BAB IPENDAHULUAN

1.1. Latar BelakangSel darah merah merupakan sel terbanyak dalam darah. Karena mengandung senyawa yang berwarna merah yaitu hemoglobin. Fungsi utamanya adalah mengikat dan membawa oksigen dari paru-paru untuk diedarkan dan dibagikan ke seluruh sel di berbagai jaringan. Kelarutan oksigen secara fisik di dalam darah sangat dipengaruhi oleh tekanan parsial dari gas ini (PO2) serta oleh suhu. Kedua faktor ini merupakan faktor lingkungan yang mudah berubah-ubah (Sadikin, 2001).Eritrosit atau sel darah merah pada dasarnya adalah suatu kantong hemoglobin yang terbungkus membran plasma yang mengangkut O2 dan CO2 di dalam darah. Leukosit atau sel darah putih adalah unit-unit pertahanan sistem imun diangkut dalam darah ke tempat-tempat cedera atau mikroorganisme penyebab penyakit. Trombosit adalah penghentian perdarahan dari suatu pembuluh yang cedera (Guyton, 2006).Darah membentuk sekitar 8% dari berat tubuh total dan memiliki volume rata-rata 5 liter pada wanita dan 5,5 liter pada pria. Darah terdiri dari 3 jenis unsur sel yaitu eritrosit, leukosit dan trombosit yang berada di dalam cairan kompleks plasma (Sadikin, 2001).Hemoglobin merupakan hal yang paling penting pada eritrosit untuk mengangkut O2. Molekul hemoglobin terdiri dari dua bagian, yaitu:a. Bagian globin, suatu protein yang terbentuk dari empat rantai polipeptida yang sangat berlipat-lipat.b. Gugus nitrogenosa nonprotein mengandung besi yang dikenal sebagai gugus hem (heme) yang masing-masing terikat ke polipeptida. (Sherwood, 2001)Setiap atom besi dapat berikatan secara reversible dengan satu molekul oksigen. Karena, O2 kurang larut dalam plasma 98,5% O2 yang diangkut dalam darah terikat pada hemoglobin membentuk oksihemoglobin. Kandungan besi hemoglobin tampak kemerahan apabila berikatan dengan O2 dan kebiruan jika mengalami deoksigenasi (Sherwood, 2001).Dengan demikian, hemoglobin berperan penting dalam pengangkutan O2 sekaligus pengangkutan CO2 dan menentukan kapasitas penyangga darah. Untuk memaksimalkan kandungan hemoglobinnya sebuah eritrosit dipenuhi oleh ratusan juta molekul hemoglobin (Sherwood, 2001).Kemampuan hemoglobin untuk dapat berikatan secara longgar dan reversibel dengan oksigen. Karena fungsi utama hemoglobin dalam tubuh adalah bergabung dengan oksigen dalam paru dan kemudian melepaskan oksigen ini dalam kapiler jaringan perifer yang tekanan gas oksigennya jauh lebih rendah daripada paru-paru (Murray, 2006).Oksigen tidak bergabung dengan dua ikatan positif besi dalam molekul hemoglobin. Namun, berikatan secara longgar dengan salah satu ikatan yang disebut ikatan koordinasi atom besi. Ikatan ini begitu longgar. Sehingga gabungan tersebut bersifat sangat reversibel. Selanjutnya oksigen diangkut ke jaringan bukan dalam bentuk ion melainkan dalam bentuk molekul (yang terdiri dari dua atom oksigen). Yang karena longgarnya dan sangat reversibel. Oksigen dilepaskan kedalam cairan jaringan dalam bentuk molekul bukan dalam bentuk ion (Guyton, 2006). 1.2. Tujuan Praktikum1. Mengamati proses pembentukan oksihemoglobin dan deoksihemoglobin2. Mengamati proses pembentukan karbon monoksida hemoglobin3. Mengamati proses pembentukan methemoglobin4. Menetapkankadar Hemoglobin dengan metode sianmethemoglobin (cyanmethemoglobin)5. Mengamati proses hemolisis sel darah merah6. Mencaritahu pengaruh pelarut organik terhadap membran sel darah merah7. Mengukur kadar peroksida lipid dalam serum

