Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Domagoj Đikić

UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH

BIOMARKERA U MIŠA

Zagreb, 2006.

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Domagoj Đikić

UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH

BIOMARKERA U MIŠA

Doktorska disertacija predložena

Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu Radi stjecanja akademskog stupnja

doktora prirodnih znanosti

Zagreb, 2006.

Ova disertacija izrađena je u Zavodu za animalnu fiziologiju, Biološkog odsjeka,

Prirodoslovno matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom

Prof.dr.sc. Oskara P. Springera u sklopu Sveučilišnog poslijediplomskog studija

pri Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u

Zagrebu.

Zahvaljujem voditelju i svima koji su pomogli u izvedbi disertacije.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Doktorska disertacija Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek

UČINAK PROMETRINA NA ODNOSE

SERUMSKIH I TKIVNIH ENZIMSKIH BIOMARKERA U MIŠA

Domagoj Đikić

Zavod za animalnu fiziologiju Biološki odsjek PMF

Rooseveltov trg 6 10 000 Zagreb

Sažetak: S-Triazinski herbicid prometrin relativno je postojan u okolišu i ljudskoj hrani u kojeg dolazi nakon zaštite nasada. Cilj disertacije je utvrditi toksikološko-patofiziološko djelovanje prometrina na fiziologiju odabranih vitalnih organskih sustava na mišjem modelu (in vivo) mjereći najsuptilnije pokazatelje oštećenja stanica, te odrediti najranije pokazatelje smrti, dinamiku, jačinu i način smrti (apoptotičnu ili nekrotičnu) pojedinih stanica u vitalnim organima, nakon subkronične izloženosti različitim dozama. Proporcionalno s dozom povećava se serumska aktivnost LDH, y-GT, AlP, smanjuje se koncentracija kreatinina, a vrlo blago ali značajno raste aktivnost AST i nešto manje aktivnost ALT. De Ritiusov se koeficijent s dozom ne mijenja bitno. Rezultati analize komet testa pokazuju oštećenja integriteta stanične DNA, karakterizirane povećanom lomljivošću molekule sa porastom doze. Do hiperplazije i infiltracije imunokompetentnih stanica dolazi u tankom crijevu, poprečno-prugastom mišićju i slezeni. Protočna citometrija pokazuje da najmanje doze više podstiću apoptozu a najveće doze nekrozu u stanica limfnog čvora i u timocita. Zaključno moglo bi se govoriti o prometrinu kao o otrovu koji ima imunotoksični, hematotoksični, hepatotoksični, nefrotoksični, genotoksični i nadasve miotoksični učinak i mjenja metaboličnu ravnotežu u animalnom organizmu.

Stranica: 240, slika: 119, tablica 41 , literaturnih navoda: 160 , jezik izvornika: hrvatski Rad je pohranjen u Nacionalnoj sveučilišnoj biblioteci Mentor: Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Ocjenjivači: Prof. dr. sc. Franjo Plavšić

Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Prof. dr. sc. Marija Heffer-Lauc

Ključne riječi: prometrin, LDH, AlP, kreatinin, AST, ALT, klinička kemija, protočna citometrija, annexinV-FITC, komet-tehnika, enzimatska histopatologija, toksikologija. Tema prihvaćena;08. 02. 2006.

BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Doctoral thesis Faculty of Science Department of Biology

THE EFFECT OF PROMETRINE ON SERUM AND

TISSUE ENZYME BIOMARCERS IN MICE

Domagoj Đikić Zavod za animalnu fiziologiju

Biološki odsjek PMF Rooseveltov trg 6

10 000 Zagreb

Abstract: Prometryn, an S-Triazine herbicide is relativly persistent in human food and enviroment after crop protection use. Thesis aim to demonstrate what toxic and pathophysiologic effects prometryn has on physiology of vital organ functions (in vivo) by mesurng the suptile changes of cell dammage and first signs of apoptotic and necrotic death. We demonstrated dynamic and strength of dammage after subchronic exposure to various doses of prometrye. LDH, y-GT, AlP activity rises in a dose dependent manner, creatinine contcentration lowers, AST and ALT rises rather slowly. De Ritis ratio is slaightly changed. Comet-assay analysis shows DNA dammage in peripheral blood cells. DNA is fragile as the doses are higher. Immune response is noted in gut, sceletal muscle and spleen. Flow cytometry shows that lower doses induce apoptotic changes and higher doses necrotic changes in lymph nodes and thymus. Prometryn could be characterized as a potentialy immunotoxic, haematotoxic, hepatotoxic, nephrotoxic, genotoxic and especially myotoxic pesticide that can change metabolic homeostasis in an animal organism.

Pages: 240, figures: 119 , tables 41 , references: 160, original in Croatian Thesis deposited in National University library Supervisor: Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Reviewers: Prof. dr. sc. Franjo Plavšić

Prof. dr. sc. Oskar P. Springer Prof. dr. sc. Marija Heffer-Lauc

Key words: prometrine, LDH, AlP, creatinin, AST, ALT, clinical chemistry, flow cytometry, annexinV-FITC, comet assay, enzymatic histopathology, toxicology. Thesis accepted; 08. 02. 2006.

POPIS KRATICA: ADI – engl. Aceptable Daily Intake, dnevno prihvatljiva doza unosa tvari u organizam Alp – Alkalna fosfataza ALT – Alanil aminotransferaza AST – Aspartat aminotransferaza B6C3F1 - soj laboratorijskih miševa BALB/C – soj laboratorijskih miševa BSA – engl. Bovine Serum Albumin, Albumin iz goveđeg seruma C57BL - soj laboratorijskih miševa CBA T6T6 - soj laboratorijskih miševa CD1 - soj laboratorijskih miševa CNS – engl. Central Nervous System CK – Kreatinin fosfokinaza CRP – C reaktivni protein CYP450 – citokrom P 450 enzimi DAPI – fluorescencijska boja za mikroskopiju i protočnu citometriju DKS – diferencijalna krvna slika DMF – dimetil formaldehid DNA – DNK EDTA – etilene diamin tetraoctena kiselina ELISA- engl. Enzyme-linked Immunoasorbent Assay EPA – engl. Enviromental Protection Agency EST – esteraza FDA – engl. Food and Drug Administration FITC – fluorokromska boja u protočnoj citometriji FMO – flavin monooksigenaze GALT- engl. Gut Assotiated Lymphatic Tissue GGT – gama glutamil transferaza yGT – isto kao GGT GOT – sinonim za AST HE – hemalaun eozinsko bojenje HMGCoA – hidroksi-metil-glutaril-koenzim A, jako hipolipidemičko sredstvo HPLC – visokotlačna kromatografija ICR - soj laboratorijskih miševa kD – kilo Daltona KF- kisela fosfataza

LD 50 –doza otrova koja usmrćuje 50% ispitivne populacije LDH – laktat-dehidrogenaza LH – luteinizirajući hormon LOEL – engl. Lowest Observable Efecte Level MALT – engl. Mucose Assotiated Lymphatic Tissue NOAEL – engl. No Observed Effect Level OTM – engl. Olive Tail Moment P-450 – citokromatski enzim monooksigenaza u biotransformaciji otrova PAI-B3AG8I – soj stanica mišjeg mijeloma PAS – engl. Periodic Acid Schiff, bojenje PBS – engl. Phosphate Buffer Saline PI – propidij jodid ppm – engl. Parts Per Million RfD – engl. Reference Dose SD – standardna devijacija ScDH- Sukcinat dehidrogenaza Swiss – soj laboratorijskih miševa T3 – trijodtironin T4 – tiroksin TLC – tankoslojana kromatografija U/L – internacionalna jedinica aktivnosti enzima po litri Y59 – rijedak, gotovo izumrli laboratorijski soj štakora WHO – engl. World Health Organization

SADRŽAJ

1 UVOD.......................................................................................................1

2 LITERATURNI PREGLED....................................................................4

2.1 HERBICIDI...............................................................................................................5

2.2 TRIAZINSKI HERBICIDI...............................................................................................................6

2.3 OPĆA SVOJSTVA PROMERINA............................................................................................................8

2.3.1 PRISUTNOST PROMETRINA U OKOLIŠU...............................................................................................................10

2.3.1.1 Prometrin u sedimentu vodenih ekosustava i pitkoj vodi......................................................................................................................10

2.3.1.2 Mikrobiološka biorazgradnja prometrina i toksičnost za mikroorganizme...................................................................................................10

2.3.2 NAKUPLJANJE PROMETRINA U BILJKAMA LJUDSKE PREHRANE...........................................................................................................11

2.4 TOKSIČNI UČINCI PROMETRINA NA FIZIOLOŠKE SUSTAVE ŽIVOTINJA.............................................................................................................14

2.4.1 UČINAK PROMETRINA U NIŽIH KRALJEŠNJAKA I BESKRALJEŠNJAKA…………………………………………………………..…..……14

2.4.2 OPĆA I SISTEMSKA TOKSIČNOST PROMETRINA.......................................................................................................15

2.4.3 IMUNOHEMATOTOKSIČNOST PROMETRINA……………………………..…… 16

2.4.4 UČINAK PROMETRINA NA ENDOKRINI I REPRODUKTIVNI SUSTAV ŽIVOTINJA............................................................................................................17

2.4.5 UČINAK PROMETRINA NA NUKLEINSKE KISELINE MUTAGENOST I GENOTOKSIČNOST…………………………………………………………………....18

2.4.6 METABOLIČNA RAZGRADNJA PROMETRINA U ORGANIZMU (PREDLOŽENI MODEL NA ŠTAKORU)...........................................................................................................19

2.4.7 ENZIMI KAO DIJAGNOSTIČKI BIOMARKERI OŠTEĆENJA POJEDINIH ORGANSKIH SUSTAVA...............................................................................................................22

2.4.7.1 Laktat dehidrogenaza (LDH)..................................................................................................................22

2.4.7.2 Gama glutamil transferaza (GGT)......................................................................35

2.4.7.3 Alkalna fosfataza (ALP)......................................................................................40

2.4.7.4 Kreatinin i kreatinin fosfokinaza (CK).....................................................................................................................45

2.4.7.5 Alanin aminotransferaza (ALT)...........................................................................49

2.4.7.6 Aspartat aminotransferaza (AST)........................................................................53

2.4.8 METODA KOMET TESTA U PROCJENI TOKSIČNOSTI NOKSI....................................................................................................................56

2.4.8.1 Apoptoza i nekroza..............................................................................................58

3 MATERIJALI I METODE

3.1 POKUSNE ŽIVOTINJE..........................................................................................62

3.2 PLAN POKUSA I NAČIN APLIKACIJE POJEDINIH DOZA PROMETRINA........................................................................................................64

3.3 ODREĐIVANJE TJELESNE TEŽINE POKUSNIH ŽIVOTINJA ..................................................................................................................................66

3.4 ANALIZA SERUMSKIH ENZIMA SPEKTROFOTOMETRIJOM.................................................................................66

3.5 ANALIZA PERIFERNE KRVI..............................................................................70

3.5.1 ODREĐIVANJE BROJA ERITROCITA I LEUKOCITA.........................................................................................................70

3.5.2 DIFERENCIJALNA KRVNA SLIKA (DKS)……………………………………………………………………….…….……....70

3.6 ANALIZA LIMFOHEMATOPOETSKIH ORGANA...........................................71

3.7 KOMET TEHNIKA LEUKOCITA PERIFERNE KRVI......................................71

3.8 METODA PROTOČNE CITOMETRIJE..............................................................73

3.9 STATISTIČKA OBRADA PODATAKA............................................................................................................74

3.10 HISTOPATOLOGIJA..............................................................................................75

3.11 ENZIMATSKOHISTOKEMIJSKE REAKCIJE NA TKIVA.....................................................................................................................80

