Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die ... · Das Laboratorium muss ein Qualitätsmanagementsystem entwickeln, umsetzen und pflegen, das alle Einrichtungen und Aktivitäten

In diesem Dokument wird im Interesse der Lesbarkeit grundsätzlich die männliche Form von Funkti-

onsbezeichnungen verwendet; dies schließt die weibliche Form ein.

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Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung

für die Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen anstreben

71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015

Geltungsbereich:

Diese Regel beinhaltet verbindliche Qualitätsmanagementanforderungen für Labore, die die Akkredi-

tierung gemäß DIN EN ISO/IEC 17025 für die Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen anstreben.

Diese Regel der Deutschen Akkreditierungsstelle (DAkkS) übernimmt vollständig und unverändert

den Inhalt des EPPO-Standards PM 7-98. (Quelle: 2010 OEPP/EPPO; Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 40,

5-22).

Datum der Bestätigung durch den Akkreditierungsbeirat: 03.11.2015

Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von

Schadorganismen von Pflanzen anstreben

71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 2 von 59

Inhaltsverzeichnis

Anwendungsbereich ................................................................................................................................ 3

2 Einführung ..................................................................................................................................... 3

3 Akkreditierungsbereich: fester und flexibler Bereich [Scope of accreditation] ............................ 3

4 Termini und Definitionen .............................................................................................................. 4

5 Managementanforderungen (ISO 17025 Punkt 4) ....................................................................... 5

4.1 Verpflichtung der obersten Leitungsebene (ISO 17025 Punkt 4.2.3) 5

4.2 Kontinuierliche Verbesserung und Überprüfung durch die Leitung (ISO 17025 Punkt 4.10) 5

6 Technische Anforderungen (ISO 17025 Punkt 5) .......................................................................... 6

5.1 Allgemeines (ISO 17025 Punkt 5.1) 6

5.2 Personal (ISO 17025 Punkt 5.2) 6

5.3 Räumlichkeiten und Umgebungsbedingungen (ISO 17025 Punkt 5.3) 6

5.4 Diagnostische Methoden (ISO 17025 Punkt 5.4) 6

5.5 Geräte (ISO 17025 Punkt 5.5) 14

5.6 Referenzmaterial (ISO 17025 Punkt 5.6.3.2) 14

5.7 Probenahme (ISO 17025 Punkt 5.7) 14

5.8 Umgang mit der Probe (ISO 17025 Punkt 5.8) 14

5.9 Sicherstellung der Diagnosequalität (ISO 17025 Punkt 5.9) 14

5.10 Ergebnisberichte (ISO 17025 Punkt 5.10.3) 14

7 Quellen ........................................................................................................................................ 14

8 Anhänge ...................................................................................................................................... 16

Anhang 1 - Liste von Tests, die Bestandteil von EPPO-Diagnoseprotokollen sind und häufig

verwendet werden ........................................................................................................... 16

Anhang 2 - Verfahren der Validierung eines Tests (A) durch Vergleich mit einem

validierten Test (B) ............................................................................................................ 26

Anhang 3 – Bericht zur Validierung eines Test .................................................................................... 28

Anhang 4 - Bericht zur Verifizierung eines Tests ................................................................................... 29

Anhang 5 – Tabellen mit detaillierter Anleitung für das Validierungsverfahren je Anwendungs-

bereich (Bakteriologie, Botanik, Entomologie, Mykologie, Nematologie, Virologie und

Phytoplasmologie) ............................................................................................................ 30

Anhang 6 – Validierung morphologischer und morphometrischer Methoden, die z. B. in der

Entomologie, Nematologie, Mykologie und Botanik verwendet werden ........................ 46

Anhang 7 – Beispiele für Laborberichte über kritische Punkte im Diagnoseverfahren und zu

Messunsicherheiten .......................................................................................................... 47




Anwendungsbereich

Diese Leitlinie beinhaltet besondere Qualitätsmanagementanforderungen für Laboratorien, die die

Akkreditierung gemäß ISO-Standard 17025 „General requirements for the competence of testing and

calibration laboratories“ [Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlabo-

ratorien] (Verweise auf die entsprechenden Teile des ISO-Standards 17025 sind enthalten) anstre-

ben. Es ist anzumerken, dass in EPPO-Standards das Verb „müssen/sind zu“ den höchsten Grad der

Verbindlichkeit darstellt.

1 Einführung

Die Entwicklung von Qualitätsmanagementsystemen (auch Managementsysteme oder Qualitätssys-

teme genannt) und die Akkreditierung sind für viele Laboratorien im EPPO-Gebiet wichtig geworden.

Der Standard PM 7/84 Basic requirements for quality management in plant pest diagnosis laborato-

ries [Grundlegende Anforderungen für das Qualitätsmanagement in Diagnoselaboratorien für Schad-

organismen von Pflanzen] wurde 2007 verabschiedet. PM 7/84 beschreibt grundlegende Anforde-

rungen, um Laboratorien, die mit der Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen befasst sind, bei

der Gestaltung ihrer Qualitätsmanagementsysteme zu unterstützen. PM 7/98 enthält zusätzliche

Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung anstreben. Er basiert auf dem ISO-Standard

17025 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories [Allgemeine

Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien] (ISO/IEC, 2005) und ist zu-

sammen mit PM 7/84 anzuwenden. Laboratorien beantragen die Akkreditierung in der Regel nur für

wenige Schadorganismen und nicht für alle Schadorganismen, für die sie möglicherweise eine Diag-

nose durchführen werden.

Die Akkreditierung nach ISO-Standard 17025 wird von den nationalen Akkreditierungsstellen durch-

geführt. Es ist wichtig, dass Laboratorien gute Kommunikationswege finden und während des gesam-

ten Vorgangs regelmäßigen Kontakt zu ihrer nationalen Akkreditierungsstelle halten.

Vorliegendes Dokument befasst sich mit der Diagnosequalität und nicht mit Fragen der Gesundheit

und Sicherheit im Besonderen. Die Laborpraxis muss jedoch den nationalen Gesundheits- und

Sicherheitsbestimmungen entsprechen.

2 Akkreditierungsbereich: fester und flexibler Bereich [Scope of accreditation]

Historisch betrachtet, erfolgte die Akkreditierung von Laboratorien in der Regel auf der Grundlage

eines festen Bereichs, der den Testbereich, der durch die Akkreditierung des Laboratoriums abge-

deckt ist, klar und eindeutig festlegt (z. B. Immunofluoreszenztest für den Nachweis von Ralstonia

solanacearum an Kartoffelknollen). Dennoch ist es nicht ohne weiteres möglich, neue oder modifi-

zierte Tests zum Akkreditierungsbereich eines Laboratoriums zuzufügen, auch wenn die Eignung des

Laboratoriums für die Durchführung und Validierung ähnlicher Tests schon von einer Akkreditie-

rungsstelle begutachtet wurde. Obwohl die Erweiterung des Bereichs jederzeit beantragt werden

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2338.2007.01174.x/pdf


http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/epp.12118/pdf





kann, kann die benötigte Zeit de facto eine schnelle Reaktion auf Wünsche des Kunden verhindern.

Deshalb wurde das Konzept des flexiblen Akkreditierungsbereichs entwickelt.

Ein flexibler Akkreditierungsbereich ermöglicht es einem Labor, bestimmte Tests durchzuführen und

die Ergebnisse als akkreditiert auszugeben, auch wenn diese Tests nicht ausdrücklich im Akkreditie-

rungsbereich des Laboratoriums genannt sind („Requirements for the Accreditation of Flexible Scopes

EA-2/15, 2008“ [Anforderungen an die Akkreditierung flexibler Bereiche] EA-2/15, 2008). Der Bedarf

nach einem flexiblen Akkreditierungsbereich kann zum Beispiel in folgenden Situationen entstehen:

Optimierung eines akkreditierten Tests,

Modifizierung eines akkreditierten Tests, um weitere Anwendungen zu ermöglichen (z. B. für

neue Matrizes),

Aufnahme eines Tests, der dem bereits akkreditierten gleichwertig ist.

Das Konzept des flexiblen Bereichs beinhaltet einen Grad an Flexibilität, der normalerweise mit der

Akkreditierungsstelle abgestimmt ist. Dennoch ist anzumerken, dass dieser Grad an Flexibilität auf

nationaler Ebene unterschiedlich ausgelegt wird. Bisherige Erfahrungen mit Laboratorien für Schad-

organismen von Pflanzen zeigen, dass es durch den flexiblen Bereich für ein Laboratorium leichter ist,

vor dem Audit und der Akkreditierung für neue Tests akkreditiert zu werden. Es trägt dabei jedoch

größere Verantwortung nachzuweisen, dass ein Test gültig und dem Anwendungszweck angemessen

ist und mit Kompetenz und Zuverlässigkeit durchgeführt wird. Gibt ein Laboratorium einen Test als

akkreditiert aus und werden bei einem späteren Audit Probleme mit den verwendeten Verfahren

festgestellt, könnte es passieren, dass die Ergebnisse als ungültig gelten und alle ausgestellten Diag-

noseberichte zurückgezogen werden müssen. Es ist also sinnvoll, Erfahrung mit einer Akkreditierung

mit festem Anwendungsbereich zu sammeln, bevor ein Laboratorium einen flexiblen Akkreditie-

rungsbereich beantragt, weil in beiden Fällen alle Anforderungen des ISO-Standards 17025 eingehal-

ten werden müssen. Ein Laboratorium kann jedoch bereits für andere Aktivitäten als die Diagnose

von Schadorganismen von Pflanzen akkreditiert sein. Erfahrungen mit einer festen Akkreditierung auf

anderem Gebiet können für die sofortige Beantragung einer flexiblen Akkreditierung für die Diagnose

von Schadorganismen von Pflanzen ausreichend sein.

3 Termini und Definitionen

Die Definitionen der in vorliegendem Standard verwendeten Termini sind in PM 7/76 Use of EPPO

diagnostic protocols [Verwendung von EPPO-Diagnoseprotokollen] (wird überarbeitet) enthalten.

In vorliegendem Standard bezieht sich „Test“ [test] auf die Anwendung einer Methode auf einen

bestimmten Schadorganismus und eine bestimmte Matrix [matrix]. Alle Testergebnisse von Labora-

torien, die Tests für Quarantäneschadorganismen durchführen, werden qualitativ angegeben (Test

positiv oder negativ oder unklar). Im Ergebnis einiger Tests erhält man quantitative Ergebnisse (z. B.

optische Dichte bei ELISA, Anzahl der Zellen bei IF-TEST, Ct-Werte bei Real-Time-PCR, Messwerte für

morphologische Merkmale). Diese quantitativen Angaben werden jedoch für die Ermittlung eines

qualitativen Werts (positiv/negativ/unklar) verwendet. Folgende Methoden können verwendet wer-

den: Bioassays, biochemische Methoden, Fingerabdruck, Isolierung/Extraktion, molekulare Metho-

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2338.2010.02407.x/full




den, morphologische und morphometrische Methoden, Pathogenitätsbewertung und serologische

Methoden.

4 Managementanforderungen (ISO 17025 Punkt 4)

Das Laboratorium muss ein Qualitätsmanagementsystem entwickeln, umsetzen und pflegen, das alle

Einrichtungen und Aktivitäten im Rahmen der akkreditierten Diagnose von Schadorganismen von

Pflanzen abdeckt.

Das Managementsystem muss die betroffenen Einrichtungen und Aktivitäten (einschließlich Einzel-

heiten zu den Kunden und getesteten Schadorganismen) beschreiben. Das Qualitätssystem muss

dokumentiert und die Qualitätsdokumente müssen archiviert werden (siehe auch unten).

Managementsystem des Laboratoriums: siehe derselbe Abschnitt PM 7/84.

4.1 Verpflichtung der obersten Leitungsebene (ISO 17025 Punkt 4.2.3)

Die oberste Leitungsebene (z. B. der Institutsdirektor) verpflichtet sich, die Ziele des Qualitätsmana-

gements zu erreichen und die Effektivität seines Managementsystems ständig zu erhöhen. Sie er-

bringt einen Nachweis dieser Verpflichtung.

4.2 Kontinuierliche Verbesserung und Überprüfung durch die Leitung (ISO 17025 Punkt 4.10)

Das Managementsystem des Laboratoriums einschließlich der Labortests wird regelmäßig von der

obersten Leitung überprüft, um dessen fortdauernde Eignung und Effektivität sicherzustellen und

notwendige Änderungen und Verbesserungen einzuführen. Das Laboratorium setzt ein Programm für

kontinuierliche Verbesserungen um. Interne Verfahren und externe Begutachtungen können die

notwendigen Informationen liefern. Zu internen Verfahren zählen:

das Festlegen von Qualitätszielen und geeigneten Qualitätsindikatoren (z. B. pünktliche Lieferung

der Ergebnisse oder Verbesserung des Kundenfeedback). Das ist durch die Leitung zu überprüfen.

die Organisation von Mitarbeiterbesprechungen zu folgenden Themen:

o die Planung von vorbeugenden Maßnahmen und die Bewertung der Wirksamkeit von Korrek-turmaßnahmen,

o die gründliche Analyse interner Audits [audit],

o die Prüfung von Beschwerden und entsprechender Korrekturmaßnahmen usw.

o das Feststellen von Schulungsbedarf,

o das Sammeln von Verbesserungsvorschlägen der Mitarbeiter.

