật bò ở nồng độ 0,3% là

Lb. acidophilus 2M14E, hai chủng còn lại có tốc độ tăng trưởng tương đối

nhau là Lb. acidophilus 5C14E và Lb. acidophilus 2G14E với thời gian tăng

OD 0,3 đơn vị vào khoảng 2,1 đến 3 giờ.

Từ các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy khả năng kháng muối mật của

vi khuẩn lactic bằng thông số thời gian tăng OD lên 0,3 đơn vị trung bình ở

vào khoảng 2 – 5 giờ, những chủng kháng mạnh có thời gian khoảng từ 2 đến

3 giờ, và những chủng kháng kém có thời gian trên 4 giờ.

So sánh với một số nghiên cứu như trên, chúng tôi nhận thấy các

chủng DC1, MC9, MC10, DC2, MC5 có khả năng chịu muối mật tốt. Trong

đó các chủng DC1, MC9 có khả năng kháng muối mật cao. Các chủng MC10,

DC2, MC5 có khả năng kháng muối mật khoảng giữa cao và trung bình (thời

gian gần bằng 3). Với mục tuyển chọn dòng tiềm năng protiotic mạnh vì thế

chúng tôi chọn các chủng kháng cao (DC1, MC9) và cận cao (MC10, DC2,

MC5) để tiếp tục khảo sát khả năng chịu axit ở mốc pH 2.

4.2. Khảo sát khả năng chịu axit

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng chịu axit của các chủng vi

khuẩn DC1, MC9, MC10, DC2, MC5 qua các mốc giờ liên tục từ 0 giờ đến

3giờ trong dịch axit có pH 2. Chủng khảo sát được nuôi trong môi trường

MRS lỏng trong eppendort ở 37oC trong 24 giờ. Tiến hành ly tâm thu sinh

khối và ủ vào dịch pH 2. Mẫu được lấy vào 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ và pha

loãng ở các nồng độ khác nhau, dàn đều các nồng độ thích hợp (50µl) lên đĩa

thạch MRS. Kết quả được xác định thông qua lượng tế bào còn sống sót sau

3 giờ nuôi cấy bằng phương pháp Koch theo công thức 3.1.

40

Số lượng khuẩn lạc đơn đếm được qua 4 mốc giờ nuôi cấy thể hiện ở

các hình từ 4.3 đến 4.7 và kết quả ở đồ thị hình 4.2, cho thấy thời gian ủ mẫu

càng lâu thì tỉ lệ sống sót của các chủng càng giảm nhưng tất cả đều có khả

năng chịu axit và sống sót trong vòng 3giờ tại pH 2. Trong đó chủng MC9 là

chủng có khả năng chịu cao nhất.

Lượng tế bào ban đầu của các chủng khảo sát rất cao (lớn hơn 108

CFU/ml ) và chênh lệch nhau không đáng kể. Ở giờ nuôi đầu tiên thì lượng tế

bào đã bắt đầu giảm ở tất cả các chủng DC2 còn 7,52 logCFU/ml ( giảm

1,269 logCFU/ml), MC5 là 7,67 logCFU/ml ( giảm 1,116 logCFU/ml), MC10

là 7,62 logCFU/ml ( giảm 1,123 logCFU/ml), giảm nhanh nhất là DC1 chỉ

còn 6,7 logCFU/ml ( giảm 2,207 logCFU/ml ). Trong khi đó chủng MC9 vẫn

đang còn 8, 51 logCFU/ml tức là chỉ giảm có 0,237 logCFU/ml với tỉ lệ sống

sót cao rất nhiều so với các chủng còn lại (Phụ luc 1). Tương tự ở mốc 2 giờ

lượng tế bào vẫn tiếp tục giảm ở tất ở các chủng. Giảm nhiều nhất là DC1 còn

6,09 logCFU/ml và MC10 còn 6,16 logCFU/ml, tỉ lệ sống sót của 2 chủng

này giảm nhanh chỉ còn 0,15% (DC1), 0,26%( MC10) ( Phụ luc 1). Trong khi

đó dẫn đầu vẫn là chủng MC9 với tỉ lệ sống sót sau 2 giờ là 4,29% tương

đương với 7,35 logCFU/ml. Ở mốc 3 giờ cũng vậy lượng tế bào của các

chủng giảm nhanh nằm trong khoảng 5,12 - 6,57 logCFU/ml. Và ở mốc giờ

này chủng MC9 vẫn là chủng có khả năng chịu mạnh nhất.