3.12 GLICERIN ŽELATINA I UKLOP PREPARATA.................................................82

4 REZULTATI

4.1 PREŽIVLJAVANJE................................................................................................84

4.2 REZULTATI MJERENJA AKTIVNOSTI SERUMSKIH ENZIMA ..................................................................................................................................86

4.3 KORELACIJE I REGRESIJE ENZIMA...............................................................102

4.4 REZULTATI KOMET TEHNIKE........................................................................130

4.4.1 REZULTATI KOMET TESTA NAKON 14. DANA IZLOŽENOSTI PROMETRINU…………………………………………………………………….…...130

4.4.2 REZULTATI KOMET TESTA NAKON 28. DANA IZLOŽENOSTI PROMETRINU………………………….………………………………………….......140

4.5 UČINAK PROMETRINA NA BROJ ERITROCITA I LEUKOCITA U PERIFERNOJ KRVI..............................................................................................150

4.6 UČINAK PROMETRINA NA DIFERENCIJALNU KRVNU SLIKU (DKS).....................................................................................................................153

4.7 UČINAK PROMETRINA NA STANIČNOST KOŠTANE MOŽDINE.............................................................................................................156

4.8 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST TIMUSA.................................................................................................................156

4.8.1 UČINAK PROMETRINA NA APOPTOZU, NEKROZU I VITALNOST TIMOCITA ISPITIVAN PROTOČNOM CITOMETRIJOM.................................................................................................156

4.9 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU, BROJ STANICA I HISTOLOŠKE PROMJENE SLEZENE...............................................................................................................157

4.9.1 UČINAK PROMETRINA APOPTOZU, NEKROZU I VITALNOST SPLENOCITA ISPITIVAN PROTOČNOM CITOMETRIJOM................................................................................................161

4.10 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I STANIČNOST LIMFNOG ČVORA (BRAHIJALNOG).................................................................................................161

4.11 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKE PROMJENE JETRE....................................................................................................................177

4.12 UČINAK PROMETRINA NA TEŽINU I HISTOPATOLOŠKU SLIKU BUBREGA............................................................................................................186

4.13 UČINAK PROMETRINA NA PROBAVNI SUSTAV................................................................................................................187

4.14 UČINAK PROMETRINA NA MOZAK..............................................................190

4.15 UČINAK PROMETRINA NA POPREČNOPRUGASTO MIŠIĆNO TKIVO...................................................................................................................194

5 RASPRAVA..........................................................................................199

6 ZAKLJUČAK.......................................................................................219

7 CITIRANA LITERATURA......................................................................................222

8 ŽIVOTOPIS..........................................................................................237

1. UVOD

1. UVOD

Porast broja svjetskog stanovništva zahtjeva i razmjerno veću proizvodnju hrane stoga

se u modernoj poljoprivredi i dalje nužno koriste kemijska sredstva za zaštitu bilja nakon

čega mnogi njihovi ostaci završavaju u okolišu i hrani, štetno djelujući na ne ciljne vrste pa

i čovjeka (Beard 2005, Glavač 1999, Walker 2001, Wallace-Hayes i sur. 2000). Velika

skupina okolišnih kemikalija za zaštitu bilja su herbicidi. To su spojevi organskog ili

anorganskog porijekla koji služe za uništenje biljaka (lat. herba = biljka, caedere = uništiti).

S obzirom da je prometrin relativno postojan (sedamdeset i dva dana ali ponekad i do tri

godine ovisno o uvjetima okoliša), i može se detektirati u značajnijim koncentracijama u

okolišu i hrani, ovisno o postupku detekcije a kako se upotrebljava za suzbijanje

jednogodišnjih trava i širokoslisnog korovnog bilja u nasadima pamuka, lana ali i celera,

graška, kukuruza, soje, krumpira, suncokreta i mrkve, biljaka čiji je primarni i/ili sekundarni

konzument čovjek, smatrali smo potrebnim provesti toksikološki pokus s prometrinom na

animalnom modelu (Bardalaye i sur., 1985, Berg i Müller, 1995, Böcher i sur., 1992,

Böcher i Sorensen 1994, Gabrilevskaia i sur., 1972, Kamrin i sur., 2000, Raszyk 1986,

Svobodova i sur., 1995.).

Pregledom do danas nama dostupne literature, uočeno je da je publicirano relativno malo

toksikoloških i ekotoksikoloških radova o prometrinu vjerojatno stoga jer je većina

znanstvenika godinama naglasak u istraživanjima davala atrazinu i kloriranim triazinima

pretpostavljajući njihovu veću toksičnost u odnosu na tio-S-triazine. Također je objavljeno

samo nekoliko radova o utjecaju prometrina na imunološki sustav štakora (Giurgea i sur.,

1981, 1979, Messow i sur. 1990).Većina radova istražuje učinkovitost prometrina kao

herbicida u sklopu ispitivanja agrotehničkih postupaka,

Cilj rada je utvrditi toksikološko-patofiziološko djelovanje prometrina na fiziologiju

odabranih vitalnih organskih sustava na mišjem modelu (in vivo). Odabir metoda

istraživanja ukazuje kako je cilj ponajprije bio utvrditi najsuptilnije pokazatelje oštećenja

stanica i odrediti najranije pokazatelje smrti pojedinih stanica u vitalnim organima, te

dinamiku, jačinu i način smrti (apoptotičnu ili nekrotičnu) kao posljedicu djelovanja

prometrina.

Obrazloženje teme: dobar pokazatelj ranog toksičnog stresa na pojedine organe predstavlja

mjerenje aktivnosti serumskih enzima; naime, kao proteinske makromolekule, enzimi u

normalnoj fiziologiji ne mogu prolaziti kroz stanične membrane. Oštečuje li toksikant na

2

bilo koji način stanicu, u izvanstaničnoj tekućini i krvi nalazit će se male količine pojedinih

enzima koji potječu od stanica pod toksičnim stresom. Budući da razina aktivnosti enzima

ovisi o ulasku enzima iz stanica u krv, funkcija i stupanj razvoja stanica u kojima se neki

enzim eksprimira kao i intenzitet ekspresije određuje koliko će enzima odumiranjem tkivnih

stanica dospjeti u cirkulaciju. S obzirom na tkivnu specifičnost enzima moguće je

lokalizirati ranu pojavu patološkog procesa i stupanj oštećenja. Nadopunu ovih rezultata

izvršilo se uporabom metoda histopatološke i enzimskohistopatološke analize. Metode

protočne citometrije i komet tehnika također imaju za cilj pokazati rane apoptotične

(annexinV-FITC) i nekrotične (propidij jodid) smrti na membranama stanica imunološkog

sustava i organa. Nadopuna ovim dvjema tehnikama su određivanja celulariteta

imunohematopoetskih organa.

Svrha rada je, s obzirom na naprijed obrazloženo, nadopuna dosadašnjih spoznaja o

toksičnom djelovanju prometrina kao induktora oksidativnog stresa na ne ciljne organizme

što predstavlja novi doprinos u procjeni rizika njegove potencijalne opasnosti po dobrobit i

zdravlje čovjeka i drugih sisavaca. Očekujemo da će rezultati dati osnovnu sliku o

interferenciji u metabolizmu organizma sisavaca te procjenu kojom jačinom prometrin kao

herbicid oštećuje vitalne sustave životinja. Analizom dobivenih rezultata pokušat će se

utvrditi postoje li naročito osjetljiva tkiva ili fiziološki sustavi koji mogu potencijalno

uzrokovati opadanje vitalnosti životinja i/ili smrt, također u razmatranje će se uzeti postoje

li spolno uvjetovane razlike u toksičnosti izazvane prometrinom, te postoji li međuovisnost

doze i vremena tijekom kontakta s prometrinom. Usporedbom dobivenih rezultata s

podacima u literaturi pokušat će se zaključiti postoje li razlike ili sličnosti u toksičnim

učincima između vrsta, poglavito u usporedbi dvaju najčešćih laboratorijskih životinja

(usporedba štakor miš), što predstavlja korak za ekstrapolaciju procjene rizika za

čovjeka. Također smatramo da bi dobiveni rezultati predstavljali početnu točku za daljnje

pokuse međudjelovanja prometrina u smjesama toksikanata koje nalazimo zaostale u

okolišu (toksični sinergizam, antagonizam, adicija i dr.).

3

2. LITERATURNI PREGLED

5

2. LITERATURNI PREGLED

2.1. HERBICIDI U užem smislu pod pojmom herbicidi podrazumjevaju se spojevi namjenjeni uništenju

korovnih biljaka. Poznate su brojne podijele herbicida, a ovdje su navedene s obzirom na

kemijske, fizikalne i biološko-fiziološke osobine i svojstva (Janjić 1985):

Prema učinku najčešće se dijele na:

- totalne (uništavaju sve biljne vrste) i

- selektivne (uništavaju samo određene biljne vrste)

Prema načinu i mjestu djelovanja mogu biti:

- kontaktnog djelovanja (djeluju u neposrednom kontaktu s biljkom i uništavaju biljne

dijelove s kojima su u dodiru)

- translokacijskog djelovanja (apsorbiraju se i prenose u razne biljne organe dalje od mjesta

ulaska i izazivaju njihovo odumiranje)

Prema toksičnosti za životinje i čovjeka (testirano na standardnim laboratorijskim životinjama)

najčešće se dijele na:

- skupina I – LD 50 < 50 mg/kg

- skupina II – LD 50 50-250 mg/kg

- skupina III – LD 50 250-1000 mg/kg

- skupina IV – LD 50 > 1000-5000 mg/kg

S obzirom na njihovu stabilnost u okolišu možemo ih označiti kao:

- vrlo stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja duže od 2 godine)

- stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja od 6 mjeseci do 2 godine)

- umjereno stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja 1 do 6 mjeseci) i

- slabo stabilni herbicidi (vrijeme razlaganja kraće od 1 mjeseca)

6

S obzirom na kemijsku strukturu dijelimo ih na:

- karbonske kiseline i njene derivate

- ariloksialilkarbonske kiseline i njene derivate

- derivate karbaminske kiseline

- derivati tio i ditiokarbaminske kiseline

- derivate karbamida

- derivati dipiridila

- nitrofenoli, nitroanilini i njihovi derivati

- heterociklički spojevi s dva atoma dušika u prstenu (diazini)

- heterociklički spojevi s tri atoma dušika u prstenu (triazini) 2.2. TRIAZINSKI HERBICIDI

Triazini su heterociklički spojevi s tri atoma dušika i tri atoma ugljika u šesteročlanom

prstenu. Triazinima pripadaju spojevi poput atrazina, simazina, terbutilazina, cijanazina i

prometrina. Triazini su još uvijek najčešće korišteni herbicidi u svijetu (Berg i sur. 1995,

Böcher i sur. 1994, Wallace-Hayes i sur. 2001).

Unutar ove skupine razlikujemo (sl. 1.) :

a) 1,2,3-triazin

b) 1,2,4-triazin

c) 1,3,5-triazin

NN

N

N

NN

N N

N

1,2,3-triazin 1,2,4-triazin 1,3,5-triazin

Slika 1.: Strukturalna građa molekula različitih tipova triazinskih spojeva

7

Posljednji se još naziva i simetrični triazin i pridružuju mu se oznake sym-triazin ili S-

triazin. Svaki od ova tri oblika ima brojne derivate. Daleko najvažniji su derivati 1,3,5-triazina

(Falbe i Regitz 1995) Imaju široku primjenu kao pesticidi, zatim u industriji boja i u

proizvodnji eksploziva (Falbe i Regitz 1995, Wackett i sur. 2001).

Triazini su kao organski herbicidi vrlo efikasni u različitim biljnim kulturama.