Verfahren zum Einholen eines Kundenfeedbacks.

Trendanalysen (technische oder Management).

Bewertungen durch externe Audits, Ergebnisse von Laborvergleichsuntersuchungen [inter-laboratory

comparisons] (Eignungsprüfungen [profiency tests] und/oder die Prüfung der Leistungsfähigkeit eines

Tests [test performance studies]) sind ebenfalls wichtige Elemente der kontinuierlichen Verbesse-

rung.





5 Technische Anforderungen (ISO 17025 Punkt 5)

5.1 Allgemeines (ISO 17025 Punkt 5.1)

Siehe gleicher Abschnitt PM 7/84

5.2 Personal (ISO 17025 Punkt 5.2)


5.3 Räumlichkeiten und Umgebungsbedingungen (ISO 17025 Punkt 5.3)


5.4 Diagnostische Methoden (ISO 17025 Punkt 5.4)

5.4.1 Allgemeines (ISO 17025 Punkt 5.4.1)

Das Laboratorium verwendet geeignete Methoden und Verfahren für alle Tests im Rahmen seines

Akkreditierungsbereichs. Dazu gehören Handhabung, Transport, Lagerung, Aufbereitung und Testung

von Proben und ggf. die Probenahme selbst. Es wird erwartet, dass Diagnoselaboratorien über

Kenntnisse der Biologie von Organismen verfügen und diese berücksichtigen, wenn sie Teilproben

nehmen und/oder wenn sie Proben für eine Untersuchung aufbereiten, was den Umgang mit Proben

einschließt. Gekaufte Geräte, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien müssen für den Verwendungs-

zweck geeignet sein.

Alle Anweisungen, Standards, technischen Handbücher, Informationen der Hersteller und Referenz-

daten, die für die Arbeit des Laboratoriums benötigt werden, müssen auf dem Laufenden gehalten

werden und dem Personal leicht zugängig sein.

5.4.2 Auswahl der Tests (ISO 17025 Punkt 5.4.2)

Ein Laboratorium verwendet Diagnosetests, die dem Anwendungszweck entsprechen (siehe EPPO-

Standard PM 7/76 Use of EPPO diagnostic protocols [Verwendung von EPPO-Diagnoseprotokollen].

Gesetzlich vorgeschriebene Tests (z. B. durch die Europäischen Union oder die nationale Gesetz-

gebung) sind für die betreffenden Länder bindend. Ist kein Test verbindlich, sollten vorzugsweise

veröffentlichte internationale, regionale oder nationale Standards verwendet werden. Stehen solche

Tests nicht zur Verfügung oder kann die Leistung verbessert werden, können laboreigene oder ange-

passte Tests berücksichtigt werden.

Das Laboratorium stellt sicher, dass es die neueste gültige Fassung eines Tests verwendet, es sei

denn, dies ist unzweckmäßig oder nicht möglich1. Die Testbeschreibung ist gegebenenfalls um weite-

re Einzelheiten zu ergänzen, wenn dadurch die zuverlässige Anwendung im Laboratorium unterstützt

wird.

1 Ein Laboratorium darf die frühere Version eines Tests weiterhin verwenden, wenn diese dem An-

wendungszweck noch angemessen ist.








Ein Labor, das die Akkreditierung anstrebt, darf nur validierte Tests verwenden. Ist das nicht der Fall,

muss der Test im Laboratorium ein Validierungsverfahren durchlaufen (siehe 5.4.3). Wird ein vali-

dierter Test verwendet, muss das Laboratorium einen objektiven Nachweis dafür erbringen, dass es

den Test entsprechend der festgelegten Leistungskriterien durchführen kann (siehe 5.4.4).

Tests, mit denen Angaben zu allen Leistungskriterien erbracht werden, gelten im Rahmen des vorlie-

genden Dokuments als "vollständig validierte Tests" und entsprechen den "Standardmethoden" im

ISO-Standard 17025.

5.4.3 Validierung von Tests (ISO 17025 Punkt 5.4.5)

Mit der Validierung wird ein objektiver Nachweis dafür erbracht, dass der Test für den Anwendungs-

zweck geeignet ist (siehe EPPO-Standard PM 7/76, in dem unterschiedliche Anwendungszwecke be-

schrieben werden). Untersuchungen der Leistungsfähigkeit eines Tests können ein wertvoller Be-

standteil des Validierungsverfahrens sein.

5.4.3.1 Validierung von Tests, die nicht auf morphologischen und morphometrischen Methoden

beruhen

Allgemeines

Ein Test gilt als vollständig validierter Test, wenn Angaben für die folgenden Leistungskriterien vorlie-

gen: analytische Sensitivität, analytische Spezifität, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit. Je

nach Anwendungsbereich des Tests muss eventuell die Selektivität bestimmt werden. Je nach lokalen

Bedingungen (z. B. der Wahrscheinlichkeit von Falschreaktionen mit nah verwandten Organismen,

die in den Originaldaten nicht enthalten sind) sind durch das Laboratorium möglicherweise auch wei-

tere Angaben zur analytischen Spezifität beizubringen. Sobald diese Angaben vorliegen, gelten solche

Tests als validiert. Liegen keine Angaben zu den Leistungskriterien vor oder sind diese nicht zugäng-

lich (z. B. veröffentlichte Quellen oder Datenblätter für Validierungen der EPPO—Diagnose-

Datenbank2), muss das Laboratorium die fehlenden Angaben beibringen oder begründen, warum sie

nicht beigebracht werden konnten. Sind Angaben zu Leistungskriterien teilweise verfügbar, ist durch

das Laboratorium zu verifizieren, dass es den Test diesen entsprechend durchführen kann (siehe

5.4.4).

Nicht alle Tests in EPPO-Diagnoseprotokollen sind validiert. Eine Erhebung über die Verwendung von

Tests aus EPPO-Diagnoseprotokollen aus dem Jahr 2008, die 2013 wiederholt wurde, (Petter &

Suffert, 2010) hat ergeben, dass die in Anhang 1 genannten am häufigsten verwendet werden. Damit

gelten sie für das EPPO-Diagnose-Panel als ausreichend vertrauenswürdig in Bezug auf Wiederhol-

barkeit und Reproduzierbarkeit. Ein Labor, das diese Tests anwendet, muss zumindest Validierungs-

daten für die analytische Sensitivität und analytische Spezifität beibringen oder sammeln.

Das regelmäßige Überprüfungsprogramm für EPPO-Diagnoseprotokolle beinhaltet das Ergänzen von

Validierungsdaten.

2 http://dc.eppo.int





Validierungsverfahren

Wie in ISO 17025 erwähnt "muss das Laboratorium die erhaltenen Ergebnisse und das für die Validie-

rung verwendete Verfahren aufzeichnen".

Das allgemeine Validierungsverfahren wird nachfolgend beschrieben (siehe auch Abb. 1). Eine detail-

liertere Anleitung findet sich in den Tabellen 4 bis 9 im Anhang 5.

Bestimmung des Anwendungsbereichs des Tests, z. B. Nachweis und/oder Bestimmung eines Or-

ganismus X in einer Matrix Y mit Hilfe der Methode Z unter Berücksichtigung jeglicher besonderer

Anforderungen unter den gegebenen Testbedingungen (Beispiele in PM 7/76).

Festlegung der technischen Anforderungen zur Bestimmung der Leistungskriterien analytische

Spezifität, analytische Sensitivität, Selektivität, Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit anhand

der Anleitung in den Tabellen 4 bis 9. Anschließend Bestimmung der Art und der Zusammenset-

zung der Proben, die für die Validierung benötigt werden. Die Validierung erfolgt mit Referenzma-

terial (siehe Definition in PM 7/84) einschließlich künstlich verseuchte oder gespikte Proben.

Werden Kulturen oder Isolate für biologische Tests verwendet, ist darauf zu achten, dass sie

nachweislich virulent sind.

Planung und Durchführung der Validierung für einzelne Leistungskriterien oder in einen kombi-

nierten Test. Es wird empfohlen, die Schritte gemäß Abbildung 1 durchzuführen.

Darstellung der Ergebnisse in einem Validierungsbericht einschließlich Schlussfolgerung, ob der

validierte Test die Anforderungen gemäß Punkt 1 erfüllt.

Die Verwendung eines Formulars "Bericht zur Validierung eines Tests" könnte nützlich sein, das

Formular kann wie in Anhang 3 gestaltet sein.









Die Validierung eines Tests (A) durch Vergleich mit einem validierten Test (B) ist auch möglich und

kann in bestimmten Situationen (siehe Anhang 2) geeignet sein. Das bedeutet jedoch nur, dass z. B.

Test (A) in Bezug auf bestimmte Leistungskriterien genauso gut ist wie der validierte Test (B).

Die hier beschriebenen Validierungsverfahren (und insbesondere die Erklärungen in den Tabellen 4

bis 9 im Anhang 5) gelten als allgemeine Anleitung für die Validierung von Tests. Die in den Tabellen

genannten Zahlen basieren auf Validierungserfahrungen von Experten der EPPO-Diagnose-Panels.

Der Validierungsumfang ergibt sich aus dem Verhältnis von Kosten, Risiken und technischer Mach-

barkeit. Abweichungen von dieser Anleitung können sich zwangsläufig aus der Kombination von

Schadorganismus und Pflanze ergeben. In diesem Fall ist der Grund für die Abweichung zu dokumen-

tieren. In vorliegendem Dokument kann keine detaillierte Beschreibung für jede Kombination ange-

boten werden.

Validierung nach signifikanter Änderung

Verändert das Laboratorium einen "vollständig validierten Test" signifikant (z. B. durch Untersuchun-

gen außerhalb des ursprünglichen Bereichs), muss dieser "neue" Test validiert werden. Verändert das

Laboratorium einen validierten Test geringfügig, ist zu beurteilen und entsprechend zu dokumentie-

ren, ob der Test aufgrund dieser Änderung validiert oder verifiziert werden muss. Jede Änderung

muss von einer geeigneten Person autorisiert werden, und ggf. ist der Kunde oder die Akkreditie-

rungsstelle zu benachrichtigen.

Zusätzliche Informationen

Gesammelte Daten und Ergebnisse aus laboreigenen Validierungen (insbesondere zur Reproduzier-

barkeit) sowie Ergebnisse aus Laborvergleichsuntersuchungen (Eignungsprüfungen) können auch auf

die Robustheit eines Tests hinweisen, z. B. inwiefern unterschiedliche Reagenzien oder geänderte

Testbedingungen die zu erwartenden Testleistungswerte beeinträchtigen. Daten über die diagnosti-

sche Sensitivität oder Spezifität lassen sich auch durch einen Vergleich mit einem oder mehreren

alternativen Tests gewinnen.

5.4.3.2 Validierung morphologischer und morphometrischer Methoden

Es ist anerkannt, dass die Verfahren morphologischer und morphometrischer Methoden letztendlich

Urteile aufgrund einer Expertenmeinung darstellen. Aus diesem Grund kann die Validierung nicht

denselben Verfahren folgen wie bei den anderen Tests. Eine Anleitung für die Validierung morpholo-

gischer und morphometrischer Methoden ist in Anhang 6 enthalten. Die Anleitung gilt für alle An-

wendungsgebiete (Entomologie, Nematologie, Mykologie, Botanik usw.). Das Laboratorium sollte die

Wahl der morphologischen oder morphometrischen Methoden begründen können, insbesondere

wenn diese nicht in internationalen Standards oder in begutachteten (peer reviewed) Fachzeitschrif-

ten beschrieben sind.

5.4.4 Verifizierung der Fähigkeit eines Laboratoriums, einen bestimmten Test durchzuführen (ISO

Punkt 5.4.2 Absatz 2 letzter Satz)

Verifizierung ist das Verfahren, nach dem der objektive Beweis erbracht werden muss, dass ein Labo-

ratorium in der Lage ist, einen bestimmten vollständig validierten Test dem Anwendungszweck ent-

sprechend durchzuführen.




5.4.4.1 Verifizierung von Tests, die nicht auf morphologischen und morphometrischen Methoden

beruhen

Allgemeines

Durch die Verifizierung wird der objektive Nachweis dafür erbracht, dass ein Laboratorium in der

Lage ist, einen vollständig validierten Test entsprechend seiner festgelegten Leistungskriterien durch-

zuführen. Die Verifizierung kann auch durch Teilnahme an einer Eignungsprüfung oder einer Unter-

suchung der Leistungsfähigkeit eines Tests erfolgen, sofern die Anforderungen in Tabelle 1 erfüllt

werden können.

Zusätzliche Informationen

Die Wahl der Reagenzien kann entscheidend für die Leistung eines Tests sein. Die Änderung der Rea-

genz (oder Partien/Chargen einer Reagenz) oder des Anbieters kann die Leistung eines Tests beein-

flussen. In diesem Fall muss die Leistung der Reagenz entweder durch Vergleich mit der vorher ver-

wendeten Reagenz oder gemäß Tabelle 1 verifiziert werden.

Tabelle 1. Anleitung für die Verifizierung von Leistungskriterien

Leistungskriterien Verifizierungsmethode

Analytische Sensitivität Mindestens 8 Proben1 an der ermittelten Nach-weisgrenze testen (bei Viren, Viroiden und Phytplasmen sollte dies bei niedriger Kontamina-tion erfolgen).

Kombinierbar mit Wiederholbar-keit/Reproduzierbarkeit

Analytische Spezifität Einige der wichtigsten Zielorganismen (z. B. un-terschiedliche Stämme) und Nicht-Zielorganismen1 auswählen. Die Tests sind bei bei mittlerer Kontamination durch die Organis-men durchzuführen.

Wiederholbarkeit Mindestens 3 Parallelversuche mit demselben Material bei niedriger Kontamination durch Ziel-organismen durchführen.

Reproduzierbarkeit Wie bei Wiederholbarkeit, aber zu unterschiedli-chen Zeiten, wenn möglich durch unterschiedli-che Mitarbeiter und ggf. mit unterschiedlichen Geräten

* künstliche Teilproben einer Probe können verwendet werden




Verifizierungsverfahren

Das allgemeine Verifizierungsverfahren wird weiter unten beschrieben (siehe auch Abb. 2).

Durchführung des validierten Tests wie beschrieben oder mit geringen Änderungen, um lokale

Bedingungen zu berücksichtigen (z. B. Anbieter von Reagenzien oder Geräten, sofern dies nicht

ausdrücklich im validierten Test gefordert ist) und um zu bewerten, ob das Laboratorium die Wer-

te für die Leistungskriterien der Validierungsdaten erreicht (siehe Leitlinien Tabelle 1). Die Selekti-

vität braucht nicht verifiziert werden.

Wenn Abweichungen von den im validierten Test beschriebenen Bedingungen die Testergebnisse

beeinträchtigen, sind die Gründe für die Abweichungen zu untersuchen. Der Test ist zu korrigie-

ren, erneut zu verifizieren oder ggf. nach dem im Abschnitt "Validierung von Tests" beschriebe-

nem Verfahren zu validieren. Werden die Leistungswerte nicht erreicht, ist zu untersuchen, ob die

geringfügigen Änderungen des Tests die Ursache dafür sind. Ist das nicht der Fall, ist externer Rat

einzuholen (z. B. Kontakt zum Autor des Tests). Dann sollten Anpassungen vorgenommen und re-

levante Schritte wiederholt werden. Wurden andere Gründe für die Abweichung festgestellt (z. B.

Fehler durch Mitarbeiter), muss eine Korrektur erfolgen und diese dokumentiert werden.

Ergebnisse des Verifizierungstests:

(A) Die Leistungswerte werden erreicht: das Laboratorium kann den Test für Routinezwecke ver-

wenden, und es ist ein Verifizierungsbericht mit dem bescheinigt wird, dass die Anforderungen

eingehalten oder nicht eingehalten wurden, zu erstellen. Möglicherweise ist die Verwendung ei-

nes Formulars "Bericht zur Verifizierung eines Tests" sinnvoll, das Formular kann wie in Anhang 4

gestaltet sein.

(B) Die Leistungswerte werden nicht erreicht: das Laboratorium darf den Test nicht entsprechend

der festgelegten Leistungskriterien anwenden.




5.4.4.2 Verifizierungsverfahren morphologischer und morphometrischer Methoden

Das Laboratorium muss bestätigen, dass es eine validierte morphologische und/oder

morphometrische Bestimmung sachgerecht durchführen kann. Solch eine Verifizierung kann durch

Teilnahme an einer Eignungsprüfung oder durch die Bestimmung mehrerer Proben im Laboratorium

und anschließende Bestätigung durch einen unabhängigen Fachexperten erfolgen.




5.4.5 Messunsicherheit (ISO 17025 Punkt 5.4.6)

Die Laboratorien müssen die Faktoren der Testunsicherheit wie z. B. das Personal, Geräte und biolo-

gische Eigenschaften (d. h. Serotypen, Pathotypen) ermitteln. Wiederholbarkeit und Reproduzierbar-

keit geben Auskunft über den Grad der Unsicherheit eines Testergebnisses. Wann immer es möglich

ist, sind geeignete Maßnahmen zur Einschränkung dieser Unsicherheiten zu ergreifen. Werden keine

Maßnahmen ergriffen, sind die Gründe dafür festzuhalten, und der Kunde ist über die Unsicherheiten

rings um den Test umfassend zu informieren.

Obwohl die Tests zur Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen zumeist qualitative Ergebnisse

liefern, können diese qualitativen Ergebnisse auf Messungen beruhen (morphometrische Daten, Zäh-

len von Zellen). Eine solche Messung mag nur einen Teil des Diagnoseverfahrens ausmachen. Ist es

jedoch für die Diagnose entscheidend, ist ihre Unsicherheit zu schätzen. Zwei Beispiele für Laborbe-

richte zur Feststellung kritischer Punkte eines Verfahrens sind in Anhang 7 enthalten.

5.5 Geräte (ISO 17025 Punkt 5.5)

Siehe derselbe Abschnitt PM 7/84

5.6 Referenzmaterial (ISO 17025 Punkt 5.6.3.2)


5.7 Probenahme (ISO 17025 Punkt 5.7)


5.8 Umgang mit der Probe (ISO 17025 Punkt 5.8)


5.9 Sicherstellung der Diagnosequalität (ISO 17025 Punkt 5.9)


5.10 Ergebnisberichte (ISO 17025 Punkt 5.10.3)

Siehe EPPO-Standard PM 7/77 Documentation and reporting on a diagnosis [Dokumentation und

Bericht zu einer Diagnose]

6 Quellen

AFNOR (12995). XP V03-111 Agricultural and food products analysis protocol for the intra-laboratory

evaluation of an alternative method of qualitative analysis against a reference method. Association

Française de Normalisation, La Plaine Saint-Denis, FR.

EA (2008) EA-2/15 Requirements for the Accreditation of Flexible Scopes

http://www.eurolab.org/docs/EA/EA-2_15.pdf [accessed 2009-09-16]. European Association for Ac-

creditation







http://www.eurolab.org/docs/EA/EA-2_15.pdf




EPPO (2007), Basic requirements for quality management in plant pest diagnosis laboratories. EPPO

Bulletin, 37 580-588

EPPO (2010), PM 7/76 (2): Use of EPPO diagnostic protocols. EPPO Bulletin, 40: 350–352.

EPPO (2006), PM 7/77 (1): Documentation and reporting on a diagnosis. EPPO Bulletin, 36: 459–460.

Hughes K. J. D., Griffin R. L., Tomlinson J. A., Boonham N., Inman A. J. & Lane C. (2006) Development

of a one step real-time PCR assay for diagnosis of Phytophthora ramorum. Phytopathology 96: 975-

981.

ISO/IEC (2005) Standard 17025 General requirements for the competence of testing and calibration

laboratories (verfügbar auf www.iso.org)

Petter F. & Suffert M. (2010) Survey on the use of tests mentioned in EPPO Diagnostic protocols Bul-

letin OEPP/EPPO Bulletin 40, 5-22.

ISO (2003) ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of

alternative methods (verfügbar auf www.iso.org)

http://www.iso.org/




7 Anhänge

Anhang 1 - Liste von Tests, die Bestandteil von EPPO-Diagnoseprotokollen sind und häufig ver-

wendet werden

Aufgrund der Erhebungen der EPPO zur Verwendung der EPPO-Diagnoseprotokolle wurde festgelegt,

dass ein Test als breit angewendet gilt, wenn er in mindestens 2 Laboratorien und für mindestens 8

Proben je Laboratorium verwendet wird. Beachten Sie bitte, dass molekulare Tests die DNS-

Extraktion einschließen.

BAKTERIOLOGIE

PM 7/20 (2) Erwinia amylovora

o asymptomatische Pflanzen – direkte Isolierung (auf CCT, King B und Levanmedium)

o asymptomatische Pflanzen - Enrichment DASI ELISA

o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer konventionellen PCR

o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer PCR (Bereswill et al.1992)

o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer Real-Time-PCR (Gottsberger, 2010)

o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer Real-Time-PCR (Pirc et al.2009)

o asymptomatische Pflanzen – Anreicherungsisolierung (auf King B oder CCT)

o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Agglutinationstest

o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von DNS-Sequenzierungen

o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Hypersensitivitätstests

o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem IF-Test

o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Pathogenitätstest

o symptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Agglutinationstest

o symptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von biochemischen Tests

o symptomatische Pflanzen – Direkte Isolierung (auf CCT, King B und Levanmedium)

o symptomatische Pflanzen - DNS-Sequenzierung

o symptomatische Pflanzen - Enrichment DASI ELISA

o symptomatische Pflanzen - Anreicherungsisolierung (auf King B oder CCT)

o symptomatische Pflanzen – Erstellung eines Fettsäureprofils

o symptomatische Pflanzen - Hypersensitivitätstest

o symptomatische Pflanzen – IF-Test

o symptomatische Pflanzen – Streifentest [Lateral flow devices]

o symptomatische Pflanzen – Nested-PCR (Llop et al.2000)

o symptomatische Pflanzen - Pathogenitätstest

o symptomatische Pflanzen - PCR (Bereswill et al.1992)

o symptomatische Pflanzen - PCR (Gottsberger nach Obradovic et al.2007)

o symptomatische Pflanzen - PCR (Stoger et al.2006)

o symptomatische Pflanzen - PCR (Taylor et al.2001)




o symptomatische Pflanzen - Real-Time-PCR (Gottsberger, 2010)

o symptomatische Pflanzen - Real-Time-PCR (Pirc et al.2009)

PM 7/21 (1) Ralstonia solanacearum

o nichtselektive Isolierung

o selektive Isolierung

o IF-Test

o Bioassay

o PCR

o biochemische Merkmale

o ELISA

o Pathogenitätstest

o REP-PCR

PM 7/42 (2) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

o Beprobung und Screening von Tomatensämlingen in Pflanzschulen auf latent Infektion gemäß Anhang 1

o Samenextrakt - Verdünnungsausstrich auf nichtselektive Medien

o Samenextrakt - Verdünnungsausstrich auf halb-selektive Medien

o Samenprobe – konventionelle PCR (nach Pastrik & Rainy, 1999)

o Samenprobe - direkte PCR auf IF-positives Samenextrakt (Pastrik & Rainy, 1999)

o Samenprobe - FAP

o Samenprobe - IF-TEST

o Samenprobe - Pathogenitätstest

o symptomatische Pflanzenproben – biochemische Merkmale

o symptomatische Pflanzenproben – konventionelle PCR (nach Pastrik & Rainy, 1999)

o symptomatische Pflanzenproben - Verdünnungsausstrich auf nichtselektive Medien

o symptomatische Pflanzenproben - Verdünnungsausstrich auf semi-selektive Medien

o symptomatische Pflanzenproben - direkte PCR auf IF-positivem Samenextrakt (Pastrik & Rainy, 1999)

o symptomatische Pflanzenproben - FAP

o symptomatische Pflanzenproben - IF-TEST

o symptomatische Pflanzenproben - Pathogenitätstest

PM 7/59 (1) Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

o IF-TEST

o Fish

o PCR (Pastrik, 2000)

o Verdünnungsausstrich auf MTNA oder RCP 88

o Bioassay

o biochemische Merkmale

o FAP


o Real-Time-PCR

http://archives.eppo.int/EPPOStandards/PM7_DIAGNOS/pm7-21%281%29.pdf






PM 7/60 (1) Pantoea stewartii subsp. stewartii

o Verdünnungsausstrich

o IF-TEST

o Zellfärbung

o FAP

o Morphologie von Kolonien und biochemische Merkmale

o PCR (Coplin & Marjercak, 2002)

