-
1Compartimientosde la va secretora
El transporte de protenas entre compartimientosrequiere de la
gemacin, translacin y fusin de estructuras membranosas.
Microscopa electrnica
Lodish et al. MCB 1999
-
2El retculo endoplsmico (RE) es el compartimiento de entrada de
protenas a la va secretora
El RE se extiende por toda la clula. Delimita un espacio
denominado lmenque ocupa > 10% del volmen de la clula, y que es
continuo con el espacioentre las dos membranas de la envoltura
nuclear.
La red de tbulos puede visualizarse por inmunofluorescencia (A)
o mediante compuestos lipoflicos fluorescentes como la rodamina
hexil ester (B).
Voeltz et al., EMBORep 2002
El RE consiste en una red de tbulos y sacos membranosos
interconectados
A B
(video disponible)
-
3La estructura y dinmica del RE puede examinarse en clulas
vivasempleando protenas fusionadas a GFP
La PTP1B es una fosfatasa asociada al RE por su terminal
carboxilo. Debajo se visualiza el RE en una clula transfectada con
un cDNA que codifica para la PTP1B fusionada a la GFP.
GFP
PTP1B
ERlmen
citosol
-
4La observacin de las clulas vivas requiere de un
cuidadosocontrol de las condiciones experimentales
microscopio invertido equipado para fluorescencia, con cmara de
incubacin que permite mantener constante la temperatura y el
CO2
-
5Waterman-Storer & Salmon, CB 1998
Los microtbulos contribuyen a la organizacin espacial del RE
microtbulos RE superposicin
Anlisis de la codistribucin y dinamismo de microtbulos y retculo
endoplsmico en clulas vivas. Debajo semuestra una clula
microinyectada con tubulina conjugada a rodamina la cual se
incorpora en microtbulos (en rojo). El RE se visualiza incubando
las clulas con el compuesto lipoflico fluorescente DiOC6 (en
verde).
Las flechas blancaslargas sealan lacolocalizacin de MTs y RE.
Las flechas amarillassealan el margen de la clula.
Los tbulos del RE se extienden hacia la periferia celular
empleando dos mecanismos diferentes: 1) asociacin con molculas
motoras que se desplazan sobre los microtbulos en direccin del
extremo (+)2) unin a complejos proteicos localizados en los
extremos (+) de los microtbulos en fase de crecimiento
(video disponible)
-
6"photobleaching" es la fotodestruccin de la fluorescencia
emitida por un fluorforo (ej. el de la protena GFP). Usualmente se
logra con un laser.
Experimentalmente se registra la intensidad de la
fluorescenciadentro de una regin definida de la clula en funcin del
tiempo, antes y despus de la fotodestruccin de la
fluorescencia.
i
n
t
e
n
s
i
t
y
time
El perfil de recuperacin de la intensidad defluorescencia revela
la cintica de difusin dela molcula fluorescente y su particin en
compartimientos mviles e inmviles.
La tcnica de FRAP permite visualizar la dinmica de protenas en
el RE
tiempo
FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching
100%
f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
molculamas dinmica
-
7Cambios en la movilidad de VSVG-GFPrevelados por FRAP
VSVG es una glicoprotena viral que se expresa enla membrana
plasmtica de las clulas infectadas.La tcnica de FRAP revela su lta
movilidad durantesu trnsito por el RE (paneles de la
izquierda).
(Nehls et al, Nature CB2000)
la ventana muestrala regin de fotodestruccin de la
fluorescenciacon el lser
VSVG-GFP VSVG-GFP + Tunicamicina
100% de recuperacinde la fluorescencia
40% de recuperacinde la fluorescencia
(videos disponibles)
La inhibicin de la glicosilacin de VSVG en el RE con la droga
tunicamicina (TM) provoca su agregaciny retencin en el RE (paneles
de la derecha).
-
8Lippincott-Schwartz et al, Science 2003
La tcnica de FLIP permite analizar la movilidad y continuidad
del compartimiento donde se halla la molcula fluorescente
Ciertas variantes de GFP slo se tornan fluorescentes al ser
fotoactivadas con un pulso de energa UV. Asi, la movilidady destino
de las molculas fluorescentes puede ser examinado
independientemente de la sntesis de novo.
la intensidad de la fluorescencia total disminuye como
consecuencia del pasajede molculas fluorescentes por la ventana de
fotodestruccin definida.
Experimentalmente se registra la intensidad de la fluorescencia
de toda la clula en funcin del tiempomientras se fotodestruye
continuamente la fluorescencia dentro de una regin definida
(rectangulo en rojo).
la intensidad de la fluorescencia dentro de la ventana de
fotoactivacin disminuye como consecuencia de la difusin de las de
molculas fluorescentes.
ventana de fotodestruccin
-
9La tcnica de FLIP revela la localizacin de KDEL-GFP en
compartimientos discontnuos
Nehls et al NCB2000
Las protenas solubles residentes del RE (ej. BiP) escapan al
cis-Golgi como consecuencia del transporte vesicular y luego son
retornadas al RE por transporte retrgrado. Estas protenas poseen la
secuencia KDEL que acta como una seal de recuperacin al RE.
