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Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Biodiversità microbica e biotecnologie alimentari
Bari 11 Marzo 2011
Marco Gobbetti
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Albero della vita e biodiversità microbica
Biodiversità microbica: un mondo ancora da scoprire
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Diversità fisiologica e biochimica
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Sorgenti termali contengono batteri termofili
(Thermus aquaticus)
Rocce arenarie dell’Antartide contengono
funghi (verde scuro) e alghe (verdastro)
Carotaggio di ghiacciomarino dell’Antartidecontenete alghe ebatteri
Biodiversità microbica: ambienti estremi
Biodiversità microbica negli alimenti e nel tratto gastrointestinale
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
“Lievito naturale”
Complesso ecosistema biologico- Più di 50 specie di LAB (appartenenti al genere Lactobacillus)
- Più di 20 specie di lieviti (appartenenti ai generi Saccharomyces, Candida)
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Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Mappa microbiologica di 25 lieviti naturali Pugliesi
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
La specie è l’ultimo livello tassonomico, è giusto da un punto di vista applicativo?
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Quoziente di fermentazione
FQ
0
LS12
LS42
LS43LS40LS13
LS8LS24LS44
LS1
LS27LS3LS23LS33LS
35LS
45LS38 LS
7LS47LS
14LS39LS11LS25LS
41LS
36LS32LS26LS3020
4 51 LS2LS20LS18
LS6LS
28LS48LS10LS
37LS
21LS31
LS9
LS49
LS19
LS50LS16
LS5
LS4LS
17LS15
30
25
20
15
10
5
0
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
(M) Acido lattico(M) Acido aceticoQ.F. =
Aroma!!
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Capacità proteolitica: proteinasi e peptidasi
Valore nutrizionalearoma
aminoacidi
Peptidasi
Composti volatili responsabili del sapore ed aroma
proteine
peptidi
proteinasi
Catabolismo degli aa
PepN
PepV
PepT
Valore nutrizionaleAroma, saporeConservabilità
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PepQ
PepR
Valore nutrizionaleAroma, sapore
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Liberazione di aminoacidi
0
LS12
LS42
LS43
LS40
LS13 LS
8LS
24LS
44 LS1
LS27 LS
3LS
23LS
33LS
35LS
45LS
38 LS7
LS47
LS14
LS39
LS11
LS25
LS41
LS36
LS32
LS26
LS30
2045
1LS
2LS
20LS
18 LS6
LS28
LS48
LS10
LS37
LS21
LS31 LS9
LS49
LS19
LS50
LS16 LS5 LS4
LS17
LS15
FA
A (
mg
kg–1
)
0
500
1000
1500
2000
2500
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Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
I biotipi di Lactobacillus sanfranciscensis possono essere selezionati per migliorare la qualità degli alimenti ma sono stabili
durante le applicazioni industriali?
Endogenuos factors effective in cereal products:Carbohydrates,N-Sources,Minerals,Lipids, free fatty acids,Enzyme activities (protease, amylase),
Field and storage germs
Process parameters:Temperature,Dough yield,Oxygen (redox potential),Fermentation time,Number of propagation steps,
Inoculum
Lactic acid bacteria
Implicit factors: bacteriocins, phages
Yeasts Contamination flora
Product quality:
Flavour, texture, shelf life, nutritional value
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Analisi RAPD-PCR di biotipi di Lb. sanfranciscensis
P7P7
P4P4M13M13
12,000
5,000
2,0001,650
1,000850
650
500400
300
bp
12,000
5,000
2,0001,650
1,000850
650
500400
300
bp
12,000
5,000
2,0001,650
1,000850
650
500400
300
12,000
5,000
2,0001,650
1,000850
650
500400
300
bp
100
12,0005,000
2,0001,650
1,000850650
500400300
bp
200
100
12,0005,000
2,0001,650
1,000850650
500400300
bp
200
100
200
100
12,0005,000
2,0001,650
1,000850650500400300
bp
LS12LS40 LS6 LS8 LS14LS44 LS3LS41 LS48SLS12LS40 LS6 LS8 LS14LS44 LS3LS41 LS48S
LS12 LS40LS6 LS8 LS14LS44 LS3LS41 LS48S
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Profili RAPD-PCR di isolati da lieviti naturali propagati per 10 giorni
LS6 I34 I35 I36S
LS14 I50I49 I55I51 LS3 LS40 I7I5SP7P7
M13M13
200
100
12,000
5,000
2,000
1,650
1,000850