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Hemoglobin adalah protein pengangkut oksigen yang terdapat pada eritrosit. Struktur hemoglobin terdiri dari satu globin yang tersusun atas empat rantai polipeptida. Masing-masing rantai polipeptida terikat dengan satu gugus heme. Setiap gugus heme mengandung besi ferro (fe2+). Setiap ferro dapat mengikat satu atom oksigen. Dengan demikian, satu hemoglobin dapat mengikat empat atom oksigen. (Sherwood, 2001)Methemoglobin merupakan bentuk hemoglobin yang teroksidasi, di mana ferro yang sangat rentan teroksidasi oleh zat-zat oksidator akan berubah menjadi ferri (fe3+). Besi dalam bentuk ferri tidak dapat berikatan dengan oksigen sehingga methemoglobin tidak mampu untuk melaksanakan fungsi utama hemoglobin yaitu mengangkut oksigen dari paru ke jaringan. Kadar methemoglobin dalam darah sangat sedikit. Hal ini disebabkan oleh adanya sistem NADH-sitokrom b5 methemoglobin reduktase yang dapat mengembalikan ferri yang sudah terbentuk menjadi ferro sehingga methemoglobin akan berubah kembali menjadi hemoglobin yang fungsional. (Murray, 2003)Methemoglobin terbentuk ketika besi dalam hemoglobin teroksidasi dari bentuk ferro (Fe2+) menjadi bentuk ferri (Fe3+). Ketika ferro hemoglobin teroksidasi menjadi Fe3+, hemoglobin tersebut kehilangan kemampuannya untuk membawa oksigen. Pada orang dewasa yang sehat jumlah methemoglobin dalam darahnya kurang dari 2% dari total hemoglobin. Tingkat ini dipertahankan terutama oleh transfer elektron dari dinukleotida nicotinamide adenin (NADH) menjadi NADH b5 sitokrom reduktase. (Kwok, 2008)Pada sistem ini terdapat dua enzim yang berfungsi untuk mereduksi methemoglobin dalam eritrosit. Kedua enzim ini adalah NADH-cytochrome b5 reductase dan NADPH-flavin reductase. Mekanisme kerja enzim ini dalam mereduksi methemoglobin dapat dijelaskan dengan reaksi sebagai berikut :Hb-Fe3+ + Cyt b5 red Hb-Fe2+ + Cyt b5 oks Lalu, untuk mendapatkan kembali sitokrom b5 yang tereduksi, terjadi reaksi sebagai berikut :Cyt b5 oks + NADH Cyt b5 red + NAD(Murray, 2003)Methemoglobin (MetHb) dapat terbentuk karena berbagai macam zat, salah satu contohnya adalah senyawa nitrit. Senyawa nitrit dapat masuk ke tubuh melalui berbagai jalur, misalnya ingesti. Salah satu contoh makanan yang bisa menjadi sumber nitrit adalah bayam.Nitrat (NO3) pada bayam jika dibiarkan dalam waktu lama atau dipanaskan akan teroksidasi menjadi nitrit (NO2). Nitrit bersifat toksik bagi tubuh manusia. Jika nitrit berikatan dengan hemoglobin dalam eritrosit, akan terjadi reaksi oksidasi yang membentuk metHb. Jika kadar metHb yang terbentuk sudah berlebihan, bisa menimbulkan berbagai macam penyakit. (Dharmawan, 2008)

BAB IIIMETODOLOGI

3.1. Alat dan Bahan3.1.1. Uji Oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin1. Darah segar2. Pereaksi stokes3. Larutan NH4OH

3.1.2. Uji karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)1. Darah segar2. Sumber gas CO3. Pereaksi stokes4. NH4OH

3.1.3. Uji untuk methemoglobin1. Darah segar2. Pereaksi K3Fe (CN)63. Pereaksi stokes

3.1.4. Penetapan kadar Hb dengan metode sianmethemoglobin1. Darah yang akan diperiksa2. Pipet sahli 0,2 ml3. Pipet volumetric 5 ml4. Pereaksi Drabkin (larutan NaHCO3, 52mg KCN beracun dan 18 mg K3Fe(CN)6 dalam 1 L air suling (simpan dalam botol)5. Spektofotometer dan kuvet6. Standar Hb

3.1.5. Hemolisis sel darah merah1. Darah segar2. Larutan NaCl 2%

3.1.6. Pengaruh pelarut organik terhadap membrane sel darah merah1. Darah segar2. Larutan NaCl 0,9%3. Kloroform 4. Eter

3.1.7. Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum1. Hemolisat darah2. Larutan asam trikloroasetat (TCA) 10%3. Larutan TBA 0,67%

3.2. Cara Kerja3.2.1. Uji oksihemoglobin dan DeoksihemoglobinOksiHb1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 2 ml darah dengan 6 ml air .2. Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksihemoglobin yang terbentuk.3. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing-masing tabung berisi 4 ml. Gunakan tabung 1 sebagai kontrol.

Pembentukan deoksiHb1. Isi tabung ketiga dengan 2 ml pereaksi Stokes dan tambahkan NH4OH secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbentuk. Campuranini merupakan larutan pereduksi yang kuat.2. Masukkan beberapa tetes larutan Stokes ke dalam tabung 2. Terlihatperubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1.

Pembentukan kembali oksiHb dari deoksiHb1. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali oksigenasi dari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk.2. Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang-ulang.