Los paneles superiores muestran que la fotodestruccin solo
elimina la fluorescencia de KDEL-GFP del RE (compartimiento
continuo) pero no de las vesculas de transporte entre el ER y Golgi
(flechas). Los panelesinferiores muestran que la fluorescencia de
VSVG-GFP localizada en el RE es completamente eliminada.
fotodestruccin
-
10
La cintica del transporte de protenas en la va secretora puede
analizarse por microscopa
Microscopa de fluorescencia de clulas en cultivo que expresan
una variante mutada termosensible de la protena viral de membrana
VSVG-ts fusionada a GFP. La incubacin de las clulas a 40C provoca
la retencin de VSVG-ts en el RE. Cuandola temperatura se baja a
32C, la VSVG se pliega correctamente y se transporta hacia la
superficie. Debajo se muestra la localizacin de la VSVG-GFP a
distintos tiempos despus de comenzar la incubacin a 32C.
Hirschberg et al JCB 1998; Lippincott-Schwartz Hist. Cell Biol
2001
ER Golgi membrana plasmtica
fusion de vesculas con la membrana plasmtica (flechas)
videos disponibles
-
11
La cintica del transporte tambin puede analizarse
bioquimicamenteempleando endoglicosidasas especficas
la endoglicosidasa D remueve selectivamente oligosacridoscon
alto contenido en manosacaractersticos del Golgi. Losprecursores
del RE no soneficientemente clivados por laendoglicosidasa D.
Clulas que expresan la mutante termosensible de la VSVG fueron
marcadas con un pulso de aminocidos radioactivos. A distintos
tiempos despus del marcado se prepararon extractos celulares y se
incubaron conendoglicosidasa D. Los productos proteicos son
analizados en geles de poliacrilamida por fluorografa.
pasaje al Golgi
VSVG retenida en el RE
incremento de VSVG en el Golgi
Lodish et al. MCB 2004
-
12
Anlisis de eventos de exocitosis mediante epifluorescencia y
TIRF en clulas vivas
vesculas visualizadas por epifluorescencia (rojo) y TIRF (verde)
de clulas transfectadas con VSVG-YFP. Cuando la vescula se fusiona
a la MP incrementa la fluorescencia de TIRF la cual difunde
post-fusin (flechas).
Toomre et al JCB2000
epifluorescencia
TIRF
TIRFM: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (mas
sobre TIRF en clase de citoesqueleto I)
videos disponibles
parte de una clula visualizada simultaneamentemediante
epifluorescencia convencional y TIRF
-
13
El anlisis gentico en levaduras permiti identificar genes claves
involucrados en el trfico intracelular
Mutantes condicionales sensibles a la temperatura (denominadas
mutantes sec) se clasifican en diferentes clases de acuerdo a la
etapa del transporte afectada en los fenotipos mutantes.
Lodish et al. MCB 2004
El anlisis de doble mutantes revela la secuencia de eventos en
la va secretora.
-
14
Retculo endoplsmico rugoso (RER)
-
15
Higy et al. Biochem. 2004
La secuencia seal o secuencias de insercin determinan la
topologa de las protenas en la membrana el RE
La topologa de una protena de membrana describe el nmero de
veces que la cadena polipeptdica atraviesa la membrana y la
orientacin de los dominios de transmembrana.
lmendel RE
citosol La orientacin de la secuencia seal y de los dominios de
transmembranadepende bsicamente de 3 factores:1) residuos bsicos
que flanquean la
secuencia hidrofbica,2) estructura del terminal amino,3)
hidrofobicidad y largo de la regin
hidrofbica.
-
16
Topologa de protenas de membrana tipo I
El terminal carboxilo de la protena permanece en el citosol. La
secuencia seal se orientacon el N-terminal hacia el citosol. Es
clivada durante la translocacin.Ej: receptor de la insulina, EGFR,
PDGFR, integrinas, caderinas
Una secuencia interna hidrofbica cerca del terminal carboxilo
acta comosecuencia de parada de la translocacin y de insercin a la
membrana.
Cooper, The Cell 2000
citosol
-
17
Protenas de tipo II.El terminal aminopermance en el citosol.Ej:
receptor de transferrina, sialil transferasa de Golgi.
Una secuencia hidrofbica interna acta comosecuencia seal, de
detencin de la translocaciny de insercin a la membrana. Su
orientacines similar a la de las protenas de tipo I.
Protenas con secuencia seal no clivable: Tipo II y III
Cooper, The Cell 2000
Protenas de tipo III.El terminal carboxilopermanece en el
citosol.Ej: citocromo P450.Una secuencia hidrofbica interna,
cercanaal terminal amino, acta como secuencia seal, de parada de la
translocacin y de insercinen la membrana. La orientacin de esta
secuenciaes opuesta a las de protenas de membrana tipo I.
-
18
las protenas de tipo IV poseen varios segmentos de
transmembrana
Protenas de tipo IV
Cooper, The Cell 2000
La primer secuencia hidrofbica interna cercana al terminal amino
acta como secuencia seal y de insercin en la membrana; la segunda
secuencia hidrofbica acta como secuencia de parada.
ejemplos de protenas de tipo IV: receptores acoplados a protenas
G (receptor -adrenrgico, transportador de glucosa GLUT1, sec 61,
etc.