650500400
300
bp
200100
12,000
5,000
2,0001,650
1,000850650
500400300
bp
LS14 I50I49 I51 I55
I4
LS44 I25LS12 I9
I9LS12 I12
I12 I41 I42 I43
LS44 I41I25 I42 I43
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3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1103
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 110
Fase di propagazione
Log u.f.c./g
Cinetica di crescita di Lactobacillus sanfranciscensis dopo propagazione del lievito naturale a 30°C per 6 h in dieci giorni consecutivi
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Fase della propagazione
Log u.f.c./g
Cinetica di crescita di Lactobacillus plantarum dopo propagazione del lievito naturale a 30°C per 6 h in dieci giorni consecutivi
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Biodiversità microbica: comunicazione cellulare nel lievito naturale
sfruttano come mediatori chimici una serie di composti chiamati
acil-omoserina-lattoni (AHLs)
Batteri Gram-negativi
Batteri Gram-positivi
sfruttano come mediatore chimico principale un peptide ribosomiale induttore (AIP)chiamato anche “peptide-feromone”
Mediatori chimici della comunicazione cellulare
Vibrio harveyi
Pseudomonas aeruginosa
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0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (h)
∆ l
og C
FU
/mL
Culture conditions
Viable cells
(log cell/mL)*
Dead/damaged cells(log cell/mL)*
Cultivable cells
(log CFU/mL)*
CB1 9.30a 7.93c 9.10a
CB1 - DC400 8.45c 9.32a 8.40c
CB1 - CR13 8.83b 8.94b 8.8b
CB1 - A7 9.33a 8.0c 9.04a
( ) = monocoltura
( ) = co-coltura con L. plantarum DC400
( ) = co-coltura con L. brevis CR13
( ) = co-coltura con L. rossiae A7
(A) (B)
Cinetica di crescita di Lb. sanfranciscensis CB1 in WFH (30°C, 24 h)
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Cellule vitali e morte di Lb. sanfranciscensis CB1 in mono e co-coltura
CB1
CB1
CB1-A7
CB1-A7
CB1-CR13
CB1-CR13
CB1-DC400
CB1-DC400
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Lb. plantarum DC400
Lb. sanfranciscensis 174
Lb. plantarum 20
Lb. paralimentarius 8D
Weissella cibaria 10XA16
Lb. pentosus 12H5
Pediococcus pentosaceus 2XA3
Lb. brevis CR13
Lb. reuteri D13
Inhibition vs. 174
Homeostasis
Homeostasis
Homeostasis
Inhibition vs. 2XA3
Homeostasis
Homeostasis
Homeostasis
Comunicazione cellulare nel lievito naturale
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
16
14
18
30S-S2
PGK
adhE
2926
222321
25
8
1310
9
51.0kDa
25.0
51.0kDa
25.0
pH 7.0pH 5.0 pH 7.0pH 5.0
16
18
30S-S2
PGK
adhE
26
222321
25
8
13109
14
29
51.0kDa
25.0
51.0kDa
25.0
pH 7.0pH 5.0 pH 7.0pH 5.0
1618
30S-S2
adhE
262223
21
8
13109
14
2925
PGK51.0kDa
25.0
51.0kDa
25.0
pH 7.0pH 5.0 pH 7.0pH 5.0
Porzioni di 2-DE gel di proteine estratte da Lb. sanfranciscensis DPPMA174
Mono-coltura Co-coltura con Lb. plantarum DC400
Mono-coltura + PlnA
� biosintesi delle proteine � metabolismo energetico � catabolismo di proteine e aminoacidi� risposta agli stress � omeostasi del potenziale redox cellulare
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300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100R
ela
tive
Ab
und
an
ce
996.3
598.6
747.5
748.3
1493.7
600.0
499.3 1003.11494.41004.0500.1
1505.51009.1757.1 1202.1 1193.8708.3664.3 1009.9501.4 1513.61016.3788.8 792.6 1371.6 1549.51332.5995.0 1793.4427.9 1578.81386.6495.9
KSSAYSLQMGATAIKQVKKLFKKWGW
plantaricin A[Lactobacillus plantarum]
µg/ml
0 2 4 6 8 10 12A
rea
(mA
U*m
l)0
20
40
60
80
100
120
Lb. plantarum DC400*
Lb. sanfranciscensis 174
Lb. plantarum 20
Lb. pentosus 12H5
P. pentosaceus 2XA3
(r2= 0,99)
2,58 ppm
1,4 ppm
0,6 ppm
*(Monocolture of DC400: 0,067 ppm)
0,04 ppm
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Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8O
D 5
40
nm
* **
*
*
*
DMEM
DC400
DC400
– DPPMA17
4
PlnA
DPPM
A174
24 h
48 h
72 h
0.8
0.7
0.8
0.7
0.8
0.7
0.8
0.7
0
0.8
0.7
0.8
0.7
0.8
0.7
0.8
0.7
0
Vitalità delle cellule Caco-2/TC7 dopo 24, 48 e 72 h di incubazione con laplantaricina A purificata (PlnA) da monocoltura di Lb. plantarum DC400 o da co-coltura con Lb. sanfranciscensis DPPMA174 (DC400-DPPMA174).