3.2.2. Uji karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)1. Encerkan 2 mL darah dengan 8 mL air suling. Bagi 2 darah encer itu (masing-masing 5 mL) dalam dua tabung reaksi.2. Pada tabung 1 alirkan gas CO (dalam lemari asam). Oksihemoglobin akan berubah menjadi karbonmonoksihemoglobin. Bandingkan warna kedua tabung tadi. 3. Pindahkan masing-masing 1 mL dari tabung 1 (yang berisi HbCO) kedalam tabung 3 dan 4, dan masing-masing 1 mL dari tabung 2 (yang berisi HbO2) ke dalam tabung 5 dan 6. 4. Tambahkan pereaksi stokes pada tabung ke 3 dan 5. Jelaskan hasil yang didapat!5. Encerkan isi tabung 4 dan 6 dengan 4 mL air suling. Bandingkan warna kedua cairan itu. OksiHb berwarna kekuning-kuningan, sedangkan HbCO bersemu kemerahan (carmine tint).

3.2.3. Uji untuk methemoglobin1. Encerkan 1 mL darah dengan 4 mL air suling dalam tabung reaksi.2. Ke dalam tabung itu tambahkan beberapa tetes K3Fe(CN)6 33%. Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Kemudian tambahkan pereaksi Stokes ke dalam tabung itu dan kocok kuat-kuat. Perubahan apakah yang terlihat?3. Encerkan 3 mL darah dengan 3 mL air suling dan panaskan sebentar, lalu tambahkan 6 mL K3Fe(CN)6. Campur dengan membalik-balikkannya.Perhatikan gelembung- gelembung oksigen yang terbentuk.

3.2.4. Penetapan kadar Hb dengan metode sianmethemoglobin1. Pipetkan dengan pipet volumetric 5 mL perekasi drabkin ke dalam sebuah tabung reaksi2. Tambahkan 0,02 mL darah yang akan diperiksa pada tabung yang berisipereaksi Drabkin, bilas pipet tersebut 3 kali dengan pereaksi Drabkin dalam tabung tersebut3. Diamkan selama 10 menit4. Pindahkan campuran tersebut ke dalam kuvet spektofometer dan tentukan serapannya pada 540nm. Sebagai blanko digunakan pereaksi Drabkin5. Tentukan kadar Hb dalam 9% dari standar Hb yang disediakan dengan rumus sebagai berikut:Kadar Hb =Ru/Rs x 10 g%= g%

3.2.5. Hemolisis sel darah merah1. Ke dalam 10 tabung reaksi, isiskan campuran berikut: TabungAir suling (mL)NaCl 2% (mL)%NaCl

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2. Campurkan dengan baik3. Tambahkan 2 tetes suspense ke dalam setiap tabung dan kocok dengan membalik-balikkan tabung perlahan. Diamkan 1 jam4. Perhatikan dan catatlah derajat hemolisis pada tiap tabung

3.2.6. Pengaruh pelarut organik terhadap membrane sel darah merah1. Ke dalam 6 tabung reaksi, masukkan setiap 10 mL larutan NaCl 0,9%.2. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol dan pada ke 5 tabung lainnyatambahkan setiap 2 tetes kloroform, eter, aseton, toluen, dan alkohol secara berurutan.3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan kontrol.

3.2.7. Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serumBahan Uji (mL)Blanko

Hemolisat darah0,25 -

Akuades -0,25

Larutan TCA 10% dingin0,500,50

Kosong, pusing, ambil supernatan

Larutan TBA 0,067%0,750,75

Masukkan penangas mendidih 10 menit, didinginkan/ baca serapan pada panjang gelomang 532 nm

Hasil A 532 kadar MDA

DAFTAR PUSTAKA

Guyton, Arthur C., 2006, Buku Ajar Fisiologi Kedokteran, edisi II, Buku Kedokteran EGC; Jakarta.

Sadikin, Muhammad., 2001, Biokimia Darah, Widya Medika; Jakarta.

Wirawan., 1976, Darah, CV. Akadoma; Jakarta.

Bayard, M., J. Farrow, and F. Tudiver. 2004. Acute Methemoglobinemia after Endoscopy. The Journal of the American Board of Family Practice.17 : 227-229.Da-Silva, S.S., I.S. Sajan, and J.P. Underwood. 2003. Congenital Methemoglobinemia: A Rare Cause of Cyanosis in The Newborn- A Case Report. Pediatrics. 112 : e158-e161.Kwok, S., J.L. Fischer, and J.D. Rogers. 2008. Benzocaine and Lidocaine Induced Methemoglobinemia after Bronchoscopy : A Case Report. Journal of Medical Case Reports. 2 : 16.Murray, R.K., D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell. 2003. Biokimia Harper. Edisi 25. Jakarta : EGC. hal 972.Sherwood, Lauralee. 2001. Fisiologi Manusia : dari Sel ke Sistem. Edisi 2. Jakarta : EGC. hal 346.