-
19
bicapa
ER lumen
citosol
Algunas protenas se anclan a la hemicapa ectoplsmica de la
membranaplasmtica por un glicosil fosfatidil inositol (GPI)
Las protenas ancladas a membrana por GPI se insertan
inicialmente en la membrana del RE como protenas de tipo I. Una GPI
transamidasa cliva el dominio de transmembrana y transfiere el
polipptido restante a un grupo GPI preformado.Las protenas ancladas
por GPI son muy mviles en el plano de la membrana.
-
20
Enzimas asociadas a la cara citoslica de la membranadel RE liso
sintetizan fosfolpidos
La insercin de cido fosfatdico en la hemicapa citoslica del RE,
catalizada por una acil transferasa (etapa 1),contribuye al
crecimiento de la membrana. La adicin del grupo polar o cargado es
catalizado por otrasenzimas asociadas. La sntesis de fosfatidil
serina, etanolamina y fosfatidil inositol ocurre de manera
similar.
Alberts et al, MBC 2002
hemicapa
hemicapa
-
21
Las enzimas scramblasa y flipasa catalizan la translocacin de
fosfolpidos
La enzima mezcladora scramblasa del RE equilibra los fosfolpidos
en ambas hemicapas de la membrana. La enzima flipasaen la membrana
plasmtica cataliza la translocacin de fosfolpidos especficos,
generando asimetra en la distribucin lipdica.
Alberts et al, MBC 2002
PS, PE
-
22
En su trnsito por la va secretora los polipptidos
experimentandiversas modificaciones antes de alcanzar sus destinos
finales:
formacin de puentes disulfuro plegado (estructura terciaria y
cuaternaria) glicosilacin maduracin proteoltica
Varias familias de chaperonas asisten en el plegado de los
polipptidos internalizados en el RE:
- Hsp70 (ej. BiP)- Hsp40- Hsp90- peptidil-prolil isomerasas-
disulfuro isomerasa- calnexina y calreticulina
RE
Post-GolgiRE y Golgi
-
23
La formacin y rearreglo de puentes disulfuro en las protenases
catalizado por la enzima disulfuro isomerasa (PDI)
El lmen del RE es un ambiente oxidante que favorece la formacin
de puentes disulfuro. La enzima PDI posee dos cistenas en su sitio
activo que son rpidamente interconvertidasentre su forma oxidada,
formando un puente disulfuro, y su forma reducida (di-tiol).
Lodish et al. MCB 2004
-
24
La rotacin de los polipptidos en las uniones peptdicas que
preceden a prolinas es catalizada por
peptidil-prolil-isomerasas
N
C
-
25
BiP, calnexina y calreticulina contribuyen al plegado del
polipptido de diferentes maneras
Lodish et al. MCB 2004
La chaperona Bip se une a regiones hidrofbicas del polipptido y
evita su agregacin. Las chaperonas Calnexinay Calreticulina
reconocen regiones glicosiladas (monoglucosiladas) y contribuyen a
monitorear el plegado del polipptido.
-
26
En protenas N-glicosiladas, oligosacridos de 14 residuos se
transfierena la cadena naciente en un proceso co-traduccin
La enzima oligosacaril transferasa, asociada a la cara luminal
del RER, transfiere el oligosacridoprecursor a residuos asparagina
en la secuenciaAsn-X-Ser/Thr del polipptido naciente.
Lodish et al. MCB 2004
La glicosilacin incrementa la solubilidad de las protenas,
inhibe la agregacin y estabiliza la conformacin del polipptido.
-
27
El oligosacrido precursor se sintetiza en el citosol asociado al
dolicol,un lpido poli-isoprenoide inserto en la membrana del RE
Enzimas asociadas a la membrana del RE, catalizan a partir de
nucletido-azcares, la sntesis del oligosacrido precursor. La
tunicamicina es una droga que inhibe a la enzima de la primer
reaccin.
Lodish et al. MCB 2004
-
28
Procesamiento del oligosacrido precursor en el ER
1- transferencia del oligosacrido precursor a la cadena
polipeptdica naciente. 2 y 3- Dos glucosas terminales son removidas
por GI y GII. Calnexina y calreticulina se unen al oligosacrido
monoglucosilado
y facilitan el plegado del polipptido por la accin de las
disulfuro isomerasas y prolil isomerasas.4- La GII eventualmente
remueve la ltima glucosa y el polipptido deglucosilado se disocia
de las chaperonas. El polipptido
puede ser reglucosilado por la glucosil transferasa si aun no
alcanz la conformacin nativa.5- El polipptido que no alcanz la
conformacin nativa es eventualmente demanosilado y exportado al
citosol via EDEM. 6- La protena correctamente plegada no se
re-glucosila y es competente para su exportacin al Golgi.
Lodish et al. MCB 2004
glucosidasa I glucosidasa II
glucosidasa II
glucosil transferasamanosidasa
EDEM
degradacin
glicoprotenaplegada
A Golgi
ismero reconocidopor EDEM para suretrotranslocacin
calreticulin
calnexin
45
oligosacariltransferasa
6
EDEM: ER Degradation Enhancing Manosidase
-
29
Ellgaard et al, Science 1999
Man9
El ciclo de deglucosilacin-glucosilacin actacomo un control de
calidad del plegado
Calnexina y calreticulina retienen a los polipptidos
monoglucosilados en el RE. Glucosidasa II remueve la glucosa
terminal y termina la retencin por calnexina/calreticulina.