Selektivno djelovanje rezultira vrlo uspješnim suzbijanjem sjemenskih širokolisnih i nekih

uskolisnih korova. U nižim dozama nedovoljno djeluju na višegodišnje korove (Glasnik zaštite

bilja 2000).

U većim dozama djeluju kao totalni herbicidi pa se primjenjuju za uništavanje biljnog pokrova

na željezničkim nasipima, putovima, u industrijskim objektima.

Simetrični triazini mogu se podijeliti u tri skupine:

kloro-triazini

metoksi-triazini

metiltio-triazini

Kao herbicidi počeli su se intenzivno primjenjivati prije 40 godina za uništavanje korova kod

različitih usjeva i za kontrolu rasta korova na nepoljoprivrednom zemljištu (Kniewald 2001).

Triazini pripadaju malo otrovnim pesticidima (Srebočan 1992). Vrijednosti LD50 oralno

za štakora za neke od triazina su prikazani u tablici 1.

Tablica 1: Relativna toksičnost nekih triazina za šakora prikazana kao LD50

triazin LD50 oralno štakor (mg/kg)

ametrin 964

atrazin 3080

cijanazin 334

prometrin 3750

simazin 5000

propazin > 5000

8

2.3. OPĆA SVOJSTVA PROMETRINA

Metil-tio-S-triazinski spoj, molekulske formule: C10H19N5S, prometrin (N,N´-Bis (1-metiletil)-6-(metiltio)-1,3,5-triazine-2,4-diamine, sinonim: 2,4-bis (izopropilamino)-6-(metiltio)-S-triazin), malo je do umjereno toksičan spoj i seletivni pesticid opće namjene. Prometrin je aktivna tvar nekoliko herbicida u Republici Hrvatskoj (Glasnik zaštite bilja 2000) registriranih pod komercijalnim nazivima:

• Prometrex 50 SC, • Prohelan-T, • Gesagard 50 WP, • Gesagard 500 Fl.

U svijetu je registriran pod komercijalnim nazivima (Kamrin i sur. 2000, Maynard i sur. 1999):

• Caparol, • Caparol 80W, • Cotton-Pro, • N,N´-Diisopropyl-6-methylthio-1,3,5-triazine-2,4-diyldiamine, • G 34161, • Gesagard, Gesagard 50, Gesagard 500 • Merkazin, • 2-Methylmercapto-4,6-bis (isopropylamino)-S-Triazine, • 2- Methylthio- 4,6 bis (isopropylamino)-S-Triazine, • Polisin, • Primatol, • Primatol Q, • Prometrex, • Prometryn, • Prometryne, • Selektin, • Sesagard Prometrin se rabi za suzbijanje jednogodišnjih trava i širokoslisnog korovnog bilja u

nasadima pamuka, lana ali i celera, graška, kukuruza, soje, krumpira, suncokreta i mrkve, tj.

biljaka čiji je primarni i/ili sekundarni konzument čovjek. Dokazano je da djeluje kao inhibitor

Hillove reakcije u fotosintezi (Kamrin i sur. 2000, Wallace-Hayes i sur. 2001). Dobro je topiv u

9

mastima i organskim otapalima. S obzirom na otrovnost za životinjske organizme svrstan je u

skupinu II ili III, ovisno o formulaciji (Glasnik zaštite bilja 2000, Kamrin i sur. 2000).

Oralno aplicirana LD 50 vrijednost za miša je 3750 – 3800 mg/kg tjelesne težine životinje

(EPA 1996, EPA-IRIS 2001, Extoxonet 1996, Kamrin i sur. 2000). Relativno je postojan u

okolišu (od sedamdesetdva dana a ponekad i do tri godine ovisno o uvjetima okoliša) i može se

detektirati u značajnijim koncentracijama u okolišu i hrani, ovisno o postupku detekcije

(Bardalaye i Wheeler 1985, Berg i sur. 1995, Böcher i sur. 1992, Böcher i Sørensen 1994,

Gabrilevskaia i Laskina 1972, Kamrin i Montgomery 2000, Raszyk 1986, Svobodova i sur.

1995).

Slika 2: Strukturna formula molekule prometrina

10

2.3.1. PRISUTNOST PROMETRINA U OKOLIŠU

2.3.1.1. Prometrin u sedimentu vodenih ekosustava i pitkoj vodi

Triazini su naširoko prisutni u vodenim ekosustavima i pitkoj vodi. Posebice je istraživan

atrazin i njegovi metaboliti primjerice hidroksiatrazin i desetilatrazin, čija se visoka toksičnost

za čovjeka već duže vrijeme poznaje (Berg i sur. 1995). Međutim manje je podataka, ali ipak

postoje o prometrinu u vodi. Istraživanje njemačkih autora provedeno na uzorcima sedimenta

Njemačkog Wadden jezera, govori o detektiranim koncentracijama većim ili jednakim 500

ng/kg uzorka. Posebno visoke koncentracije bile su prisutne u estuariju rijeke Weser, što govori

o transportu rezidua herbicida s poljoprivrednih površina u more (Bester i Huenhnerfuss 1996).

ilustrativan primjer prave opasnosti od mogućeg toksičnog djelovanja prometrina na zdravlje

čovjeka predstavlja studija biomonitoringa pitke vode gradskog vodovoda u Ljubljani autorice

Leh i suradnika (2005), gdje se iznose podaci mjerenja rezidua pojedinih pesticida u gradskom

vodovodu od kojih prometrin doseže polovicu propisanih MAK vrijednosti za pitku vodu

odnosno 0.5 μg/L.

2.3.1.2. Mikrobiološka biorazgradnja prometrina i toksičnost za

mikroorganizme Studije utjecaja na mikroorganizme okoliša ukazuju da prometrin ne predstavlja ekotoksičnu

noksu koja bi u većoj mjeri mogla narušiti populacijsku ravnotežu pojedinih komponenti

mikroflore tla koja bi uzrokovala veće promjene u ekosustavu. Mikroflora tla vrlo je bitna za

biodegradaciju prometrina koji se našao u okolišu. Bezgulov i sur. izvještavaju da prometrin

apliciran svake godine u proljeće, tijekom 8 godina u dozama od 1.5 kg/ha nije pokazao

značajan utjecaj na mikroorganizme tla. Amonificirajuće bakterije i gljive, aktinomiceti i

denitrifikacijske bakterije pokazale su se neosjetljive na sve pesticide testirane u ovoj studiji, a

tako i na prometrin (Bezuglov i sur., 1976). U okolišu osim abiotičkih čimbenika koji utječu na

degradaciju i razgradnju prometrina, važnu ulogu imaju i mikroorganizmi, najviše bakterije.

Brojni su dokazi ovoj tvrdnji. Istraživanje u kojem autoklavirani i nesterilizirani uzorci gline,

svaki tretiran s 4 ppm prometrina i inkubiran 60 dana, kao suhi, bezvodni na 4 °C ili sa

prisutnih 75 % vlage na 30 °C pokazuju da više prometrina ostaje u steriliziranom vlažnom

11

uzorku nego u nesteriliziranom. Također, uzgojem biljke krastavca u ovako pripremljenim,

nesteriliziranim uzorcima tla, nije bilo znakova fitotoksičnosti prometrinom nakon 47 dana. To

ukazuje na mikrobiološku razgradnju kao jedan od glavnih načina detoksikacije prometrina u

tlu. U istom radu autori opisuju pokus u kojem su uzorku tla tretiranog s prometrinom dodali 1

%-tnu otopinu glukoze i ekstrakte kvasca, nakon 30 dnevne inkubacije. Tako tretirani uzorak

tla sadržavao je manje prometrina u odnosu na kontrolu.

Dodatkom antibiotika, bakterijskog inhibitora kloramfenikola nakon 40 dnevne inkubacije

uzorak tla predtretiranog prometrinom sadrži više prometrina u odnosu na kontrolni uzorak.

Međutim, dodatkom cikloheksamida, gljivičnog inhibitora, uzorak nije pokazao statistički

bitnu razliku u koncentraciji prometrina u odnosu na kontrolu. Autori izvode zaključak da je

mikrobiološka degradacija prometrina uglavnom zasluga bakterijskih populacija u tlu (Hulin i

sur. 1973).

Bakterije tla degradiraju prometrin tijekom faze rasta. U kulturi bakterija selektiranih

predteretmanom prometrinom, identificirana su tri metabolita biorazgradnje. Autori ovog

pokusa utvrdili su da nakon bakterijske metabolizacije triazinski prsten ostaje intaktan. Rezultat

podržava hipotezu prema kojoj metiltio-S-triazini degradiraju u tlu procesom N-dealkilacije

bočnih ogranaka molekule. Intaktnost triazinskog prstena nakon bakterijskog djelovanja

ukazuje da bakteriološka degradacija rezidua prometrina u tlu ne znači nužno i potpunu

detoksikaciju tla (Giardina i sur. 1977).

2.3.2. NAKUPLJANJE PROMETRINA U BILJKAMA LJUDSKE PREHRANE

Korjenasto bilje, poput mrkve, repe, krumpira najbolji je modelni organizam za

demonstraciju akumulacije ksenobiotika. Bioakumulacija prometrina u biljkama koje primarno

i/ili sekundarno koristi čovjek i životinje tema je brojnih studija. Rezultati ukazuju da

koncentracija rezidua u biljci rijetko prelazi 0.1 ppm. Također vremenski, rezidue ne ostaju u

biljci dulje od nekoliko mjeseci, što izravno ovisi o apliciranoj koncentraciji. U prilog tome

govore rezultati studije akumulacije prometrina provedene na biljkama mrkve koje su rasle na

tlu tretiranom s 3 kg/ha, 5 kg/ha i 10 kg/ha. Pri najnižoj apliciranoj dozi od 3 kg/ha, prosječna

koncentracija prometrina u tlu prvi dan nakon aplikacije bila je 0.5 mg/kg, što je, prema

autorima granična vrijednost dopuštena u to doba u SSSR-u.

12

Veće doze prometrina od 5 kg/ha i 10 kg/ha povećale su ostatke prometrina u tlu 7-13 puta više

od dopuštene granice (Gordienko 1977).

Autori Kavolyunayte i Shpokauksas (1974) izvještavaju da se koncentracija prometrina u

krumpiru uzgojenom na tlu tretiranom s 2 kg/ha i 4 kg/ha kreće između 0 i 0.08 mg/kg, a u

gornjim slojevima tla koncentracija se kretala između 0.01 mg/kg i 0.64 mg/kg.

Heinisch i Refenstein (1971) zabilježili su koncentracije od 0.02-0.05 ppm u mrkvi ubranoj

3-5 mjeseci nakonu tretirana od 2.5 kg/ha zemljišta za uzgoj.

U sličnom istraživanju nakon tretmana tla prometrinom koncentracijama 1.5 kg/ha, 2 kg/ha,

2.5 kg/ha i 3.5 kg/ha, 2 mjeseca nakon tretmana u korjenu mrkve utvrđene su koncentracije

0.22-0.27 mg/kg za dozu 1.5 kg/ha, 0.3-0.34 mg/kg za dozu 2 kg/ha, 0.08-0.11 mg/kg u lišću

mrkve i 0.22 mg/kg u tlu. Četiri mjeseca nakon aplikacije doza 1.5 i 2 kg/ha rezidue prometrina

nisu detektirane u korjenu, lišću i tlu.

Međutim, tri mjeseca od aplikacije utvrđene koncentracije u korjenu mrkve iznosile su 0.01-

0.02 mg/kg za dozu od 2.5 kg/ha i 0.03-0.05 mg/kg za dozu od 3.5 kg/ha. Kod ovih doza, čak i

6 mjeseci nakon aplikacije herbicida, tragovi prometrina bili su detektirani u lišću i korjenu

mrkve (Ivanova i sur. 1973).