PM 7/65 (1) Xanthomonas fragariae

o DAS ELISA

o IF-TEST

o Isolierungsmethode 1

o PCR (Anhang 2)

o Biochemische und physiologische Bestimmung – konventionelle Tests

o Verdünnungsausstrich nach Detached Leaf Assay

o Erstellung eines Fettsäureprofils

o Isolierungsmethode 2

PM 7/96 (1) Xylophilus ampelinus

o Biochemische Tests

o Direkte Isolierung aus symptomatischem Material auf YPGA und/oder NA

o ELISA

o Extraktion aus symptomatischen Blättern

o Extraktion aus symptomatischen Trieben – erste Methode

o Real-Time-PCR Dreo et al., 2007

PM 7/99 (1) Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus

o Verdünnungsausstrich von Samenextrakten auf King B unter Zusatz von Cycloheximid

o Extraktion aus Samen

o IF-TEST an Reinkulturen

PM 7/102 (1) Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

o Konventionelle PCR Tegli et al., 2002

o Direkte Isolierung auf NBY und SSM

o Direkte Isolierung auf YPGA und SSM

o Extraktion aus asymptomatischen Samen durch Einweichmethode

o Morphologische und biochemische Merkmale von Reinkulturen

o Pathogenitätstest Methode A

PM 7/110 (1) Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas gardneri,

Xanthomonas perforans, Xanthomonas vesicatoria), Erreger der Blattfleckenkrankheit an Tomate

und Paprika

o Biochemische Merkmale

o DNS-Barcoding







o Extraktion aus symptomatischen Pflanzen

o Analyse von Fettsäuremethylester

o Hypersensititvätsreaktion

o IF-TEST an Reinkulturen

o Isolierung aus Samen auf CKTM

o Isolierung aus Samen auf NA

o Isolierung aus Samen auf YDC

o Isolierung aus Samen auf YPGA

o Isolierung aus symptomatischen Pflanzen auf Wiebrinks Medium

o Isolierung aus symptomatischen Pflanzen auf YGCA


ENTOMOLOGIE

PM 7/3 (2) Thrips palmi (EPPO-Standard ersetzt durch Anhang 1 des ISPM 27)

o morphologische Bestimmung

PM 7/11 (1) Frankliniella occidentalis


PM 7/12 (1) Parasaissetia nigra


PM 7/13 (1) Trogoderma granarium


PM 7/19 (1) Helicoverpa armigera


PM 7/38 (1) Unaspis citri


PM 7/35 (1) Bemisia tabaci


PM 7/36 (1) Diabrotica virgifera


PM 7/51 (1) Aonidiella citrina


PM 7/53 (1) Liriomyza spp.


o PCR RFLP




PM 7/55 (1) Rhizoecus hibisci


PM 7/56 (1) Scirtothrips aurantii, Scirtothrips citri & Scirtothrips dorsalis


PM 7/71 (1) Opogona sacchari


PM 7/74 (1) Popillia japonica


PM 7/83 (1) Rhynchophorus ferrugineus und Rhynchophorus palmarum


PM 7/104 (1) Ceratitis capitata

o Morphologische Bestimmung

PM 7/107 (1) Rhagoletis completa


PM 7/109 (1) Epitrix cucumeris, E. similaris und E. tuberis


MYKOLOGIE

PM 7/15 (1) Ciborinia camelliae

o morphologische Bestimmung in vivo

PM 7/17 (2) Guignardia citricarpa

o konventionelle PCR (Bonants et al., 2003)

o Isolierung auf Kirschagar (CDAG)

o Isolierung auf Hafermehlagar

o Isolierung auf Kartoffeldextroseagar


o Real-Time-PCR (van Gent-Pelzer et al., 2007)

o Sequenzierung ITS 1 und 2 – nach konventioneller PCR (Bonants et al., 2003)

PM 7/18 (2) Monilinia fructicola

o konventionelle PCR (Ioos & Frey, 2000)

o Isolierung auf Kartoffeldextroseagar


PM 7/27 (1) Puccinia horiana






PM 7/28 (1) Synchytrium endobioticum

o Nachweis von Sporangien in Erde


o Biossay zur Löschung

o Bestimmung des Pathotyps - Feldversuch

o Bestimmung des Pathotyps - Glynne-Lemmerzahl-Methode

o Bestimmung des Pathotyps – Spieckermann-Methode

PM 7/29 (2) Tilletia indica

o Waschtest für unbehandelten Samen

o Isolierung und Keimung von Teliosporen auf Wasseragar


o Waschtest für behandelten Samen

PM 7/45 (1) Cryphonectria parasitica

o Isolierung


PM 7/66 (1) Phytophthora ramorum

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Gemüsesaftagar V8

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit P5ARP

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit P5ARP[H]

o Isolierung aus Erde mit P5ARP[H]

o Isolierung aus Wasser mit P5ARP[H]

o konventionelle PCR (Wagner & Werres, 2003)

o konventionelle PCR (Kox et al., 2002)

o konventionelle PCR (Lane et al., 2003)

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Karottensaftagar (Kröber, 1985)

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Kirschagar (CDAG)

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Karottenstückenagar (CPA) (Werres et al., 2001)

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit dunklem Karottenagar

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit PARB [H]

o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit SNA

o Rhododendronblatttest für Erd- und Wasserproben (Themann et al., 2002) in Kombination mit Isolierung auf CPA (Werres et al., 2001)

o Real-Time-PCR (Hayden et al., 2004)

o Real-Time-PCR (Hughes et al., 2005)

o Sequenzierung der ITS-Region

PM 7/85 (1) Plasmopara halstedii

o Bioassay

o konventionelle PCR in Samen (Ioos et al.2007)

http://archives.eppo.int/EPPOStandards/PM7_DIAGNOS/pm7-28%281%29.pdf




PM 7/86 (1) Diaporthe vaccinii

o morphologische Bestimmung in vitro auf MEA

o morphologische Bestimmung in vitro auf PDA


PM 7/91 (1) Gibberella circinata

o Bestimmung in Pflanzengewebe außer Samen durch Real-Time-PCR mit doppelt markierter Sonde (Ioos et al., 2009)

o Bestimmung in Reinkulturen durch konventionelle oder SyBr Green Real-Time-PCR (Schweigkofler et al., 2004)

o Bestimmung in Samen durch konventionelle oder SyBr Green Real-Time-PCR (Schweigkofler et al., 2004)

o Bestimmung in Samen durch Real-Time-PCR mit doppelt markierter Sonde (Ioos et al., 2009)

o Isolierung aus Pflanzengewebe außer Samen auf DCPA

o Isolierung aus Pflanzengewebe außer Samen auf PDAS

o Isolierung aus Samen auf DCPA und Übertragung auf PDA und SNA

o Isolierung aus Samen auf Komada Medium und Übertragung auf PDA und SNA

o morphologische Bestimmung in Reinkultur

PM 7/92 (1) Gremmeniella abietina

o morphologische Bestimmung in vitro auf anderen Vollmedien


PM 7/93 (1) Melampsora medusae


PM 7/111 (1) Fusarium foetens

o Isolierung aus symptomatischen Pflanzen auf SNA unter Zusatz von Antibiotika gefolgt von

Ausplattierung auf semi-selektive Medien

o PM 7/112 (1) Phytophthora kernoviae

o Ködertest Erde

o Ködertest Wasser

o konventionelle PCR (Schlenzig, 2011)

o Isolierung auf CPA

o Isolierung auf semi-selektiven V8-Agar


o Real-Time-PCR für eine Region des ras-verwandten Proteins (Ypt1) (Schena et al., 2006)

o Auslösung der Sporulation (Julius Kühn Institute )

o Test für die ITS-Region (Hugues et al., 2011)

NEMATOLOGIE

PM 7/4 (3) Bursaphelenchus xylophilus

o Extraktion mit Bearmann-Trichter

o ITS RFLP PCR (Burgermeister et al., 2009)





PM 7/40 (3) Globodera rostochiensis und Globodera pallida

o Bioassay (Test A Bioassay – Methode angewendet in Deutschland und Österreich)

o Bioassay (Test A Reproduktionstest - Methode angewendet in Norwegen)

o Extraktion durch Flaschen- und Papierstreifenmethode

o Extraktion Fenwick-Kanne

o Extraktion Schuilingzentrifuge

o Extraktion Seinhorst-Abscheider

o Extraktion Wye Spüler

o Schlupftest A (Methode angewendet in Norwegen)

o Schlupftest C (Methoden angewendet in Frankreich)

o morphologische und morphometrische Bestimmung

o Multiplex-PCR-Test (Bulman & Marshall, 1997)

o Testung der Überlebensfähigkeit (visuelle Bestimmung)

PM 7/41 (2) Meloidogyne chitwoodi und Meloidogyne fallax

o Extraktion aus Wurzeln Inkubationsmethode

o Extraktion aus Wurzeln Mazeration/Inkubation/Flotation (Coolen, 1979)

o Extraktion aus Erde Baermann-Trichter

o Extraktion aus Erde für große Mengen angepasst Baermann-Trichter

o Extraktion aus Knollen (enzymatischer Abbau) (Araya & Caswell-Chen, 1993)

o Extraktion aus Knollen (Gewebe im Mixer zerkleinert) Extraktionssiebe oder Flotation (Viaene et al., 2007)

o Morphologie

o PCR RFLP (Zijlstra et al., 1997)

o PCR (Wishart et al., 2002)

o PCR (Zijlstra et al, .2000)

o Real-Time-PCR (TaqMan) (Zijlsta & van Hoof, 2006)

PM 7/87 (1) Ditylenchus destructor und Ditylenchus dipsaci

o Extraktion aus Erde

o Extraktion von D. dipsaci aus Samen


PM 7/88 (1) Radopholus similis

o Extraktion aus Pflanzenmaterial



PM 7/89 (1) Heterodera glycines


PM 7/94 (1) Hirschmanniella spp.

o Extraktion aus Wurzeln







PM 7/95 (1) Xiphinema americanum sensu lato



PM 7/103 (1) Meloidogyne enterolobii

o Extraktion aus Wurzeln



PHYTOPLASMOLOGIE

PM 7/62 (1) Candidatus Phytoplasma mali

o Holzindikatoren

o ELISA

o Universal-PCR (Lorenz et al., 1995)

o Universal-PCR (Lee et al., 1998)

o AP- oder 16SrX-gruppenspezifische PCR (Lorenz et al., 1995)

o AP-spezifische PCR (Jaraush et al., 1995)

PM 7/63 (1) Candidatus Phytoplasma pyri

o Universal-PCR (Lorenz et al., 1995)

o Universal-PCR (Lee et al., 1998)

PM 7/79 (1) Grapevine flavescence dorée phytoplasma

o Multiplex-nested-PCR (für den gleichzeitigen Nachweis von Flavescence dorée und Bois noir)

o Direkte generische PCR gefolgt von generischer nested-PCR gefolgt von RLFP

o Direkte generische PCR gefolgt von gruppenspezifischer nested-PCR

VIROLOGIE

PM 7/30 (2) Beet necrotic yellow vein benyvirus

o ELISA

PM 7/31 (1) Citrus tristeza closterovirus

o DAS-ELISA

o Tissue print-ELISA

PM 7/32 (1) Plum pox potyvirus

o biologischer Test (Pfropfinokulation von Indikatorpflanzen)

o DAS-ELISA mit 5B-IVIA oder polyklonalen Antikörpern

o IC-RT-PCR

o Co-PCR

o DASI-ELISA mit 5B-IVIA universellen monoklonalen Antikörpern




PM 7/33 (1) Potato spindle tuber pospiviroid

o DIG Sonde

o R-PAGE

o RT-PCR

o TaqMan

PM 7/34 (1) Tomato spotted wilt virus, Impatiens necrotic spot virus und Watermelon silver mottle

virus

o mechanische Inokulation von Indikatorpflanzen

o TAS-ELISA

o RT-PCR

o Nachweis von TSWV in Pflanzen und einzelnen Thripsen unter Verwendung der Real-Time-Fluoreszenz-RT-PCR (TaqMan)

o Streifentest [Lateral Flow Devices](LFD)

PM 7/50 (1) Tomato yellow leaf curl und Tomato mottle begomoviruses

o TAS-ELISA

o PCR-Methode 1 (Accotto et al., 2000)

o DNS-Extraktionsmethode 1 (Accotto et al., 2000)

o PCR/MPCR (Deng et al., 1994)

PM 7/67 (1) American plum line pattern virus (Ilarvirus)

o DAS ELISA (Clark & Adams, 1977)

o Holzindikatoren

PM 7/113 (1) Pepino mosaic virus

o Biossay mechanische Inokulation aus Blatt- oder Fruchtextrakten

o Biossay mechanische Inokulation aus Samenextrakt

o DAS ELISA


o Real-Time-PCR (Ling et al., 2007)




Anhang 2 - Verfahren der Validierung eines Tests (A) durch Vergleich mit einem

validierten Test (B)

Der Vergleich eines Tests (A) mit einem validierten Test (B) kann ein geeignetes Validierungsverfah-

ren sein, wenn der Grad der analytischen Sensitivität oder analytischen Spezifität des validierten

Tests (B) als ausreichend gilt und wenn der Test (A) einen Vorteil bietet (z. B. schneller, einfacher).

Bekanntlich kann Test (A) einen höheren Grad an Sensitivität oder Spezifität als der validierte Test (B)

haben, und mit Hilfe des Vergleichs wird nur festgestellt, dass die Sensitivität oder Spezifität des

Tests (A) zumindest genauso hoch wie die des validierten Tests (B) ist.

Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit sind ebenfalls für Test (A) zu bewerten (siehe Anhang 5).

Der Vergleich des Tests (A) mit dem validierten Test (B) ist wie folgt durchzuführen:

3 Wiederholungen mit dem Zielorganismus und 3 mit jedem Nichtzielorganismus wie in Tabelle 2

angegeben durchführen. Die Proben sind den beiden Tests parallel zu unterziehen.