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0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
ctr 1
DC 400
EDC400/
174
E
pin A
INFg
INF g
+ D
C400/
174 E
INF g
+pin
A
T24
T48* *
*
*
*
*** ****
DMEM
DC400
DC400 –
DPPMA174
P lnA
INF-
γ
INF-
γ + DC40
0 –
DPPMA17
4
INF-
γ + PlnA0
DMEM
DC400
DC400 –
DPPMA174
P lnA
INF-
γ
INF-
γ + DC40
0 –
DPPMA17
4
INF-
γ + PlnA00
Ohm
sx
cm2
Ohm
sx
cm2
* **
* *
*
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
ctr 1
DC 400
EDC400/
174
E
pin A
INFg
INF g
+ D
C400/
174 E
INF g
+pin
A
T24
T48* *
*
*
*
*** ****
DMEM
DC400
DC400 –
DPPMA174
P lnA
INF-
γ
INF-
γ + DC40
0 –
DPPMA17
4
INF-
γ + PlnA0
DMEM
DC400
DC400 –
DPPMA174
P lnA
INF-
γ
INF-
γ + DC40
0 –
DPPMA17
4
INF-
γ + PlnA00
Ohm
sx
cm2
Ohm
sx
cm2
* **
* *
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
ctr 1
DC 400
EDC400/
174
E
pin A
INFg
INF g
+ D
C400/
174 E
INF g
+pin
A
T24
T48* *
*
*
*
*** ****
DMEM
DC400
DC400 –
DPPMA174
P lnA
INF-
γ
INF-
γ + DC40
0 –
DPPMA17
4
INF-
γ + PlnA0
DMEM
DC400
DC400 –
DPPMA174
P lnA
INF-
γ
INF-
γ + DC40
0 –
DPPMA17
4
INF-
γ + PlnA00
Ohm
sx
cm2
Ohm
sx
cm2
* **
* *
*
Resistenza transepiteliale (TEER) delle cellule intestinali Caco-2/TC7
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Isolamento di batteri lattici da lievito naturale
Utilizzo del pool di lattobacilli e di enzimi microbici
Selezione per l’attività proteinasica e peptidasica specifica
Lb. brevis 14GLb. alimentarius 15M Lb. hilgardii 51BLb. sanfranciscensis 7A
Lb. sanfranciscensis E14Lb. sanfranciscensis E21 Lb. sanfranciscensis 174 Lb. sanfranciscensis 13Lb. sanfranciscensis A1 Lb. sanfranciscensis 274
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St 1 2
ω-gliadins
α, β, γ-gliadins
Hydrolysed gliadins
St 1 2
ω-gliadins
α, β, γ-gliadins
Hydrolysed gliadins
ω-gliadins
α, β, γ-gliadins
Hydrolysed gliadins
regione dei frammenti di idrolisi
((11)) standardstandard gliadinicogliadinico europeoeuropeo;; ((22))impastoimpasto acidificatoacidificato chimicamentechimicamente ee ((33))impastoimpasto alal 2020%% didi farinafarina fermentatofermentatoconcon batteribatteri latticilattici selezionatiselezionati ee proteasiproteasiperper 4848 hh aa 3737°°CC..
campione glutine (ppm)
Controllo ac. chim. 18.700
Fermentato 12
R5-ELISA Sandwich e Competitiva
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Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
CAD
B. long
um
Lb. delbru
eckii s
ubsp
. bulga
ricu
s
Lb. ca
sei
Lb. plan
taru
m
B. infa
ntis
B. bre
ve
Lb. ac
idop
hilu
s
St.
ther
mop
hilu
s
Prep
arat
o VSL#
3
St.