Reifenstein i Heinisch (1973) utvrđuju da mrkva koja je rasla na tlu jednokratno tretiranom s

2-3 kg/ha sadrži prometrin u koncentraciji ispod 0.03 ppm, a vrijednost od 0.15 ppm, što je

iznad granične vrijednosti koja je iznosila 0.1 ppm u biljci, a prema tadašnjim propisima DDR-

a, izmjerena je samo u jednom uzorku od ukupno 46 izmjerenih. U gornjim slojevima tla autori

su nakon jednokratnog tretmana izmjerili koncentraciju prometrina ispod 0.02 ppm. Autori

zaključuju da aplikacija herbicida prometrina ne stvara problem s akumuliranim ostacima tog

herbicida

Studija Rumunjskih znanstvenika provedena na luku i mrkvi, s dozama 2-6 kg/ha

apliciranog prometrina, spominje koncetracije od 0.28-1.5 ppm u proljeće i 0.2-0.72 ppm u

jesen. Korijen luka je sadržavao koncentraciju od 0.008-0.018 ppm, a korijen mrkve 0.05-0.1

ppm. U lišću obaju biljaka izmjerena je koncentracija od 0.001-0.05 ppm (Rughinis i sur.

1977).

Norveški znanstvenik Fiveland proveo je sličan pokus na dva različita tipa tla (sjeverna

Norveška, tlo sa 6% humusnih tvari i tlo u južnoj Norveškoj s 9 % humusnih tvari). Aplicirane

doze prometrina bile su jednokratno 1.5 i 3 kg/ha i dvokratno (pre- i postemergentno) 1.5+1.5

13

kg/ha i 3+3 kg/ha. Osim mrkve, sađena je i repa, obje biljke su kasnije analizirane kao model

akumulacije. Rezultati pokazuju koncentracije prometrina ispod 0.1 ppm u svim opisanim

slučajevima na obje lokacije. Dvije godine nakon aplikacije herbicida nisu nađeni tragovi

rezidua (Fiveland 1977).

U istraživanju koje je za cilj imalo utvrditi koncentracije prometrina akumulirane u

medicinskim biljkama uzgojenim pod tretmanom s 0.8-1 kg/ha prometrina, pokazalo se da

kamilica (Matricaria chamomillla), menta (Mentha piperita) i timijan (Thymus vulgaris) sadrže

koncentracije manje od 0.02 ppm. Autori zaključuju da prometrin ne predstavlja opasnost pri

uporabi za uzgoj ljekovitog bilja (Reifenstein i sur. 1975).

Opaženo je da biljke tretirane prometrinom imaju donekle izmjenjenu koncentraciju mikro i

oligo elemenata. Biljke uzgojene u tlu tretiranom s 1 kg/ha prometrina pokazuju ove promjene:

mrkva sadrži 11-22% više željeza (Fe), a uzgojena u tlu s 2 kg/ha prometrina sadrži 22 % nižu

koncentraciju željeza, dok je aluminij (Al) povećan za 38% . Paprika (zelena) je sadržavala

44% više željeza i statistički značajno višu koncentraciju molibdena (Mo) i bakra (Cu).

Spomenute koncentracije opadaju proporcionalno s porastom aplicirane doze (1.5 i 2 kg/ha)

u odnosu na kontrolu. Rajčica međutim, nakon tretmana prometrinom sadržavala za 59 %

manju količinu aluminija (Al), a s porastom doze (1.5, 2 kg/ha) opadala je i koncentracija (84

% manje u odnosu na kontrolu), ali se koncentracija željeza (Fe), nikla (Ni) i mangana (Mn)

nije bitno mijenjala bez obzira na dozu. Patliđan pri dozi 1 kg /ha nije promjenio koncentraciju

željeza (Fe), i mangana (Mn), ali je koncentreacija bakra (Cu) pala za 30 % pri dozi od 1 kg/ha,

a za 60 % pri dozi od 1.5 kg/ha od vrijednosti kontrolnih uzoraka (Baratov 1979).

Grožđe i merelica proizvedeni na tlu tretiranom s prometrinom u koncentracijama 7 i 9

kg/ha nisu sadržavali rezidue prometrina, ali su pokazali povećanu koncentraciju željeza (Fe),

nikla (Ni) i molibdena (Mo) ali ne i mangana (Mn) (Baratov i sur. 1981).

Osim doze, načina aplikacije i vremena karence i kulinarska priprema jestivog bilja igra

značajnu ulogu na putu herbicida do čovjeka.

Nasadi mrkve tretirani prometrinom (1 i 1.5 kg/ha) 77 dana prije ubiranja biljaka za ljudsku

prehranu sadržavale su koncentraciju (0.011-0.013 ppm) prometrina nižu od propisane.

Kulinarskom obradom (čišćenje, guljenje, pranje, rezanje, kuhanje) koncentraciju rezidua

prometrina reducira se za 75-100 % (Bognar 1977).

14

2.4. TOKSIČNI UČINCI PROMETRINA NA FIZIOLOŠKE SUSTAVE ŽIVOTINJA 2.4.1. UČINAK PROMETRINA U NIŽIH KRALJEŽNJAKA I

BESKRALJEŽNJAKA

U pokusu istraživača Jordana i sur. (1977) punoglavci vrste Rana temporaria u dva različita

razvojna stadija bili su izloženi djelovanju Mediazan 50 i Gesagard 50. Promjene uzrokovane

ovim tvarima nastale su na probavilu, mozgu i mišićima. Mediazan je uzrokovao djelomične

lezije crijevnog epitela i parenhima jetre. Gesagard 50 pokazao je jači toksični učinak,

uzrokujući jake degenerativne promjene u probavilu i mozgu. Uz navedene uočene su i

promjene poput inhibiranog rasta životinje i retardacije u procesu razvoja operkuluma. Mlađi

punoglavci bili su manje osjetljivi od starijih.

Učinak Gesagard 50 na regeneraciju stražnjeg mozga punoglavaca vrste Xenopus leavis,

ovisno o upotrebljenoj koncentraciji uzrokovao je inhibiciju (0.001 % koncentracija) i

poremećaje regeneracije (0.0005 % koncentracija). Najniža testirana koncentracija (0.0001 %

prometirna) imala je stimulirajući učinak na regenerativne procese (Maryanska-Nadachowska i

sur. 1980 (RECD. 1981)). U pokusu utjecaja S-triazinskih herbicida na oogenezu triju vrsta kukaca Pterostichus

cupreus, Pterostichus melanosarius i Agonium dorsale, red Coleoptera, porodica Carabidae,

Gesagard 50 (prometrin) pokazao manju kemosterilizirajuću sposobnost u odnosu na Gesatop

50 (simazin), te selektivno djelovanje 10 % koncentracije samo na vrstu Pterostichus

melanosarius u odnosu na druge dvije vrste.

Kod P. melanosarius uzrokovao je piknozu u jezgrama trofocita. Taj učinak odgovarao je

učinku 13 % otopine drugog ispitivanog pesticida Gesatop 50 (simazin) (Rozek 1978).

15

2.4.2. OPĆA I SISTEMSKA TOKSIČNOST PROMETRINA

Nakon kroničnog tretmana Wistar štakora prometrinom, dozama 2 i 190 ppm, smanjivala se

apsorpcija glukoze i osjetljivost na inzulin izoliranih dijafragmi štakora, ovisno o dozi pesticida

(Madar i sur. 1982).

Analizom krvi štakora tretiranih dozom od 50 mg/kg tijekom 6 mjeseci pokazalo se da životinje

pate od hiperglikemije i hiperkolesteremije. Također, životinje su imale reduciranu aktivnost

peroksidaze i ugljikove anhidraze (Martynyuk i sur. 1970). Autori Dinerman i Levrenteva

(1969) provode pokus određivanja LD 50 na štakorima. U pokusu koriste ruski i švicarski

preparat prometrina. Pokus je proveden na 37 životinja koje su dnevno primale suspenzije

prometrina gastričkom kanilom. Probit analizom, autori dolaze do podatka da je LD50 za

štakora 2100 mg/kg tjelesne težine za sovjetsku preparat prometrina i 750 mg/kg tjelesne težine

za švicarski preparat (Dinerman i sur. 1969).

Vrijednost LD 50 za štakora od 2150-3750 mg/kg iznose Heinisch i Reifenstein u radu

publiciranom nešto kasnije (Heinisch i sur. 1971). Prema Agrochemical Pesticide-Desk

Reference, CRC net Base, Chapman & Hall, LD 50 za glodavce je 3750 mg/kg (Kamrin i sur.

1999).

Studija postnatalnog učinka kombinacije simazina i prometrina na mladunce štakora u fazi

laktacije pokazala je negativne učinke na tjelesnu težinu, neuro-muskularne veze i tjelesni

razvoj, kao i na povećanu količinu opsonizanta C-reaktivnih proteina i povećan broj leukocita

(Messow i sur. 1990). Testiran na pilećim i štakorskim embrijima prometrin nije pokazao

značajne embriotoksikološke osobine u pogledu preživljavanja embrija (Dinerman i sur. 1970).

16

2.4.3. IMUNOHEMATOTOKSIČNOST PROMETIRNA Tretmanom Whistar štakora tijekom 60 dana s dvostrukom dnevnom dozom 2 ppm i 190

prometrina inducira involutivne promjene timusa koje se očituju smanjenjem timusa,

smanjenjem količine ukupnih proteina i lezije DNA u timocitima (Giurgea 1979).

U radu u kojem je praćena citogenetička analiza stanica koštane moždine štakora nakon

djelovanja herbicida S-triazinske skupine, herbicid je injektiran jednokratno u dozama 1/10,

1/30 i 1/50 LD50 Analizom nakon 24 sata otkrivene su strukturalne promjene na stanicama

(fragmentacija) i kromosomska agregacija u kasnoj anafazi i ranoj telofazi (analizirano 200

stanica po životinji). Također je određivan mitotički indeks (analizirano je 300 stanica po

životinji). 1/10 i 1/30 doze imale su inhibicijski i supresijski učinak na mitozu stanica u

koštanoj moždini, a broj kromosomskih lomova u odnosu na kontrolu se povećao (Kulakov

1970).

Štakori tretirani 6 mjeseci dnevnim dozama od 50 mg/kg imali su morfološke promjene u

strukturi krvnih stanica uz pojačanu sedimentaciju eritrocita (SE) i redukciju protrombinskog

indeksa. S dnevnom dozom od 5 mg/kg apliciranu tijekom 3 mjeseca primjećena je samo

leukocitoza i redukcija protrombinskog indeksa (Martynyuk i sur. 1970).

Gzhegotskii (1968) izvještava o učincima akutnog i kroničnog izlaganja prometrinu na

perifernu krv štakora. Akutno izlaganje rezultiralo je u smanjenjem broja leukocita i limfocita,

te porastom eozinofila, neutrofila i monocita. Brzina koagulacije je povećana (592 sekundi u

akutno otrovanih životinja naprama 866 sekundi u kontrolnoj skupini). Ove promjene bile su

još jače izražene 10 i 12 sati nakon izlaganja u životinja koje su preživjele akutnu dozu.

Životinje u pokusu kronične izloženosti 50 mg/kg imale su iste promjene. Nakon četri i šest

mjeseci razvila se hipokromna anemija.

17

2.4.4. UČINAK PROMETRINA NA ENDOKRINI I REPRODUKTIVNI SUSTAV ŽIVOTINJA

Nizom pokusa, brojni autori pokazali su da prometrin jako djeluje na endokrine funkcije

odnosno da djeluje kao endokrini ometač (prema engleskom pojmu: endocrine disruptor).

