Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 380 nm), daerah visible (380 700 nm), daerah inframerah (700 3000 nm) (Khopkar 1990).Spektrofotometer bekerja berdasarkan pada prinsip penyerapan gelombang cahaya (radiasi) yang dilewatkan pada suatu larutan. Spektrofotometer yang digunakan adalahvisible atau menggunakan cahaya tampak, yang panjang gelombang terukurnya berkisar antara 340 nm 1000 nm. Panjang gelombang maksimum dicari untuk mengetahui seberapa besar energi cahaya tertinggi yang diserap oleh suatu larutan. Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :a. Sumber CahayaSebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 2200 nanometer (nm).b. MonokromatorMonokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).c. CuvetCuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempatcontoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible).d. DetektorPeranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io). Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain: radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen, tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer). Spektrofotometer UV-Vis membandingkan cuplikan standar yaitu substrat gelas preparat. Hasil pengukuran dari spektrofotometer UV-Vis menunjukkan kurva hubungan transmitan dan panjang gelombang ( ) (Basset 1994).Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan, yaitu: spektrofotometer Vis (Visible), spektrofotometer UV (Ultra Violet), spektrofotometer UV-Vis, dan Spektrofotometri IR (Infa Red). Pada spektrofotometri Vis, yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 750 nm. Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Senyawa yang dapat menyerap sinar UV terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna (bening dan transparan). Spektrofotometri UV-Vis menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator dan dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Sedangkan, spektrofotmetri IR berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada spektrofotometri IR digunakan untuk analisa kualitatif, misalnya untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa.Basset J et al. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGCCairns D. 2009. Intisari Kimia Farmasi Edisi Kedua. Penerjemah : Puspita Rini. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari : Essentials of Pharmaceutical Chemistry Second Edition.Day R dan Underwood A. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Penerjemah : Sopyan Iis. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Quantitative Analysis Sixth Edition.Khopkar S. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia (UI-Press)Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet.[1] Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.[2] Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.[1][2]Pengujian kadar protein dengan metode Bradford adalah suatu metodedengan pewarnaan protein yang didasarkan pada pengukuran absorbansi. Perubahan warna yang dilakukan oleh dye commassie (komponen reagen Bradford) dari pewarna merah commasie ke pewarna biru commasie disebabkan oleh pengikatan protein. Selama pembentukan kompleks pengikatan protein ini, terjadi pelepasan elektron bebas dari pewarna merah commasie yang mempengaruhi lapisan hidrofobik protein. Lapisan hidrofobik ini mengikat wilayah non-polar dari pewarna melalui gaya van der walls sehingga posisi amina positif tertarik pada muatan negatif dari pewarna tersebut. Pengikatan protein ini diperkuat oleh interaksi ionik antar kedua muatan. Pengikatan protein menyebabkan zat pewarna biru commasie pada reagen Bradford menjadi stabil. Hal ini disebabkan oleh penstabilan anion dari pewarna biru commasie oleh kation dari pewarna merah commasie. Jumlah protein yang mengompleks ini adalah ukuran untuk menentukan konsentrasi protein dengan membaca absorbansinya (Bradford 1976).Uji ini didasarkan pada pengamatan bahwa absorbansi maksimum untuk larutan pewarna asam Coomassie Brilliant Blue G-250 bergeser dari 465 nm ke 595 nm, ketika mengikat protein (terjadi perubahan warna). Panjang gelombang yang digunakan untuk pengukuran protein dengan metode Bradford adalah 595 nm. Hal ini dikarenakan pada panjang gelombang 595 nm absorbansi sebanding dengan pewarna yang terikat pada protein. Oleh karena itu, kadar protein pun menjadi sebanding dengan absorbansi jika diukur menggunakan kurva standar (Bradford 1976).Metode Bradford mempunyai ketelitian yang tinggi karena koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA adalah konstan selama rentang konsentrasi flip-10. Uji Bradford sangat cepat dan menggunakan jumlah protein yang relatif sama dengan uji Lowry.Metode Bradford cukup akurat dan sampel yang berada di luar jangkauan dapat diuji ulang dalam beberapa menit.Bradford direkomendasikan untuk penggunaan umum, terutama untuk menentukan kadar protein dari fraksi sel dan menilai konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. Metode Bradford tidak mengukur adanya ikatan peptida tapi mendeteksi asam amino yang spesifik, seperti arginin, yang diyakini bertanggung jawab atas pengikatan pewarna untuk protein (Stoscheck 1990).Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein suatu sampel dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar.Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan dalam percobaan spektrofotometri ini adalah spektronik 20, kuvet, pipet volumetrik, bulb, gelas piala, tabung reaksi, stirer, dan gelas ukur. Bahan bahan yang digunakan adalah akuades, larutan Bovine Serum Albumin (BSA) 0.1 mg/mL, larutan NaCl, dan reagen Bradford.Prosedur PercobaanLarutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0.1 mg/mL dan larutan NaCl disiapkan. Enam tabung reaksi dibersihkan dan dikeringkan. Tabung pertama diisi larutan BSA 0 L dan 100 L larutan NaCl. Tabung kedua diisi larutan BSA 10 L dan larutan NaCl 90 L. Tabung ketiga diisi larutan BSA 20 L dan larutan NaCl 80 L. Tabung keempat diisi larutan BSA 30 L dan larutan NaCl 70 L. Tabung elima diisi larutan BSA 50 L dan larutan NaCl 50 L. Tabung keenam diisi larutan BSA 100 L dan larutan NaCl 0 L. Reagen Bradford 5 mL ditambahkan ke dalam masing-masing tabung.Semua tabung dikocok dengan alat stirer dan dibiarkan antara lima belas menit sampai satu jam. Tabung ke-1 digunakan sebagai blanko. Satu per satu tabung dimasukkan ke dalam spektrofotometer untuk dibaca absorbansinya. Panjang gelombang yang digunakan adalah 595 nm. Setelah itu dibuat kurva hubungan antara absorban dengan konsentrasi protein dalam tabung beserta persamaan garisnya.Larutan sampel protein dipipet ke dalam tabung reaksi dan diukur absorbansinya. Pengukuran absorbansi pada larutan sampel diulang sebanyak dua kali. Nilai absorban yang diperoleh digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel. Konsentrasi sampel ditentukan dengan memasukkan nilai absorban ke persamaan garis yang sudah diperoleh pada percobaan pertama.Uji ini didasarkan pada observasi bahwa absorbansi maksimum untuk larutan asam pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 bergeser dari 465 nm ke 595 nm, ketika pengikatan protein. Lapisan hidrofobik dari protein berinteraksi menstabilkan anion dari pewarna biru coomassie. Uji ini memiliki ketepatan yang tinngi karena koefisien penghentian kompleks larutan BSA adalah konstan selama rentang konsentrasi flip-10. Dalam rentang linier dari sampel protein (5-25 g / ml), semakin banyak protein yang terikat oleh pewarna coomassie tersebut. Komponen reagen Bradford terdiri dari Larutan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan 100 ml 85% (w/v) asam fosfat (Bradford 1976).Keuntungan uji Bradford sangat cepat sehingga dapat mengefektifan waktu percobaan. Metode ini juga cukup akurat dan sampel yang berada di luar jangkauan dapat diuji ulang dalam beberapa menit. Uji Bradford direkomendasikan untuk penggunaan umum, terutama untuk menentukan kadar protein dari fraksi sel dan menentukan konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. Uji protein Bradford adalah prosedur sederhana untuk penentuan konsentrasi total protein dalam larutan. Uji ini tergantung pada perubahan absorbansi berdasarkan pengikatan pewarna Coomassie Blue G 250 dengan protein. Pewarna biru Coomassie mudah mengikat protein arginina dan residu lysna (bukan dalam bentuk asam amino bebas). Metode Bradford tidak mengalami gangguan yang disebabkan oleh berbagai bahan kimia yang berada dalam sampel (Stoscheck 1990).Kelemahan utama metode Bradford adalah kekhususan reagennya yang dapat mengakibatkan variasi respon tes untuk protein yang berbeda. Oleh karena itu, dianjurkan untuk memilih protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel protein yang diujikan. uji ini kurang akurat untuk atau asam protein dasar. Selain itu, meningkatnya konsentrasidetergen dapat mengganggu pengukuran konsentrasi protein dengan etode ini. Sebagai contoh, sodium dodesil sulfat(SDS), dapat ditemukan dalam ekstrak protein karena digunakan untuk mengeluarkan isi sel dengan cara merusak lapisan ganda membran lipid. Detergen lain mengganggu pengukuran uji ini pada konsentrasi yang tinggi. Gangguan yang disebabkan oleh SDS adalah dua modus yang berbeda dan masing-masing terjadi pada konsentrasi yang berbeda.Untuk konsentrasi SDS di bawah konsentrasi misel kritis (dikenal sebagai CMC, 0,00333% W / V untuk 0,0667%) dalam larutan pewarna coomassie, cenderung menghambat situs pengikat reagen pewarna.Hal ini dapat menyebabkan ketidakakuratan konsentrasi protein yang diukur dalam larutan.Konsentrasi SDS yang berada di atas konsentrasi misel kritis, asosiasi detergen sangat kuat dengan pewarna hijau coomassie. Hal ini menyebabkan kesetimbangan bergeser sehingga menghasilkan lebih dari warna biru pada protein. Warna yang dihasilkan menyebabkan peningkatan absorbansi pada 595 nm.Gangguan lain mungkin berasal dari buffer digunakan ketika mempersiapkan sampel protein.Sebuah konsentrasi yang tinggi akan menyebabkan buffer konsentrasi protein berlebih karena menipisnya proton bebas dari larutan dengan basa konjugasi dari buffer.Ini tidak akan menjadi masalah jika konsentrasi protein yang diukur rendah (Stoscheck 1990).Larutan BSA adalah protein yang paling berlimpah dalam serum. Larutan ini berfungsi dalam transportasi asam lemak, menjaga cairan agar tidak bocor keluar dari sistem peredaran darah, dan peran terbatas dalam pemeliharaan pH. Larutan BSA sering digunakan untuk membantu menstabilkan larutan encer enzim di laboratorium atau untuk mencegah antigen non-spesifik mengikat antibodi. Larutan BSA dan IGg adalah larutan standar yang biasa digunakan untuk menentukan kadar protein dengan metode Bradford (Keenan 1992).Protein adalah fungsi dari konsentrasi garam. Fungsi dari penambahan NaCl ke dalam larutan BSA adalah untuk melarutkan protein yang akan diukur. Semakin banyak NaCl yang ditambahkan maka semakin banyak protein yang larut. Semakin banyak protein yang larut maka pengompleksan antara protein dan zat warna dalam reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi. Hal ini ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang semakin rendah jika NaCl yang ditambahkan semakin banyak (Khopkar 2007).Prinsip dari percobaan ini adalah menentukan konsentrasi sampel protein dengan menggunakan kurva standar yang menghubungkan antara konsentrasi protein dari larutan BSA dengan absorbansinya. Larutan BSA yang digunakan memiliki enam konsentrasi yang berbeda. Enam konsentrasi tersebut diukur absorbansinya untuk mengetahui konsentrasi dari sampel protein melalui kurva standar yang menghubungkan absorbansi dengan konsentrasi larutan BSA. Fungsi kurva standar adalah untuk menentukan konsentrasi sampel yang absorbansinya sudah diketahui.Hasil percobaan menunjukkan nilai absorbansi yang semakin tinggi seiring dengan berkurangnya volume NaCl yang ditambahkan dan meningkatnya volume larutan BSA yang ditambahkan. Tabung pertama yang berisi larutan BSA 0 L dan 100 L larutan NaCl menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0.688 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0 . Tabung kedua yang berisi larutan BSA 10 L dan larutan NaCl 90 L menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0.778 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.090. Tabung ketiga yang berisi larutan BSA 20 L dan larutan NaCl 80 L menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0.821 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.133. Tabung keempat diisi larutan BSA 30 L dan larutan NaCl 70 L menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0.802 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.114. Tabung kelima diisi larutan BSA 50 L dan larutan NaCl 50 L menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0.963 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.275. Tabung keenam diisi larutan BSA 100 L dan larutan NaCl 0 L menunjukkan nilai absorbansi sebesar 1.657 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.969.Konsentrasi larutan standar bovine serum albumin (BSA) pada masing-masing tabung reaksi adalah 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL. Persamaan garis yang diperoleh dari kurva yang menghubungkan nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan BSA adalah y = 0.95 + 0.069x dengan r sebesar 96.46 %. Ketepatan yang diperoleh tidak 99.99%, hal tersebut dikarenakan terjadinya kesalahan selama praktikum. Kesalahan tersebut dapat disebabkan oleh pengukuran volume yang tidak tepat saat menambahkan larutan BSA dan larutan NaCl serta kesalahan pengkalibrasian spektrofotometer sehingga diperlukan menghitung absorbansi terkoreksi untuk masing-masing pengukuran.Konsentrasi larutan sampel diperoleh dengan cara memasukkan nilai absorbansi yang terukur ke dalam persamaan garis kurva antara konsentrasi protein dengan absorbansi. Pengukuran absorban sampel protein dilakukan sebanyak dua kali. Absorban sampel ulangan pertama adalah sebesar 0.927. Absorban sampel ulangan kedua adalah sebesar 1.062. Konsentrasi yang diperoleh dari sampel ulangan pertama adalah 0.333 mg/mL sedangkan konsentrasi sampel yang diperoleh dari ulangan kedua adalah sebesar 1.623 mg/mL. Rataan konsentrasi sampel ulangan pertama dan ulangan kedua adalah sebesar 0.978 mg/mL. Pengukuran protein dalam sampel jarang dinyatakan dalam mg/mL. Biasanya pengukuran protein dinyatakan dalam mg/dL. Oleh karena itu, rataan konsentrasi sampel perlu dikonversi ke dalam satuan mg/dL. Konsentrasi sampel yang diperoleh adalah 97.8 mg/dL. Konsentrasi yang diperoleh mendekati konsentrasi yang tertera dalam label sampel protein yaitu 1 mg/mL atau 100 mg/dL.SimpulanPercobaan ini mempraktikkan cara menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan metode Bradford. Panjang gelombang yang digunakan yaitu 595 nm. Konsentrasi larutan bovine serum albumin (BSA) adalah 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.5 mg/mL, dan 1 mg/mL. Absorbansi yang terukur berturut-turut adalah 0.688, 0.778, 0.821, 0.802, 0.963, 1.657 dan nnilai absorbansi terkoreksi berturut-turur adalah 0, 0.090, 0.133, 0.114, 0.275, 0.969. Persamaan garis yang diperoleh dari kurva yang menghubungkan nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan BSA adalah y = 0.95 + 0.069x dengan ketepatan sebesar 96.46 %. Absorban sampel protein ulangan pertama adalah sebesar 0.927. Absorban sampel ulangan kedua adalah sebesar 1.062. Konsentrasi yang diperoleh dari sampel ulangan pertama adalah 0.333 mg/mL sedangkan konsentrasi sampel yang diperoleh dari ulangan kedua adalah sebesar 1.623 mg/mL. Rataan konsentrasi sampel ulangan pertama dan ulangan kedua adalah sebesar 0.978 mg/mL. Konsentrasi sampel dalam satuan mg/dL adalah 97.8 mg/dL.Daftar PustakaBradford MM .1976. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemistry 72 , 248-254.Keenan R. 1992. Biokimia Laboratorium. Jakarta : Erlangga.Khopkar S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.Stoscheck CM. 1990. Increased uniformity in the response of the Coomassie blueprotein assay to different proteins. Analitical Biochemistry 184, 111-116Stoscheck CM .1990. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182, 5Bradford Protein Assay (image from freewebs.com)Salah satu prosedur analisa kandungan protein dalam larutan adalah menggunakan metode Bradford yang pertama kali dideskripsikan oleh Bradford (Bradford et al., 1976). Metode ini lebih simple, lebih cepat dan lebih sensitif dibanding metode Lowry, selain itu Bradford juga lebih tahan terhadap interferensi senyawaan nonprotein.Metode Bradford didasarkan pada pengikatan zat warna Coomassie Blue G-250 ke protein, dimana zat warna ini memiliki empat formasi ion berbeda dengan nilai pKa 1.15, 1.82 dan 12.4. Bentuk kationik zat warna ini berwarna merah