Như vậy trong cả 3giờ thì chủng MC9 là chủng có khả năng chịu axit

tốt nhất tỉ lệ sống sót là 0.92 %, trong khi các chủng khác tỉ lệ sống sót đều rất

thấp.

41

Hình 4.2. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic ở pH 2

Zhou và cộng sự (2007) [32] cho rằng giá trị pH 2 và pH 3 được xem là

giới hạn quyết định trong sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng

làm probiotic. Kết quả nghiên cứu của Kim và cộng sự (2007) [25] cho thấy

khi xử lý bằng dịch dạ dày pH = 2,5, có 3/7 chủng vi khuẩn có khả năng chịu

môi trường axit, tuy nhiên, tỉ lệ sống của các chủng này giảm mạnh chỉ còn

0,8% đến 8% sau 30 phút xử lý và tiếp tục giảm mạnh sau 2 giờ xử lý (từ

0,04% đến 0,2% so với ban đầu).

Theo nghiên cứu của M. T. Liong và N.P. Shah [27] trên 11chủng

lactic bao gồm Lb.acidophilus và Lb.casei kết quả cho thấy cả Lb. acidophilus

và Lb.casei đều có khả năng chịu axit sau 2 giờ nuôi cấy. Trong đó Lb.

acidophilus ATCC 4962, Lb.casei ASCC 290 và Lb.casei ASCC 292 là

những chủng chịu tốt nhất khi giảm từ khoảng 1010cfu/ml (10 logCFU/ml)

xuống khoảng hơn 107 CFU/ml (khoảng 1000 lần), có một số chủng chỉ còn

42

104 CFU/ml (1 triệu lần). Như vậy, khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn

lactic thay đổi rất lớn theo chủng.

Kết quả nghiên cứu của Liu và cộng sự (2007) [29] cho rằng

Lactobacillus là chi lactic có khả năng chịu axit rất tốt trong đó chủng Lb.

acidophilus GG (ATCC 53103) là chủng duy nhất được phân lập từ phân

người có khả năng chịu axit với số lượng còn lại sau 2 giờ tại pH từ 1-2 là

khoảng 103 CFU (3 logCFU/ml).

Maragkoudakis và cộng sự (2006) [30] cũng khảo sát khả năng chịu

axit của một số chủng Lactobacillus, kết quả cho thấy các chủng có khả năng

kháng axit mạnh nhất là Lb. paracasei subsp. paracasei ACA-DC 130, Lb.

plantarum ACA-DC 146, Lb. rhamnosus ACA-DC 112, với mức giảm

logCFU/ml từ 8,6 xuống còn lần lượt là 6,8; 5,7 và 7,1 sau 3 giờ ủ ở pH 2,

ngoài ra, một số chủng trong nghiên cứu của nhóm tác giả này không có khả

năng sống sót ở pH 2 sau 1 giờ. Ở Việt Nam Nguyễn Vũ Tường Vy và cộng

sự (2007) [9] lại không phát hiện được một chủng vi khuẩn lactic nào có thể

chịu được pH 2 sau 2 giờ.

Như vậy theo như các nghiên trên thì các chủng lactic đều sống trong

điều kiện pH dạ dày và số lượng chúng giảm nhanh theo thời gian, điều này

hoàn toàn phù hợp với các chủng DC1, DC2, MC5, MC9, MC10.

Đối chiếu các nghiên cứu trên thì các chủng này có khả năng chịu axit

tốt sau 2 giờ vẫn còn tồn tại ở 106 –107 CFU với tỉ lệ sống sót là 0,26 – 4,29 %,

3giờ là 105 – 106 CFU tỉ lệ sống là 0,03 – 0,92 %.

Kết hợp 2 tiêu chí khả năng chịu axit và muối mật cho thấy có 4 chủng

có tiềm năng tốt là MC9, MC5, DC1, DC2, các chủng này có thể tiếp tục tiến

hành các khảo sát sâu hơn để sàng lọc dòng có tiềm năng probiotic. Qua đó

chúng tôi nhận thấy chủng MC9 có khả năng kháng lại muối mật và axit tốt

nhất. Chủng này được lựa chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo về khả

năng sinh trưởng và định danh.

43

44

Hình 4.3 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC1

trên đĩa peptri

A. Mẫu 0 giờ B.Mẫu 1 giờ C. Mẫu 2giờ D. Mẫu 3 giờ

A B

C D

45

Hình 4.4 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC2

trên đĩa peptri


A B

C D

46

Hình 4.5 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC5

trên đĩa peptri


A B

C D

47


trên đĩa peptri


A B

C D

48


trên đĩa peptri


A B

C D

4.3. Xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của MC9

Quá trình thu sinh khối của chủng vi khuẩn probiotic có ý nghĩa rất lớn

trong sản xuất các chế phẩm probiotic. Sinh khối của vi khuẩn thay đổi theo

thời gian, gồm 4 pha là pha thích ứng, pha logarit, pha ổn định và pha suy tàn

[5]. Việc nắm được thời gian của các pha có ý nghĩa lớn trong sản xuất, nhờ

đó xác định được thời điểm thu sinh khối cao nhất và tiết kiệm được thời gian

nuôi cấy và giảm chi phí sản xuất. Sinh khối của chủng làm probiotic thường

được thu vào cuối pha logarit, do lượng sinh khối cao và tế bào ở pha này sẽ

nhanh chóng thích nghi và tăng trưởng khi đưa vào môi trường mới.

Để tiến hành khảo sát đường cong tăng trưởng của chủng MC9 và xác

định thời điểm thu sinh khối tối ưu, chúng tôi tiến hành cấy mẫu vào môi

trường MRS lỏng, với mức pha loãng nhằm đạt được OD khởi điểm vào

khoảng 0,05. Mẫu được ủ ở 37oC trong eppendorf 1ml (không lắc). Tiến hành

lấy mẫu mỗi giờ 1 lần trong 8 giờ đầu, 2 giờ một lần trong 32 giờ tiếp theo và

8 giờ một lần trong 48 giờ cuối. Xác định sinh khối mẫu bằng cách đo OD ở

bước sóng 600nm.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 100

Thời gian (giờ )

OD

600

nm

49

Hình 4.8. Đường cong tăng trưởng của chủng MC9

Kết quả cho thấy trong 14 giờ đầu sinh khối tăng nhanh một cách đáng

kể đặc biệt là từ 4 giờ đến 14 giờ. Ở các mốc giờ còn lại thì mật độ tế bào tiếp

tục tăng chậm cho đến 96 giờ. Như vậy trong khoảng thời gian từ 0 - 4 giờ là

giai đoạn tiềm phát của quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào trong điều

kiện nuôi cấy tĩnh vì vậy trong khoảng thời gian này mật độ tế bào có tăng

nhưng chưa rõ rệt. Chỉ khi quá trình đi vào pha logarit (4 giờ -14 giờ) thì vi

khuẩn phát triển và sinh trưởng theo lũy thừa dẫn đến tốc độ tích lũy sinh

khối tăng nhanh một cách rõ rệt. Từ 14 giờ đến 96 giờ sinh khối có tăng

nhưng rất chậm, đây là pha ổn định của chủng MC9 (Hình 4.8).

Kết quả trên khá đồng nhất với một số nghiên cứu có khảo sát đường

cong tăng trưởng của Lactobacillus spp., Dumbrepatil (2008) và cộng sự [13]

cũng đã khảo sát khả năng sinh trưởng của Lactobacillus delbrueckii trong 40

giờ. Nhóm tác giả cũng nhận thấy rằng chủng Lactobacillus delbrueckii tốc

độ sinh trưởng tăng nhanh trong 12 giờ đầu, đến 14 giờ đã đi vào pha ổn

định .

Pha ổn định trong đường cong tăng trưởng của vi sinh vật thực chất là

một sự cân bằng động khi lượng vi khuẩn chết đi bằng với lượng sinh ra, nên

cân bằng này không đứng yên mà có sự thay đổi nhẹ, có thể tăng nhẹ hay

giảm nhẹ hoặc lúc giảm lúc tăng tùy đặc điểm của chủng.

Dựa vào kết quả trên, chúng tôi xác định thời điểm thu sinh khối tốt

nhất của chủng MC9 trong môi trường MRS lỏng, nuôi kỵ khí là 14 giờ.

4.4. Kết quả định danh

Chủng MC9 được định danh bằng phương pháp giải trình tự một phần

gen mã hóa trình tự cho tiểu phần ribosome 16S (rRNA 16S), kết quả được

tra cứu trên ngân hàng gen của NCBI thông qua chương trình search BLAST

và dựa vào sự tương đồng trong trình tự của đoạn gen để định danh đến loài.