Istraživanja reproduktivne toksičnosti (faza I testova teratogenosti i reprodukcije) koja

uključuje analizu sposobnosti plodnosti i začeća nakon aplikacije toksikanta pokazala su da pri

dnevnoj aplikaciji doza 5 mg/kg tijekom tri mjeseca, spareni mužjaci i ženke štakora mogu dati

potomstvo. Međutim u istom radu autori opisuju i tretman dozom od 50 mg/kg tijekom 6

mjeseci nakon čega sparene životinje nisu dale potomstvo (Martynyuk i sur. 1970).

Muški albino štakori dnevno tretirani 20-kratno s dozom 1/20 LD 50 prometrina imali su

velike citološke alteracije u sjemenim kanalićima (tubuli seminiferi). Autori zaključuju da

prometrin ima jak gonadotoksični učinak. Također, dokazano je da utječe na morfologiju jezgre

spermija, na osobine primanja boja citoplazmatske RNA i afinitet pironina za citoplazmu

(Shtabskiy i sur. 1976).

Nadalje, u pokusu utjecaja S-triazinskih pesticida na metabolizam testosterona i stvaranje

kompleksa 5-alfa-dihidroksitestosterona i 5-alfa-dihidroksitestosteronskog receptora u prostati

štakora, Kniewald i sur. pokazuju antiandrogenski učinak prometrina. Pokazano je da u in vitro

sustavu prometrin kao i mješavina prometrina i atrazina imaju statistički značajan negativan

utjecaj na stvaranje kompleksa 5-alfa-dihidroksitestosteron-specifičnog receptora. Odnosno,

prometrin djeluje inhibirajuče na enzimske aktivnosti koje kataliziraju reakcije konverzije

prekursora u testosteron. Autori zaključuju da je inhibicija reverzibilna i nekompetitivna

(Kniewald i sur. 1995).

Isti autori dokazali su inhibirajuće djelovanje prometrina na osnovne enzimske sustave i

mogućnost vezanja androgena i njihovih receptora u hipofizama dvaju vrsta: štakora

(prometrin doziran in vivo) i teleta (hipofize tretirane in vitro) nakon izlaganja prometrinu. U

hipofizama ženske teladi utvrđeno je prevođenje testosterona u 5-alfa dihidroksitestosteron i 3-

alfa diol oblik što je isti mehanizam koji je utvrđen i kod mužjaka štakora u istom pokusu. U

muške teladi uglavnom je došlo do stvaranja androstendiona i androstandiona enzimima 17-

beta hidroksisteroid dehidrogenazom i 5-alfa reduktazom. Autori su jasno pokazali da

prometrin mijenja enzimske reakcije i utjeće na vezanje androgenih hormona na receptore u

18

hipofizi te napominju potrebu za jačom kontrolom ovih tvari u okolišu kako bi se izbjegli

nekontrolirani i nepoželjni učinci na sustav regulacije produkcije spolnih hormona (Kniewald i

sur. 1983).

U sličnom pokusu u kojem se istraživao učinak različitih pesticida (atrazin, lindan i prometrin)

na stvaranje kompleksa estradiola i estradiolnog receptora u uterusu ženki štakora in vivo i in

vitro. Dokazano je da pod utjecajem prometirna dolazi do smanjivanja broja slobodnih veznih

mjesta na receptoru iako se afinitet vezanja estradiola za estradiolni receptor nije mjenjao pod

utjecajem pesticida (Težak i sur. 1992).

Osim žlijezda spolnog sustava ispitivan je i učinak na štitnjaču (tiroideu) i stanice ljudske

štitnjače u staničnoj kulturi. Promatran je učinak prometrina na diobu stanica, sintezu proteina,

enzimsku aktivnost u stanicama i sintezu hormona štitnjače Dokazano je da koncentracije

prometrina od 0.001-1 mg/15 ml dozirana na stanične kulture stanica ljudske štitnjače,

stimuliraju sintezu trijodtironina (T3) i inhibiraju sintezu tiroksina (T4). U slično osmišljenom

pokusu ali na modelu in vivo, štakori tretirani akutno s 50 ppm prometrina dobiveni su slični

rezultati potaknutog lučenja T3 i inhibiranog lučenja T4. Isti autori izvještavaju da je također

smanjena i količina luteinizirajučeg hormona (LH) izlučenog u plazmu tako tretiranih životinja

(Ghinea i sur. 1980).

2.4.5. UČINAK PROMETRINA NA NUKLEINSKE KISELINE, MUTAGENOST I GENOTOKSIČNOST Postoje indicije da prometrin i/ili neki njegovi derivati mogu biti inkorporirani u molekulu

RNA i DNA. Pretpostavlja se da djeluje kao bazni analog. Rezultati istraživanja na Eschericha

coli iz 1966. godine demonstriraju da prometrin djelomično nadomješta uracil u RNA i timin u

DNA (Temperli-Turler i Ercegovich 1966).

Raznovrsne kemikalije u okolišu, uključujući pesticide koji su nosioci sekundarnih i

tercijarnih amino grupa, predstavljaju opasnost po zdravlje životinja i ljudi zbog mogućnosti

stvaranja potencijalno kancerogenih nitrozospojeva u prisutstvu nitrita i uz pH 1 (uvjeti koji su

slični uvjetima u želucu čovjeka ). Egert i Greim proveli su pokus u kojem su u vremenu od 4

sata izložili prometrin HCl-u i octenoj kiselini pri pH 1, na 37 ° C. Produkt reakcije bili su N-

19

nitrozo spojevi (14 % od ukupnog prometrina). Ovi produkti per se, bili su slabo ili nikako

mutageni na sojevima E. coli K12 i Salmonella typhimurium TA 1538. Međutim, mutagenost

produkata reakcije značajno se povećala nakon metabolične aktivacije mikrosomima mišje

jetre. Zaključak je autora da osim spojeva koji sadrže metil i etil supstituirane amino skupine i

spojevi s izo-propilamino grupama mogu stvarati potencijalno kancerogene nitrozo derivate.

Isti autori također zaključuju da tvari koje daju visoku koncentraciju nitrozo derivata

predstavljaju potencijalno opasanost jer u prisutnosti nitrita u ljudskom želucu mogu stvoriti

potencijalno kancerogene spojeve (Egert i sur. 1976).

Stevens i sur. izložili su soj-SD štakora tijekom cijelog životnog vijeka životinja utjecaju

prometrina dodajući ga u hrani i promatrali incidenciju nastanka mamilarnog tumora. Nakon

dvije godine, s dozama iznad maksimalne tolerabilne doze povećala se incidencija nastanka

tumora u odnosu na kontrolu (Stevens i sur. 1994).

Znanstvenici su razvili i neka molekularnobiološka oruđa za istraživanje prometrina, tako

postoje monoklonalna protutjela za prometrin. Skupina autora na Tehničkom Sveučilištu u

Münchenu 1990 godine proizveli su mišja monoklonalna protutjela za detekciju nekih S-

triazina, između ostalog i prometrina. Za detekciju enzimskim immunoassay-em. BALB/C

miševi imunizirani su derivatima herbicida (ametrin-sulfoksid i dikloratrazin) konjugiranim na

albumin iz goveđeg seruma (BSA).

Fuzijom stanica tako imunizirane slezene i mišjih mijeloma stanica PAI-B3AG8I stvorene su

hibridoma stanice. Nakon screening-a ELISA-om izolirana su četiri monoklonalna protutjela

na S-triazine i podvrgnuta daljnjoj karakterizaciji. Protutjela proizvedena protiv ametrin-

sulfoksida imala su jak afinitet prema prometrinu i terbutrinu. Detekcijski limit postignut je kod

vrijednosti od 0.3 mg/l (Giersch i sur. 1990).

2.4.6. METABOLIČNA RAZGRADNJA PROMETRINA U ORGANIZMU (PREDLOŽENI MODEL NA ŠTAKORU) Iako je toksikokinetika i biotrnsformacija kloro-S-triazina primjerice atrazina u štakora

poznata i detaljno opisana, vrlo je malo spoznaja o metaboličnim putevima prometrina i drugih

nekloriranih triazina u organizmu sisavaca. U publikaciji Maynarda i sur., predložen je model

detoksikacijskog mehanizma i metabolizma prometrina u štakora (Maynard i sur. 1999). Cilj

rada bio je utvrditi ukupnu razinu prometrina u tkivima, udio izlučen od aplicirane doze, kao i

20

identificirati glavne metabolite prometrina. Uspoređivani su utjecaj jakosti doze i spola na

metabolizam prometrina, kao i utjecaj predtretmana ponavljanih doza prometrina na

metaboličnu sudbinu spoja. Dodatno, je in vitro istraživana uključenost c-P-450

monoksigenaznog sustava i mikrosomalnih monoksigenaza koje sadržavaju flavin (FMO-

enzimski sustav) u detoksikacijskom putu te je uspoređivana s rezultatima dobivenim u

pokusima in vivo.

Studija je provedena na mužjacima i ženkama (5 u skupini). Radioaktivno obilježeni

prometrin apliciran je gastričkom kanilom u dozama od približno 0.5 i 500 mg/kg. Nakon 3 do

7 dana životinje su žrtvovane. Analiza prometrina i njegovih metabolita provedena je u urinu,

fecesu, krvi, mozgu, kosti (femur stražnje noge), masnom tkivu, ovarijima i testisima, srcu,

bubregu, jetri plućima, i slezeni. Analiza je provedena visokotlačnom kromatografijom (HPLC-

om), masenom spektrometrijom i tankoslojnom kromatografijom (TLC-om). Veći postotak

(90-98 %) aplicirane doze izlučeno je urinom (46.5-53.3 %) i fecesom (33.1-45.5 %) u roku 7

dana od aplikacije. Oko 0.4-0.6 % doze nađeno je u tkivima, a značajan dio (1.2-1.9 %) doze

detektiran je u krvi. Ostaci prometrina nakupljeni u tkivima prema količinama od najmanje do

najveće nakupljene koncentracije su: masno tkivo, mišić, bubreg, jetra.

Ovi tkivno akumulirani ostaci bili su proporcionalni apliciranim dozama. Rezultati

pokazuju da je razina prometrina bila značajno veća u tkivima ženki nego u tkivima mužjaka.

Identificirano je preko 30 metabolita (slika 3.). Prema toj studiji metabolični putevi uključuju

N-demetilaciju, S-oksidaciju, S-S dimerizaciju, OH supstituciju s NH2 i SCH3, kao i

konjugaciju s glutationom i glukuronskom kiselinom. Inkubacijom mikrosoma jetre u in vitro

modelu dobiveni su slični rezultati. Faza I metabolizma, kako in vivo tako i in vitro obuhvaćala

je uglavnom S-oksidaciju i N-dealkilaciju (Maynard i sur. 1999).

21

Slika 3: Predloženi putevi metabolične degradacije Prometrina u štakora, prilagođeno iz Maynard M.S., Brumback D., Itterly W., Capps T, Rose R. Metabolism of [(1)(4)C] prometryn in rats. Journal of Agricultural food and Chemistry, Vol. 47 (9), 3858-3865, 1999

22

2.4.7. ENZIMI KAO DIJAGNOSTIČKI BIOMARKERI OŠTEĆENJA POJEDINIH ORGANSKIH SUSTAVA

Kemijske se reakcije u biološkim sustavima malokad zbivaju bez katalizatora tj.

specifičnih proteina-enzima. Bitne osobine svih enzima su njihova katalitička moć i

specifičnost. Neki enzimi sudjeluju u pretvorbi raznih oblika energije.

Cjelokupni metabolizam moguć je upravo zbog djelovanja enzima. Enzimi smanjuju energiju

aktivacije i time ubrzavaju reakcije barem 107 puta. Većina reakcija u biološkim sustavima ne

odvija se bez enzima zamjetljivom brzinom.

Enzimi su visokospecifični i po reakciji koju kataliziraju i po izboru reaktanata odnosno

supstrata, pa tako obično katalizira samo jednu kemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija.

Specifičnost za supstrat je visoka, a katkad i potpuna.