Tabelle 2. Mindestanzahl von Proben für den Vergleich eines Tests (A) mit einem validierten Test (B)

Art des Materials Kontamination mit dem Organismus

Niedrig/Niedrig

(relativ*)

Mittel/Mittel

(relativ*)

Hoch/Hoch

(relativ*)

Reinkulturisolate des Zielorganismus

oder mit dem Zielorganismus gespikte

Proben

101 71 51

Reinkulturisolate des Nichtzielorganis-

mus (der Nichtzielorganismen) oder mit

dem Nichtzielorganismus (Nichtzielor-

ganismen) gespikte Proben

- 22 bis 44 -

Natürlich mit dem Zielorganismus kon-

taminierte Probe

Geeignete Verdünnungsreihen werden mit 15 positiven

Proben, die zuvor mit dem validierten Test (B) bestimmt

wurden, hergestellt, um die Nachweisgrenze des validier-

ten Tests (B) festzustellen.

1 Die Gesamtanzahl der Proben von Zielorganismen ist mindestens zweimal so groß wie die Anzahl

der Proben von Nicht-Zielorganismen.

* Für Virologie und Phytoplasmalogie.

Die Anzahl der in dieser Tabelle angegebenen Proben wurde im Vergleich mit veröffentlichten Stan-

dards, z. B.ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs, Protocol for the validation of

alternative methods [Protokoll für die Validierung alternativer Methoden] (ISO, 2003) und AFNOR XP

V03-111 Agricultural and food products analysis, Protocol for the intra-laboratory evaluation of an

alternative method of qualitative analysis against a reference method [Analyse landwirtschaftlicher

Erzeugnisse und von Nahrungsmittel, Protokoll der internen Laborbewertung einer alternativen Me-

thode des Qualitätstests gegenüber einer Referenzmethode] (AFNOR, 1995), ermittelt.




Die Korrelation zwischen den Ergebnissen des validierten Tests (B) mit denen des Tests (A) ist in Be-

zug auf die unterschiedliche Schadorganismuskontamination zu bewerten. Die Darstellung der Er-

gebnisse und Berechnung der relativen Leistungskriterien kann wie in Tabelle 3 erfolgen.

Tabelle 3. Beispiel für Ergebnisse einer Korrelation von validiertem Test (B) mit Test (A)

validierter Test (B)

Test (A)

+ - Gesamt

+ 69 3 72

- 6 12 18

Gesamt 75 15 90

Tabelle 3 wurde von Hughes et al., 2006 übernommen. Die Zahlen in dieser Tabelle dienen De-

monstrationszwecken.

PA (positive Übereinstimmung), PD (positive Abweichung), ND (negative Abweichung), NA (negative

Übereinstimmung).

Positive (+) und negative (-) Ergebnisse für 90 Proben, die beiden Tests unterzogen wurden, verdeut-

lichen die diagnostische Sensitivität (PA/(PA+ND)), diagnostische Spezifität (NA/(NA+PD)) und relative

Genauigkeit (PA+NA)/(PA+PD+ND+NA). Diagnostische Sensitivität = 92 %, diagnostische Spezifität =

80 %, relative Genauigkeit = 90 %.

PA PD

ND NA




Anhang 3 – Bericht zur Validierung eines Test

Testname:

Anwendungsbereich des Tests:

Zusätzliche Anmerkungen:

Die Unterlagen zur Validität des Tests und den Anforderungen an den Test sind im Laboratorium

verfügbar. Dazu gehören Laborbücher und weitere unten genannte Informationen, die aufzeigen, wie

die Verfahren in dieser Untersuchung validiert wurden.

Leistungskriterien A B C D Aufbewahrungsort für die Unterlagen

Analytische Sensitivität

Analytische Spezifität

Selektivität (wenn relevant)

Wiederholbarkeit

Reproduzierbarkeit

A = Daten aus eigenen Laborversuchen

B = Daten aus Laborvergleichsuntersuchungen

C = Informationen der Hersteller

D = Externe Informationen (Literatur usw.)

Weitere Informationen (wahlweise)

Aufbewahrungsort für die Unterlagen

Diagnostische Sensitivität

Diagnostische Spezifität

Robustheit (siehe 5.4.3)

Auf Grundlage der obigen Feststellung wird der Test als für den Anwendungsbereich geeignet bewer-tet.

Verantwortlicher Mitarbeiter für die Durchführung des Tests

Name in Großbuchstaben:

Unterschrift: Datum:

Autorisierte Person






Anhang 4 - Bericht zur Verifizierung eines Tests

Testname:

Ausgewählter vollständig validierter Test:

Anwendungsbereich des vollständig validierten Tests:

Beschreibung von Änderungen:

Die Unterlagen zur Verifizierung des Tests und den Anforderungen an den Test sind im Laboratorium

verfügbar. Dazu gehören Laborbücher und weitere Informationen, die aufzeigen, wie der Verifizie-

rungstest in dieser Untersuchung durchgeführt wurde.

Leistungskriterien Erhaltene Werte für die Leistungskriterien

Erfüllt die Anforde-rungen des vollstän-dig validierten Tests

(Ja/Nein)

Aufbewahrungsort für die Unterlagen

Analytische Sensitivität

Analytische Spezifität

Wiederholbarkeit

Reproduzierbarkeit

Auf Grundlage des obigen Berichts zur Verifizierung gilt der Test als für den Anwendungsbereich ge-

eignet.

Verantwortlicher Mitarbeiter für die Durchführung des Tests



Autorisierte Person






Anhang 5 – Tabellen mit detaillierter Anleitung für das Validierungsverfahren je Anwendungs-

bereich (Bakteriologie, Botanik, Entomologie, Mykologie, Nematologie, Virologie und

Phytoplasmologie)

Benutzungshinweise für die Tabellen

Anmerkung zu Zahlen

Die in den Tabellen genannten Zahlen basieren auf Validierungserfahrungen von Experten in den

EPPO-Diagnose-Panels. Abweichungen von dieser Anleitung können sich zwangsläufig aus der Kom-

bination von Schadorganismus und Pflanze ergeben. Die Validierung morphologischer und

morphometrischer Methoden ist für alle Bereiche im Anhang 6 beschrieben.

Allgemeine Anmerkung zur analytischen Sensitivität

Die Nachweisgrenze eines Tests (gemäß Definition in PM 7/76) sollte möglichst immer festgestellt

werden. Dennoch kann diese Grenze nicht immer absolut für den Nachweis von Schadorganismen

von Pflanzen festgestellt werden. Es gibt Organismen, die nicht in Kultur gehalten werden können

(obligate Pathogene), die nicht quantifiziert werden können (Pilze), die nur in der Pflanze vorkom-

men oder von denen keine Reinkultur hergestellt werden kann (z. B. Phytoplasmen). Aus diesem

Grund können für diese Organismen keine oder kaum jemals exakte Konzentrationen ermittelt wer-

den und es müssen folglich Schätzungen benutzt werden. Auch wenn man Reinkulturen herstellen

kann (viele Bakterien und Viren), kann die Konzentration nur geschätzt werden (z. B. cfu oder

mg/mL). Diese Schätzung beruht häufig auf einer indirekten Messung. Sofern möglich, sollten serielle

Verdünnungen hergestellt werden bis ein Endpunkt erreicht ist.

Allgemeine Anmerkung zu Wiederholungen

Die Anzahl der Wiederholungen (angegeben in den nachfolgenden Tabellen) entspricht nicht der

Anzahl der technischen Wiederholungen (z. B. Doppel-/Dreifachreaktionen – die ein Standard bei

ELISA-Tests - oder Real-Time-PCR-Läufen sind).

Methode für die Extraktion von Zielorganismen aus einer Matrix (Isolierung eines Zielorganismus)

Extraktionen sind immer durch einen Test zu validieren.

Analytische Sensiti-

vität

Die Methode muss die Extraktion/Isolierung einer ausreichenden Menge des

Zielorganismus, die weiter kultiviert oder untersucht werden kann, ermögli-

chen. Führen Sie Extraktionen aus mindestens 3 Proben mit ho-

her/mittlerer/niedriger Konzentration des Zielorganismus durch.

Die Proben können aus eindeutig infiziertem Material (Diagnose) bestehen,

oder die Proben können auch durch Zugabe von infiziertem Material mit be-

kannter Zelldichte des Zielorganismus zum Probenmaterial hergestellt wor-

den sein (Nachweis von latenter Infektion oder Kontamination).

Analytische Spezifi-

tät

Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus

einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.

Selektivität Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus

einer Probe ist per Definition nicht selektiv.





Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens eine Probe mit niedriger Konzentration des Ziel-

organismus und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Be-

werten Sie die Extraktionsleistung durch das entsprechende Testverfahren.

Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu extra-

hieren.

Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche

Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-

ten.

Molekulare Methoden, z. B. PCR, Real-Time-PCR und LAMP

Zu diesem Schritt gehören auch Methoden zur Isolierung von DNS aus der Probe.


vität

Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakte mit 101 – 106

Zellen des Zielorganismus/mL. Dafür sollten vorzugsweise Dezimalverdün-

nungen von Zellsuspensionen des Zielorganismus in den Probenextrakten

hergestellt werden. Bestimmen Sie die niedrigste Zelldichte mit positivem

Testergebnis.

Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere

Serien aufzubereiten und zu testen.

Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-

parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-

marke der PCR-Reagenzien (insbesondere DNS-Polymerase) und PCR-

Zyklusbedingungen.


tät

Testen Sie (I) Stämme des Zielbakteriums, die genetische Diversität, unter-

schiedliche geographische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken,

und (II) einen Satz von Nicht-Organismen, insbesondere solchen, die mit dem

Probenmaterial assoziiert sind. Verwenden Sie Zellsuspensionen von Reinkul-

turen mit ungefähr 106 Zellen/mL. Bei Nicht-Zielorganismen sollte die Höhe

der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreaktion maximal

fördern, jedoch realistisch sein.

Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich von

Sonde/Primer-Sequenzen mit Sequenzen in Genbanken untermauert werden.

Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-

trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Wirte derselben

Familie, unterschiedlicher Sorten der Wirtspflanze).

Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen gespikter Probenextrakte mit nied-

riger Kontamination. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind wei-

tere Serien aufzubereiten und zu testen.






ten.

Serologische Methoden: IF-TEST und ELISA


vität

Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakte mit 102 – 106




Testergebnis bei Antiserum/Antikörper in der Arbeitsverdünnung.




parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Anzahl

der Mikroskopfelder, die im IF-Test ausgewertet werden müssen, und die OD-

Schwelle im ELISA-Test.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität von Antikörpern (I) an Stämmen des Zielbakteri-

ums, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge

und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-

Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert

sind. Verwenden Sie Zellsuspensionen von Reinkulturen mit ungefähr

106 Zellen/mL und verwenden Sie das Antiserum/die Antikörper in der Ar-

beitsverdünnung.









ten.




Plattierung: selektive Isolierung


vität

Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakten mit 10 – 106




Testergebnis.





marke der Bestandteile für das Medium (insbesondere Antibiotika und Her-

stellung von Stammlösungen) und Inkubationsbedingungen.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität des Nährmediums (I) an Stämmen des Zielorga-

nismus, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge



sind. Verwenden Sie eine Zellsuspension mit ungefähr 106 Zellen/mL und tes-

ten Sie durch Verdünnungsausstrich.









ten.

Bioassay: selektive Anreicherung in Wirtspflanzen


vität

Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakte, die mit 102 –

106 Zellen des Zielorganismus/mL. Dafür sollten vorzugsweise Dezimalver-

dünnungen von Zellsuspensionen des Zielbakteriums in den Probenextrakten


Testergebnis. Das erfordert die Isolierung aus Testpflanzen mit

Befallssymptomen oder ohne Befallssymptome.







parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Wachs-

tumsstadium der Testpflanzen, Inokulationsmethode und Inkubationsbedin-

gungen.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays (I) an Stämmen des Zielbakteri-

ums, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge



sind. Verwenden Sie eine Zellsuspension mit ungefähr 106 Zellen/mL.


trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten einschließ-

lich der empfindlichsten Sorte(n)).


riger Kontamination und verwenden Sie die Wirtspflanzen, die im Spezifitäts-

test bestimmt wurden. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind

weitere Serien aufzubereiten und zu testen.



ten.

Pathogenitätstest


vität

Dieser Parameter ist für den Pathogenitätstest, der im Allgemeinen mit Sus-

pensionen von ca. 106 Zellen/mL durchgeführt wird, nicht relevant. Die analy-

tische Sensitivität kann jedoch eine Rolle spielen, wenn unterschiedliche

Wachstumsstadien der Wirtspflanze inokuliert werden.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität des Pathogenitätstests an einem Satz von

Stämmen des Zielbakteriums, die genetische Diversität, unterschiedliche geo-

graphische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, und an einem

Satz von Nicht-Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmate-

rial assoziiert sind. Verwenden Sie Zellsuspensionen mit ungefähr

106 Zellen/mL.

Ein positives Ergebnis erfordert Symptomausprägung und Reisolierung des

Zielorganismus (Kochsches Postulat).