Chủng được giải trình tự rRNA 16S tại Phòng thí nghiệm của công ty

Nam Khoa, TP Hồ Chí Minh, kết quả trình bày ở hình 4.9.

50

Hình 4.9. Trình tự một đoạn gen rDNA 16S của chủng MC9 và

Lactobacillus fermentum SFCB2-3

Query: chủng truy vấn: Lactobacillus fermentum SFCB2-3

Sbjct: chủng Lactobacillus spp. MC9

51

52

16s Ribosome RNA gen Chủng Lactobacillus MC9

Hình 4.10. Cây phân loại dựa trên trình tự rRNA 16S

Qua tra cứu ngân hàng dữ liệu trình tự gen trên NCBI, chúng tôi nhận

thấy trình tự gen rRNA 16S của chủng MC9 có sự tương đồng cao nhất với

chủng Lactobacillus fermentum SFCB2-3 (99%), mức tương đồng thể hiện

trong hình 4.9. Kết quả so sánh trong cây phân loại dựa trên sự tương đồng

trình tự rRNA 16s cũng cho thấy chủng này có quan hệ gần gủi về mặt di

truyền với nhiều chủng Lactobacillus fermentum khác (Hình 4.10). Từ đó

chúng tôi kết luận chủng MC9 thuộc loài Lactobacillus fermentum.

53

PHẦN 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.

5.1. KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút ra những kết luận sau

- 12 chủng vi khuẩn lactic DC1, DC2, MC5, MC9, MC10, N1, N5,

N10, T9, T110,NC10, NC13 đều có khả năng phát triển trên môi trường MRS

có bổ sung muối mật trong 4 giờ, cao nhất là DC1 và thấp nhất là NC10.

- 5 chủng chịu muối mật cao nhất ở trên là DC1, DC2, MC5, MC9,

MC10 đều có khả năng sống sót pH 2 sau 3 giờ nuôi cấy. Chủng chịu axit tốt

nhất là MC9 và kém nhất là MC10.

- Thời điểm thu sinh khối tốt nhất của chủng MC9 trên môi trường

MRS ở 37oC là sau 14 giờ nuôi cấy.

- Chủng MC9 thuộc loài Lactobacillus fermentum là chủng được tuyển

chọn trong quá trình nghiên cứu.

5.2. KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục nghiên cứu các tính chất để sàng lọc chủng làm probiotic và

định danh các chủng DC1, DC2, MC5, MC10.

- Tiến hành các thử nghiệm về tác dụng của các chủng trên trên động

vật.

- Nghiên cứu khả năng ứng dụng chủng MC9 vào sản xuất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

54

Tiếng Việt

1. Nguyễn Lân Dũng, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà

xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 1978.

2. Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nhà xuất bản giáo dục, Hà

Nội, 2001.

3. Nguyễn Thành Đạt (Chủ biên), Mai Thị Hằng (2001), Sinh học vi sinh vật,

NXB giáo dục.

4. Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp Hà Nội,

1998.

5. Lê Xuân Phương, Vi Sinh Vật Công Nghiệp, NXB xây dựng, Hà Nội,

2001

6. Nguyễn Thế Trang, Trần Đình Mấn, Một số đặc điểm phân loại của hai

chủng vi khuẩn lactic HN11 và HN34 sinh tổng hợp L(+)-Lactic axit phân

lập tại Việt Nam, Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4), 2008,505-511.

7. Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu, Nghiên cứu khả năng sống trong

môi trường đường tiêu hóa của động vật của một số chủng vi sinh vât

nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probotic, tạp chí khoa

học Đại học Huế, số 55, 2009.

8. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích Vi sinh vật trong nước, thực

phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo Dục.

9. Nguyễn Vũ Tường Vy, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa (2007), Khảo

sát khả năng chịu đựng acid, muối mật và kháng sinh của một số vi sinh

vật là nguyên liệu sản xuất probiotic dùng đường uống, Tạp Chí Dược

học, (378), tr. 255-263.

Tiếng Anh

55

10. Analie Lourens-Hattingh, Bennie C. Viljoen, Yogurt as probiotic carrier

food, 2001, International Dairy Journal 11 (2001) 1–17.