SDS-PAGE di polipeptidi gliadinici estratti da impasti di farina di grano incubati per 24 h con i ceppi presenti nel preparato commerciale VSL#3.
J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010 Dec;51(6):777-83.Gluten-free sourdough wheat baked goods appear safe for young celiac patients: a pilot study.Di Cagno R, Barbato M, Di Camillo C, Rizzello CG, De Angelis M, Giuliani G, De Vincenzi M, Gobbetti M, Cucchiara S.Department of Plant Protection and Applied Microbiology, University of Bari, Bari, Italy.
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Lattobacilli del lievito naturale e celiachia: trial in vivo
Department of Pediatrics and European Institute for the Study of Food Induced Diseases, University of Naples, Federico II,
BY
S1
S2
- 13 celiac patients (in remission)
was enrolled
-6 patients consumed BY equivalent
to 10 g of gluten
-2 patiets consumed S1
-5 patiens consumed S2
- 60 days of administration
- Sixteen celiac patients (in remission)- 60 days of soministration of bread S2 containing 10 g of prefermented gluten
Steps:1. time 0: serologic tests (AGA;EMA, TTG), intestinal biopsy and steatocrit2. 30° day: clinical and serologic tests, steatocrit.3. 60° day: clinical and serological tests, steatocrit, intestinal biopsy4. wash-out period
Department of Pediatric Gastroenterology and Liver Unit, Sapienza University of Rome, Italy
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Serology, morphometric and immunohistochemistry analyses of celiac disease
patients during challenge with fermented baked good
Celiac patient
Time EMA tTG Marsh Grade CD3 γδ CD25
S1 bread
S.A. T0 Negative 0.5 T0 42 4.8 2
T60 Negative 0.5 T3a 59.6 29.6 22
P.M. T0 Negative 1.7 T0 30 6.6 1
T60 Light positivity 9.2 T2 78.4 29.6 30
S2 bread
F.I. T0 Negative 1.6 T0 39 5.6 6
T60 Negative 1.0 T0 38 8.6 5
I.C. T0 Negative 1.9 T0 3.7 0.9 11
T60 Negative 1.1 T0 11 3.8 9
R.R. T0 Negative 0.3 T0 53 11.5 3
T60 Negative 0.3 T0 56 17.8 4
I.I. T0 Negative 0.5 T0 31 8.4 21
T60 Negative 0.3 T0 36 12.8 21
C.C. T0 Negative 0.4 T0 32 21 3
T60 Negative 0.7 T0 47 18 7
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Biopsy (t0) Biopsy (t60)
CD3 (t0) CD3 (t60)
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
1
2
3
1
2
3
T-CD
U-CD
HC
-3 -2 -1 0 1 2 3
Fatt. 1: 63.81%
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Fatt.
2: 3
6.19
%
Hydrocarbons
Aldehydes
Ketones
Alcohols Esters
Short chain fatty acids
Sulfur compounds
T-CD
U-CD
HC
-3 -2 -1 0 1 2 3
Fatt. 1: 63.81%
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Fatt.
2: 3
6.19
%
Hydrocarbons
Aldehydes
Ketones
Alcohols Esters
Short chain fatty acids
Sulfur compounds
Dieta gluten-free e microbiota intestinale nei soggetti celiaci
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
(BMC Microbiology, submitted)
Duodenal and Faecal Microbiota of Celiac Children: Molecular, Phenotype and
Metabolome Characterization
Raffaella Di Cagno1, Ilaria De Pasquale1, Maurice Ndagijimana2, Pamela Vernocchi3, Patrizia
Ricciuti1, Francesca Gagliardi4, Luca Laghi3, Ruggiero Francavilla4, Carmine Crecchio1, M.
Elisabetta Guerzoni3, Marco Gobbetti1and Maria De Angelis1*
Dieta gluten-free e microbiota intestinale nei soggetti celiaci
Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro
Biodiversità microbica e biotecnologie alimentari
……………………
“Il ruolo dell’infinitamente piccolo, in natura, è infinitamente grande” (Louis Pasteur, 1822 - 1895)