Izoenzimi kataliziraju istu reakciju i međusobno su vrlo slični, ali imaju različitu primarnu

strukturu. Razlikuju se po svojstvima koja su važna za regulaciju aktivnosti, a u tome je

vjerojatno biološka funkcija tih multiplih oblika. Prema vrsti katalitičke reakcije razlikujemo

šest glavnih skupina enzima. Unutar glavnih skupina podjela se provodi prema kemijskim

vezama koje se cijepaju ili nastaju.

Glavne skupine enzima (Karlson 1988):

1. OKSIDOREDUKTAZE - enzimi biološke oksidacije i redukcije

2. TRANSFERAZE - enzimi koji prenose grupe

3. HIDROLAZE -enzimi koji kataliziraju hidrolitička cijepanja

4. LIAZE - kataliziraju reakcije eliminacije uz stvaranje dvostruke veze ili adicije na dvostruku vezu

5. IZOMERAZE - kataliziraju pregradnju unutar molekula

6. LIGAZE -stvaraju veze uz istovremeno cijepanje ATP

23

Neki su enzimi široko rasprostranjeni u raznim tkivima, a neki su specifični samo za neko tkivo

ili organ (tablica 2.). Prema rasprostranjenosti u organizmu, enzimi se mogu podijeliti u tri

skupine:

1. ORGANSKI NESPECIFIČNI ENZIMI

Većinom sudjeluju u energetskoj mijeni tvari. To su enzimi glikolize, oksidacije

glukoze i disanja, dakle enzimi koji sudjeluju u procesima u kojima se oslobađa energija.

Glikoliza se odvija na isti način u mišiću, srcu, bubregu i drugdje, što znači da su u svim tim

organima prisutni i enzimi potrebni za te procese, ali možda u različitim kvantitativnim

odnosima. Takvi su enzimi npr. laktat-dehidrogenaza, aldolaza i dr.

2. ORGANSKI SPECIFIČNI ENZIMI

Nalaze se samo u određenim organima i sudjeluju u metaboličnim procesima

koji se odvijaju samo u određenim organima. Npr. amilaza i lipaza.

3. ORGANSKI SPECIFIČNI IZOENZIMI

Mnogi enzimi se javljaju u više multimolekularnih oblika ili izoenzima. Pojedini

izoenzimi nekog enzima su specifični za određene organe. Tako je laktat-dehidrogenaza

prisutna u mnogim organima, ali su njeni izoenzimi specifični za neke organe. U miokardu

se laktat-dehidrogenaza nalazi u obliku svog izoenzima LDH1 i nešto LDH2, dok u jetri

dolazi kao izoenzim LDH5 i nešto LDH4.

Da bi se na osnovi promjene aktivnosti nekog enzima u serumu moglo zaključiti koji je organ

oštećen, treba znati koji su enzimi karakteristični za pojedini organ, odnosno tkivo (Štraus

1992).

24

Tablica 2: Organska specifičnost pojedinih enzima (Štraus 1992)

Organ Enzim Specifičnost

Gušterača Lipaza +++ Amilaza ++ Aspartat-aminotrasferaza (AST) +

Slinovnice Amilaza ++ Kosti Alkalna-fosfataza (AP) ++

Prostata Kisela fosfataza (KP) +++ Miokard LDH1 ++

Kreatin-kinaza (CK) ++ Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) +

Poprečnoprugasti mišići Kreatin-kinaza (CK) ++ Aldolaza (ALD) + Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aspartat-aminotrasferaza (AST) +

Jetra Kolinesteraza (AchE) +++ LDH5 ++ Aspartat-aminotrasferaza (AST) + Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aldolaza +

Žučni vodovi Alkalna-fosfataza (AlP) ++ Pepsinogen +++

Želudac LDH1 ++ Eritrociti Kisela fosfataza (KP) ++

Laktat-dehidrogenaza (ukupna) (LDHp) + Aspartat-aminotrasferaza (AST) +

2.4.7.1. Laktat-dehidrogenaza (LDH, EC. 1.1.1.2.7.)

U kralježnjaka laktat-dehidrogenaza naziv je koji objedinjava skupinu tetramernih

citopalzmatskih izoenzima od otprilike 140 kD. LDH pripada u skupinu oksidoreduktaznih

enzima (EC klasifikacija). LDH katalizira reverzibilnu oksidaciju laktata u piruvat i obrnuto

redukcije piruvata u laktat. U toj reverzibilnoj reakciji ravnoteža je pomaknuta u smjeru

stvaranja laktat→piruvat. Reakcija teče optimalno pri pH 8.8 – 9.8 dok se reakcija u smjeru

piruvat→ laktat odvija optimalno kod pH 7.2 – 7.8

25

Ova grupa izoenzima prisutna je i u eukariota i prokariota u čijim stanicama sudjeluje u

reakcijama glikolize tj. u anaerobnoj razgradnji glukoze. U tim reakcijama molekule glukoze

nastale razgradnjom ugljikohidrata, glukoneogenezom ili glikogenolizom, razgrađuju se do

dvaju molekula pirogrožđane kiseline. U aerobnim uvjetima piruvat će se transportirati u

mitohondrij gdje će biti oksidacijski dekarboksiliran do acetil-CoA, zajedničkog

intermedijera razgradnje aminoksielina, glukoze i masnih kiselina.

Acetil-CoA je supstrat za ciklus limunske kiseline iz kojeg se stvaraju prekursori

biosinteze biomolekula a također služi da bi se reducirali u NADH i FADH2 koji u

oksidativnoj fosforilaciji oslobađaju energiju za resintezu ATP. Međutim jedini proces koji

u anaerobnim uvjetima može dati energiju je glikoliza. Proces glikolize može se odvijati

samo uz dovoljne količine NAD+. Stoga se redukcijom nastali NADH mora neprestano

reoksidirati u NAD+ (slika 4.).

Slika 4.: Prikaz molekularne strukture ljudske laktat-dehidrogenaze, podjedinice M iz poprečnoprugastog mišića Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka Preuzeto iz: Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L.: Structural Basis for Altered Activity of M- and H-Isozyme Forms of Human Lactate Dehydrogenase. Proteins 43 pp. 175 (2001) Naime, kada se stanica nađe u uvjetima

nedovoljne opskrbljenosti kisikom (npr. pri

jakoj mišićnoj aktivnosti), piruvat se reducira u L - laktat uz katalizu LDH, prilikom ćega se

NADH oksidira u NAD+. Ovo je put kojim se regenerira NAD+ potreban za glikolizu kada

stanice ne dobivaju dovoljno kisika. Anaerobnom glikolizom u mišićima nastali L - laktat

krvlju dospjeva u jetru. Laktat nastao pri kontrakciji mišića pretvara se u jetri u glukozu,

koja se ponovno može vratiti u mišić i pohraniti u obliku glikogena.

26

Slika 5.: Prikaz molekularne strukture ljudske laktat-dehidrogenaze, podjedinice H iz srčanog mišića Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka, sinonim: LDH-B Preuzeto iz: Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L.: Structural Basis for Altered Activity of M- and H-Isozyme Forms of Human Lactate Dehydrogenase. Proteins 43 pp. 175 (2001)

U većini tkiva u organizmu tetramer LDH, odnosno njegove izoenzimske oblike, čine

dvije različite podjedinice koje se prema razini ekspresije u pojedinim organima označavaju

sa M (od engl. muscle) i H (od engl. heart) (slika 5.).

M i H podjedinice razlikuju se međusobno u naboju. Kod sisavaca podjedinica M je znatno

negativnija od podjedinice H, dok je kod većine ptica, gmazova i vodozemaca razlika u

naboju manja. Kod određenih vrsta riba H podjedinica je negativnija od M. Dijelovanjem 12

M otopinom ureje ili 5 M otopinom guanidina tetramer se može razgraditi na monomere. Da

se podjedinice, monomeri, spontano vežu međusobno stvarajući izoenzime LDH, pokazao je

već davno Nieland 1952. godine (Štraus 1992). Ovisno o sastavu podjedinica, biokemijskim

osobinama, elektroforetskoj pokretljivosti i rasporedu u stanicama različitih organa, u

čovjeka razlikujemo pet izoenzima:

LDH1 (H4) LDH2 (MH3) LDH3 (M2H2) LDH4 (M3H) LDH5 (M4)

Karakterističan je odnos frakcija koje se pojavljuju u svim tkivima čovjeka. LDH1 i LDH2

izoenzimi (ili α - HBDH izoenzimi) su najzastupljeniji oblici u srcu, a LDH3, LDH4 i LDH5 (ili

LDH - P izoenzimi) u poprečnoprugastim mišićima i jetri.

Različiti izoenzimi LDH pokazuju i različite enzimske osobine. LDH1 (H4) izoenzim ima

malu KM odnosno veliki afinitet za piruvat i inhibira ga visoka koncentracija ovog metabolita,

27

stoga on ima funkciju laktat-oksidaze. LDH5 (M4) izoenzim ima suprotna svojstva tj. veliki

KM odnosno niski afinitet za piruvat koji ga ne inhibira, stoga je on laktat-reduktaza. (Boyer i

sur 1963, Blake i sur. 1968, Schmidt 1968, Schatz 1969, Wuntch i sur. 1969, Kruse - Jarres

1979, Franković 1990, Strayer 1991, Kopperschlager i Kirchberger 1996, Kaneko 1997,

Schmidt 2000, Hakenberger - Kutuzović 2001)

LDH izoenzimski sustav jedan je od najčešće istraživanih modela za porjeko i evoluciju

izoenzima i multigenomski reguliranih enzimskih sustava. Podjedinice kodiraju geni ldha (za

podjedinicu M stoga je neki autori nazivaju LDH - A), ldhb za podjedinicu H koju neki atori

nazivaju LDH - B. U kralježnjaka LDH - A je najupotrebljavaniji za redukciju piruvata u

anaerobnim tkivima primjerice mišiću, a LDH - B za oksidaciju laktata u aerobnim tkivima

primjerice srčanom (Bengtsson i Karlsson 1980, Shoei - Lung Li 1998). U sisavaca i

kolumbidnih ptica postoje i geni tzv. ldhc koji se eksprimiraju u germinalnom epitelu testisa

tijekom spermatogeneze stvarajući treći oblik tetramera izoenzim LDH - C4 (slika 6.)

specifičan samo za testise, koji se po svojim karakteristikama razlikuje od ostalih izoenzima

LDH i prilagođen je jedinstvenim metaboličnim potrebama pripadajućeg tkiva (Li i sur. 1998).

Tetramer LDH - C4 poznat je i pod starijim nazivom LDH - X testikularnog tkiva. U štakora je

njegova molekularna masa 125 ± 4 kD (Schatz i Segal 1969).

Slika 6.: Prikaz molekularne strukture mišje laktat-dehidrogenaze, izoenzimskog tetramera C4 iz testisa Ec: 1.1.1.2.7. dobiven difrakcijom x zraka, sinonim: LDH-B Preuzeto iz: Hogrefe, H. H., Griffith, J. P., Rossmann, M. G., Goldberg, E.: Characterization of the antigenic sites on the refined 3-A resolution structure of mouse testicular lactate dehydrogenase C4 J Biol Chem 262 pp. 13155 (1987)

U vodozemaca i gmazova dokazana je ekspresija samo LDH - A i LDH - B (Shoei - Lung Li

1998). Posebice je zanimljivo da je u očnoj leći nekih ptica i krokodila LDH - B strukturalni

28

protein poznat i pod nazivom epsilon - kristalin (PROSITE 1988). U naprednijih koštunjača

LDH-C eksprimira se jedino u oku dok se kod primitivnijih teleosta, ukoliko posjeduju gen,

LDH-C eksprimira ubikvitarno. Evolutivno gledano geni za LDH-C u ptica, vodozemaca

(Xenopus) i nekih riba nastaju duplikacijom iz gena za polipeptid LDH - B (srčani izoenzim) a

u sisavaca iz gena za polipeptid LDH-A (mišićni izoenzimi). U čovjeka geni za LDH - A i

LDH-C nalaze se na kraćem kraju 11-tog kromosoma, a u miša na 7 kromosomu što nadalje

potvrđuje filogenetsku vezu dvaju gena u sisavaca (Shoei - Lung Li 1998). U obje vrste, kao i u

štakora podjedinica A sačinjena je od 332 aminokiseline (Olsson 2003). Geni LDH - A, B i C u

sisavaca isprekidani su sa 6 introna u kralježnjaka, a postojanje samo dva introna u

beskralježnjaka pokazano je po prvi puta na jednoj vrsti nematoda (Shoei - Lung Li 1998).