Glucosil transferasa (GT) actacomo un sensor del plegado y solo
re-glucosila a polipptidosparcialmente plegados. Estos
sonnuevamente retenidos porcalreticulina o calnexina.
* ERp57 es una disulfuro isomerasa que cataliza la formacin de
puentes disulfuro en el polipptido.
sensor del plegado
-
30
Tsai et al NRMCB2002
EDEM(lectina)
EDEM = ER Degradation Enhancing Manosidase es una lectinade la
membrana del RE que se une a un ismero especfico del oligosacrido
con 8 manosas y lo transfiere al translocon.
Ubiquitin-ligasa
ERAD (ER-Associated Degradation)
ERAD es un proceso que involucra varias etapas:
- seleccin del substrato con defectos en el plegado
("misfolded")- desplegado del substrato y transferencia al
translocn (1)- translocacin del substrato hacia el citosol (2)-
ubiquitinacin y degradacin en el proteosoma (3,4)
El control de calidad esta acoplado a mecanismosde degradacin
asociados al RE (ERAD)
sec61
(man8)
(Man)8(GlcNAc)2
-
31
IRE1 oligomerizacin procesamiento de Hac/XBP1 mRNA sntesis de
chaperonas (ej. BiP) y de EDEM
PERK oligomerizacin fosforilacin de eIF-2 sntesis de
protenas
ATF6 exportacin al Golgi proteasas clivan el TM translocacin al
ncleo sntesis de chaperonas (ej. BiP)
El control de calidad en el RE esta acoplado a mecanismos
adaptativosque disparan una respuesta transcripcional (UPR)
(Unfolded protein response = UPR)
Transmembranesensors
- IRE1- PERK- ATF6
IRE1
PERK
ATF6
Estrs del RE. Es un estado en el cual el influjo de polipptidos
al RE excede su capacidad de plegar y/o procesar los polipptidos.En
ese estado se acumulan protenas mal plegadaso estados
intermediarios y se dispara la respuesta UPR. BiP
BiP
BiP
-
32
1. Ire1 y PERK son protenas de transmembrana del RE capaces de
dimerizar en su porcin luminal. En condiciones normales BiP se une
a la reginluminal y previene la dimerizacin. Durante elde estrs del
RE, BiP se disocia y se favorece la dimerizacin de Ire1 y PERK.
2. El dmero de Ire1 se autofosforila yactiva el dominio de
endoribonucleasa que remueveel intrn en el mRNA de Hac1 (XBP1 en
mamferos).
3. Los dos exones del factor de transcripcin Hac1/XBP1son
ligados y forman un mRNA maduro.
4. El mRNA es traducido en el citosol, Hac1/XBP1 se transloca al
ncleo y activa la transcripcin de genes quecodifican para
chaperonas del RER (ej. BiP) y componentesde la maquinaria de
degradacin (ej. EDEM) .
Lodish et al. MCB 2004
Mecanismo de respuesta transcripcional mediado por IRE1
ATF es una protena de transmembrana de tipo II, que seune a BiP
por el dominio luminal. La disociacin de BiPcomo consecuencia de
estrs, desenmascara secuenciasde localizacin a Golgi en ATF. En
Golgi, el dominio detransmembrana de ATF es clivado y ATF soluble
se transloca al ncleo, activando transcripcin.
-
33
ocurre en sitios discretos, sin ribosomas asociados (tER)
requiere del reclutamiento transitorio de protenas
citoslicas y del ensamble de un complejo multiproteico es en
gran medida un proceso selectivo ocurre en estructuras
tubulo-vesiculares cuyo
movimiento depende de microtbulos
-
34
Existe un transporte bi-direccional de protenas entre el RE y
Golgi. El transporte RE Golgi es mediado por vesculascon cubierta
COP II. El transporte retrgrado Golgi RE esmediado por vesculas con
cubierta de protenas COP I.
cis Golginetwork
Las vesculas que emergen del RE se fusionan formando
estructurastubulo-vesiculares que se tranlocan al cis Golgi por
microtbulos
Debajo se muestra la localizacin de una mutante termosensible de
VSVG-GFP que es retenida en el RE a 40C (A).Cuando la temperatura
se baja a 32C la VSVG-GFP se acumula rpidamente en sitios de
exportacin tER o ERES (B). A tiempos posteriores la protena ya ha
llegado al Golgi (C).
Ellgaard & Helenius, NRMCB 2003
A B C
video disponible (Presley et al 1997)
Los sitios de exportacin del RE, tER o ERES, son subdominios de
la membrana del RE a partir de los cuales emergen las vesculas con
cubierta de COP II.
-
35
El transporte antergrado hacia el Golgi depende de dinenas que
se translocan hacia el extremo (-) de microtbulos
El Golgi (en naranja) poseeuna localizacin perinuclear.
ncleo
Donaldson & Lippincott-Schwartz, Cell 2000
protenas decoatmeros
microtbulos
membranaplasmtica
Las estructuras tubulo-vesiculares emergentes e intermediarias
se unen a dinenasy microtbulos y migran en direccin al centrosoma
de localizacin perinuclear.
-
36
Las protenas cargo de transmembrana son seleccionadas en base
aseales o motivos localizados en sus dominios citoslicos
Bonifacino and Glick, Cell 2004
Las seales de exportacin consisten en motivos de aminocidos
cidos, bsicos o hidrofbicosy son esenciales para su interaccin con
las protenas de la cubierta COP II.
-
37
La exportacin de las protenas cargo solubles ocurre de manera
pasiva o por mecanismos activos
Barlowe, TICS 2003
Se postulan dos modelos de exportacin de protenas cargo solubles
del RE: (a) incorporacin pasiva de protenasen las vesculas COP II;
(b) concentracin activa de las protenas mediada por receptores de
transmembrana. En ambos modelos, las protenas residentes del RE (R)
son diferencialmente retenidas en el lmen de la vescula en
formacin.
Las enzimas amilasa yquimiotripsingeno son ejemplos de
exportacinpasiva (a) cuya concentracin ocurre en el
compartimientotubulovesicular. ERGIC53 es un receptor requerido
para lasecrecin de varias glicoprotenasque responden al modelo de
exportacin (b)
R
Rpasivo,no ocurreconcentracindel cargo
activo,concentracindel cargo
-
38
El proceso de formacin de vesculas con cubierta COP II ocurre de
acuerdo a la siguiente secuencia:
1) Asociacin de la GTPasa Sar1 a la membrana del RE. Este paso
requiere del intercambio del GDP por GTP en Sar1catalizado por la
protena de membrana sec 12 (GEF). Sar1-GTP inserta una alfa hlice
del N-terminal en la membranadel RE e inicia su deformacin.
2) Sar1-GTP recluta las protenas sec23/sec24 las cuales
ensamblan una cubierta que curvan la membrana. Existen al menos 4
isoformas de protenas Sec24 las cuales poseen diferentes sitios de
interaccin para diversas seales deexportacin de protenas de
transmembrana (cargo).
3) La cubierta de sec23-sec24 recluta complejos de protenas
sec13/31 que ensamblan una capa externa y completanla formacin de
la vescula cubierta.
4) Fisin de la vescula y desensamble de la cubierta, evento que
requiere de la hidrlisis del GTP de Sar1 (no mostrado).
Modelo de ensamble de la cubierta de protenas COP IILas protenas
de la cubierta deforman la membrana y seleccionan cargos
Bonifacino & Glick, Cell 2004
1
2
3
-
39
Protenas solubles residentes del RE que escapan al Golgi
retornan al RE por un mecanismo especfico dependiente del
tetrapptido KDEL
La secuencia KDEL esta presente en el terminalcarboxilo de
protenas solubles del RE (ej. BiP).Esta secuencia es reconocida por
un receptor de transmembrana en el medio ligeramente cidodel cis
Golgi. El complejo KDEL/Receptor retornaal RE en vesculas con
cubierta COP I. En el medioneutro del RE el complejo se
disocia.
RE lumenpH ~ 7
cis GolgipH < 7
Lodish et al. MCB 1999
-
40
Ejemplos: KKXX RXREstas seales son requeridas para la
interaccincon protenas COP I que recubren las vesculasde retorno al
RE.
Protenas de membrana residentes del RE poseenseales de retencin
especficas en su tallo citoslico
Las seales de retencin al RE representan mecanismos de control
de calidad. Algunas protenas oligomricas exponen las seales de
retencin en los monmeros pero estas quedan ocultas en la estructura
cuaternaria de los oligmeros (A). En otros casos, la fosforilacin
de serinas adyacentes recluta protenas 14-3-3 que enmascaran la
seal de retencin (B). Algunas protenas de membrana forman complejos
con protenas citoslicas que ocultan la seal de retencin (C).
citosol
RElmen
complejoC
Al Golgicitosol
RElmen
fosforilacinB
Al Golgi
COP Irecuperacinal RE
citosol
RElmen
oligomerizacinA
Al Golgi
COP Irecuperacinal RE
14-3-3
-
41
Modelo de ensamble de cubiertas COP I
1. La GTPasa ARF-GDP se asocia a un receptor asociadoa la
membrana del Golgi que intercambia el GDP por GTP. ARF-GTP se
inserta en la membrana e inicia su deformacin.
2. ARF-GTP recluta complejos protecos del citosol
denominadoscoatomeros y que ensamblan la cubierta COP I. Las
subunidadesde los coatomeros seleccionan las protenas cargo y
tambin unaARF-GAP.
3. La hidrlisis de ARF-GTP mediada por ARF-GAP disparala fisin y
desensamblaje de la cubierta COP I.
Las subunidades de los coatmeros reconocenmotivos en los
dominios citoslicos deprotenas de transmembrana. Ej: KKXX y RXR
ERGIC/VTC y cis Golgi cisterna
ERGIC: ER to Golgi Complex; VTC: Vesicular Tubular ClusterLodish
et al. MCB 1999
3
2
1
-
42
El Golgi es una estructura dinmica y polarizada dondese
procesan, de manera secuencial, glicoprotenas y glicolpidos
GolgiSacos del Golgi en una clulavegetal. Microscopa
electrnica
cis
trans
El Golgi consiste de sacos o cisternas que transportan material
de manera antergrada. Puesto que el Golgi es una estructuradinmica,
en estado estacionario, existe un continuo reflujo de protenas por
transporte retrgrado. El sitio de entrada del Golgise denomina
cis-Golgi, las cisternas intermedias constituyen el medial-Golgi, y
las mas distales, el trans-Golgi. Vesculas y tbulos que emergen del
trans-Golgi forman la red del trans-Golgi (TGN).
principales funciones del Golgi- Modificacin y procesamiento de
carbohidratos en lpidos y protenas- Distribucin y transporte- Sitio
de anclaje de protenas de sealizacin, distribucin y del
citoesqueleto
transporteantergrado transporte
retrgrado
-
43
La inhibicin del flujo de protenas a travs del Golgiprovoca su
desaparicin
Sciaky et al., JCB 1997
La incubacin de clulas con brefeldina A, una droga que inhibe la
exportacin de protenas del RE al Golgipero no el transporte Golgi
RE provoca la reabsorcin del cis-Golgi en el RE. Este efecto se
visualiza filmandola redistribucin de una galactosil transferasa
fusionada a GFP desde el Golgi al RE (fotos debajo).
video disponible
Golgi RE
-
44
manosidasa
manosidasaGlcNAc transferasaGlcNAc transferasa
Gal transferasa
fucosiltransferasa
sialiltransferasa
lisosomalprotein
GlcNAc fosfotransferasa
P
Las distintas cisternas del Golgicontienen una batera de
enzimasque modifican los oligosacridosde las protenas en
trnsito
las glicosil transferasas son protenas de transmembrana, cuyo
dominio catalticointraluminal agrega monosacridos especficosa los
aceptores en trnsito. Cada enzimamantiene una localizacin
intra-Golgi restringida.
Dependiendo de la protena, se observan dos tiposde
N-oligosacridos en las protenas maduras:- oligosacridos con alto
contenido de manosa(similar al precursor que proviene del RE)
- oligosacridos complejos. Resultan de la eliminacin de manosas
y el agregado de GlcNAc,galactosa y cido silico en el
medial/trans-Golgi.
Lodish et al. MCB 1999
-
45
(ER, red delcis Golgi)
(trans Golgi)
(red del trans Golgi)
(motivos en protenas aceptoras:Asn-X-Ser o Asn-X-Thr)
Estructuras de oligosacridosencontradosen glicoprotenas
(trans Golgi)
(red del trans Golgi)
tipos:
O-oligosacridos
N-oligosacridos- alta manosa- complejos
Lodish et al. MCB 1999
-
46
Las estructuras tubulo-vesiculares que emergen del trans-Golgi
forman una red o TGN. Lass vesculas requieren de una
accincoordinada de traccin de la membrana mediada por molculas
motoras asociadas a microtbulos y eventos de fisin mediadapor la
generacin y acumulacin de diacil glicerol. Un aumento descontrolado
del proceso de fisin produce la fragmentacin delGolgi en pequeas
vesculas (b); en contraste, su inhibicin produce la formacin de
largas estructuras tubulares (c).
Bard & Malhotra, ARCDB 2006
-
47
Transporte a lisosomas: Las hidrolasas lisosomales son
direccionadasdel trans-Golgi a endosomas tardos mediante una seal
de M6P
la seal de manosa 6-fosfato es introducida por la GluNac
fosfotransferasadel cis-Golgi. Esta enzima se une a precursores
lisosomales N-glicosiladosreconociendo una seal tridimensional en
la estructura nativa. En unaprimera reaccin la enzima transfiere
GluNac fosfato al carbono 6 de manosas. En un segundo paso otra
enzima remueve la GluNac.
M6P
-
48
Los precursores lisosomales se unen a receptores de M6P en el
trans-Golgi y se empaquetan en vesculas cubiertas con clatrina
Receptores de transmembrana de M6P concentran a los precursores
lisosomales en el trans-Golgi y son empaquetados en vesculas de
clatrina (1). Estas vesculas se fusionan con endosomas tardos donde
el pH cido provoca la disociacindel complejo M6P-receptor (2).
Fosfatasas remueven el fosfato de las M6P. Los precursores
lisosomales se segregan en vesculas de transporte que se fusionan a
lisosomas (3). Los receptores de M6P son retornados al Golgi (4) o,
raramentetransportados a la superficie donde contribuyen a
internalizar precursores lisosomales.
Lodish et al. MCB 1999
1
23
pH 5-5,5
pH 6,5
4
-
49
La Clatrina contribuye a la formacin de vesculas que emergen
dedel trans-Golgi y de la membrana plasmtica
Cada molcula de clatrina consiste de tres subunidades grandes y
tres pequeas. Numerosas molculas de clatrina ensamblan una celda
proteica asociada a la membrana.
video
-
50
Protenas adaptadoras son reclutadas por ARF-GTP a la membranaque
dar origen a vesculas de clatrina
Las protenas adaptadoras cumplen tres funciones esenciales:
- seleccionan las protenas cargo- reclutan molculas de clatrina
a la membrana- interaccionan con protenas accesorias que regulan el
ensamble y desensamble de las protenas de la cubierta (ej.
Arf).
Bonifacino & Traub, ARB 2003
TGN,endosomas
TGN, PM
TGN,endosomas
TGN,endosomas
Las protenas adaptadoras descriptas son monomricas (GGA) o
tetramricas (AP1).
Las protenas adaptadoras asociadas a clatrinareconocen motivos
especficos en los dominioscitoslicos de protenas de transmembrana.
Ej:
NPXY AP2YXX AP1 y AP2LL AP2
-
51
Modelo de formacinde vesculas con clatrina cargo
Arf
(AP)
La formacin de vesculas en el TGN ocurre de acuerdo a la
siguiente secuencia:
1. ARF-GTP se asocia al TGN y recluta complejos de protenas
adaptadoras(ej. AP, GGAs) que a su vez reclutan protenas cargo y
molculas de clatrina.
2. El ensamble de la canasta de clatrina deforma la membrana.3.
Fisin del cuello y formacin de la vescula. Este evento requiere de
la
GTPasa dinamina y de la hidrlisis de GTP.4. Desensamble de la
canasta de clatrina por chaperonas
(hsp70, auxilina), proceso que requiere de hidrlisis de ATP.
-
52
microscopa electrnica
La GTPasa dinamina es esencial para la fisin de vesculas con
clatrina. Este proceso requiere de la hidrlisis del GTP
molculas de dinamina detectadascon un anticuerpo anti-dinamina
unidoa granos de oro coloidal
cuello
-
53
Transporte a la membrana plasmtica: Anlisis por video-microscopa
de fluorescencia en clulas vivas revela
que del TGN emergen vesculas y estructuras tubulares
Hirschberg et al., JCB 1998
Clulas transfectadas con VSVG-GFP. La flecha seala la produccin
de una estructura tubular y la fisin de una vescula del extremo
distal.
video disponible
-
54
En clulas epiteliales polarizadas existen mecanismos selectivos
de transporte de protenas a la membrana apical y basolateral
Algunas protenas apicales de membrana se transportan al dominio
apical por una va directa a partir del Post-Golgi (A, rojo). Otras
protenas se transportan al dominio apical por una va indirecta que
involucra el transporte e insercin en la membranabasolateral y
luego su re-direccionamiento por endocitosis a la cara apical (B,
rojo). Este proceso se denomina transcitosis.
apical
basolateral
The Art of MBC, Garland Publ. 1995
protenas ancladas por GPIy el virus de la influenza
sonmarcadores apicales. El virusVSV, caderinas e integrinasson
marcadores basolaterales.
-
55
Determinantes moleculares que contribuyen al direccionamientode
protenas a los dominios apical y basolateral
seales para localizacin apical y basolateraltipo localizacin de
la seal ejemplos
basolateralYXX..............................citoplasmtica..............VSVG,
caderinasLL/IL................................citoplasmtica..............receptor
de
Fcotras................................citoplasmtica..............TfR,
LDLR
apicalanclaje de
GPI..................membrana..................Thy-1N-oligosacridos...............luminal........................eritropoietinatransmembrana.................membrana..................hemaglutinina
Microdominios (~70 nm dimetro) formados en la membrana del
trans-Golgi y en la membranaapical de las clulas epiteliales,
denominadoslipid rafts, concentran protenas ancladas porGPI y
protenas que poseen un dominio de transmembrana mas largo que el
resto.
-
56
Keller et al, Nature CB 2001
La segregacin de protenas al dominio apical y basolateral
puedevisualizarse empleando protenas fluorescentes
observacin de unplano superficial (A)
A
B
observacin de unplano ecuatorial (B)
Clulas epiteliales polarizadas se transfectaron con cDNAs que
codifican para protenas fluorescentes. A la izquierda se muestra la
localizacin apical de una YFP modificada mediante el agregado de un
ancla de GPI. A la derecha se muestra la localizacin basolateral de
una YFP fusionada a la protena VSVG. Las clulas se observan en dos
planos confocales (A y B).
YFP-GPI VSVG-YFP
A
B
A
B
-
57
Keller et al, Nature CB 2001(video disponible)
Visualizacin de la segregacin de protenas del dominio apical y
basolateral en el Golgi
Clulas transfectadas con CFP-GPI (verde) y VSVG-YFP (rojo). Note
la segregacin de tbulos conteniendo CFP-GPI y VSVG-YFP de la misma
estructura (flechas).
-
58
El dominio apical en clulas epiteliales es equivalente al axnen
neuronas y el dominio basolateral al soma y dendritas
Alberts et al. MBC 2002
VSVGVSVG
HA
HA
influenza virus+ VSV virus influenza virus
+ VSV virus
-
59
Las clulas poseen mecanismos de exocitosis constitutivos y
regulados
Alberts et al. MBC 2002
protenas cuya secrecin es regulada forman agregados en el
trans-Golgicon las protenas cromogranina A y By la secretogranina
II.