11. Arvola T, Sutas Y, Moilanen E, and Salminen S, Probiotics in the

management of atopic eczema, Clin. Exp. Allergy 2000, 30: 1604–161.

12. Corzo G., and Gilliland S.E. , Bile Salt Hydrolase Activity of Three

Strains, Oklahoma State University, Stillwater 74078.

13. Dumbrepatil A., Adsul M., Chaudhari S., KhireJ. , and Gokhale D.

(2008), Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production by

Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Mutant Uc-3 in Batch

Fermentation, Applied and environmental microbiology, Jan. 2008, Vol.

74, No. 1, p. 333–335 [ac6]

14. Fuller, R. Probiotics. J. Appl. Bacteriol. Symp. 1986, (Suppl 61), 1S–7S.

15.Gilliland, S. E., and D. K. Walker. 1990. Factors to consider when

selecting a culture of L. acidophilus as a dietary adjunct to produce a

hypercholesterolemic effect in humans. J. Dairy Sci.73:905–909.

16.Gunter Klein, Alexander Pack, Christine Bonaparte1, Gerhard Reuterk,

Taxonomy and physiology of probiotic lactic axit bacteria, International

Journal of Food Microbiology, 1998, 103-125.

17. Gyu Sung Cho and Hyung Ki Do, Isolation and Identification of Lactic

Axit Bacteria Isolated from a Traditional Jeotgal Product in Korea, Ocean

Science Journal, Vol. 41 No. 2, 2006,113-119.

18. Havenaar, R., Huis in’t Veld, J.H.J. Probiotics: a general view. In: Wood,

B.J.B. (ed) The lactic acid bacteria in health and disease. The lactic acid

bacteria, Vol. 1. Chapman and Hall, New York, 1992: 209-224.

19. Ignacio Guerrero Hernández,1 Aldo Torre Delgadillo,1 Florencia Vargas

Vorackova, 1 Misael Uribe, Intestinal flora, probiotics, and cirrhosis,

2008, 120-124.

20. J. B. Brian, Wood, The Lactic Axit Bacteria, The Lactic in Health And

Disease.

21. Joint FAO/WHO Expert Consultation, Health and Nutritional Properties

of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid

Bacteria Report, 2001.

56

22. Joint FAO/WHO Working Group, Guidelines for the Evaluation of

Probiotics in Food , 2002.

23. John F. T. Spencer, Alicia L. Ragout de Spencer, Food Microbiology

Protocols,173- 183.

24. Khalil R., Mahrous H., , Kamaly K. , Frank J., El-Halafawy K. and El

Soda M. (2007), Evaluation of the probiotic potential of lactic acid

bacteria isolated from faeces of breast-fed infants in Egypt, African

Journal of Biotechnology Vol. 6 (7), pp. 935-945, 2 April 2007 .

25.Kim P.I., Jung M.Y., Chang Y.H., Kim S., Kim S.J., Park Y.H. Probiotic

properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from

porcine gastrointestinal tract. Appl Microbiol Biotechnol, 74, (2007),

1103-1111.

26.Klaenhammer T.R. and Kullen M.J. Selection and design of probiotics.

Int. J. Food Microbiol, 50, (1999), 45-57.

27. Lars Axelsson, Lactic Axit Bacteria: Classification and Physiology, in:

Lactic Axit Bacteria, Microbiological and Functional Aspects, 3rd edition,

Seppo Salminen, Atte von Wright, Arthur Ouwehand, Marcel Dekker, Inc,

New York, USA, 2004, 1-67.

28. Lin W.H.,Yu B., Jang S.H., Tsen H.Y. (2007); Different probiotic

properties for Lactobacillus fermentum strains, isolated from swine and

poultry; Anaerobe 13 (2007) 107–113 .

29. Liu et al, Acid and bile salt resistant Lactobacillus isolates having the

ability to lower and assimilate cholesterol, United States Patent, 2007.

30. Maragkoudakisa P. A., Zoumpopouloua G., Miarisa C., Kalantzopoulosa

G., Potb B., Tsakalidou E, Probiotic potential of Lactobacillus strains

isolated from dairy products, International Dairy Journal 16,2006, p: 189–

199 .

31.Martins F.S., Miranda I.C., Rosa C.A., Nicoi J.R., and Neves M.J. Effect

of the trehalose levels on the screening of yeast as probiotic by in vivo and

in vitro assays Brazilian Journal of Microbiology, 39, (2008), 50-55.

