LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA I
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Disusun Oleh :
Nama : Rizki Triyunita
NIM : 06111010041
Kelompok : 11
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA
JURUSAN PENDIDIKAN MIPA
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
2013
I.NOMOR PERCOBAAN : V (Lima)
II.NAMA PERCOBAAN : KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
III. TUJUAN PERCOBAAN : Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan
KLT dan mengetahui harga Rf asam amino
IV. DASAR TEORI
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber
pada tahun 1983. KLT merupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi
kertas dan elektroforesis. Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan
yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng
kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik.
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak
sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending) (Rohman,2007).
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaanya lebih mudah dan lebih murah
dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga dengan peralatan yang
digunakan, dalam kromatografi ini peralatan yang digunakan lebih sederhana.
Keuntungan kromatografi planar adalah:
1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet
3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
Teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan suatu adsorben yang
disalutkan pada suatu lempeng kaca sebagai fase stasionernya dan pengembangan
kromatogram terjadi ketika fase mobil tertapis melewati adsorben itu. Seperti
dikenal baik, kromatografi lapis tipis mempunyai kelebihan yang nyata
dibandingkan kromatografi kertas karena nyaman dan cepatnya, ketajaman
pemisahan yang lebih besar dan kepekaannya tinggi (Pudjaatmaka, 1994).
Fase Diam KLT
Lapisan dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT
yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Panjang lapisan 200 mm dengan lebar
200 atau 100 mm. Untuk analisis totalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelu
digunakan, lapisan disimpan dalam lingkunga yang baik lembab dan bebas dari uap
laboratorium (Stahl, 1985).
Penjerap yang umum ialah silica gel, aluminium oksida, kieselgur, selulosa
dan turunannya, poliamida, dan lain-lain. Dapat dipastikan silica gel paling banyak
digunakan. Silica gel ini menghasilkan perbedaan dalam efek pemisahan yang
terganyung kepada cara pembuatannya sehingga silica gel G Merck, menurut
spesifikasi Stahl, yang diperkenalkan tahun 1958, telah diterima sebagai bahan
standar. Selain itu harus diingat bahwa penjerap seperti aluminium oksida dan silica
gel mempunyai kadar air yang berpengaruh nyata terhadap daya pemisahnya (Stahl,
1985).
Fase Gerak KLT
Menurut Rohman (2007), Fase gerak pada KLT yang paling sederhana ialah
campuran 2 pelarut organic karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat
mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitive
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak
antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
3. Untuk pemisahan denga menggunakan fase diam polar seperti silica gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti
juga menentukan nialai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar
seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metal benzene akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan
4. Solute-solut ionic dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan
perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-
masing akan meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.
Deteksi Bercak
Bercak pemosahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak
berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun
biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak
dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas.
Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan
pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet
terutama untuk senyawa yang dapat berfluoresensi, membuat bercak akan terlihat
jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi
indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang
latar belakangnyaa akan kelihatan berfluoresensi (Rohman, 2007).
V. ALAT DAN BAHAN
1) Alat
a) pelat kromatografi
b) selembar kaca
c) penggiling
d) beker gelas
e) pengaduk magnetik
f) gelas ukur
g) pipet tetes
h) penyemprot
i) penggaris
j) pensil
2) Bahan
a) silika gel
b) pelarut etanol
c) larutan ninhidrin
d) larutan Kuprinitrat
e) larutan asam amino (tirosin, fenilalanin, glisin)
f) aquades
VI. PROSEDUR PERCOBAAN
a) Pembuatan Lapis Tipis
Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbang 25
gram Silica gel G dan kocok dengan 50 ml air selama 30 detik di dalam botol
atau Erlenmeyer tertutup. Suspense ini dimasukan kea lat pembuatan lapis tipis
(alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis adalah sekitar 250 mu.
Biarkan lapis tipis ini ditempatnya selama kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh
dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam.
b) Meneteskan Larutan Zat yang Diperiksa
Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5;0;2,0 μg dalam 0,5μl,
diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1,5 cm dari tepi bawah. Jika banyak
macam zat yang akan diselidiki, maka ini dapat diteteskan berjajar dengan
jarak kira-kira 8 mm antara dua zat atau kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi.
Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati sekali agar permukaan lapis tidak
rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan larutan
tersebut, sebelumnya diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna
mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak
akan banyak mempengaruhi bentuk noda.Sebelum eluen dijalankan maka
tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering.
c) Ruang Kromatografi
Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan
eluen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya
terendam sampai di bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding
ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen.Ini
suapaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen.
d) Cara Melakukan Elusi
Plat-plat yang telah ditetesi asam-asam amino dan yang telah kering,
dimasukkan ke dalam ruang kromatografi.Disini yang dipakai adalah
kromatografi mendaki.Hendaknya suhu dibuat tetap.Kromatografi
diberhentikan setelah eluen berjalan sekitar 10 cm. pada batas ini semula diberi
tanda garis dengan ujung pensil yang runcing. Plat diambil dan dikeringkan
pada suhu kamar.
e) Cara Pewarnaan
1. Dengan hati-hati plat disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang
ditambahkan (lihat pada bab bahan) dimasukkan untuk menjaga pH sekitar
5, juga apaila fase gerak yang dipakai bersifat alkali. Selanjutnya plat
dikeringkan pada 60ᵒ selama 30 menit atau pada 110ᵒC selama 10 menit.
Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose.
2. Untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka
plat kemudian disemprot dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab
bahan). Maka akan terjadi ikatan kompleks Cu-ninhidrin yang berwarna.
Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. maka sesudah
disemprot, plat harus dikenakan uap amoniam. Juga plat tidak boleh kena
uap air karena ikatan kompleks tersebut akan terdisosiasi dalam suasan basa
antara pH 7- 9. Walau disosiasi ini reversiberl. Di atas pH 9 disosiasi
tersebut adalah reversible.
VII. HASIL PENGAMATAN
No Asam Amino Rf
1 Glisin 0,91
2 Arginin 0,83
3 Alanin 0,85
VIII. ANALISA DATA
Menghitung harga Rf yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino
dengan jarak yang ditempuh pelarut dari awal hingga garis akhir :
Rf = Jarak yangditempuh senyawa pelarutJarak yang ditempuh sen yawa terlarut
Maka nilai Rf dapat dihitung sebagai berikut :
1. Pada Glisin, Rf =
9,1cm10cm
=0 , 91
2. Pada Arginin, Rf =
8,3 cm10 cm
=0 , 83
3. Pada Alanin, Rf =
8,5 cm10 cm
=0 , 85
IX. PERSAMAAN REAKSI
Reaksi Asam amino dengan Etanol
Reaksi Asam amino dengan Ninhidrin
Reaksi Asam amino dengan Kuprinitrit
X. PEMBAHASAN
Pada percobaan kali ini kami membahas tentang Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Percobaan ini bertujuan untuk memisahkan asam amino dan mengetahui harga Rf
dari asam amino yang diuji. Sampel asam amino yang dipakai dalam percobaan
adalah asam amino glisin, alanin dan arginin. Pada percobaan ini, kami
menggunakan kaca untuk meletakan lapis tipis. Kaca yang digunakan harus benar –
benar kering dan bebas dari lemak.
Yang berperan sebagai fasa diam adalah silica gel sedangkan yang berperan sebagai
fasa gerak adalah eluen.
Silica gel dibuat pada plat kaca yang benar – benar bersih dari lemak. Setelah
dibuat, silicat gel didiamkan terlebih dahulu selama semalam agar benar – benar
kering sebelum digunakan. Pada proses penetesan sampel yang akan diuji, harus
dilakukan secara hati – hari supaya silica gel tidak robek. Penetesan asam amino
dilakukan dengan jarak 2 cm dari tepi bawah plat kaca dan berjarak 1.5 cm antara
masing – masing sampel asam amino. Setelah dilakukan penetesan, lalu
dikeringkan terlebih dahulu sebelum melakukan elusi.
Pada percobaan KLT ini, eulen yang digunakan adalah etanol 96%. Eulen diisikan
kedalam ruang kromatografi hingga merendam bagian bawah plat yang sebelumnya
telah ditetesi sampel. Perlahan – lahan eulen membasahi lapis tipis. Ketika sudah
mencapai 10 cm, eluen yang berjalan dihentikan, lalu plat lapis tipis dikeringkan.
Pada proses pwarnaan, plat lapis tipis yang telah dikeringkan lalu disemprot oleh
larutan ninhidrin. Tujuannya untuk melihat bercak noda dari jarak asam amino.
Larutan ninhidrin berfungsi untuk melacak jalannya asam amino dengan
menimbulkan warna rose pada asam amino. Setelah disemprotkan plat dikeringkan
kembali.
Warna yang diperoleh dari penyemprotan ninhidrin blum stabil. Untuk
menyetabilkannya maka plat disemprot lagi dengan larutan kuprinitrat. Sehingga
terbentuklah noda yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya Cu-
ninhidrin. Asam amino alanin berwarna merah, arginin berwarna orange dan glisin
berwarna ungu. Dari analisa data yang diperoleh, Rf untuk asam amino glisin
adalah 0.91, Rf untuk alanin adalah 0.85 dan Rf untuk arginin adalah 0.83.
sedangkan menurut teori Rf glisin, alanin dan arginin berturut – turut adalah 0.26,
0.38, 0.20. Dari data yang diperoleh dapat diketahui bahwa antara teori dan praktek
agak berbeda. Hal ini dapat disebabkan oleh :kesalahan praktikan pada saat
membuat lapisan silica gelnya, kesalahan pada pembuatan larutan sampel yang
digunakan, penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta dengan jarak yang
terlalu dekat.
XI. KESIMPULAN
1. Dalam KLT silica gel berperan sebagai fase diam sedangkan eluen (fase
geraknya) adalah etanol.
2. Harga Rf yang diperoleh :
glisisn : 0.91
alanin : 0.85
arginin : 0.83
3. Penggunaan eulen didasarkan dapa jenis asam amino yang diidentifikasi.
4. Penyemprotan larutan ninhidrin tujuannya untuk melihat bercak noda dari jarak
asam amino dan melacak jalannya asam amino dengan menimbulkan warna
rose pada asam amino.
5. Penyemprotan larutan kuprinitrat tujuannya untuk menstabilkan noda – noda
asam amino sehingga terjadi ikatan kompleks Cu-ninhidrin.
XII. DAFTAR PUSTAKA
Andriyani.2011. Kromatografi Lapis Tipis(online).(www. repository.usu.ac.id )
diakses pada 29 Oktober 2013.
Day & Underwood. 1980.Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga
Recommended