dan hijau dengan panjang gelombang serapan (absorbansi) maksimum pada 470 dan 650 nm. Sedangkan bentuk anioniknya berwarna biru dengan absorbansi maksimum 590 nm. Pengukuran proteinnya sendiri dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru), dan biasanya hal ini dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan pada 595 nm.Zat warna Coomassie Blue G-250 bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein, sehingga hal ini menyebabkan adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda-beda. Protein dengan residu arginil dan lysil yang lebih banyak tentu akan menghasilkan warna biru yang lebih intens dibanding protein yang residu arginil dan lysilnya lebih sedikit meskipun jumlah proteinnya sama. Namun secara umum metode Bradford masih merupakan metode yang paling sesuai dan paling umum digunakan.Ada dua jenis assay protein dengan metode Bradford, yaitu Standard Assay cocok untuk pengukuran kadar protein antara 10 sampai 100 g dan Microassay yang dapat mendeteksi antara 1 sampai 10 g protein. Konsekuensinya microassay lebih rentan terhadap interferensi senyawaan nonprotein.Material yang digunakanPereaksi (Reagent)Pereaksi yang digunakan dibuat dengan melarutkan 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml ethanol 95%. Larutan ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml asam fosfat 85% dan diencerkan sampai volume 1 L dengan aquadest. Pereaksi ini harus difilter dengan kertas saring Whatman no. 1 dan disimpan dalam botol amber (gelap) di suhu ruang. Pereaksi ini stabil hingga beberapa minggu, namun jika terbentuk endapan ketika penyimpanan, maka harus difilter lagi saat hendak digunakan.Standar ProteinBovine -globulin dengan konsentrasi 1 mg/ml (atau 100 g/ml untuk microassay) digunakan sebagai larutan stok (disimpan beku pada suhu -20oC). Konsentrasi protein larutan standard harus diukur sebelum digunakan dengan mengukur absorbansinya pada 280 nm. Absorbansi larutan Bovine -globulin 1mg/ml pada cuvet 1 cm adalah 1.35. Jika yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) atau Ovalbumin, maka absorbansinya masing-masing adalah 0.66 dan 0.75.Alat Gelas dan PlastikAlat gelas dan plastik yang digunakan harus benar-benar bersih dan bebas detergen. Jangan menggunakan cuvet silika (Quartz) untuk pengukuran spektrofotometer karena zat pewarna dapat terikat pada bahan ini.Standard Assay Pipet 100 l sample yang mengandung kira-kira 10 100 g protein. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui, maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1, 1:10, 1:100, 1:1000, dst). Siapkan secara duplo. Untuk kurva kalibrasi, buatlah seri larutan standard 100, 200, 400, 600, 800 dan 1000 g/ml. Lalu pipet masing-masing 100 l ke dalam tabung. Siapkan blanko dengan aquadest 100 l. Tambahkan 5 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung sample dan standard, campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan. Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit. Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelombang 595 nm.Catatan: Standard 100 g akan memberikan absorbansi sekitar 0.4. Kurva standard-nya tidak linear, dan presisi absorbansinya bervariasi bergantung pada lamanya inkubasi. Jadi kurva kalibrasi harus dibuat untuk setiap assay.Microassay Pipet 100 l sample yang mengandung kira-kira 1 10 g protein ke dalam tabung Eppendorf 1.5 ml. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui, maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1, 1:10, 1:100, 1:1000, dst). Siapkan secara duplo. Untuk kurva kalibrasi, buatlah seri larutan standard 10, 20, 40, 60, 80 dan 100 g/ml. Lalu pipet masing-masing 100 l ke dalam tabung. Siapkan blanko dengan aquadest 100 l. Tambahkan 1 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung, campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan. Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit. Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelombang 595 nm. Nilai absorbansi untuk sampel yang mengandung 10 g -globulin adalah 0.45.Sumber: http://www.molecularstation.com/protein/bradford-protein-assay/ http://www.molecularstation.com/protein/bradford-protein-assay-protocol/