Selektivität Stellen Sie fest, ob die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirtspflanze

die Testleistung beeinträchtigt.

Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen einer Gruppe von Stämmen des

Zielbakteriums, die die Variabilität von Bestimmungstests und der Virulenz

abdecken. Verwenden Sie Zellsuspensionen mit ungefähr 106 Zellen/mL.

Ein positives Ergebnis schließt Symptomausprägung und Reisolierung des




Zielorganismus (Kochsches Postulat) ein.



ten.

Fingerabdruck: Erstellung eines Proteinprofils, Fettsäureprofils und DNS-Profils


vität

Bestimmen Sie die Mindestmenge von Bakterien, die von ausgewählten

Nährmedien entnommen werden müssen, um eine zuverlässige Untersu-

chung durchführen zu können.

Die Testparameter müssen genau definiert und standardisiert werden, z. B.

Nährmedium, Kulturstadium für die Entnahme von Zellen.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität des Fingerabdruckverfahrens (I) an Stämmen des

Zielbakteriums, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische

Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von

Nicht-Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial asso-

ziiert sind.

Stellen Sie Marker zur Differenzierung von Unterarten oder Pathotypen zur

Verfügung.

Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich mit

Daten in Genbanken untermauert werden.

Selektivität Nicht relevant.

Wiederholbarkeit Testen Sie 3 Wiederholungen des Protein-/Fettsäure-/DNS-Extrakts.



ten.

Tabelle 5. Botanik

Siehe auch die Benutzungshinweise für die Tabellen

Methode für die Extraktion eines Zielorganismus aus der Matrix

Die Extraktion ist immer durch einen Test zu validieren.


vität

Mit der Methode muss eine ausreichende Menge des Zielorganismus für wei-

tere Untersuchungen extrahiert werden können.

Sie können den prozentualen Anteil von Samen invasiver fremder Pflanzen,

der durch die Extraktion zurückgewonnen wird, anhand von mindestens 3

Proben bestimmen.

Analytische Spezifi- Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus




tät einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.




objekts und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Bewerten

Sie die Extraktionsleistung durch das entsprechende Testverfahren. Werden

keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu extrahieren.



ten.

Tabelle 6. Entomologie


Methode für die Extraktion eines Zielorganismus aus der Matrix

Die Extraktion ist immer durch einen Test zu validieren.


vität

Mit der Methode muss eine ausreichende Menge des Zielorganismus für wei-

tere Untersuchungen extrahiert werden können. Sie können den prozentua-

len Anteil von Insekten, der durch die Extraktion zurückgewonnen wird, an-

hand von mindestens 3 Proben bestimmen.

DNS-Extraktion: die Validierung ist Bestandteil der Validierung molekularer

Verfahren.


tät





Wiederholbarkeit Nicht relevant.

Reproduzierbarkeit Nicht relevant.


Zu diesem Schritt gehören auch Methoden für die Isolierung von DNS aus dem Probenmaterial.


vität

Bereiten Sie eine entsprechende Anzahl von Individuen auf. Diese Anzahl

hängt vom Geschlecht, der Art und dem Stadium ab. Bestimmen Sie die Min-

destanzahl von Individuen oder den Teil der Individuen, die/der nachzuwei-

sen sind/ist.

Führen Sie mindestens 3 Versuche durch. Werden nach 3 Serien keine ein-

heitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.







Zyklusbedingungen.


tät

Testen Sie (I) eine Reihe von Zielorganismen, die genetische Diversität, unter-


und (II) relevante Nicht-Zielorganismen, insbesondere solche, die mit dem

Probenmaterial assoziiert sind. Bei Nicht-Zielorganismen sollte die Höhe der

Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreaktion maximal för-

dern, jedoch realistisch sein.




trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-

pflanze).

Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger

Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere

Wiederholungen aufzubereiten und zu testen.



ten.

Tabelle 7. Mykologie


Methode für die Extraktion/Isolierung/Ködern von Zielorganismen aus einer Matrix



vität

Die Methode muss die Extraktion/Isolierung/das Ködern einer ausreichenden

Menge des Zielorganismus, die weiter kultiviert oder untersucht werden

kann, ermöglichen. Sofern möglich, bestimmen Sie durch Mischen von ge-

sundem und infiziertem Gewebe die Mindestmenge von krankem Gewebe

oder Merkmalen, die ausgestrichen bzw. bestimmt werden müssen, um eine

zuverlässige Untersuchung durchführen zu können.

Extrahieren/Isolieren/Ködern Sie den Zielorganismus aus mindestens 3 Pro-

ben (natürlich infizierten oder künstlich beimpften Proben). Dazu können

auch Waschverfahren oder Membranen zum Ködern von Sporen gehören.


tät









objekts und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Bewerten

Sie die Extraktionsleistung durch die entsprechende Testmethode. Werden

keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu extrahieren.



ten.


Zu diesem Schritt gehört auch die Isolierung von DNS aus dem Probenmaterial.


vität

Bestimmen Sie die Mindestmenge des Zielobjekt (z. B. Anzahl der Konidien

oder das Gewicht des infizierten Materials in gesundem Material), aus der

eine nachweisbare Menge der Ziel-DNS gewonnen werden kann. Führen Sie

mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungsstufen, vorzugsweise in

Wirtspflanzen-DNS, durch. Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergeb-

nisse erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.




Zyklusbedingungen.


tät

Testen Sie (I) eine Reihe von Zielobjekten, die genetische Diversität, unter-


und (II) relevante Nicht-Zielorganismen (z. B. phylogenetisch verwandte Pil-

ze), die in der Probe und im Probenextrakt vorkommen können. Bei Nicht-

Zielorganismen sollte die Höhe der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten

einer Kreuzreaktion maximal fördern, jedoch realistisch sein.





pflanze).



Proben zu aufzubereiten und zu testen.



ten.




Serologische Methoden: ELISA


vität

Bestimmen Sie die Mindestmenge des Zielobjekts (z. B. Anzahl der Konidien

oder das Gewicht des infizierten Materials in gesundem Material), mit positi-

vem Testergebnis mit Antiserum/Antikörper in der Arbeitsverdünnung.


parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. OD-

Schwelle. Werden nach 3 Versuchen keine einheitlichen Ergebnisse erzielt,

sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität von Antikörpern (I) an Stämmen des Zielorga-



Zielorganismen, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert

sind.



pflanze).



Proben zu aufzubereiten und zu testen.



ten.

Bioassay: Pathogenitätstest


vität

Bestimmen Sie die Matrixmenge oder Matrixextraktmenge (z. B. Gramm Blät-

ter, Erde), die für die Erzeugung von Symptomen erforderlich ist. Führen Sie 3

Versuche mit 5 Verdünnungsserien durch.




parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Stadium

der Testpflanzen, Inokulationsmethode und Inkubationsbedingungen.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays (I) an Stämmen des Zielpilzen, die

genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge und unter-

schiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-Zielorganismen,

insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert sind.






pflanze).


Konzentration und verwenden Sie die Wirtspflanzen, die im Spezifitätstest

bestimmt wurden. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weite-

re Proben zu aufzubereiten und zu testen.



ten.

Tabelle 8. Nematologie


Methode für die Extraktion von Zielorganismen aus einer Matrix



vität

Mit der Methode muss eine ausreichende Menge des Zielorganismus für wei-tere Untersuchungen extrahiert werden können. Der prozentuale Anteil von Nematoden, der durch die Extraktion gewonnen wird, ist anhand von mindes-tens 3 Proben zu bestimmen.


tät

Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.

Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-trächtigen (z. B. Bodenart für Zystenextraktoren).

Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens eine Probe mit niedriger Konzentration des Ziel-organismus und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Be-werten Sie die Extraktionsleistung durch das entsprechende Testverfahren.

Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-ten.


Zu diesem Schritt gehört auch die Isolierung von DNS aus dem Probenmaterial.


vität

Bereiten Sie eine entsprechende Anzahl von Individuen auf. Diese Anzahl hängt vom Geschlecht, der Art und dem Stadium ab. Bestimmen Sie die Min-destanzahl von Individuen oder den Teil der Individuen, die/der nachzuwei-sen sind/ist.

Führen Sie mindestens 3 Versuche durch. Werden nach 3 Serien keine ein-heitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.

Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-marke der PCR-Reagenzien (insbesondere DNS-Polymerase) und PCR-




Zyklusbedingungen.


tät

Testen Sie (I) eine Reihe von Zielorganismen, die genetische Diversität, unter-schiedliche geographische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) relevante Nicht-Zielorganismen, insbesondere solche, die mit dem Probenmaterial assoziiert sind. Bei Nicht-Zielorganismen sollte die Höhe der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreaktion maximal för-dern, jedoch realistisch sein.

Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich von Sonde/Primer-Sequenzen mit Sequenzen in Genbanken untermauert werden.

Selektivität Nicht relevant für die Bestimmung von Nematoden, wenn sie vorher aus der Matrix isoliert wurden.

Wird jedoch die PCR für den Nachweis benutzt, ist festzustellen, ob Variatio-nen im Probenmaterial die Testleistung beeinträchtigen (z. B. Erde, Pflanzen).

Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.

Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-ten.

Biochemische Methoden: z. B. Enzymelektrophorese, Erstellung eines Proteinprofils

Zu diesem Schritt gehört auch die Probenaufbereitung


vität

Stellen Sie die Mindestanzahl nachzuweisender Individuen fest, die für eine

zuverlässige Untersuchung benötigt werden, und das, sofern möglich, mit

mindestens drei Proben. Die geringste Anzahl von Ziel-Individuen hängt vom

Zustand der Probe (gut bis sehr schlecht), der bekannten innerartlichen Vari-

abilität, der Schwierigkeit, Merkmale zu interpretieren usw. ab.

Die Testparameter müssen genau definiert und standardisiert werden.


tät

Testen Sie (I) eine Reihe von Zielorganismen und (II) Nicht-Zielgattungen

und/oder -arten.




Proben aufzubereiten und zu testen.



ten.




Ködern oder Bioassay (einschließlich Pathogenitätstests)


vität

Stellen Sie mit mindestens 3 Wiederholungen die Mindestanzahl Individuen

fest, bei der Symptome hervorgerufen werden oder sich der Organismus in

Pflanzenmaterial vermehrt.



der Testpflanzen, Inokulationsmethode.

Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzu-

bereiten und zu testen.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays an (I) Stämmen von Zielorganis-

men, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge


Zielorganismen, insbesondere solche, die mit dem Probenmaterial assoziiert

sind.



pflanze).

Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens 3 Wiederholungen mit der Mindestanzahl von

Individuen, die benötigt wird um eine Population zu bilden, und verwenden

Sie die Wirtspflanzen, die im Spezifitätstest bestimmt wurden. Bei Verwen-

dung als Pathogenitätstest müssen die 3 Wiederholungen so viele Individuen

enthalten, dass Symptome erzeugt werden. Werden keine einheitlichen Er-

gebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.



ten.

Tabelle 9. Virologie und Phytoplasmologie

Siehe auch die Benutzungshinweise für die Tabellen. Diese Tabelle gilt für Viren, Viroide und

Phytoplasmen.


Zu diesem Schritt gehört auch die Isolierung von RNS/DNS aus dem Probenmaterial.


vität (relative Sensi-

tivität)

Da die Konzentration von Viren, Viroiden und Phytoplasmen immer unbe-

kannt ist, bestimmen Sie die maximale Verdünnung nachzuweisender

RNS/DNS. Führen Sie mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungsstufen

durch. Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind wei-








Zyklusbedingungen.


tät

Testen Sie (I) eine Auswahl von Zielorganismen und (II) relevante Nicht-

Zielorganismen, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische

Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, insbesondere solche, die

ggf. im Probenmaterial vorhanden sein könnten. Bei Nicht-Zielorganismen

sollte die Höhe der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreak-

tion maximal fördern, jedoch realistisch sein.





pflanze).


(relativer) Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind

weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.



ten.

Serologische Methoden: ELISA und Direct Tissue Blot Immuno Assay, einschließlich Probenaufberei-

tung (gilt nicht für Viroide)



tivität)

Führen Sie mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungen einer infizier-

ten Probe in der ausgewählten gesunden Probe durch. Bestimmen Sie die

maximale Verdünnung nachgewiesener RNS/DNS.


parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. die OD-

Schwelle im ELISA-Test. Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse

erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität von Antikörpern (I) an Stämmen des Zielorga-




sind.



pflanze).






weitere Proben aufzubereiten und zu testen.



ten.