-
60
Protein Type Example Site of Synthesis
Constitutive Secretory Proteins
Serum proteins Albumin Liver (hepatocyte) Transferrin (Fe
transporter) Liver Lipoproteins Liver, intestine Immunoglobulins
Lymphocytes Extracellular matrix proteins Collagen Fibroblasts,
others Fibronectin Fibroblasts, liver Proteoglycans Fibroblasts,
others
Regulated Secretory Proteins
Peptide hormones Insulin Pancreatic -islet cells Glucagon
Pancreatic -islet cells Endorphins Neurosecretory cells Enkephalins
Neurosecretory cells ACTH Anterior pituitary lobe Digestive enzymes
Trypsin Pancreatic acini Chymotrypsin Pancreatic acini Amylase
Pancreatic acini, salivary glands Ribonuclease Pancreatic acini
Deoxyribonuclease Pancreatic acini Milk proteins Casein Mammary
gland Lactalbumin Mammary gland
Ejemplos de protenas secretadas en forma constitutiva y
regulada
-
61
Las protenas de secrecin y de membrana frecuentemente requieren
del procesamiento proteoltico en el trans-Golgi para generar la
forma madura
Una familia de endoproteasas denominadaspro-protein convertasas
(PC) y furinas se localizan en la red del trans-Golgi y
clivanpolipptidos despus de la secuencia dibsicaArg-Arg o
Lys-Arg.
-
62
La insulina se secreta de manera regulada en clulas beta del
pncreas
El aumento de glucosa en sangre produce una mayor captacin por
los receptores GLUT2 (1). La degradacin de la glucosa a piruvato
produce ATP (2) el cual induce el cierre de canales de potasio
dependientes de ATP (3). Esto provoca una depolarizacin localizada
de la membrana (4) que induce la apertura de los canales de calcio
dependientesde voltaje (5). El aumento de calcio citoslico dispara
la fusin de vesculas secretoras que contienen insulina (6).
Lodish et al. MCB 2004
-
63
Exocitosis reguladaMicroscopa electrnica de una clula beta del
pncreas endcrino
que exocita vesculas conteniendo insulina
-
64
Exocitosis regulada
Microscopa electrnica de mastocitos antes (A) y despus (B) de
liberar sus grnulos de histamina. La exocitosis es disparada por la
agregacin de los receptores de IgE en su superficie
Secrecin de histamina por mastocitos
-
65
Exocitosis reguladaLas neuronas secretan neurotransmisores en
respuesta a la
llegada de un potencial de accin al terminal axonal
axn
-
66
-
67
Las protenas Rabs y SNARE controlan la especificidad de la fusin
entre membranas del compartimiento donor y aceptor
v-SNARE
t-SNAREs
Las GTPasas Rab-GDP se encuentran en el citosol. El intercambio
del GDP por GTP catalizadopor un GEF induce la asociacin de Rab-GTP
ala membrana de la vescula de transporte. Rab-GTPinteracciona con
receptores en la membrana aceptoraanclando la vescula a la membrana
blanco.
Protenas integrales de membrana denominadasv-SNARE se incorporan
a la vescula durantesu formacin. La fusin requiere de la formacinde
un complejo tetramrico entre v-SNARE, y t-SNAREs.
Eventos posteriores al desensamble de la cubierta
SNARE: Soluble NSF Attachment REceptors
-
68
Los complejos trans-SNARE se forman entre dominios coiled coil
dev-SNARE y t-SNAREs. Los complejos trans-SNARE cumplen dos
funciones: inducir la fusin de las membranas y contribuir a la
especificidad de la fusin. El calcio dispara la fusin.
Posterior a la fusin de las membranas, lasprotenas -SNAP
reclutan a la ATPasa NSFa los complejos cis-SNARE. NSF hidroliza el
ATPy desensambla los complejos cis-SNARE.
v-SNARE
t-SNAREs
NSF: N-ethylmaleimide Sensitive Factor
+ Ca2+fusin
-
69
-
70
Las vesculas cubiertas median transporte de materiales entre
compartimientos. Eventos esenciales son la asociacin de GTPasas al
sitio de emergencia de la vescula, el reclutamiento de las protenas
de la cubierta y la seleccin del cargo.
Lodish et al 2004
-
71
La cubierta se desensambla despus de formarse la vescula.
Lodish et al 2004
Se exponen protenas que determinan la especificidad de la fusin
con receptores en la membrana aceptora.
v/t-SNAREcomplex
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72
Visualizacin del proceso de formacin de vesculas cubiertas.
El ensamble de la cubierta provoca la curvatura de la
membrana.
Microscopa electrnica
Lodish et al 2004
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73
Resumen de tipos de vesculas cubiertas y GTPasas
involucradas
Lodish et al MBC 2004
-
74
Resumen de las propiedades de las cubiertas
proteicasinvolucradas en el transporte vesicular
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75
Resumen de la gnesis, transporte y fusin de vesculas
1. Ensamble de la cubierta. Evento disparado por la asociacin de
una GTPasa (esfera roja) a la membrana del compartimientodonor. Las
protenas cargo y protenas v-SNARE se concentran en la vescula en
formacin.
2. Gemacin. Los componentes externos de la cubierta se ensamblan
en una malla que curva la membrana y forman la vescula.3. Fisin del
cuello entre la vescula y el compartimiento donor. En este evento
intervienen protenas accesorias.4. Desensamble de la cubierta.
Participan chaperonas, fosfoinostidos y GTPasas. Las protenas de la
cubierta son recicladas5. Transporte de la vescula hasta el
compartimiento aceptor mediado por microtbulos y protenas
motoras.6. Anclaje mediado por la interaccin de las GTPasas Rab y
sus receptores. 7. Fusin mediada por la formacin de los complejos
trans-SNARE (v- y t-SNARE + SNAP 25).
Bonifacino & Glick, Cell 2004