Usporedbom sekvenci gena za LDH u različitih vrsta sugerira se visoka sličnost i očuvanost

strukture gena za LDH, primjerice usporedbom sekvence za LDH - A laboratorijskog miša Mus

musculus i čovjeka sličnost je 93.98 %, laboratorijskog štakora 96.69 %, Drosophile

melanogaster 61.45 %, C. elegans 58.84 % E. coli 24.60 % slijeda baza.

Budući da se LDH nalazi u citoplazmi, dovoljno je da se promijeni propusnost stanične

membrane pa da enzim iz citoplazme prijeđe u cirkulaciju i da se aktivnost u serumu povisi.

Zbog toga mu se aktivnost u serumu poveća već i kod lakših oštećenja tkiva u kojima se nalazi.

Stoga LDH izoenzimi imaju veliku važnost kako u dijagnostici veterinarske i humane kliničke

analitike, fundamentalnom znanstveno istraživačkom radu na poljima filogenije, ekologije i

evolucije (Çolak i sur. 2002), ali i temeljne fiziologije (npr. fiziologija stresa), toksikologije,

ekotoksikologije, biokemijske filogenije i dr.

Normalne serumske vrijednosti LDH ovise o dobi, vrsti organizma i fiziološkom stanju

(Matsuzawa i sur. 1993), primjerice za čovjeka:

Kruse - Jarres (1979): odrasle jedinke 120 - 140 U/L , novorođenčad 300 - 700 U/L

Jaeger i Hedegaard (2002):

Odrasli bez navedenog spola, optimum 125 U/L, Štraus (1992):

Odrasli bez navedenog spola 150 - 310 U/L na 30°C.

29

Za laboratorijskog miša vrijednosti vrlo varijabilne ovisno o soju miša.

Kaneko (1997): bez specificiranja soja, spola ili uzrasta 366 U/L,

Santos (2005): 25 - 35 g teške mužjake miševa soja Swiss 370.4 ± 77.4 U/L

Mady (2002): 22 - 25 g teške ženke soja Swiss 1714 ± 27.86 U/L

Za štakora prosjek aktivnosti LDH u serumu navode:

Kaneko (1997): 464 ± 22 U/L,

Anbarust (2005): mužjaci Wistar štakora, 100 - 120 g, 104.71 ± 7 U/L,

Franković (1990): 55.51 – 158.67 U/L (srednja vrijednost 100.33 ± 34.09 U/L).

Za ostale životinjske vrste nalazimo prema navodima autora naredne aktivnosti LDH u serumu.

Kaneko (1992):

1. Konj 162 - 412 U/L (252 ± 63 U/L) 2. Govedo 692 - 1445 U/L (1061 ± 222 U/L) 3. Ovca 238 - 440 U/L (352 ± 59 U/L) 4. Koza 123 - 392 U/L (281 ± 71 U/L) Svinja 380 - 634 U/L

(499 ± 75 U/L) 5. Pas 45 - 233 U/L (93 ± 50 U/L) 6. Mačka 63 - 273 U/L (137 ± 59 U/L)

Radman i Harapin (1998):

1. Konj do 400 U/L. 2. Govedo do 1500 U/L 3. Ovca do 530 U/L Svinja do 600 U/L 4. Pas do 100 U/L 5. Mačka do 7 U/L

30

Prema pojedinim organima aktivnost LDH također je različita. Za čovjeka primjerice aktivnost

LDH u pojedinim organima odnosno u njihovim homogenatima Štraus (1992) navodi:

1. poprečnoprugasti mišić 147 U/g, 2. jetra 145 U/g, 3. srce 124 U/g, 4. bubreg 106 U/g, 5. limfni čvorovi 83 U/g, 6. gušteraća 50 U/g, 7. eritrociti 36 U/g, 8. pluća 27 U/g.

Za mužjake Wistar štakora 100 - 120 grama Anbarust (2005) navodi aktivnost LDH u

pojedinim organima odnosno u njihovim homogenatima:

1. pluća 19.5 ± 1.17 U/mg proteina, 2. srce 18.42 ± 1.12 U/mg proteina 3. jetra 13.80 ± 2.10 U/mg proteina, 5. bubreg 9.75 ± 0.28 U/mg proteina, 6. mozak 8.20 ± 1.09 U/mg proteina

Slično, u tekstu Clinical chemistry (http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/2005.) iznešene su slijedeće vrijednosti LDH prema aktivnosti u organima štakora:

1. poprečnoprugasti mišić 453 U/g

2. srce 360 U/g

3. jetra 212 U/g

4. probavilo 185 U/g

5. bubreg 167 U/g

6. serum 109.5 ± 9.1 U/L

Značaj mjerenja aktivnosti LDH u toksikološkim i kliničkim istraživanjima je velik

pogotovu mjerenje aktivnosti u serumu i organima ili elektroforetska karakterizacija pojedinih

frakcija izoenzima. Najbitnije je napomenuti da se prilikom promatranja povećanja ili

smanjenja LDH u serumu, a u svrhu dijagnosticiranja bolesti ili tumačenja patološko -

toksikoloških ili farmakoloških učinaka noksi, uz LDH treba uspoređivati kretanje i drugih

kliničko fiziološko - biokemijskih (napose enzimskih) parametra.

31

Za svaki organski sustav za koji se postavlja ovakav tip dijagnostike setovi varijabli koji se

uspoređuju uglavnom su dugogodišnjim istraživanjima već standardizirani, stoga u slijedećem

pregledu literature napomenut će se i kretanje ostalih parametara karakterističnih za oštećenje

pojedinog organskog sustava. LDH je raširen u većini tkiva po cijelom organizmu. Iako među

tkivima zamjetne razine u ekspresiji enzima postoje, on najčešće indicira sistemsku toksičnost

ali i oštećenja onih organa koji ga sadrže najviše. Primjerice, izraženija promjena aktivnosti

LDH u serumu uočena je kod bolesti i oštećenja skeletne muskulature, srca (uglavnom infarkt i

perikarditis), jetre, pluća a u manjoj mjeri kod kancerogenih oboljenja i oboljenja gušteraće.

Mnogi autori spore informativnost LDH enzima u patološkoj dijagnostici upravo zbog njegove

ubikvitarnosti, a drugi pak iznose brojne dokaze o njegovoj dobroj dijagnostičkoj vrijednosti.

Dio tih korelacija razine LDH s toksičnim ili patofiziološkim noksama iznosimo u daljnjem

tekstu.

LDH i poprečnoprugasti mišić. Miozitis i polimiozitis, amputacije, pasaža parazita,

distrofije, miotoksične miopatije tipična su stanja kod kojih se aktivnost LDH mijenja (raste ili

opada), dok se primjerice kod miastenia gravis izmjerene vrijednosti ne mijenjaju osim ako se

istovremeno oštećuje jetra ili drugi organi koji sadrže puno LDH. Također uočeno je da

pojačana fizička aktivnost i učestalo vježbanje u čovjeka i svinja znatno povećava aktivnost

LDH u poprečnoprugastim mišićima, dok isti parametri kod konja umanjuju aktivnost LDH u

serumu, obrazloženje nije poznato. Mehanizmi koji uzrokuju miotoksičnost poprečnoprugastih

mišića uključuju promjene u staničnoj membrani mišića i promjene u energetskom i

metaboličnom statusu povezanom s mitohondrijima (Evans 1996, Capsoni 2000, Larsson i

Oldfors 2001).

Već blaža promjena propusnosti stanične membrane uzrokuje izlazak sadržaja iz sarkoplazme u

krv, što se mjerenjem aktivnosti očitava kao povećanje aktivnosti LDH u serumu. Kako

oštećenjem membrane ona biva sve jače propusna, proporcionalno raste i vrijednost aktivnosti

serumske LDH, a ukoliko dijelovanje noksa na poprečnoprugasti mišić traje kronično može se

zabilježiti i opadanje aktivnosti LDH, ovakva dinamika vrijedi i za ostale organe i enzime

(Bacci i sur. 1999).

Uz spomenute promjene aktivnosti serumske LDH za točnije dijagnosticiranje oštećenja

poprečnoprugastih mišića uz izravne enzimsko-histokemijske metode bojanja LDH na uzorku

poprečnoprugastog mišićnog tkiva, koje su ograničene semi-kvantitativnošću, moguće je pratiti

32

promjene aktivnost enzima aspartat aminotransferaze (AST), kreatin-kinazae (CK), aldolaze,

troponina (njihovo standardiziranje tek je u istraživačkoj fazi) ili kreatina i mioglobina. Iako se

promjene ovih enzima prate i kod oštećenja srčanog mišića uslijed infarkta miokarda, a metoda

razlikovnog testa je mjerenje promjena pojedinih izoenzima ili njihovo elektroforetsko

razlučivanje (CK - MP i LDH1 i LDH2 (tj. α - HBDH) najbolji su izoenzimski pokazatelji za

dijagnosticiranje miopatija skeletnog mišića). Kod infarkta miokarda, promjena aktivnosti teče

na slijedeći prepoznatljiv način. Prvo najviše poraste aktivnost CK, oko 20 - 40 puta, zatim

AST do 10 puta, sve unutar prvih 24 sata. LDH u serumu počinje rasti 8 - 10 sati nakon infarkta

miokarda, unutar 48 - 72 sata doseže povećanje 5 - 6 puta a normaliziranje vrijednosti uočava

se tek 8 - 14 dana nakon infarkta miokarda. U većine ostalih miokardijalnih oboljenja

aktivnosti enzima u serumu su normalne. Jedino kod perikarditisa mogu biti umjereno

povišene, a postoje i indicije da hipoksično - anoksična stanja nastala uslijed nekih toksikanata,

primjerice etanola mogu povistiti serumski LDH, CK i mioglobin, porijeklom iz srca, ili

promjeniti izoenzimsku elektroforetsku pokretljivost LDH mozga pri izoelektričnom

fokusiranju. Budući da su promjene spomenutih enzima na opisani način uglavnom uočene kod

infarkta miokarda, a u drugih se miokardijalnih miopatija vrlo rijetko mjenja enzimska slika

LDH i spomenutih enzima, njihova promjena najčešće se pripisuje uglavnom oštećenjima

poprečnoprugastih mišića (Schmidt 1968, Schatz 1969, Wuntch i sur. 1969, Kruse - Jarres

1979, Moses i Henderson 1987, Franković 1990, Štraus 1992, Evans 1996, Kaneko 1997,

Guppy i Littleton 1999, Schmidt 2000, Capsoni 2000, Larsson i Oldfors 2001, Rajab i sur.

2004, Park i sur. 2004, Vianna i sur. 2004).

Toksikološki gledano, brojni su primjeri miotoksičnog djelovanja različitih polutanata,

pesticida ili lijekova koji mijenjaju aktivnost LDH u serumu. U štakora klorpromazin apliciran

intramuskularno, ali ne i intraperitonealno podiže razinu aktivnosti enzima tipičnih za mišićje.