32. Mota R. M., Moreira J. L., Souza M. R., Horta M. F., Teixeira S.,

Neumann E., Nicoli J. and Nunes A. C. (2006), Genetic transformation of

57

novel isolates of chicken Lactobacillus bearing probiotic features for

expression of heterologous proteins: a tool to develop live oral vaccines ,

BMC Biotechnology 2006, 6:2 doi:10.1186/1472-6750-6-2.

33. M. T. Liong and N. P. Shah, Acid and Bile Tolerance and Cholesterol

Removal Ability of Lactobacilli Strains, J. Dairy Sci, 2005, 88:55–66,

American Dairy Science Association.

34. Parvez1 S., Malik2 K.A. , Kang3 S. Ah and H.-Y. Kim, Probiotics and

their fermented food products are beneficial for health, Journal of Applied

Microbiology ISSN 1364-5072.

35. Suskovic J, Kos B, Matosic S. and Besendorfer V, The efect of bile salts

on survival and morphology of a potential probiotic strain Lactobacillus

acidophilus M92, World Journal of Microbiology & Biotechnology 16:

673-678, 2000.

36. Tournut, J. Applications of probiotics to animal husbandry. Rev. Sci.

Tech. Off. Int. Epiz. 1989, 8, 551–566.

37. Yang et al, Bifidobactera strains with acid, bile salt and oxygen tolerance

and their culture method, 1998.

38. Yuan Kun Lee And Seppo Salminen, Handbook of probiotics anhd

prebiotic, A Jonh Wiley and Sons, Inc., Publication.

39.Zhou X., Pan Y., Wang Y., and Li W. In vitro assessment of

gastrointestinal viability of two photosynthetic bacteria,

Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides. J. Zhejiang

Univ Sci B, 8(9), (2007), 686-692.

PHỤ LỤC 1

Các bảng số liệu của khảo sát khả năng chịu muối mật

58

Bảng 1: Kết quả thời gian OD 0,3 đơn vị của các chủng vi khuẩn lactic

trong môi trường MRS có bổ sung muối mật

STT Tên chủng Thời gian OD tăng lên 0,3

1 DC1 2.345e

2 DC2 3.188cde

3 MC5 3.238cde

4 MC9 2.636 de

5 MC10 3.025cde

6 N1 3.659 bcd

7 N5 5.067 a

8 N10 3.693a

9 T9 3.835bc

10 T10 4.307 ab

11 NC10 5.366 a

12 NC13 5.334 a

Bảng 2 : Bảng phân tích phương sai của kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 11 34.38513805 3.12592164 8.99 <.0001Error 24 8.34346497 0.34764437 Corrected Total

