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COMO CONVERTIR A UN INHIBIDOR COMPETITIVO EN

INCOMPETITIVO: EL CASO DE LAS BETANAS ALDEHDO DESHIDROGENASAS

Rosario A. Muoz Clares, ngel G. Daz Snchez, Carmina Montiel

Departamento de Bioqumica, Facultad de Qumica, UNAM, Ciudad Universitaria, CP O4510, Mxico D. F., Mxico.

clares@servidor.unam.mx

Resumen

Las betana aldehido deshidrogenasas (BADHs) son un grupo de aldehdo deshidrogenasas capaces de oxidar con diferente eficiencia a la betana aldehdo (BA) en una reaccin irreversible que tiene como coenzimas a los nicotinamn adenn dinucletidos, NAD(P)+. Hasta donde se conoce, su mecanismo de reaccin y su estructura tridimensional son esencialmente iguales a los descritos para otras aldehdo deshidrogenasas (ALDHs). Sin embargo, las propiedades cinticas de aquellas BADHs que han sido caracterizadas a la fecha presentan diferenciasimportantes por sus posibles implicaciones fisiolgicascon las de otras ALDHs. Una de estas diferencias es la inhibicin mixta del NADH frente al NAD

+ encontrada en

las BADHs de plantas, bacterianas y animales, mientras que esta inhibicin es competitiva en la gran mayora de las deshidrogenasas dependientes de NAD(P)

+, incluyendo a las ALDHs. Otra

peculiaridad es que se inactivan reversiblemente si se preincuban con el nucletido reducido o durante el curso de la reaccin, inactivacin esta ltima que es ms rpida cuanto mayor sea la concentracin de sustrato. La estructura tridimensional de la BADH de Pseudomonas aeruginosa en complejo con NADPH mostr la formacin de un aducto entre la nicotinamida del nucletido y el grupo tiol de la cistena cataltica. Pensamos que este aducto, que no ha sido encontrado con anterioridad en ninguna enzima, es la forma inactiva de la PaBADH observada bajo condiciones

catalticascomo el componente incompetitivo de la inhibicin y como la inactivacin durante la reacciny no catalticas. La existencia de dos conformaciones de la Cys cataltica, una que permite que se lleve a cabo la reaccin y otra que permite la formacin de un aducto no activo con el NAD(P)H, explica el que la inactivacin por NAD(P)H ocurra an a concentraciones saturantes de NAD(P)

+. Este mecanismo novedoso permite que un inhibidor como el NAD(P)H

que por razones estructurales debera ser exclusivamente competitivo con respecto al NAD(P)

+posea un componente incompetitivo en su inhibicin, es decir no slo disminuya la

Bustos Jaimes I, Castaeda Patln C, Rendn Huerta E, Reyes Vivas H, Romero lvarez I, (eds). Mensaje Bioqumico, Vol XXXIII. Depto de Bioqumica, Fac de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Cd Universitaria, Mxico, DF, MXICO (2009). (http://bq.unam.mx/mensajebioquimico)

(ISSN-0188-137X)

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afinidad aparente de la enzima por NAD(P)+ sino que tambin disminuya la Vmax. Tanto el

componente incompetitivo como la formacin del aducto durante la reaccin proveen de vlvulas de seguridad que evitan que una alta velocidad de la reaccin lleve rpidamente al agotamiento del NAD

+. In vivo, la inactivacin transitoria de la enzima por cualquiera de estos dos

mecanismos permitira que el NAD+ consumido en la reaccin de la BADH se regenere por las

reacciones ms lentas que lo reciclan. En el caso de la BADH de plantas ocurre adems el establecimiento de una ruta alterna de liberacin del NADH cuando la BA est a alta concentracin, lo que lleva a que la inhibicin por NADH sea parcial y por tanto se evite no slo el agotamiento del NAD

+ sino tambin que el aldehdo pueda llegar a acumularse y producir

efectos txicos. En conclusin, ciertas propiedades estructurales de las BADHs les permiten tener mecanismos efectivos de control a corto plazo por el nucletido reducido, los cuales probablemente tambin operen en otras ALDHs que los requieran.

Palabras clave: Inhibicin competitiva versus incompetitiva; bases estructurales de la inhibicin por NAD(P)H; inactivacin por NAD(P)H; aducto tiol-nicotinamida; consecuencias fisiolgicas de la regulacin por NAD(P)H.

Abstract

The betaine aldehyde dehydrogenases (BADHs) are a group of aldehyde

dehydrogenases able of oxidizing betaine aldehyde (BA) with different efficiency in an irreversible reaction that uses nicotinamide adenine dinucleotides, NAD(P)

+, as coenzymes. As far as it is

known, their reaction mechanism and three-dimensional structure are essentially the same as those described for other aldehyde dehydrogenases (ALDHs). However, the kinetic properties of the BADHs so far characterized present several differenceswhich may be physiologically relevantwith respect to other ALDHs. One of these differences is the mixed inhibition of NADH against NAD

+ found in the BADHs from plants, bacteria and animals, while this inhibition is

competitive in the majority of the NAD(P)+-dependent dehydrogenases, including the ALDHs.

Another peculiarity is their reversible inactivation after being pre-incubated with the reduced nucleotide, or during the course of the reaction, the latter being faster as the concentration of substrates increases. The Pseudomonas aeruginosa BADH three-dimensional structure in complex with NADPH showed the formation of an adduct between the nicotinamide of the nucleotide and the thiol group of the catalytic cysteine. We propose that this adductwhich so far has not been detected in any other enzymeis the PaBADH inactive form observed under catalytic and non-catalytic conditions. The existence of two conformations of the catalytic cysteine, one that allows the reaction and another that allows the formation of the inactive NAD(P)H-adduct, explains that inactivation by NAD(P)H takes place even at saturating NAD(P)

+

concentrations. This novel mechanism adds an uncompetitive component in the inhibition of NAD(P)H against NAD(P)

+, an inhibition that should be strictly competitive for structural reasons.

In other words, NAD(P)H not only decreases the apparent affinity of the enzyme for NAD(P)+ but

also decreases Vmax. Both the uncompetitive component of the inhibition and the enzyme inactivation during the reaction provides the enzyme with a security valve that prevents the exhaustion of NAD(P)

+ when the reaction velocity is high. In vivo the transitory inhibition of the

enzyme for any of these two mechanisms would allow the recycling of the NAD(P)+ consumed

during the BADH reaction. In the case of the chloroplastic BADH, a new route of NADH release is established at high concentrations of BA. As a consequence, the inhibition by the reduced nucleotide is partial, and thus not only the exhaustion is prevented of NAD

+ but also the build up

of the toxic betaine aldehyde. In conclusion, our results show that certain structural features of the BADHs are the base for effective short-term regulation mechanisms, which are likely shared by other ALDHs that needs them.

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Keywords: Competititve versus uncompetitive inhibition; structural bases for NAD(P)H inhibition; enzyme inactivation by NAD(P)H; thiol-nicotinamide adduct; physiological implications of the regulation by NAD(P)H.

Diferentes tipos de inhibicin y sus implicaciones fisiolgicas

La inhibicin enzimtica juega un papel fundamental en la regulacin de los flujos metablicos, por lo que es de gran importancia el conocer los efectos que sobre estos flujos tienen los diferentes tipos de inhibidores. Atendiendo a la especie de la enzima a la que se unen, en las reacciones monosustrato los inhibidores se clasifican en competitivos, incompetitivos y mixtos [1]. Los inhibidores competitivos se unen a la enzima libre (E) en competencia con el sustrato y por tanto el sustrato y el inhibidor no pueden estar unidos simultneamente a la enzima (Esquema 1A). Esta inhibicin puede eliminarse a altas concentracin de sustrato relativas a su Km y a la concentracin efectiva de inhibidor presente (es decir, a la concentracin de inhibidor relativa a su Ki). Los inhibidores incompetitivos se unen a la especie de la enzima que ya tiene unido el sustrato (ES) (Esquema 1B), por lo que producen mayor inhibicin a mayor concentracin de sustrato y su mxima inhibicin a saturacin de ste. Los inhibidores mixtos se unen a ambas formas de la enzima y presentan por tanto dos componentes de inhibicin: el competitivo y el incompetitivo (Esquema 1C). Un tipo especial, y no muy frecuente, de la inhibicin mixta es la inhibicin nocompetitiva (Esquema 1D), que se caracteriza porque el inhibidor posee igual afinidad por la enzima libre que por la enzima que ya ha unido al sustrato.

Los inhibidores incompetitivos, o los mixtos que poseen un componente incompetitivo

por muy pequeo que ste sea, son mucho ms efectivos que los inhibidores competitivos en disminuir el flujo a travs de la ruta metablica en la que se encuentre la enzima inhibida. Esto es porquea diferencia de la inhibicin competitivael efecto de la inhibicin incompetitiva no es contrarrestado por la acumulacin de sustrato que sigue inevitablemente a la inhibicin de una enzima. Por el contrario, se favorece a medida que transcurre el tiempo, ya que el sustrato de la reaccin inhibida va acumulndose progresivamente al seguir siendo producido por la reaccin anterior y no consumido en la reaccin de la que es sustrato. Como discute Cornish-Bowden [2], la inhibicin incompetitiva puede llevar a que no se pueda establecer la condicin de estado estacionarionecesaria para cualquier ruta metablicay con ello a la muerte celular. Es por esto que los organismos vivos parecen no usar inhibidores sin salida incompetitivos o mixtos como medio de control metablico. En reacciones con dos sustratos o ms que operan bajo la condicin de estado estacionario es frecuente que se d una inhibicin incompetitiva de algn producto con respecto a alguno de los sustratos, pero estos productos, a diferencia de los inhibidores sin salida, son sustratos de la reaccin siguiente en la ruta metablica y eso controla su concentracin dentro de los lmites impuestos por el flujo en estado estacionario de esta va.

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Esquema 1. Tipos de inhibicin. Formas de la enzima que unen al inhibidor en reacciones monosustrato y patrones de inhibicin mostrados en grficas de dobles recprocos. Inhibicin competitiva (A). Inhibicin incompetitiva (B). Inhibicin mixta (C). Inhibicin no competitiva (D). E = enzima libre; ES = complejo enzima-sustrato. EI = complejo enzima-inhibidor. ESI = complejo enzima-sustrato-inhibidor. Ks = constante de disociacin del sustrato del complejo ES; Kis = constante de disociacin del sustrato del complejo ESI; Kic = constante de disociacin del inhibidor del complejo EI; Kii = constante de disociacin del inhibidor del complejo ESI.

Las betana aldehdo deshidrogenasas

Las betana aldehdo deshidrogenasas (BADHs) son enzimas capaces de oxidar con diferente eficiencia a la betana aldehdo (BA) en una reaccin irreversible que usa como coenzimas a los nicotinamn adenn dinucletidos, NAD(P)+ [3-9] (Esquema 2A). Dentro de la superfamilia de las aldehdo deshidrogenasas existen varias familias de enzimas entre las que destacan, por poseer un mayor nmero de miembros caracterizados bioqumicamente, las ALDH9 bacterianas y animales, las ALDH10 de plantas y las ALDH22 bacterianas [10].

Las BADHs no constituyen un grupo homogneo en lo que respecta a su estado de

oligomerizacin, distribucion subcelular y especificidad de coenzima y sustrato [10]. Debido a que histricamente su actividad se midi con diferentes sustratos (Esquema 2B), en el sistema de clasificacin de enzimas se les han asignado diferentes nmeros: EC 1.2.1.8 (betana

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aldehido deshidrogenasa); EC 1.2.1.5 (E3 ALDH); EC 1.2.1.19 (-aminobutiraldehdo deshidrogenasa) y EC 1.2.1.47 (4-N-trimetilaminobutiraldehdo deshidrogenasa). En general esto refleja adems sus diferentes preferencias por un sustrato, y en consecuencia sus diferentes papeles fisiolgicos que dependen de su origen o distribucin intracelular. Hasta la fecha se ha encontrado que las BADHs participan en: (1) la sntesis del osmoprotector glicina betana (GB) [6,11-13]; (2) la degradacin de colinapor las bacterias que pueden crecer en este compuesto como nica fuente de carbono, nitrgeno y energa [4,14-15]; (3) la degradacin de poliaminas [16]; (4) la sntesis del cido -amino butrico [17] y (5) la sntesis de carnitina [18]. En nuestro grupo de trabajo estamos estudiando las propiedades cinticas y estructurales de las BADHs de cloroplasto (chBADH) de amaranto y espinaca [12,19-27], como ejemplos de las enzimas anablicas que sintetizan glicina betana, y de la BADH del patgeno humano oportunista Pseudomonas aeruginosa (PaBADH) [ 20,28-33], como ejemplo de las enzimas catablicas.

Esquema 2. Reaccin catalizada por la BADHs y sustratos conocidos de estas enzimas. (A) El hidruro del aldehdo se transfiere al C4 del NAD(P)+ en una reaccin irreversible que produce el cido correspondiente y el NAD(P)H. (B) Las enzimas hasta ahora caracterizadas bioqumicamente aceptan a compuestos aldehdos con una carga positiva, ya sea sta en un nitrgeno cuaternario: betana aldehdo (1) o trimetilamino butiraldehdo (2); un azufre ternario: dimetilsulfonio propionaldehido (3); o en un grupo amino: 3 amino propionaldehdo (4) y -amino butiraldehdo (5). Las chBADHs son enzimas dimricas [5,7] que usan exclusivamente al NAD+ [5,7] y

participan en la respuesta al estrs osmticoproducido ste ya sea por dficit de agua (sequa) o por exposicin a suelos hipersalinosque consiste en la sntesis y acumulacin de glicina betana en los cloroplastos. Las plantas que poseen esta capacidad de respuesta son mucho ms resistentes a estas condiciones adversas que aquellas plantas que no acumulan glicina

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betana. Es por esto que desde hace unos aos han habido numerosos intentos de ingeniera metablica para convertir plantas no acumuladoras de glicina betana en plantas acumuladoras, transformndolas con genes de BADH de origen bacteriano [34,35] o vegetal [36-39]. Sin embargo, no se ha logrado que las plantas transformadas acumulen el osmoprotector hasta los niveles que lo hacen las plantas que lo producen naturalmente. Estos fracasos pudieran deberse, entre otras razones, a que las enzimas que se introdujeron no posean las caractersticas cinticas adecuadas para llevar a cabo la sntesis de glicina betana en cantidades tales que permitan su acumulacin. De aqu el inters de conocer las propiedades cinticas de la chBADH que poseen las plantas acumuladoras de GB y las implicaciones fisiolgicas de estas propiedades.

En cuanto a la PaBADH, sta es una enzima tetramrica [21] que cataliza un paso

intermedio del catabolismo de colina o de los precursores de colinaacetilcolina, fosfatidilcolina o fosforilcolina, todos ellos compuestos muy abundantes en los sitios que infecta la bacteria. Al mismo tiempo, provee a la bacteria del osmoprotector glicina betana, importante para resistir el estrs osmtico existente en los tejidos infectados, y de equivalentes de reduccin tanto para el catabolismo (NADH) como para el anabolismo (NADPH), ya que staal igual que la enzima de otras bacterias con capacidad de crecer en colina [14,40]es la nica ALDH conocida que usa con igual eficiencia al NAD+ y al NADP+. El NADPH producido en la reaccin de la PaBADH puede tambin ser necesario para la respuesta de la bacteria al estrs oxidativo, que le impone el organismo infectado como una primera lnea de defensa frente a la infeccin. Debido a las importantes funciones de esta enzima en la fisiopatologa de la bacteria, pensamos que la PaBADH puede ser un enzima clave en el establecimiento y crecimiento del patgeno y un blanco potencial de frmacos. Su inhibicin, adems, llevara a la acumulacin de BA que es un compuesto altamente txico para la bacteria [41]. El diseo o seleccin de inhibidores especficos de la PaBADH que puedan usarse como agentes antibacterianos en la lucha contra P. aeruginosaun patgeno altamente resistente hacia los antibiticos de uso comnrequiere de una caracterizacin cintica y estructural a fondo de esta enzima.

Las peculiares propiedades cinticas de las betana aldehdo deshidrogenasas de cloroplasto y de P. aeruginosa

Hasta donde se conoce, la estructura tridimensional [42, 43] (Fig. 1) y el mecanismo de

reaccin [15] (Esquema 3) de las BADHs son esencialmente iguales a los descritos para el resto de las aldehdo deshidrogenasas no fosforilantes (ALDHs) [44]. Sin embargo, las propiedades cinticas de aquellas pocas BADHs que han sido caracterizadas a la fecha [19, 27, 33, 40] presentan diferenciasimportantes por sus posibles implicaciones fisiolgicascon las encontradas en otras ALDHs. El mecanismo cintico de las chBADH [27], PaBADH [33] y BADH de rin de cerdo [19] es el bi bi secuencial ordenado en estado estacionario caracterstico de las deshidrogenasas dependientes de NAD(P)+ incluyendo a las ALDHs [45], con el nucletido oxidado como el primer sustrato y el nucletido reducido como el ltimo producto. Sin embargo, las BADHs presentan inhibicin mixta del NAD(P)H frente al NAD(P)+ (Fig. 2A), mientras que en el resto de las ALDHs [45], y en la generalidad de las deshidrogenasas dependientes de NAD(P)+ [45-48], esta inhibicin es competitiva. El hallazgo del componente incompetitivo de la inhibicin por el nucletido reducido, que no puede eliminarse a saturacin del nucletido oxidado, llev a la propuesta de que el mecanismo cintico ordenado de las BADHs era de naturaleza Iso, como define Cleland [49]. En este tipo de mecanismos el ltimo producto liberado de la enzima se une a una forma de sta diferente a la que une al primer sustrato de la reaccin. En el caso de las BADHs, el nucletido oxidado y el reducido se uniran a formas diferentes de la enzima que estaran en equilibrio (Fig. 2B).

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Figura 1. Estructura tridimensional de la PaBADH. (A) monmero, mostrando el dominio de unin al nucletido (verde), el dominio cataltico (violeta) y el dominio de oligomerizacin (rojo). (B) Dmero, mostrando la forma en que se asocian dos subunidades por medio de sus dominios de oligomerizacin. (C) Tetrmero, que es la unidad funcional de esta enzima. La figura se hizo con PyMOL [67] usando las coordenadas cristalogrficas del 2ve5.pdb [43].

Esquema 3. Mecanismo qumico de la reaccin catalizada por las BADHs. Paso (1) Acilacin: Despus de que se han unido el NAD(P)+ y la betana aldehdo (BA) al sitio activo de la enzima, ocurre un ataque nucleoflico del grupo tiolato de la cistena cataltica sobre el carbono carbonlico del aldehdo, formndose un intermediario tetradrico covalente (tiohemiacetal). (2) Transferencia del hidruro: en este paso se produce la oxidacin del sustrato por la transferencia del hidruro del tiohemiacetal al C4 del NAD(P)+, formndose un intermediario tetradrico trigonal (tioster). (3) Desacilacin: una molcula de agua realiza un ataque nucleoflico sobre el tioster formando un nuevo intermediario tetrahdrico (tioacetal). (4) Liberacin de los productos: La ruptura del enlace S-C permite la liberacin de la glicina betana (GB) seguida de la del NAD(P)H.

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Figura 2. Inhibicin mixta del NADH frente al NAD+ en las BADHs. (A) Patrn de inhibicin obtenido con la PaBADH. (B) Esquema del mecanismo Iso Bi Bi ordenado en estado estacionario propuesto para las BADHs de cloroplasto [27] y de rin [19]. La forma de la enzima libre que resulta despus de liberarse el nucletido reducido (E) se isomeriza a la forma de la enzima libre que une al nucletido oxidado (E) antes de que empiece un nuevo ciclo cataltico. Otra peculiaridad interesante de la cintica de las BADHs bacteriana y de plantas

estudiadas en nuestro grupo de investigacin es que se inactivan reversiblemente si se preincuban con el nucletido reducido bajo condiciones no catalticas, es decir en ausencia de los sustratos NAD+ y BA. La inactivacin es un proceso dependiente del tiempo y de la concentracin del nucletido (Fig. 3A). Con una cintica de inactivacin bifsica en la que primera fase es muy rpida (Fig. 3B). La inactivacin es un proceso adicional a la inhibicin que stos nucletidos producen (Fig. 3C). La enzima de cloroplasto tambin se inactiva parcial y reversiblemente si se preincuba con BA bajo condiciones no catalticas, es decir en ausencia de NAD+ [C. Mjica-Jimnez, A.G. Daz-Snchez, C. Montiel y R.A. Muoz-Clares, resultados no publicados]. La cintica de estos procesos de inactivacin es consistente con un cambio conformacional de la enzima con una modificacin qumica de sta inducida por el nucletido o por la BA, que ocurre en forma ms lenta que la unin rpida del ligando al sitio activo.

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Figura 3. Inactivacin de la PaBADH por incubacin con NADPH. (A) Cintica bifsica de inactivacin observada por la preincubacin de la enzima en presencia de NADPH a 60 (), 120 () y 200 M (). (B) Fase rpida de la inactivacin observada a los tiempos cortos. (C) Inhibicin por el NADH determinada como la actividad al tiempo cero de incubacin en presencia de las concentraciones del nucletido indicadas. Este valor es el considerado como 100% en la grfica de la inactivacin. Las determinaciones de actividad se hicieron en presencia de la misma concentracin de NADPH que se us en la preincubacin. Las lneas son tericas, resultado del mejor ajuste a una doble exponencial (A y B) o a una hiprbola (C). Y finalmente, pero igualmente interesante, las BADHs estudiadas por nosotros se

inactivan rpidamente durante el curso de la reaccin por el NAD(P)H producido en sta (Fig. 4A) [A.G. Daz-Snchez, C. Montiel y R.A. Muoz-Clares, resultados no publicados]. A concentraciones de NAD(P)+ cercanas a la saturacin slo se consume aproximadamente un 10% del sustrato. El que no se trata de una inhibicin total por el NAD(P)H producido en la reaccin se demuestra porque (1) La adicin de NAD(P)+ y/o BA frescos al medio de reaccin una vez que la enzima se ha inactivado no permite que se reinicie la actividad (Fig. 4A) y (2) la concentracin del nucletido reducido no es capaz de inhibir totalmente a la enzima, si se aade al inicio de una reaccin que se lleva a cabo con concentraciones de sustratos iguales a las que quedan cuando la reaccin se detiene (Fig. 4B). La inactivacin, sin embargo, se debe al NAD(P)H formado durante la reaccin, puesto que se puede revertir si se elimina ste por dilucin en un medio de ensayo fresco, llegndose de nuevo a una segunda inactivacin cuando se alcanza una concentracin de nucletido reducido similar a la alcanzada en la primera reaccin (Fig. 4C). El grado de avance de la reaccin, es decir el porcentaje del sustrato que se consume antes de que se produzca la inactivacin, es menor cuanto ms altas sean las concentraciones iniciales de cualquiera de los dos sustratos (Fig. 4D). El que el grado de avance de la reaccin dependa en forma hiperblica pero inversa de la concentracin de los sustratos es consistente con que esta inactivacin sea el resultado de una reaccin colateral que convierte a un intermediario del ciclo cataltico, E-NAD(P)H, en un complejo abortivo, E*-NAD(P)H (Esquema

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4). La enzima atrapada en la especie E*-NAD(P)H slo puede reincorporarse al ciclo cataltico por disociacin del NAD(P)H, el cual de acuerdo a nuestros resultados no puede ser desplazado de este complejo ni por NAD(P)+ ni por BA. Este mecanismo difiere del mecanismo Iso propuesto anteriormente en que las especies E*-NAD(P)H y E* no forman parte del ciclo cataltico.

Figura 4. Inactivacin de la PaBADH durante la reaccin. (A) Curso temporal de la reaccin obtenido usando una concentracin de sustratos saturante (2 mM NAD+ y 2 mM BA). La reaccin se detiene cuando slo se ha consumido el 10% del NADP+. La flecha indica la adicin de NADP+ y BA a una concentracin final en el medio de ensayo igual a la que haba al tiempo cero de la reaccin. (B) Reversibilidad de la inactivacin. Cuando una enzima que se ha inactivado en la reaccin se diluye 500 veces en un medio de ensayo fresco, se recupera la actividad si ste no contiene NADPH (lnea 1), pero no recupera actividad si contiene NADPH a la misma concentracin que se produjo cuando la reaccin se detuvo (lnea 2). (C) La concentracin de NADPH que mantiene inactiva a la enzima despus de que la reaccin se ha detenido permite una actividad significativa, aunque disminuida, de la enzima si se aade desde el inicio de la reaccin. (D). Dependencia del grado de avance que alcanza la reaccin antes de detenerse de la concentracin inicial de NADP+. La lnea terica es el resultado del mejor ajuste de los datos experiementales a la ecuacin de un hiprbola. El grado de avance mnimo estimado en este ajuste es del 10 %.

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Esquema 4. Mecanismo propuesto para la formacin de la especie inactiva E*-NAD(P)H. La especie E-NAD(P)H, que es un intermediario del ciclo cataltico, puede producir la enzima libre o la especie abortiva E*-NAD(P)H, la que se va acumulando durante el transcurso de la reaccin hasta que toda la enzima queda atrapada en forma de esta especie abortiva y la reaccin se detiene. Si se elimina el NAD(P)H del medio en que est la enzima, se produce la disociacin del NAD(P)H y la isomerizacin de E* a E, reactivndose de esta forma la enzima.

Bases estructurales de las propiedades cinticas de las betana aldehdo deshidrogenasas Los nicotinamn adenn dinucletidos (o nucletidos de piridina), tanto en su forma

oxidada como reducida, se unen en un dominio de las deshidrogenasas que posee una estructura caracterstica conocida como plegamiento Rossmann [50]. En el caso de las ALDHs este plegamiento (Fig. 5A) es ligeramente diferente al clsico descrito para las alcohol deshidrogenasas (Fig. 5B) [51]. Se ha propuesto [52] que esta estructura atpica del plegamiento Rossmann permite al nucletido unido a las ALDHs el poseer una gran flexibilidad conformacional, necesaria para la catlisis. Efectivamente, las estructuras tridimensionales de diferentes ALDHs obtenidas sin y con el nucletido unido han mostrado que la unin de ste no induce un cambio conformacional importante en el sitio activo, slo el rearreglo de algunas cadenas laterales de residuos catalticos [44]. Es el nucletido el que cambia de conformacin durante el ciclo catalticoal pasar de NAD(P)+ a NAD(P)Hpara permitir que la reaccin prosiga [53]. La porcin de la nicotinamida del nucletido reducido debe moverse en el sitio activo una vez que se reduce (Fig. 5C) para permitir el acceso de la molcula de agua hidroltica al enlace tioster que se va a romper y as liberar el producto cido. Ello tiene como consecuencia importantes diferencias entre el NAD(P)+ y el NAD(P)H con respecto a la forma en que su porcin nicotinamida interacciona con los residuos catalticos de las ALDHs, as como con los intermediarios de la reaccin catalizada por estas enzimas. Pero a pesar de estas diferencias, puesto que slo existe un dominio de unin al nucletido por sitio activo de las deshidrogenasas, el nucletido reducido tiene que unirse al mismo sitio que el nucletido oxidado y por tanto la unin de ambos debe ser mutuamente excluyente. De acuerdo con esto, el nucletido reducido debe ser un inhibidor competitivo del nucletido oxidado, el que al saturar a la enzima debe eliminar la inhibicin, en el caso de deshidrogenasas que catalizan reacciones reversibles.

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Figura 5. Sitio de unin del dinucletido a deshidrogenasas dependientes de nicotinamn adenn dinucletidos y conformaciones de stos. (A) Plegamiento Rossmann modificado caracterstico de las alcohol deshidrogenasas (ADHs) obtenido en la PaBADH [43]. (B) Plegamiento Rossmann clsico de las ADHs obtenido en la ADH de hgado de caballo [65]. (C) Sitio de unin del nucletido mostrando la conformacin adoptada por el NADP+ observada en la 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa de humano [54] y la conformacin del NADPH observada en la lactaldehdo deshidrogenasa de E. coli [66]. La figura se hizo con PyMOL [67] usando las coordenadas cristalogrficas de 2ve5.pdb (A); de 2ohx.pdb (B); 2o2q.pdb (NADP+) y 2ilu.pdb (NADPH) (C).

Recientemente se determin la estructura tridimensional de la BADH de Pseudomonas

aeruginosa (PaBADH) con NADPH unido [A.G. Daz-Snchez, L. Gonzlez-Segura, E. Rudio-Piera, A. Martnez-Vzquez y R.A. Muoz-Clares, resultados no publicados], lo que nos permiti conocer que este nucletido forma un aducto con el grupo tiol de la cadena lateral de la cistena cataltica (Fig. 6A), con las caractersticas que se muestran en la Fig. 6B. Este hallazgo confirm los resultados de estudios espectroscpicos realizados en nuestro laboratorio [A.G. Daz-Snchez y R.A. Muoz-Clares, resultados no publicados] que mostraban un cambio en la regin UV del espectro de absorcin del NAD(P)H cuando estaba en presencia de la enzima (Fig. 6C). Con anterioridad se haba encontrado en otra ALDH un aducto formado entre la cistena cataltica y el NADP+ [54] (Figs. 6D y E), aducto que tambin presenta espectros de absorcin caractersticos que nos han permitido detectarlo en la PaBADH (Fig. 6F). De hecho, se conoca de tiempo atrs que el C4 de la nicotinamida del NAD+ era capaz de reaccionar con compuestos tioles de bajo peso molecular [55] y con tioles de protenas [56], formando el tipo de aducto que

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se muestra en la Fig. 6E. Pero en el caso de la nicotinamida reducida del NAD(P)H el C4 ya no es reactivo, por lo que el aducto debe formarse o en el C2 o en el C5 como se muestra en la Fig. 6A y B. La estructura cristalogrfica mostr claramente que es el C2 de la nicotinamida del NADPH el que forma el aducto con el tiol de la cistena cataltica de la PaBADH (Fig. 6A).

Figura 6. Aductos cistena cataltica-NADP(H) en las ALDHs. (A) Estructura del aducto encontrado en el cristal de la PABADH en complejo con NADPH [A.G. Daz-Snchez, L. Gonzlez-Segura, E. Rudio-Piera, A. Martnez-Vzquez y R.A. Muoz-Clares, resultados no publicados]. El enlace covalente entre la cistena cataltica en la conformacin de descanso y el C2 del anillo reducido de la nicotinamida est indicado con una flecha. (B) Esquema de la estructura del aducto PaBADH-NADPH. (C) Cambios en los espectros de absorcin UV de la PaBADH por la unin del NADPH indicativos de la formacin del aducto. (D) Estructura del aducto encontrado en el cristal de la 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa de humano en complejo con NADP+ [54] El enlace covalente entre la cistena cataltica en la conformacin de ataque y el C4 del anillo oxidado de la nicotinamida est indicado con una flecha. (E) Esquema de la estructura del aducto PaBADH-NADH. (F) Cambios en los espectros de absorcin UV de la por la unin del NADP+ indicativos de la formacin del aducto. Las figuras A y D se hicieron con PyMOL [67] usando las coordenadas cristalogrficas de la PaBADH en complejo con NADPH y 2o2q.pdb, respectivamente. Este hallazgo es de gran inters porque constituye la primera demostracin de que los

adenn nicotinamn dinucletidos reducidos pueden formar aductos con el grupo tiol de cistenas de las protenas, pero, sobre todo, porque sugiere las bases moleculares del mecanismo de la inactivacin reversible por el NAD(P)Hque habamos observado cuando incubbamos a las BADHs estudiadas en nuestro laboratorio con estos nucletidos reducidosy el de la inactivacin durante el curso de la reaccin. Esto es porque encontramos que el aducto con el NADPH se forma cuando la cistena est en la conformacin que hemos llamado de descanso (Fig. 6A), mientras que est en la conformacin que llamamos de ataque en el aducto encontrado por otro grupo de investigacin con NADP+ [54] (Fig. 6D). La BA una vez que se une

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al sito activo es capaz de romper el aducto formado por el NAD(P)+ con la cistena en la posicin de ataque [54]. Probablemente ste sea un paso obligatorio de la reaccin, dado que el mecanismo cintico consiste en la unin ordenada del nucletido oxidado seguido de la unin del aldehdo y el aducto se forma muy rpidamente, en un tiempo inferior a 3 ms. Pero la BA no puede romper el enlace del aducto formado por el NAD(P)H con la cistena en la posicin de descanso, ya que este enlace est alejado de su sitio de unin. En cuanto al NAD(P)+, aunque pudiera romperlo formara otro aducto que tambin sera inactivo porque mantendra a la cistena cataltica en la posicin de descanso impidiendo as la formacin del tiohemiacetal con el BA.

Por medio de la formacin de este aducto el NAD(P)H disminuye la concentracin de

sitios activos de la enzima y produce el efecto inhibitorio sobre la Vmax observado como el componente incompetitivo de la inhibicin por estos nucletidos. En los estudios de inhibicin realizados in vitro esta disminucin de sitios activos puede ocurrir rpidamente al inicio de la reaccin en el momento en que el NAD(P)H aadido se une a la enzima. En los ensayos de actividad realizados en ausencia de NAD(P)H aadido en los que observamos inactivacin durante el curso de la reaccin, la disminucin de sitios activos, es decir la inactivacin, ocurrira a medida que la reaccin transcurre y se va produciendo NAD(P)H, lo que llevara a la progresiva acumulacin del aductola especie que hemos nombrado como E*NAD(P)Hy a la completa inactivacin de la enzima cuando toda ella se encuentre como esta especie.

De esta forma se convierte un inhibidor que debe ser competitivo por razones

estructurales en uno mixto que posee un importante componente incompetitivo; es decir, en un inhibidor que no slo disminuye la afinidad aparente de la enzima por su sustrato (aumenta la Km) sino que tambin disminuye la Vmax. Sin embargo, es importante resaltar que aunque el efecto de la formacin del aducto se percibe en los estudios cinticos de velocidad inicial como el componente incompetitivo de la inhibicin mixta, no es ni mecanstica ni cinticamente equivalente. A diferencia de los inhibidores incompetitivos clsicos que son muy efectivos slo a altas concentraciones de sustratolo que no permitira disminuir significativamente la velocidad de la reaccin cuando el NAD+ se est agotandoeste mecanismo es tambin efectivo a bajas concentraciones de NAD+, puesto que se basa en la inactivacin de una parte de la enzima, lo que depende solamente de la concentracin del inhibidor y de la proporcin de enzima libre que exista en la conformacin correcta para formar el aducto con l.

Relevancia fisiolgica de las propiedades cinticas de las betana aldehdo deshidrogenasas

Las inusuales propiedades cinticas de los dos tipos de BADHs estudiados por nosotros

tienen en comn dos cosas: (1) que en ambas enzimas el nucletido reducido es ms eficiente en reducir la velocidad de la reaccinya sea por el componente incompetitivo de la inhibicin mixta o por inactivacin reversible de la enzimaque si se tratara de un inhibidor competitivo, y (2) que estos efectos inhibitorios o inactivantes del NAD(P)H no pueden ser revertidos por el NAD(P)+.

Pero qu importancia fisiolgica puede tener el que el NAD(P)H sea un buen inhibidor y

que NAD+ no pueda eliminar su inhibicin? La respuesta est probablemente en que cualquier reaccin irreversible que use un compuesto de suma importancia para el metabolismo como es el NAD+ o el NADP+ supone un peligro potencial para la clula y debe disponer de mecanismos para su control efectivo a corto plazo. Todas las ALDHs no fosforilantes catalizan reacciones irreversibles, pero en general estn participando en la destoxificacin de aldehdos que se encuentran en pequeas cantidades, ya sean de origen endgeno, es decir producidos por el metabolismo, o exgeno, es decir contaminantes ambientales o resultado del metabolismo de frmacos. Por ello no representan un peligro real para la clula. Sin embargo, las funciones fisiolgicas de las BADHs que participan en la sntesis del osmoprotector glicina betana o en la degradacin de la colinacuando sta es la nica fuente de carbono, nitrgeno y energa para la

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bacteriaimplican un consumo elevado de su sustrato aldehdo y con el del nucletido oxidado. Esto puede llevar a una disminucin importante de las concentraciones de NAD(P)+, o incluso a su agotamiento, si la reacciones que regeneran a los nucletidos oxidados a partir de sus formas reducidas poseen, en conjunto, una velocidad inferior a la de la BADH. Particularmente en el caso del NAD+ esta situacin sera extremadamente peligrosa. Es por ello de suma importancia que las BADHs tengan mecanismos que frenen su actividad en condiciones en las que exista el riesgo de llegar a una concentracin de NAD+ tan baja que pueda comprometer la viabilidad de la clula. La inhibicin o inactivacin por NADH es el freno ms importante que se le puede poner a esta reaccin irreversible para evitar el agotamiento del NAD+, ya que el otro producto de la reaccin, la GB, no inhibe aun a concentraciones muy elevadas [19,27,33]. La incapacidad del producto cido de inhibir la reaccin catalizada por las BADHs es una caracterstica comn de las ALDHs [57-59], cuyas bases estructurales an no estn claras.

Las concentraciones de NADH reducido en la mayora de las clulas son slo un

porcentaje pequeo de las de NAD+ [60,61], por lo que a no ser que la afinidad de la enzima por el NADH sea mucho mayor que por el NAD+lo que no ocurre en las BADHs [62]no podra funcionar como un inhibidor muy efectivo hasta que la concentracin de NAD+ disminuyera hasta niveles que seran peligrosos. Es necesario evitar esta posibilidad, por lo que se requiere que el NADH sea capaz de inhibir en forma efectiva si su concentracin aumenta aun cuando la del NAD+ siga siendo alta y, sobre todo, es necesario que el NADH sea capaz de detener la reaccin si sta est ocurriendo a una velocidad muy alta. Esto es especialmente importante para el caso de la PaBADH cuya kcat es de las ms altas de las ALDHs estudiadas hasta la fecha [33]. Este objetivo se logra por medio de los dos mecanismos descritos, la inhibicin incompetitiva y la inactivacin de la enzima durante la reaccin cuando los sustratos estn cercanos a la saturacin.

Las condiciones fisiolgicas en las que la actividad de las BADHs de P. aeruginosa y del

cloroplasto se desarrolla son bastante diferentes y ello exige diferencias en la regulacin de su actividad. Como discutiremos a continuacin, nuestros estudios hasta el momento nos han permitido conocer y entender en parte cmo las propiedades funcionales y estructurales de estas enzimas se modifican y adaptan para que aun catalizando la misma reaccin se integren a diferentes contextos metablicos.

En el caso de la reaccin NAD+-dependiente de la PaBADH, el componente

incompetitivo de la inhibicin del NADH frente al NAD+ as como inactivacin producida por NADH probablemente no tengan lugar bajo condiciones aerbicas normales en las que haya un aporte suficiente de oxgeno, dado que la bacteria puede regenerar el NAD+ va cadena respiratoria. Pero pueden constituir una importante vlvula de seguridad cuando la regeneracin del NAD+ est comprometida por escasez de oxgeno que obliga a la bacteria a usar una cadena de transporte de electrones ms lenta o por una velocidad muy alta de la reaccin. En cuanto a la reaccin NADP+-dependiente no existe tal riesgo y como adems los niveles de NADP+ y NADPH son muy similares en clulas procariticas [63], el NADPH puede ser un inhibidor efectivo de la reaccin. Es quizs por estas razones el que en la PaBADH la inhibicin del NADPH es competitiva con respecto al NADP+ [33]. Es interesante que esta enzima tiene una afinidad por el NADP+, medida por la Kd, dos veces superior a la que tiene por el NAD

+, por lo que aun cuando la concentracin del NADP+ sea menor que la del NAD+, la reaccin NADP+-dependiente puede llegar a constituir una proporcin significativa de la NAD+-dependiente.

En el cloroplasto la poza del par NAD+/NADH no est en equilibrio con la del par

NADP+/NADPH, por lo que los niveles de NAD+ no se pueden regular mediante las reacciones fotosintticas de asimilacin del carbono. Por ello, en las BADHs de cloroplasto s tene una gran importancia la regulacin a corto plazo por el NADH para evitar el agotamiento del NAD+ intracloroplstico. Pero el riesgo de inhibir a la chBADH es que se acumule BAque est siendo producido activamente bajo condiciones de estrs osmtico por la colina monooxigenasa [64] ya que este aldehdo es altamente txico para la planta [36]. La regulacin a corto plazo de la

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actividad de las chBADHs debe ser tal que evite el agotamiento del NAD+ y al mismo tiempo evite la acumulacin de BA. Probablemente sta es la razn por la queadems de las peculiares propiedades cinticas de la BADH bacteriana ya mencionadasla enzima de cloroplasto presenta una inhibicin parcial por su sustrato BA [25] que conlleva una inhibicin parcial por el NADH. La inhibicin por BA se demostr que se debe al establecimiento de una ruta alterna de liberacin del NADH ms lenta que la ruta que opera a bajas concentraciones del aldehdo [25]. A concentraciones altas, la BA puede unirse al complejo Enzima-NADH formando un complejo ternario no productivo Enzima-NADH-BA del cual puede liberarse el NADH, lo que causa que tanto la inhibicin por sustrato como por NADH sea parcial. Creemos que tanto la inhibicin parcial por altas concentraciones de BA como la inhibicin parcial por NADH son de gran importancia para la enzima de cloroplasto, ya que probablemente en este organelo las reacciones de regeneracin del NAD+ son ms lentas que las que existen en P. aeruginosa y se puede por tanto alcanzar concentraciones tan altas de NADH que de no existir la ruta alterna de la reaccin produciran una inhibicin total y la acumulacin de BA, con los efectos txicos que esto conllevara.

Comentarios finales

Los mecanismos de regulacin a corto plazo aqu descritos de la actividad de las BADHs por el nucletido reducidoen conjuncin con la regulacin por la BA en el caso de la enzima de cloroplastono han sido descritos hasta la fecha para otras enzimas. Estos mecanismos se basan en propiedades estructurales que probablemente comparten muchas otras ALDHs. En el caso de las BADHs la regulacin a corto plazo responde a claras necesidades metablicas.

Agradecimientos Los trabajos de investigacin mencionados del grupo al que pertenecen los autores fueron realizados con el apoyo financiero de CONACYT y DGAPA-UNAM a proyectos de RAMC. Los autores agradecen el valiosos apoyo tcnico de Carlos Mjica-Jimnez en los trabajos de investigacin de nuestro grupo aqu descritos. Referencias 1. Segel, H. I. (1993) Enzyme Kinetics. Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State

Enzyme Systems. Wiley Classics Library Edition, Wiley-Interscience Publication, USA 2. Cornish-Bowden, A. (1999) Fundamentals of Enzyme Kinetics. 1st Ed., Portland Press LTD. UK 3. Rothschild, H. A., Guzman-Barron, E. S. (1954) J. Biol. Chem. 209, 511-523 4. Nagasawa, T., Kawabata, Y., Tani, Y., Ogata, K. (1976) Agric. Biol. Chem., 40, 1743-1749 5. Weretilnyk, E. A., Hanson, A. D. (1989) Arch. Biochem. Biophys. 271, 56-63 6. Falkenberg, P., Strm, A. R. (1990) Biochem. Biophys. Acta, 1034, 253- 259 7. Valenzuela-Soto, E. M., Muoz-Clares, R. A. (1994) J. Plant Physiol. 143, 145-152 8. Guzmn-Partida, A. M., Valenzuela-Soto, E. M. (1998) Comp. Biochem. Physiol. Part B. 119, 485-491 9. Klein, J. R., Handler, P. (1942) J. Biol. Chem. 144, 537-539 10. Julin-Snchez, A., Viveros-Rosas, H., Martnez-Castilla, L. P., Velasco-Garca, R., Muoz-Clares, R.

A. (2007) Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism. Weiner, H. (ed). Indianapolis, USA

11. Petronini, P. G., De Angelis, E. M., Borghetti, P., Borghetti, A. F., Wheeler, K. (1992) Biochem. J., 282, 69-73

12. Vojtchov. M., Hanson, A. D., Muoz-Clares, R. A., (1997) Arch. Biochem. Biophys. 337, 81-88 13. Boch, J., Kempf, B., Schmid, R., Bremer, E. (1996) J. Bacteriol. 178, 5121-5129 14. Smith, L. T., Smith, G. M. (1988) J. Bacteriol., 171, 4714-4717 15. Velasco-Garca, R., Villalobos, M. A., Ramrez-Romero M. A., Mjica-Jimnez, C., Iturriaga, G.,

Muoz-Clares, R. A. (2006), Arch. Microbiol. 185, 14-22 16. Ambroziak, W., Pietruszko, R. (1991) J. Biol. Chem. 266, 13011-13018

Muoz Clares y cols.

47

17. Lin, S. W., Chen, J. C., Hsu, L. C., Hsieh, C. L., Yoshida, A. (1993) Genomics, 34, 376-380 18. Vaz, F. M., Fouchier, S. W., Ofman, R., Sommer, M., Wanders, R. J. A. (2000) J. Biol. Chem. 275,

7390-7394 19. Figueroa-Soto, C. G., Valenzuela-Soto, E. M. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 596-603 20. Velasco-Garca, R., Chacn-Aguilar, V. M., Hervert-Hernndez, D., Muoz-Clares, R. A. (2003) Chem.

Biol. Interact. 143-144,149-158 21. Valenzuela-Soto, E. M., Velasco-Garca, R., Mjica-Jimnez, C., Gaviria-Gonzlez, L. L., Muoz-

Clares, R. A. (2003) Chem. Biol. Interact. 143-144, 139-148 22. Muoz-Clares, R. A., Gonzlez-Segura, L., Mjica-Jimnez, C., Contreras-Daz, L. (2003) Chem. Biol.

Interact. 143-144, 129-137 23. Muoz-Clares, R. A., Mjica-Jimnez, C. (2001) Chem. Biol. Interact. 130-132, 71-80 24. Legaria, J., Rajsbaum, R., Muoz-Clares, R. A., Villegas-Seplveda, N., Simpson, J., Iturriaga, G.

(1998) Gene 218, 69-76 25. Vojtechov, M., Rodrguez-Sotres, R., Valenzuela-Soto, E. M., Muoz-Clares, R. A. (1997) Biochim.

Biophys. Acta. 1341, 49-57 26. Muoz-Clares, R. A., Vojtechov, M., Mjica-Jimnez, C., Rodrguez-Sotres, R. (1997) Adv. Exp. Med.

Biol. 414, 261-268 27. Valenzuela-Soto, E. M., Muoz-Clares, R. A. (1993) J. Biol. Chem. 268, 23818-23823. Erratum in: J.

Biol. Chem. (1994) 269, 4692 28. Velasco-Garca, R., Mjica-Jimnez, C., Mendoza-Hernndez, G., Muoz-Clares R. A. (1999) J.

Bacteriol. 181,1292-1300 29. Gonzlez-Segura, L., Mjica-Jimnez, C., Muoz-Clares, R. A. (2009) Chem. Biol. Interact. 178, 64-69 30. Velasco-Garca, R., Zaldvar-Machorro, V. J., Mjica-Jimnez, C., Gonzlez-Segura, L., Muoz-Clares,

R. A. (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 341, 408-415 31. Gonzlez-Segura, L., Velasco-Garca, R., Rudio-Piera, E., Mjica-Jimnez, C., Muoz-Clares, R. A.