U pokusu provedenom na zečevima simvastatin, sredstvo za snižavanje lipida, izaziva lezije

poprečnoprugastog mišićja. Jedno drugo hipolipidemično sredstvo, 3-hidroksi-3-metil-glutaril-

koenzim A (HMGCoA) uzrokuje iste promjene u pokusu provedenom na marmozetu. Injekcije

diazepama, benzoktamina i petidina u pokusu provedenom na psima te diazepama, lidokaina i

digoksina u pokusu na zečevima uzrokuju nekroze mišića i povećanje razine enzima u serumu

(poglavito CK). Slična miotoksična svojstva sa relativno kratkotrajnim učinkom na povećanje

33

aktivnosti serumskih LDH i CK pokazali su u pokusima na štakorima i majmunima ketamin i

tetraciklin (Evans 1996).

U studiji utjecaja kadmija i terapije antioksidantom difenilselenidom (toksikološki

antagonist mnogih teških metala poput arsena i dr.) Santos i sur. (2005) pokazuju da zbog

lipidne peroksidacije koja je uslijedila nakon aplikacije kadmija subkronično, aktivnost LDH u

serumu naraste i do 1.99 puta više od normale. Hirano (1996) u studiji utjecaja inhalatorne

toksičnosti različitih teških metala bilježi znatno povišenje aktivnosti LDH u

branhioalveolarnoj tekućini i zaključuje da je linearna korelacija porasta aktivnosti ovog

enzima i polimorfonuklearnih leukocita s dozama teških metala pokazatelj da je aktivnost LDH

najbolji indeks za vrednovanje potencijala izazivanja pulmonarne upale uzrokovane

inhalacijom aerosola koji sadrže teške metale. U raspravi rezultata autor predlaže da takvo

mjerenje postane obavezni standard pri svim inhalatornim studijama toksičnosti.

U pogledu inhalatorne toksičnosti, postoje dokazi da i duhanski dim povećava razinu LDH u

serumu (Anbarasi i sur. 2005). Anbarasi i autori pokazuju utjecaj duhanskog dima cigareta na

LDH i izoenzimski elektroforetski uzorak. Nedvojbeno razina aktivnosti ukupne LDH u

štakora je povećana u svim analiziranim organima (mozak, pluća, srce, jetra, bubreg, serum) i

izoenzimskim frakcijama. Nije uvjek slučaj da toksikanti povećavaju razinu serumske LDH

aktivnosti, neki drugi otrovi koji imaju drugačije puteve farmakokinetike, distirbucije i

akumulacije, te ciljno pogađaju organe koji sadrže manje količine LDH ne uzrokuju takve

promjene. Primjerice Boscolo i sur. (1982) u kroničnoj studiji toksičnosti arsena prisutnog u

vodi za piće u koncentraciji od 50 μg/ml tijekom 320 dana, na štakorima ne bilježe znatnije

povećanje aktivnosti LDH u serumu. Autori uočavaju manje patološke promjene na

hepatocitima, ali velika patološka oštećenja na bubregu (Boscolo i sur. 1982). Bubreg sadrži

manje LDH nego jetra, poprečnoprugasti i srčani mišić, a u samom bubregu postoje razlike u

količini LDH, pri čemu distalni kanalići imaju više LDH nego proksimalni kanalići (Stonard

1997).

Izraženiji porast aktivnosti LDH u serumu uočen je kod šoka i trauma, što je posljedica

djelovanja stresa na srčani mišić, ali i djelovanja neurohormona koji se luče tijekom stresa na

poprečnoprugasti mišić. Sanchez i sur. (2002) u studiji utjecaja akutnog stresa na oštećenja

tkiva istražuju dijelovanje socijalnog i emotivnog stresa na miševima, a kao pokazatelje

oštećenja tkiva uspoređuju razinu serumske aktivnosti LDH, AST, CK, ALT, De Ritisov omjer,

34

α- HBDH, CK-MB enzima, razinu EGF i glikogena. Pri obje vrste ispitivanog stresa životinje

su pokazale razinu aktivnosti serumske LDH značajno višu od kontrolnih životinja i normalnih

referentnih vrjednosti. Rezultati pokazuju da osim srca i drugi organi doprinose povećanju

razine LDH i kod emotivnog i kod socijalnog stresa. Autori se napose osvrću i na

poprečnoprugasti mišić. LDH spada među enzime koji se standardno u medicinsko

biokemijskoj dijagnostici uspoređuju kako bi se otkrilo oštećenje jetre, iako najveći dio

dijagnostike u pogledu jetre odnosi se na aktivnosti AST i ALT te De Ritiusovog omjera.

Kolokvijalno, LDH AST, ALT (najčešće mjereni), SDH, GDH, ICDH, MDH¸ 5´nukleotidaza

(rjeđe korišteni) nazivaju se još i «jetrene probe», naime kod primjene većine ljekova, ali i pri

toksikološkim studijama u većine otrova, a zbog biotransformacijske i filtracijske uloge jetre,

dolazi do oštećenja hepatocita i/ili žučovodnog epitela. Ciroza, toksični hepatitis, virusni

hepatitis, naročito nekroza ali i apoptoza hepatocita koji slijede nakon nabrojanih stanja te kod

postojanja metastaza, osobito onih u jetri nalaze se visoke aktivnosti LDH. (Evans 1996,

Kaneko 1997, Radman i Harapin 1998, Štraus 1992). Franković primjerice (1990) dokazuje

porast aktivnosti LDH u plazmi nakon djelovanja 2,4-D na organizam štakora pri čemu se kao

glavni uzrok ovog porasta pokazao milijarni hepatitis u otrovanih životinja.

Kod oboljenja gušteraće, iako je najbolji pokazatelj patoloških promjena α - amilaza,

povećanje aktivnosti LDH u serumu daje sliku o tijeku bolesti a pogotovo usporedbom

promjena omjera aktivnosti LDH:AST govori o nekrotičnim promjenama u gušteraći (Isogai i

sur. 1998). Isogai objašnjava ulogu LDH kao osjetljivog indikatora nekroze gušteraće u razvoju

bilijarnog pankreatitisa. Autor napominje da je aktivnost tzv. jetrenih enzima u pacijenata koji

boluju od bilijarnog pankreatitisa u ranoj fazi bolesti povišena. Kao razlog navodi se akutna

upala jetrenog tkiva u najranijem tijeku bolesti. Nadalje autor govori da se pri kroničnom tijeku

bolesti, a ukoliko se u bolesnika pojavljuje nekroza gušteraće, aktivnost LDH održava na vrlo

viskoj razini. Kao potvrdu nekrotičnim promjenama autor napominje da omjer LDH:AST,

promatran tijekom tri tjedna, u pacijenata sa nekrozom gušteraće viši nego u onih koji nisu

imali taj simptom. Potvrdu postojanja nekrotičnih promjena gušteraće autor je dobio CT

skenerom abdomena pacijenata s bilijarnim pankratitisom. Isogai zaključno ističe ovaj indeks

omjera vrlo vrijednim (poput De Ritiusovog omjera za jetru) i naglašava njegovu dijagnostički

informativnu vrijednost te ga preporuča kao standardnog za spomenute bolesti gušteraće, uz

ostale pokazatelje pankrasnih oštećenja pr. α-amilaze, glukoze, inzulina.

35

2.4.7.2. Gama-glutamil-transferaza, γ-GT, GGT (EC. 2.3.2.2.)

γ-glutamil-transferaza dimerni je glikozilirani enzim (glikoprotein) lociran na vanjskoj strani

membrane epitelnih stanica, veličine 80 - 90 kD prema Štraus (1992) ili 90 - 350 kD prema

Kaneko (1997). Prema EC klasifikaciji svrstava se u skupinu hidrolaza, peptidaza (točnije

karboksipeptidaza). Peptidaze kataliziraju hidrolitičko cijepanje peptida do manjih peptida ili

aminokiselina.

γ-GT reverzibilno katalizira prijenos γ- glutamilne skupine s γ-glutamil-peptida na druge

polipeptide u L-aminokiselina, uz prisutstvo ATP. Prvotno je γ-GT nazvana transpeptidaza, ali

je termin kasnije promijenjen u prikladniji, transferaza. Fiziološka uloga povezana je sa

metabolizmom glutationa (ciklus sinteze glutationa, γ-glutamilski ili Meisterov ciklus) i

stvaranjem merkapturnih kiselina u krajnjim stupnjevima detoksikacije i biotransformacije

reakcija faze II u bubregu (Kaneko 1997, Štraus 1992, Evans 1996). U daljnjem pregledu

literature biti će iznešene neke novije spoznaje o mogućim drugim različitim ulogama ovog

enzima.

γ-GT koji se koristi kao biomarker u toksikologiji tj. kao kliničko - dijagnostički marker,

dimer je sastavljen od dva glikolizirana monomera koji potječu od jednog polipeptida

(propeptid). Taj polipeptid je kodiran jednim genom sa višestrukim promotorskim mjestima i

vrlo kompliciranim procesom transkripcije, translacije te kasnijim proteolitičkom

transformacijom (splicing) u dva različita monomera. Monomeri se spajaju stvarajući

heterodimer koji se usidri na vanjskoj strani membrane stanica koje sadrže γ-GT. Manjim

dijelom (oko 10%), γ-GT može postojati u jetri, kao slobodna, topiva forma. Vezani γ - GT

prelazi u slobodni γ - GT enzimskim procesom, vjerojatno dijelovanjem proteaza ili

deterdžentskim djelovanjem žućnih kiselina.

U publikaciji Joyce - Brady i sur. (2000) demonstriralo se postojanje γ - GT enzima i na

membrani endoplazmatskog retikuluma, ali se nakon posttranskripcijske i translacijske obrade

ne događa spajanje monomera u heterodimer već su samo monomerne jedinice uklopljene u

strukturu membrane. Kao takve one su aktivne ali je primjetno da izostaje njihova transferazna

aktivnost. Označava se nazivom γ - GTΔ7, a veličine je 44 kD. Prisutnost monomera na

membrani uočena je u tkivima koja imaju visoku razinu ekspresije γ - GT, primjerice bubreg,

36

stoga autori zaključno navode vjerojatno postojanje novih funkcija vezanih uz endoplazmatski

retikulum, za razliku od same transaminacije koju vrši heterodimerni ektoenzim stanične

membrane. Predlažu da monomer služi kao receptorna signalna jedinica koja signalizira manjak

ekspresije γ - GT, i aktivira ER da proizvede dodatne transpeptidazne dimere.

Razni multipli oblici enzima razlikuju se u glikozidnom dijelu molekule. Glikozidni dio

sadrži šećere heksoze, heksamine i sijalinsku kiselinu. Prema tome «izoenzimi» γ - GT nisu

pravi izoenzimi nego multipli oblici (izoforme) nastali posttranslacijskim modifikacijama

(Joyce - Brady i sur. 2000, Kaneko 1997, Štraus 1992, Evans 1996). Chikhi i sur. (1999) u

studiji organizacije i ekspresije gena za γ - GT u štakora, miša, svinje i čovjeka utvrđuju visoku

konzerviranost genoma tijekom evolucije a stoga i visoku sličnost γ-GT među spomenutim

vrstama, što potvrđuju i autori prethodno citirane publikacije Joyce-Brady i sur. (2000).

Nadalje, Chikhi i sur. (1999) u svojoj studiji zaključuju da se indukcija transkripcije gena za γ -

GT odvija s nekoliko promotorskih mjesta unutar jednog gena, upravo takva kompleksna

organizacija transkripcije omogućuje njenu indukciju nakon različitih vrsta oksidativnog

podražaja ksenobiotika koji ovisno o afinitetu za pojedino promotorsko mjesto pokreću

transkripciju s pripadajučih promotorskih mjesta. Zaključno, autori tumače da je upravo taj