35 42.72860302

Bảng 3: Kết quả đo OD ( 600nm) của khả năng chịu muối mật

STT Tên chủng Thời gian ( giờ )0 4

0.33 0.331 0.355 0.812 0.823 0.818

59

1 DC1 0.3460.317

0.3640.311

0.3560.301

0.8340.889

0.8450.9

0.840.895

2 DC20.3180.3

0.299

0.340.3110.305

0.3210.3120.309

0.6830.670.7

0.6940.6810.711

0.6890.6760.706

3 MC50.3390.2890.301

0.340.2930.297

0.3390.3030.305

0.6540.7120.679

0.6650.7230.69

0.660.7180.685

4 MC90.260.2670.28

0.2510.2610.282

0.2620.2630.275

0.6120.7580.825

0.6230.7690.836

0.6180.7640.831

5 MC100.3340.3140.339

0.3280.3230.324

0.3330.3170.334

0.7790.7190.672

0.790.730.683

0.7850.7250.678

6 N10.2760.3010.296

0.2820.3020.305

0.2810.3090.292

0.6370.6

0.632

0.6280.6110.633

0.6330.6060.628

7 N50.3810.3790.394

0.3850.3960.402

0.3860.3860.405

0.6760.6010.605

0.6870.6120.616

0.6820.6070.611

8 N100.3150.3140.306

0.3010.3220.306

0.3170.3310.307

0.5790.6710.666

0.5860.6820.677

0.5850.6770.672

9 T90.2740.3

0.294

0.2640.2890.276

0.2830.2830.286

0.6410.5370.62

0.6520.5480.631

0.6470.5430.626

10 T100.3930.4130.394

0.3960.4140.396

0.4030.4210.397

0.70.680.652

0.7110.6910.663

0.7060.6860.658

11 NC10 0.3270.3310.325

0.3310.3230.327

0.3360.3270.324

0.520.5340.6

0.5310.5450.611

0.5260.540.606

12 NC13 0.2830.2710.277

0.2870.2690.278

0.2790.2740.292

0.4980.4730.528

0.5090.4840.539

0.5040.4790.534

PHỤ LUC 2

Các bảng số liệu của khảo sát khả năng chịu axit

Bảng 4: Số lượng tế bào đếm trên đĩa thạch của chủng DC1

60

STT Thời gian (giờ) Độ pha loãng Số tế bào

1 0 105400399400

2 1 103249248248

3 2 103636061

4 3 103403940

Bảng 5: Số lượng tế bào đếm trên đĩa thạch của chủng DC2

STT Thời gian ( giờ) Độ pha loãng Số tế bào

1 0 105173575374

2 1 104160173166

3 2 103119287203

4 3 10310496100

Bảng 6: Số lượng tế bào đếm trên đĩa thạch của chủng MC5

STT Thời gian (giờ) Độ pha loãng Số tế bào206

61

1 0 105 453329

2 1 104149363256

3 2 103211235223

4 3 102270264267


STT Thời gian ( giờ) Độ pha loãng Số tế bào

1 0 105263309286

2 1 105147177162

3 2 10413591113

4 3 103279264244


62

STT Thời gian (giờ) Độ pha loãng Số tế bào

1 0

105283286284

2 1105

227213220

3 2 104

747072

4 3102

716869

Bảng 9: Số lượng tế bào của các lactic trong khảo sát khả năng chịu axit( logCFU/ml)

STT Chủng

Số lượng tế bào ( logCFU/ml)

0 giờ 1giờ 2 giờ 3 giờ

1 DC1 8.903a 6.696d 6.085c 5.898c

2 DC2 8.786ab 7.517c 6.557b 6.279b

3 MC5 8.783ab 7.667b 6.642b 5.716d

4 MC9 8.742b 8.505a 7.346a 6.568a

5 MC10 8.755b 7.623b 6.152c 5.134e

Bảng 10: Tỉ lệ sống của các chủng lactic trong môi trường axit

Tên chủng 1 giờ 2 giờ 3 giờ

63

DC1 0.62c 0.1533c 0.1017c

DC2 6.26b 0.65bc 0.3867b

MC5 7.705b 0.785b 0.0983c

MC9 58.815a 4.285a 0.92a

MC10 7.83b 0.26bc 0.025c

Bảng 11: Bảng phân tích phương sai của khảo sát khả năng chịu axit 0 giờ


Model 4 0.14625980 0.03656495 1.93 0.1244

Error 40 0.75822550 0.01895564

Corrected Total 44 0.90448530


64


Model 4 14.83101450 3.70775362 329.88 <.0001

Error 40 0.44959000 0.01123975




Model 4 9.14077530 2.28519382 197.94 <.0001

Error 40 0.46179300 0.01154483




Model 4 10.87816170 2.71954042 104.84 <.0001

Error 40 1.03759300 0.02593982


Bảng 15 : Giá trị OD trung bình của khảo sát đường cong tăng trưởng

STT Thời gian ( giờ)

Gía trị OD trung bình

1 0 0.0494q

65

2 1 0.0773q

3 2 0.1215 q

4 3 0.2262 pq

5 4 0.4003 p

6 5 0.7207 o

7 6 1.2021n

8 7 1.854 m

9 8 2.4342 l

10 10 3.4026 k

11 12 4.1326j

12 14 4.6662hi

13 16 4.6756 hi

14 18 4.5777i

15 20 4.5872 i

16 22 4.7139 hig

17 24 4.9432fgh

18 26 4.8527 fghi

19 28 4.9874 efg

20 30 4.8949fgh

21 32 4.9563fg

22 34 5.1077def

23 36 5.0853def

24 38 4.7871hig

25 40 4.9099fgh

26 48 5.2345cde

27 56 5.4105bc

28 64 5.313bcd

29 72 5.3196bcd

30 80 5.4639bc

31 88 5.5286ab

32 96 5.7317a

66

PHỤ LỤC 3

Kết quả định danh chủng MC9 theo phương pháp giải trình gen 16S

67

68

Documents

Bao Cao Muoi