(2005) Biochimie. 87, 1056-1064 32. Gonzlez-Segura, L., Velasco-Garca, R., Muoz-Clares, R. A. (2002) Biochem. J. 361, 577-585 33. Velasco-Garca, R., Gonzlez-Segura, L., Muoz-Clares, R. A. (2000) Biochem. J. 352, 675-683 34. Hlstrom, K. O., Somersalo, S. A., Mandal, A., Palva, T. E., Welin, B. (2000) J. Exp. Bot. 51, 177-185 35. Yilmaz, J. L., Bulow, L. (2002) Biotechnol. Prog. 18, 1176-1182 36. Rathinasabapathi, B., McCue, K. F., Gage, D. A., Hanson, A. D. (1994) Planta 193, 155-162 37. Jia, G. X., Zhu, Z. Q., Chang, F. Q., Li, Y. X. (2002) Plant. Cell. Reports 21, 141-146 38. Rontein, D., Basset, G., Hanson, A. D. (2002) Metabolic. Eng. 4, 49-56 39. Li, Q. L., Gao, X. R., Yu, X. H., Wang, X. Z., An, L. J. (2003) Biotech. Letters 25, 1431-1436 40. Mori, N., Yoshida, N., Kitamoto, Y. (1992) J. Ferment. Bioeng. 73, 352-356 41. Sage, A. E., Vasil, A. I., Vasil, M.L. (1997) Mol. Microbiol. 23, 43-56. 42. Johansson, K., El-Ahmad, M., Ramaswamy, S., Hjelmqvist, L., Jrnvall, H., Eklund, H. (1998) Protein

Sci. 7, 2106-2117 43. Gonzlez-Segura, L., Rudio-Piera, E., Muoz-Clares, R. A., Horjales, E. (2009) J. Mol. Biol. 385,

542-557 44. Steinmetz, C.G., Xie, P., Weiner, H., and Hurley, T.D. (1997) Structure 5, 701-711 45. Vallari, R. C., Pietruszco, R. (1981) Arch. Biochem. Biophys. 212, 9-19 46. Plapp, B.V. (1970) J. Biol. Chem. 245, 1727-1735 47. Plapp, B. V., Mitchell, J. L., Berst, K.B. Chem. Biol. Interact. 130, 445-456 48. Ohshima, T., Misono, H., Soda, K. (1978) J. Biol. Chem. 253, 5719-5725. 49. Cleland, W. W. (1963) Biochim. Biophys. Acta 67, 104-137 50. Rossmann, M. G., Moras, D., Olsen, K. W. (1974) Nature 250: 194-199 51. Liu, Z.J., Sun, Y. J., Rose, J., Chung, Y. J., Hsiao, C.D., Chang, W.R., Kuo, I., Perozich, J., Lindahl, R.,

Hempel, J., Wang, B. C. (1997) Nat. Struct. Biol. 4, 317-326 52. Cobessi, D., Tte-Favier, F., Marchal, S., Azza, S., Branlant G., Aubry, A. (1999) J. Mol. Biol. 290, 161-

173 53. Perz-Miller, S. J., Hurley, T. D. (2003) Biochemistry 42, 7100-7109 54. Tsybovski, Y., Donato, H., Krupenko, N.I., Davies, C., Krupenko, S.A. (2007) Biochemistry 46, 2917-

2929 55. Van Eys, J., Kaplan, N.O. (1957) J. Biol. Chem. 228, 305-314 56. Segal, H., Boyer, P.D. (1953) J. Biol. Chem. 204, 265-281 57. Bradbury, S. L., Jakoby, W. B. (1971) J. Biol. Chem. 246, 1834-1840 58. Satya-Narayan, V., Nair, P.M. (1990) Plant Sci. 71, 159-166 59. Feldman, R.I., Weiner, H. (1972) J. Biol. Chem. 247, 267-272 60. Igamberdiev, A. U., Bykova, V., Lea, P. J., Gardestrm, P. (2001) Physiol. Plant. 111, 427-438 61. Hampp, R., Goller, M., Fllgraf, H. (1984) Plant Physiol. 75, 1017-1021

MENSAJE BIOQUMICO, Vol. XXXIII (2009)

48

62. Schafer, F., Buettner, G. (2001). Free Radic. Biol. Med. 30, 1191212 63. Appleman, J.R., Beard, W.A., Delcamp, T.J., Prendergast, N.J., Freisheim, J.H., Blakey, R.L. (1990). J.

Biol. Chem. 265, 2740-2748. 64. Burnet, M., Lafontaine, P. J., Hanson, A. D. (1995), Plant Physiol. 108, 581-588 65. Al-Karadaghi, S., Cedergren-Zeppezauer, E.S. (1994) Acta Cristallogr. 50, 793-807 66. Di-Costanzo, L., Gomez, G.A., Christanson, D.W. (2007) J. Mol. Biol. 366, 481-493 67. DeLano, W. L. (2002) The PyMOL Molecular Graphics System on the World Wide Web.

http://www.pymol.org/

Semblanza de la Dra. Rosario A. Muoz Clares

Naci en Granada, Espaa, en cuya Universidad realiz sus estudios de licenciatura y doctorado obteniendo las mximas calificaciones. Despus de estancias postdoctorales en las universidades de Kent y Manchester, Inglaterra, se incorpor en 1981 al Departamento de Bioqumica de la Facultad de Qumica de la UNAM, en el que actualmente es Profesora Titular C definitiva de tiempo completo. Es nivel D del PRIDE, investigadora Nivel III del Sistema Nacional de Investigadores y tuvo el nombramiento de Catedrtico UNAM, Nivel II. Ha realizado estancias de investigacin en la Universidad Autnoma de Madrid y en la Universidad de Vanderbilt, en Nashville, EUA. Su quehacer cientfico, que versa sobre la caracterizacin cintica y molecular de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa de plantas, as como

el estudio de la relacin estructura-funcin de la enzima betana aldehdo deshidrogenasa de plantas y bacterias, se ha publicado en 54 artculos cientficos internacionales y 9 nacionales. Cuenta con 400 citas a sus publicaciones. Ha presentado 43 trabajos en congresos internacionales y 67 en congresos nacionales. En la Universidad Nacional Autnoma de Mxico ha impartido 79 cursos curriculares de licenciatura y posgrado; adems, ha asesorado o est asesorando a 15 alumnos de licenciatura y 23 de posgrado y ha formado parte del Comit Tutoral de 67 alumnos de diferentes posgrados nacionales. La comunidad cientfica la ha invitado a impartir 19 conferencias en diferentes congresos nacionales e internacionales. Dentro de la UNAM se ha desempeado o desempea como Coordinadora de la Maestra y Doctorado en Ciencias Bioqumicas en la Facultad de Qumica; Jefe del Departamento de Bioqumica de la Facultad de Qumica; miembro de la Comisin Dictaminadora y del PRIDE de los Institutos de Ecologa, Fisiologa Celular, Biotecnologa, e Investigaciones Biomdicas y como consejera propietaria del CAABYs por la Facultad de Qumica. Fuera de la UNAM, ha pertenecido o pertenece a diferentes Comits de Evaluacin como la Comisin de Premios de la Academia Mexicana de Ciencias, la Comisin Evaluadora Externa del Centro de Investigacin Cientfica de Yucatn y la Comisin Dictaminadora del Centro de Investigacin Cientfica de Yucatn y del Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste, y al Comit de Acreditacin de Evaluadores del rea VI del CONACYT, entre otros.

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