Bioassay: Pflanzentest (hauptsächlich zur Verifizierung von Viren und Viroiden, jedoch nicht für

Phytoplasmen) und Pfropfung



tivität)

Bestimmen Sie die Maximalverdünnung einer infizierten Probe in der gesun-

den Probe, durch die Symptome hervorgerufen werden oder sich der Orga-

nismus in Pflanzen vermehren kann. Es handelt sich hier nur um eine Schät-

zung anzuwendender Verdünnungen. Führen sie 3 Serien mit Verdünnungs-

schritten durch.



der Testpflanzen, Inokulationsmethode und Inkubationsbedingungen. Wer-

den keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben aufzubereiten

und zu testen.

Nicht relevant für die Pfropfung.


tät

Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays (I) an Stämmen des Zielorganis-

mus, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge



sind.



pflanze).

Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit geeigne-

ter Verdünnung, die im Sensitivitätstest festgestellt wurde und wählen Sie

Wirtspflanzen anhand der Ergebnisse der obigen Leistungskriterien aus.

Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzu-

bereiten und zu testen.



ten.




Biochemische Methoden: z. B. Elektrophorese, R-PAGE



tivität)

Führen Sie mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungsstufen einer

infizierten Probe in der ausgewählten gesunden Probe durch. Bestimmen sie

die größte noch nachweisbare Verdünnung der Probenextrakte.

Die Testparameter müssen genau definiert und standardisiert werden.


tät

Vergleichen Sie mit relevanten Targets/Proteinen/Kontaminanten und führen

Sie auf, wie sie differenziert werden können. Untersuchen Sie auch die inne-

rartliche Variabilität. Definieren Sie die zu bestimmenden Merkmale.




weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.



ten.




Anhang 6 – Validierung morphologischer und morphometrischer Methoden, die z. B. in der Ento-

mologie, Nematologie, Mykologie und Botanik verwendet werden

Die Anleitung basiert auf Validierungserfahrungen von Experten der EPPO-Diagnose-Panels.3

Bei der morphologischen Bestimmung beruht das Expertenurteil i.d.R auf der Verwendung verfügba-

rer Referenzen in Form von Schlüsseln, morphologischen Originalbeschreibungen, Präparaten und

Belegfotos, die von den Experten als Referenz zur Unterstützung der Bestimmung anerkannt sind. Da

diese Referenzen oder Hilfsinformationen von Fachleuten der entsprechenden Gruppe(n) beige-

bracht wurden, gelten sie folglich als validierte Tests im vorstehenden Standard.

Beispiele für Referenzen oder Hilfsinformationen, die im vorstehenden Standard als validierter Test

gelten, sind:

morphologische und morphometrische Methoden in internationalen Standards wie IPPC-

Diagnose-Protokollen und EPPO-Diagnoseprotokollen,

morphologische und morphometrische Methoden, Taxonüberprüfungen, Beschreibungen – vor-

zugsweise Originalartikel - und Schlüssel, die in begutachteten [peer reviewed] Veröffentlichun-

gen – vorzugsweise Originalartikel - veröffentlicht wurden,

Belegpräparate und –typenmaterial (wie Holotypen, Paratypen, Lectotypen und Neotypen) und

Belegfotos (Präparate und Fotos müssen von einem Fachmann bestimmt und bestätigt sein),

morphologische und morphometrische Methoden in allgemeinem Gebrauch, die in nicht-

begutachteten [non-peer reviewed] Zeitschriften einschließlich elektronischen Medien (insbe-

sondere für Schlüssel) veröffentlicht sind.

Wie in 5.4.4.2 erklärt, muss das Laboratorium bestätigen, dass es morphologische und/oder

morphometrische Bestimmungen sachgerecht durchführen kann.

Das Laboratorium sollte auch die Wahl der morphologischen und morphometrischen Methoden

begründen, insbesondere wenn diese nicht in internationalen Standards oder begutachteten (peer-

reviewed) Zeitschriften veröffentlicht sind.

3 Erfahrungen bei der Akkreditierung morphologischer und morphometrischer Bestimmungen in ei-

nem forensischen Laboratorium wurden auch berücksichtigt.




Anhang 7 – Beispiele für Laborberichte über kritische Punkte im Diagnoseverfahren und zu Mes-

sunsicherheiten

Bericht 1 – Bestimmung kritischer Punkte und Schätzung der Messunsicherheit (mit freundlicher

Genehmigung des National Institute of Biology, Slowenien, 2012).

Anwendungsbereich Bestimmung von Phytoplasma

Methode

(Name, Protokollnummer)

Real-time PCR (02D-Pos43)

Schadorganismus FD und BN

Art der Probe

(Beschreibung, Protokollnummer)

Wein, Vektoren, andere Wirtspflanzen (02D-

Pos10)

Bemerkungen /

Autorisierter Versuchsansteller (Unterschrift,

Datum)

Nataša Mehle, 6.7.2012

Andere Anbieter (Unterschrift, Datum) /

Prüfleiter (Unterschrift, Datum)

Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse

Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit

Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind

Probenahme – Proben-typ

Ungleiche Verteilung des Phytoplasmas in der Pflanzenprobe.

Die Art der Probenahme unterliegt nicht unserer direkten Kontrolle; sie ist jedoch eindeutig festgelegt.

Jahresprogramm besonderer Kon-trollen auf Grapevine yellows (Op. Prev.: Pro-gram posebnega nadzora trsnih rumenic)

Insekten, die mit Gelbta-feln gefangen wurden, eigenen sich nicht für eine Untersuchung.

Bei Eingang der Probe verifizieren wir, ob die Probe für die Untersu-chung geeignet ist.

02D-Pos10

Probenahme - Zeitpunkt Die Phytoplasma-konzentration in den Pro-ben ändert sich mit der Jahreszeit.

Der Zeitpunkt der Pro-benahme ist festgelegt.








Bei Eingang der Proben verifizieren wir, ob die Probe für die Untersu-chung geeignet ist (ob sie zu einem geeigneten Zeitpunkt/einer geeigne-ten Jahreszeit genom-men wurde).

02D-Pos10

Probenahme – eindeu-tige Etikettierung von Proben

Nicht eindeutige Etiket-tierung der Proben – das Untersuchungsergebnis wurde unter der falschen Probe erfasst.

Die Etikettierung der Proben unterliegt nicht vollständig unserer di-rekten Kontrolle; sie ist jedoch eindeutig festge-legt.


Bei Erhalt der Probe verifizieren wie, ob das Etikett des Kunden auf der Probe dem Etikett des Probenahme-berichts entspricht.

02R-Nav05

Transport der Probe zum Labor

Die langfristige Lagerung der Proben bei hohen Temperaturen sowie das Einfrieren und Auftauen der Proben können die Proben schädigen, was die Nachweisbarkeit des Phytoplasmas in solchen Proben verschlechtern kann.

Die Transportmittel zum Laboratorium sind fest-gelegt.


Bei Erhalt der Probe verifizieren wir den Zu-stand der Proben.

02D-Pos10

Eingang der Probe Die Probe wurde nicht an die zuständige Person geliefert – die Tests wur-den nicht pünktlich oder überhaupt nicht durchge-führt.

Alle Beschäftigten müs-sen die Anweisungen für den Eingang von Proben kennen.

02R-Nav05; 02R-Sez07







Dokumentierung der Probe

Die Information über die gelieferte Probe erreicht nicht die zuständige Per-son - die Tests wurden nicht pünktlich oder überhaupt nicht durchge-führt, oder es wurden falsche Tests durchge-führt.

Genaue Anweisungen für die Erfassung neu eingegangener Proben.

02R-Sez07, 02D-Nav01, 02D-Nav16

Lagerung der Probe Die langfristige Lagerung der Proben bei hohen Temperaturen sowie das Einfrieren und Auftauen der Proben können die Proben schädigen, was die Nachweisbarkeit des Phytoplasmas in solchen Proben verschlechtern kann.

Festgelegter Platz für die Lagerung von Proben.

02R-Nav05

Wahl der Tests Ein ungeeigneter Test wurde durchgeführt.

Genau festgelegte Aus-wahl von Tests und eine gut definierte Abfolge von Verfahren für die Durchführung der Un-tersuchung.

02D-Sez01, 02D-Pos10

Aufbereitung der Probe für die Untersuchung

Kontamination zwischen Proben.

Die Verfahren für die Aufbereitung und Homogenisierung von Proben sind festgelegt einschließlich der Art und Weise der Arbeits-durchführung, um eine Kontamination der Pro-ben untereinander zu verhindern. Nur zustän-dige autorisierte Perso-nen wenden diese Ver-fahren an.

02D-Pos06, 02D-Pos54, 02D-Pos43, 02R-Sez04







Wahl eines ungeeigneten Teils der Probe; unzurei-chende Homogenisierung der Probe.

Die Homogenisierung (mit paralleler DNS-Extraktion) wird durch die Verwendung von NIC und interne Positivkon-trolle kontrolliert (die interne Positivkontrolle wird für jede Probe ge-trennt durchgeführt).

Extraktion Wahl einer ungeeigneten Methode für die DNS-Extraktion; ein Fehler während der Extraktion; Kontamination während der Extraktion.

Wahl und Leistung eines Extraktionsverfahrens sind gut beschrieben. Sie erfolgen nur durch zu-ständige autorisierte Personen.

NIC ist in den Extrakti-onsverfahren enthalten. Die Angemessenheit des DNS-Extraktions-verfahrens ist für jede einzelne Probe verifiziert durch Amplifikation einer internen Kontrolle (endogene Nukleinsäu-re, interne Positivkon-trolle w).

02D-Pos06, 02D-Pos54, 02D-Pos43, 02R-Sez04

Durchführung der Me-thode –Bearbeiter

Nicht vertraut mit der Methode – fehlerhafte Durchführung.

Die Methode wird nur von qualifizierten und geschulten Bearbeitern angewendet.

02R-Sez04

Durchführung der Me-thode – Auswirkung von Inhibitoren

Falsch negative Ergebnis-se aufgrund von Inhibito-ren der PCR-Reaktion im DNS-Extrakt.

Untersuchung zusätzli-cher DNS-Verdünnun-gen, wenn eine große Anzahl von Inhibitoren in den DNS-Extrakten vermutet wird.

02D-Pos43

Die DNS-Extraktion wird mit einem anderen vali-dierten Extraktionsver-fahren wiederholt.

02D-Pos06







Durchführung der Me-thode – Einfluss der Matrix auf die Spezifi-tät?

Neue und unbekannte Matrix – unspezifische Reaktion bei der Verwen-dung von Oligonukleotidprimern und –sonde.

Für jeden neuen Pro-bentyp und/oder Fund (wie neue Wirte) führen wir zusätzliche Bestäti-gungstests durch.

02D-Pos10, 02D-Pos43

Durchführung der Me-thode – Einfluss der Matrix auf die Sensitivi-tät?

Neue und unbekannte Matrix – verringerte Sen-sitivität der Methode.

Wird eine niedrige Phytoplasmakonzen-tration in den Proben erwartet (aufgrund der KE-Ergebnisse), werden weitere Tests mit höhe-rer DNS-Konzentration durchgeführt.

02D-Pos43

Durchführung der Me-thode – Möglichkeit von Kontaminationen?

Falsch positive Ergebnis-se.

Einbinden der internen Kontrollen: NAC 1, NAC 2.

02D-Pos48

Die Durchführung der Methode ist gut be-schrieben, um mögliche Kontaminationen zu verhindern.

02D-Pos48

Einzelne Schritte des Analyseverfahrens wer-den in getrennten Räu-men durchgeführt.

02D-Pos18

Durchführung der Me-thode – Einfluss der Labormaterialien und -sachen?

Einfluss auf die Fluores-zenzmessung: Staub auf der Testplatte/-folie, Tal-kum an den Handschu-hen, Berühren der Fo-lie/des Bodens der Test-platte.

Größere Kontaminations-möglichkeiten: filterlose Pipettenspitzen.

Einbinden der internen Kontrollen: NAC 1, NAC2.

Verwendung von Labor-handschuhen ohne Tal-kum, Verwendung von Pipettenspitzen mit Fil-ter.

Staubfreie Lagerung von Testplatten und –folie.

02D-Pos48

Durchführung der Me-thode – Einfluss der Laborausstattung?

Ungenaue Pipettierung kleiner Volumina.

Ausschließliche Verwen-dung kalibrierter Pipet-ten.







Einbindung von PAC 1 und PAC 2 mit bekann-tem Ct-Wert (Verifizie-rung der Eignung der Ct-Werte).

02D-Obr30, 02D-Pos43

Durchführung der Me-thode – Einfluss des Geräts?

Theoretisch möglich. Verifizierung der Eig-nung des Geräts durch Vergleich mit einer an-deren Vorrichtung/Gerät vor deren Verwendung für die Diagnose.

Beispiel wie bei Bericht über Eig-nungstest D0002/12

Durchführung der Me-thode – Einfluss der Chemikalien?

Alte Chemikalien, unge-eignete Lagerung von Chemikalien, Wahl unge-eigneter Chemikalien, schlechte Qualität einer Chemikaliencharge, kon-taminierte Chemikalien – Beeinträchtigung der Amplifikation, falsch ne-gative/positive Ergebnis-se.

Einbinden der internen Kontrollen: NAC 1, NAC 2. Einbindung von PAC 1 und PAC 2 mit bekann-tem Ct-Wert (Verifizie-rung der Eignung der Ct-Werte).

Aufzeichnung der Ab-laufdaten von Chemika-lien, der Charge-/Inventarnummer oder des Aufbereitungsdatum eines PPS-Gemischs.

02D-Obr30, 02D-Nav24

Durchführung der Me-thode – Einfluss der Umgebung?

Einfluss der Temperatur bei Pipettierung kleiner Volumina.

Verifizierung der Tem-peratur des Raums, in dem PCR-Reaktionsmixe hergestellt werden und des Raums, in dem DNS zugegeben wird.

02D-Obr30, 02D-Pos48

Durchführung der Me-thode – Analyse der Ergebnisse

Falscher Grenzwert – falsch negative Ergebnis-se; Signal, das nicht das Ergebnis der Amplifikati-on ist – falsch positive Ergebnisse.

Verifizierung der Ampli-fikationskurve (z. B. Mehrkomponentenplot).


Feststellung und Eintrag der Testergebnisse

Falsche Interpretation der Ergebnisse der Methode.

Klar definierte Interpre-tation der Ergebnisse (z. B. Nachweisgrenze, Pa-ralleltests und Kontrol-len).








Die zuständige autori-sierte Person für die Überwachung und In-terpretation der Ergeb-nisse verifiziert die Rich-tigkeit der eingegebenen Daten.

02D-Nav01, 02R-Sez07

Endergebnis einer Un-tersuchung – ein Ergeb-nis mit der endgültigen Feststellung vorhan-den/nicht vorhanden

Das Endergebnis hängt von den Teilergebnissen für die verschiedenen einzelnen Amplicons ab – das Fehlen eindeutiger Regeln für die Formulie-rung des Endergebnisses kann zu falschen Schluss-folgerungen führen.

Klar festgelegte Kriterien für den Abschluss der Untersuchungen von Proben. Nur die Perso-nen, die für den ab-schließenden Schritt zuständig und autori-siert sind können die Probenuntersuchung abschließen

02D-Pos10, 02D-Pos43, 02R-Sez07

Falsche Formulierung der Endergebnisse kann den Kunden verwirren.

Die Formulierung der Testergebnisse ist fest-gelegt

02D-Pos18

Benachrichtigung Endergebnisse nicht an alle Seiten weitergeleitet, die lt. Vertrag zum Erhalt des Endergebnisses be-rechtigt sind.

Verzögerung bei der Be-nachrichtigung über die Testergebnisse.

Klar festgelegte Anlei-tungen für die Benach-richtigung über die End-ergebnisse. Der gesamte Schriftwechsel mit dem Kunden wird aufbewahrt (Rückverfolgbarkeit des Schriftwechsels über die einzelnen Proben wird ebenfalls sichergestellt). Das BiaLims-System informiert uns automa-tisch über die fällige Daten/Fristen für die Vorlage von Endergeb-nissen eines Tests.

02D-Nav01, 02D-Nav16

Weitergabe der Testbe-richte

Ergebnisbericht nicht an alle Seiten weitergeleitet, die lt. Vertrag zum Erhalt des Endergebnisses be-rechtigt sind.

Klar festgelegte Anlei-tungen für die Weiterlei-tung und Versendung von Testberichten.

02D-Nav01







Archivierung Beschwerde eines Kun-den, Auftraggebers oder Inhabers über die Durch-führung der Tests.

Organisierte strukturier-te Archive für Testbe-richte für Proben ver-gangener Jahre. Gesi-cherte Nachverfolgbar-keit vom Eingang der Probe bis zu Weitergabe des Testberichts.

Die Proben werden zu-mindest bis zur Überga-be des Testberichts auf-bewahrt. Alle wichtigen DNS-Extrakte werden in einer Sammlung von DNS-Isolaten aufbe-wahrt.

02D-Vzo01, 02D-Pos18, 02D-Nav01, 02R-Nav02, 02R-Nav08

Sonstiges/Anmerkungen /




Bericht 2 – Nachweis von Flavescence dorée (FD) und Bois noir (BN) durch Real-Time-PCR

Validierte Methode:

französische Methode MOA006 Teile A und B Version 1b – Nachweis von Phytoplasmen der

16SrV-Gruppe (Flavescence dorée) und 16SrXII-Gruppe (Bois noir)/Matrix: Vitis sp.

Erratum MOA006 Teil A am 7. März 2012

Referenz internes Standardarbeitsverfahren SOP: AMO07S23

Identifizie-

rung der

Faktoren der

Unsicherheit

Art der Unsicherheit Häufigkeit Maßnahmen zur Verringe-

rung/Vermeidung der Unsicherheit

und entsprechende Dokumentation

Beitrag zur

Gesamtunsi-

cherheit

Mitarbeiter

Bestimmung

von Chargen

und Proben

Fehler beim Zuordnen

der Ergebnisse zu ei-

ner Probe

selten Übertragung der vereinfachten Pro-

bennummer auf das Päckchen und

auf die Dokumentregistrierung

APRO6002

zu vernachläs-

sigen

Etikettierung

von Gestel-

len und Be-

häl-

tern/Röhr-

chen (PCR)

Fehler beim Zuordnen

der Ergebnisse zu ei-

ner Probe

selten Verwendung der vereinfachten Pro-

bennummer auf den Behältern wäh-

rend des Untersuchungsverfahrens

(Beutel, Röhrchen, Belegung der PCR-

Platten) APQA

zu vernachläs-

sigen

Schulung der

Mitarbeiter

Menschlicher Fehler

während des Untersu-

chungsverfahrens

selten Schulung und Autorisierung von Mit-

arbeitern APR02003 / APR02004

zu vernachläs-

sigen

Lesen und

Interpretati-

on von PCR-

Ergebnisse

Risiko falsch positiver

und falsch negativer

Ergebnisse

selten Regeln zur Entscheidungsfindung klar

definiert im Qualitätsmanagement-

system AMO07T42

Schulung und Autorisierung von Mit-

arbeitern APR02003 / APR02004

zu vernachläs-

sigen

Berichts-

bearbeitung:

Niederschrei-

ben von In-

formation

Fehler in der Nieder-

schrift

nicht häufig Gesamtprüfung durch den techni-

schen Leiter.

Prüfung der korrekten Übernahme

der Ergebnisse in den Bericht durch

den technischen Leiter und den ad-

ministrativen Leiter. Bericht unter-

zeichnet vom administrativen Leiter:

APR07001

zu vernachläs-

sigen




Identifizie-

rung der

Faktoren der

Unsicherheit




Beitrag zur

Gesamtunsi-

cherheit

Untersu-

chung und

Aufbereitung

von Puffern,

Lösung und

Reaktions-

gemischen

Fehler beim Herstel-

lungsverfahren

(Menge,…)

Vollständige und detaillierte Stan-

dardarbeitsverfahren, die eine zuver-

lässige Rückverfolgung gestattet

AMO07P32, AMO05T28 und

AMO07T42

zu vernachläs-

sigen

Material

Verteilung

der

Zielphytoplas

men in Pflan-

zengeweben

Zufällige Verteilung

der Phytoplasmen in

den Pflanzengeweben

häufig Probenahme der notwendigen Men-

ge/Volumen von Blattstielen

und/oder Hauptadern an symptoma-

tischen Weinblättern AMO07T42

nicht zu ver-

nachlässigen

Probe bei

Eingang im

Laboratori-

um zersetzt

Entwicklung von Sap-

rophyten und/oder

Zersetzung von Pflan-

zenmaterial verursa-

chen eine Verringe-

rung des Kontaminati-

onsgrads

selten Probe zurückgewiesen, Benachrichti-

gung des Kunden: AMMQSE06 -

APR06002

zu vernachläs-

sigen

Zersetzung

der Proben

während der

Lagerung


rophyten und/oder



chen eine Verringe-


onsgrads

selten Anforderungen an die Lagerungsbe-

dingungen werden festgelegt und

angewendet APQA, APRO6002,

AMO07T42.

zu vernachläs-

sigen

Probe mit

viel Pflan-

zenmaterial

("reiche"

Probe)

Risiko des Vorhanden-

seins von Inhibitoren

gelegentlich Durch das korrekte Ergebnis der

Weinpositivkontrolle kann bestätigt

werden, dass die Amplifikation nicht

gehemmt wird AMO07T42.

zu vernachläs-

sigen




Identifizie-

rung der

Faktoren der

Unsicherheit




Beitrag zur

Gesamtunsi-

cherheit

Qualität der

Reagenzien,

Lösungen,

Puffer und

Medien

Nichtbeachtung der

Anforderungen bezüg-

lich Lagerbedingun-

gen, Ablaufdatum,

Kontaminationen

nicht wahr-

scheinlich

Festlegung von Lagerbereichen und –

bedingungen gemäß den Empfehlun-

gen des Lieferanten und der Festle-

gungen des Laboratoriums. Tempera-

turüberwachung von Klimakammern

(z. B. Kühlschrank) für die Lagerung

von Reagenzien: APQM

Lagerbereiche getrennt von den Be-

reichen für die Probenannahme und

die Lagerung positiver Kontrollen:

APQA

Verwendung relevanter Kontrollen

bei jedem Test AMO07T42

Regelmäßiger Austausch des BET-

Färbebades gemäß APQT01

zu vernachläs-

sigen

Aufbereitung

von Lösun-

gen, Puffern

und Medien

Fehler beim Messen

von Gewicht, Volumen

und pH-Wert

nicht wahr-

scheinlich

Metrologische Kontrollen der Waa-

gen, Pipetten, des pH-Meters, um

sicherzustellen, dass die Anforderun-

gen und der festgelegte Maximalfeh-

ler eingehalten werden

APQM

zu vernachläs-

sigen




Identifizie-

rung der

Faktoren der

Unsicherheit




Beitrag zur

Gesamtunsi-

cherheit

Geräte / Messungen

Geräte unter

metrologi-

scher Über-

wachung

oder nicht

Nichtbeachtung met-

rologischer und/oder

technischer Anforde-

rungen

nicht wahr-

scheinlich

Festlegung und Durchsetzung eines

metrologischen Qualitätsplans APQM.

Verfahren und Kalibrierungs-

/Verifizierungsprogramme: APQM /

APR03032

Pipette : APR03009 / APR03010

Waage : APR03007 / APR03008

pH-Meter : APR03006

Temperaturen : APR03031

PCR-Maschine Qualifizierung :

APR03036

Festlegung eines Wartungs- und Rei-

nigungsplans APRO3005, APQN.

Technische Bestätigung durch den

Metrologieleiter und den technischen

Leiter vor Inbetriebnahme APRO3001.

zu vernachläs-

sigen

Umgebung

Kreuzkonta-

mination:

allgemein


Ergebnisse

selten Desinfektionsplan für Geräte und

Werkbänke.

Beachtung des „Einbahnverkehrs“

während des Untersuchungsverfah-

rens:

APQA

zu vernachläs-

sigen

Kreuzkonta-

mination:

PCR


Ergebnisse

selten Getrennte Räume für die Herstellung

von Reaktionsgemischen, die Zugabe

von DNS-Extrakten, die Amplifikation

und die Elektrophorese und die Ver-

wendung geeigneter Kontrollen

APQT01

zu vernachläs-

sigen




Identifizie-

rung der

Faktoren der

Unsicherheit




Beitrag zur

Gesamtunsi-

cherheit

Lagerung der

Proben


rophyten und/oder



chen eine Verringe-


onsgrads

selten Die Anforderungen an die Lagerungs-

bedingungen werden festgelegt und

eingehalten.

APQA, APRO6002, AMO07T42.

zu vernachläs-

sigen

Methode / Verfahren

Positive Kon-

trolle für das

gesamte

Verfahren

Kontrolle nicht nach-

gewiesen

gelegentlich Feste Regel:

Wenn die positive Extraktionskontrol-

le nicht die richtige Reaktion zeigt, ist

- entweder eine andere Probe der-

selben Extraktionsserie positiv und

damit der Lauf validiert

- oder keine Probe war positiv im

Lauf (selten) und der Lauf ist nicht

validiert. Der Versuch ist zu wie-

derholen.

Die Verwendung "Wein"-interner

Positivkontrollen für jede Probe er-

laubt die Validierung der Qualität von

jedem Extrakt AMO07T42.

zu vernachläs-

sigen

Sensitivität /

Nachweis-

grenze

Zielorganismus unter

der Nachweisgrenze

möglich

Häufigkeit

nicht fest-

gestellt

Das Risiko hängt von der Methode ab.

Verwenden Sie Kontrollen an der

Nachweisgrenze MO07T42.

Leistungskriterien für den Test wer-

den im internen Validierungsbericht

festgelegt FD BN 2009.

nicht zu ver-

nachlässigen

abhängig von

den Grenzen

der verwende-

ten Methode

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Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die ... · Das Laboratorium muss ein Qualitätsmanagementsystem entwickeln, umsetzen und pflegen, das alle Einrichtungen und Aktivitäten