LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA I

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Disusun Oleh :

Nama : Rizki Triyunita

NIM : 06111010041

Kelompok : 11

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

JURUSAN PENDIDIKAN MIPA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS SRIWIJAYA

2013

I.NOMOR PERCOBAAN : V (Lima)

II.NAMA PERCOBAAN : KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

III. TUJUAN PERCOBAAN : Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan

KLT dan mengetahui harga Rf asam amino

IV. DASAR TEORI

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber

pada tahun 1983. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi

kertas dan elektroforesis. Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan

yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng

kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik.

Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak

sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik

(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun

(descending) (Rohman,2007).

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaanya lebih mudah dan lebih murah

dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga dengan peralatan yang

digunakan, dalam kromatografi ini peralatan yang digunakan lebih sederhana.

Keuntungan kromatografi planar adalah:

1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis

2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,

fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet

3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau

dengan cara elusi 2 dimensi

4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan

ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.

Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan suatu adsorben yang

disalutkan pada suatu lempeng kaca sebagai fase stasionernya dan pengembangan

kromatogram terjadi ketika fase mobil tertapis melewati adsorben itu. Seperti

dikenal baik, kromatografi lapis tipis mempunyai kelebihan yang nyata

dibandingkan kromatografi kertas karena nyaman dan cepatnya, ketajaman

pemisahan yang lebih besar dan kepekaannya tinggi (Pudjaatmaka, 1994).

Fase Diam KLT

Lapisan dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT

yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Panjang lapisan 200 mm dengan lebar

200 atau 100 mm. Untuk analisis totalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelu

digunakan, lapisan disimpan dalam lingkunga yang baik lembab dan bebas dari uap

laboratorium (Stahl, 1985).

Penjerap yang umum ialah silica gel, aluminium oksida, kieselgur, selulosa

dan turunannya, poliamida, dan lain-lain. Dapat dipastikan silica gel paling banyak

digunakan. Silica gel ini menghasilkan perbedaan dalam efek pemisahan yang

terganyung kepada cara pembuatannya sehingga silica gel G Merck, menurut

spesifikasi Stahl, yang diperkenalkan tahun 1958, telah diterima sebagai bahan

standar. Selain itu harus diingat bahwa penjerap seperti aluminium oksida dan silica

gel mempunyai kadar air yang berpengaruh nyata terhadap daya pemisahnya (Stahl,

1985).

Fase Gerak KLT

Menurut Rohman (2007), Fase gerak pada KLT yang paling sederhana ialah

campuran 2 pelarut organic karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat

mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.

Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:

1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan teknik yang sensitive

2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak

antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan

3. Untuk pemisahan denga menggunakan fase diam polar seperti silica gel,

polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti

juga menentukan nialai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar

seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metal benzene akan

meningkatkan harga Rf secara signifikan

4. Solute-solut ionic dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut

sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan

perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-

masing akan meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.

Deteksi Bercak

Bercak pemosahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak

berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun

biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak

dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas.

Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan

pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet

terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi, membuat bercak akan terlihat

jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi

indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang

latar belakangnyaa akan kelihatan berfluoresensi (Rohman, 2007).

V. ALAT DAN BAHAN

1) Alat

a) pelat kromatografi

b) selembar kaca

c) penggiling

d) beker gelas

e) pengaduk magnetik

f) gelas ukur

g) pipet tetes

h) penyemprot

i) penggaris

j) pensil

2) Bahan

a) silika gel

b) pelarut etanol

c) larutan ninhidrin

d) larutan Kuprinitrat

e) larutan asam amino (tirosin, fenilalanin, glisin)

f) aquades

VI. PROSEDUR PERCOBAAN

a) Pembuatan Lapis Tipis

Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbang 25

gram Silica gel G dan kocok dengan 50 ml air selama 30 detik di dalam botol

atau Erlenmeyer tertutup. Suspense ini dimasukan kea lat pembuatan lapis tipis

(alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis adalah sekitar 250 mu.

Biarkan lapis tipis ini ditempatnya selama kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh

dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam.

b) Meneteskan Larutan Zat yang Diperiksa

Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5;0;2,0 μg dalam 0,5μl,

diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1,5 cm dari tepi bawah. Jika banyak

macam zat yang akan diselidiki, maka ini dapat diteteskan berjajar dengan

jarak kira-kira 8 mm antara dua zat atau kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi.

Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati sekali agar permukaan lapis tidak

rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan larutan

tersebut, sebelumnya diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna

mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak

akan banyak mempengaruhi bentuk noda.Sebelum eluen dijalankan maka

tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering.

c) Ruang Kromatografi

Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan

eluen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya

terendam sampai di bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding

ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen.Ini

suapaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen.

d) Cara Melakukan Elusi

Plat-plat yang telah ditetesi asam-asam amino dan yang telah kering,

dimasukkan ke dalam ruang kromatografi.Disini yang dipakai adalah

kromatografi mendaki.Hendaknya suhu dibuat tetap.Kromatografi

diberhentikan setelah eluen berjalan sekitar 10 cm. pada batas ini semula diberi

tanda garis dengan ujung pensil yang runcing. Plat diambil dan dikeringkan

pada suhu kamar.

e) Cara Pewarnaan

1. Dengan hati-hati plat disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang

ditambahkan (lihat pada bab bahan) dimasukkan untuk menjaga pH sekitar

5, juga apaila fase gerak yang dipakai bersifat alkali. Selanjutnya plat

dikeringkan pada 60ᵒ selama 30 menit atau pada 110ᵒC selama 10 menit.

Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose.

2. Untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka

plat kemudian disemprot dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab

bahan). Maka akan terjadi ikatan kompleks Cu-ninhidrin yang berwarna.

Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. maka sesudah

disemprot, plat harus dikenakan uap amoniam. Juga plat tidak boleh kena

uap air karena ikatan kompleks tersebut akan terdisosiasi dalam suasan basa

antara pH 7- 9. Walau disosiasi ini reversiberl. Di atas pH 9 disosiasi

tersebut adalah reversible.

VII. HASIL PENGAMATAN

No Asam Amino Rf

1 Glisin 0,91

2 Arginin 0,83

3 Alanin 0,85

VIII. ANALISA DATA

Menghitung harga Rf yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino

dengan jarak yang ditempuh pelarut dari awal hingga garis akhir :

Rf = Jarak yangditempuh senyawa pelarutJarak yang ditempuh sen yawa terlarut

Maka nilai Rf dapat dihitung sebagai berikut :

1. Pada Glisin, Rf =

9,1cm10cm

=0 , 91

2. Pada Arginin, Rf =

8,3 cm10 cm

=0 , 83

3. Pada Alanin, Rf =

8,5 cm10 cm

=0 , 85

IX. PERSAMAAN REAKSI

Reaksi Asam amino dengan Etanol

Reaksi Asam amino dengan Ninhidrin

Reaksi Asam amino dengan Kuprinitrit

X. PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini kami membahas tentang Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

Percobaan ini bertujuan untuk memisahkan asam amino dan mengetahui harga Rf

dari asam amino yang diuji. Sampel asam amino yang dipakai dalam percobaan

adalah asam amino glisin, alanin dan arginin. Pada percobaan ini, kami

menggunakan kaca untuk meletakan lapis tipis. Kaca yang digunakan harus benar –

benar kering dan bebas dari lemak.

Yang berperan sebagai fasa diam adalah silica gel sedangkan yang berperan sebagai

fasa gerak adalah eluen.

Silica gel dibuat pada plat kaca yang benar – benar bersih dari lemak. Setelah

dibuat, silicat gel didiamkan terlebih dahulu selama semalam agar benar – benar

kering sebelum digunakan. Pada proses penetesan sampel yang akan diuji, harus

dilakukan secara hati – hari supaya silica gel tidak robek. Penetesan asam amino

dilakukan dengan jarak 2 cm dari tepi bawah plat kaca dan berjarak 1.5 cm antara

masing – masing sampel asam amino. Setelah dilakukan penetesan, lalu

dikeringkan terlebih dahulu sebelum melakukan elusi.

Pada percobaan KLT ini, eulen yang digunakan adalah etanol 96%. Eulen diisikan

kedalam ruang kromatografi hingga merendam bagian bawah plat yang sebelumnya

telah ditetesi sampel. Perlahan – lahan eulen membasahi lapis tipis. Ketika sudah

mencapai 10 cm, eluen yang berjalan dihentikan, lalu plat lapis tipis dikeringkan.

Pada proses pwarnaan, plat lapis tipis yang telah dikeringkan lalu disemprot oleh

larutan ninhidrin. Tujuannya untuk melihat bercak noda dari jarak asam amino.

Larutan ninhidrin berfungsi untuk melacak jalannya asam amino dengan

menimbulkan warna rose pada asam amino. Setelah disemprotkan plat dikeringkan

kembali.

Warna yang diperoleh dari penyemprotan ninhidrin blum stabil. Untuk

menyetabilkannya maka plat disemprot lagi dengan larutan kuprinitrat. Sehingga

terbentuklah noda yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya Cu-

ninhidrin. Asam amino alanin berwarna merah, arginin berwarna orange dan glisin

berwarna ungu. Dari analisa data yang diperoleh, Rf untuk asam amino glisin

adalah 0.91, Rf untuk alanin adalah 0.85 dan Rf untuk arginin adalah 0.83.

sedangkan menurut teori Rf glisin, alanin dan arginin berturut – turut adalah 0.26,

0.38, 0.20. Dari data yang diperoleh dapat diketahui bahwa antara teori dan praktek

agak berbeda. Hal ini dapat disebabkan oleh :kesalahan praktikan pada saat

membuat lapisan silica gelnya, kesalahan pada pembuatan larutan sampel yang

digunakan, penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta dengan jarak yang

terlalu dekat.

XI. KESIMPULAN

1. Dalam KLT silica gel berperan sebagai fase diam sedangkan eluen (fase

geraknya) adalah etanol.

2. Harga Rf yang diperoleh :

glisisn : 0.91

alanin : 0.85

arginin : 0.83

3. Penggunaan eulen didasarkan dapa jenis asam amino yang diidentifikasi.

4. Penyemprotan larutan ninhidrin tujuannya untuk melihat bercak noda dari jarak

asam amino dan melacak jalannya asam amino dengan menimbulkan warna

rose pada asam amino.

5. Penyemprotan larutan kuprinitrat tujuannya untuk menstabilkan noda – noda

asam amino sehingga terjadi ikatan kompleks Cu-ninhidrin.

XII. DAFTAR PUSTAKA

Andriyani.2011. Kromatografi Lapis Tipis(online).(www. repository.usu.ac.id )

diakses pada 29 Oktober 2013.

Day & Underwood. 1980.Analisa Kimia Kuantitatif  Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga