BIOSINTESIS ASAM GLUTAMAT BERBASIS PEMANFAATAN MIKROORGANISME

Posted January 6, 2012 by aguskrisno in Uncategorized. Leave a Comment

Latar Belakang

Untuk keperluan hidupnya, jasad  hidup memerlukan bahan makanan. Juga mikroba, untuk kehidupannya memerlukan bahan-bahan organik dan anorganik yang diambil dari lingkungannya. Biosintesis sebagai salah satu kegiatan jasad hidup di dalam metabolisme, berbeda dengan nutrisi, karena di sini diperlukan sumber energi. Asam glutamat merupakan asam amino yang banyak diproduksi (4 juta ton/tahun). Glutamat sendiri adalah salah satu jenis asam amino non-essensial yang merupakan substansi dasar penyusun protein dan bisa diproduksi sendiri oleh tubuh kita untuk keperluan metabolisme serta ditemukan hampir di dalam setiap makanan yang mengandung protein.

Beberapa jenis makanan yang mengandung glutamat dari alam adalah tomat, keju, saos soya, saos ikan, dan bahkan juga terdapat di air susu ibu (ASI). Asam glutamat biasanya digunakan pada produksi MSG.

Asam glutamat sebagian dapat dihasilkan dengan cara menggunakan mikroba. Berbagai teknik yang telah diketahui dalam pembuatan asam L-glutamat, tapi  memiliki bermacam variasi efisiensi dalam konversi gula menjadi asam glutamat. Dalam semua sistem dan di antara parameter lain, ekskresi asam glutamat oleh sel-sel bakteri memiliki tingkat faktor peleburan.

Pada Abad 21 teknik pembuatan MSG mulai beragam. Menurut “The Encyclopedia of Common Natural Ingredients”  MSG bisa diproduksi dengan menggunakan proses klasik (proses ekstraksi), teknik hidrolisis protein, sintesis kimia, dan fermentasi oleh mikroba. Oleh karena itu dalam blog ini akan dibahas mengenai biosintesis asam glutamat berbasis pemanfaatan mikroorganisme.

Strain Mikrobia

Sebagian besar asam £-Glutamat diproduksi oleh bakteri gram positif yang tidak membentuk spora, non-motil, dan membutuhkan biotin untuk tumbuh.

Tabel. Strain Mikrobia yang menghasilkan Asam £-Glutamat

Genus SpesiesCorynebacterium C. glutamicum,C. lilium, C. callunae, C. herculis

Brevibacterium

B. divaricatum, B. aminogenes, B. flavum,B. lactofermentum, B.saccharolyticum,B. roseum, B. immariophilum, B. alunicum,B. ammoniagenes B. thiogenitalis

Microbacterium M .salicinovolum, M . ammoniaphilum,M . Flavum

var. glutamicumArthrobacter A. globiformis , A. aminofaciens

Kondisi Kultur

1. Sumber Karbon

Bakteri penghasil asam £-Glutamat dapat menggunakan berbagai macam sumber karbon, seperti glukosa, fruktosa, sukrosa, maltosa, ribosa, atau silosa, sebagai substrat untuk pertumbuhan sel dan biosintesis asam glutamat. Konsentrasi biotin pada medium harus benar-benar dikontrol dalam level suboptimal agar memaksimalkan pertumbuhan sehingga diperoleh asam glutamat yang tinggi. Oleh karena itu, bahan baku kaya biotin, seperti molase dari gula bit dan gula tebu, tidak dapat digunakan sebelum ditemukannya pengaruh mediasi biotin pada penisilin dan asam lemak jenuh C16-C18. Asam oleik hanya membutuhkan akumulasi mutan asam £-Glutamat pada medium yang kaya biotin ketika konsentrasi asam oleik terkontrol pada level suboptimal agar pertumbuhan maksimal.

2. Sumber Nitrogen dan Kontrol pH

Medium yang baik untuk fermentasi asam £-Glutamat mengandung nitrogen dengan kadar 9,5 %. Contoh sumber nitrogen yang dapat ditambahkan ke dalam medium adalah amonium klorida atau amonium sulfat. Bakteri yang menghasilkan asam glutamat juga memiliki aktivitas urease yang kuat sehingga urea juga dapat digunakan sebagai sumber nitrogen. Ion amonium berpengaruh pada pertumbuhan sel dan pembentukan produk sehingga konsentrasinya dalam medium harus dikontrol pada konsentrasi rendah.

Tingkat  keasaman  (pH)  medium sangat mudah menjadi asam karena ion amonium terasimilasi dan dihasilkan asam glutamat. Amonia dalam bentuk gas lebih baik daripada basa cair dalam menjaga  pH  pada  level 7-8,  sebagai pH optimum untuk produksi asam £-Glutamat. Amonia dalam bentuk gas berperan sebagai agen pengontrol pH dan sebagai sumber nitrogen serta dapat mengatasi bermacam-macam masalah teknis. Penambahan otomatis gas amonia dapat mengontrol pH dengan tepat. Selain itu, juga mencegah efek  merugikan dari amonia dan pengenceran yang tidak diinginkan pada cairan fermentasi.

3. Faktor Tumbuh

Bakteri penghasil asam £-Glutamat membutuhkan biotin untuk pertumbuhan dan konsentrasinya harus dikontrol agar memperoleh produk yang maksimal. Dampak biotin pada fermentasi asam £-Glutamat sangat erat kaitannya dengan permeabilitas asam £-Glutamat terhadap membran sel.

4. Ketersediaan Oksigen

Biosintesis dari asam glutamat merupakan proses aerob yang membutuhkan oksigen selama proses fermentasinya. Untuk mengoptimalkan produksi, kadar oksigen terlarut harus dijaga pada kondisi optimal. Sel yang melakukan respirasi akan mengkonsumsi oksigen dalam media hanya dalam beberapa detik sehingga oksigen harus disuplai secara terus-menerus untuk menjaga konsentrasi oksigen terlarut.

Akumulasi Produk Lain yang Dipengaruhi oleh Perubahan Kondisi Kultur

1. Asam Laktat dan Asam Suksinat

Brevibacterium flavum yang memproduksi asam glutamat mengakumulasi asam laktat dan asam suksinat ketika dikulturasi dengan jumlah oksigen yang kurang. Saat jumlah suplai oksigen kurang dari kondisi kejenuhan komplet ke berbagai derajat kecukupan kebutuhan oksigen, produk utama berubah dari asam glutamat menjadi asam suksinat kemudian menjadi asam laktat. Lebih dari 30 g  l-1 asam suksinat atau 45 g  l-1 asam laktat dapat mengakumulasi pada 72 h kondisi optimum.

2. Asam α-Ketoglutarat

Suplai oksigen yang cukup dengan ketidakadaan ion amonium pada fermentasi asam £-Glutamat akan menghasilkan akumulasi asam α-Ketoglutarat. Ketika pengontrol pH diubah dari NH4OH menjadi NaOH pada pada akhir fase pertumbuhan, 18 g l-1 asam α–Ketoglutarat terakumulasi pada hasil substrat 0,20 g g l-1 pada pembudidayaan 72 h.

3. Asam £-Glutamin

Asam £-Glutamat diubah menjadi £-glutamin ketika terdapat kelebihan amonium klorida pada kultur pada pH rendah dengan adanya ion seng. Pada medium yang mengandung 40 g  l-1

amonium klorida dan 10 mg l-1 sulfat seng, sel terakumulasi lebih dari 40 l-1 £-Glutamin pada 0,30 g  l-1 sumber karbon.  Konsentrasi tinggi ion amonium pada kondisi pH rendah menghasilkan produksi N -asetil-£-glutamin. Ion seng efektif dalam pengurangan ekskresi N -asetil-£-glutamin dalam akumulasi £-glutamin.

Fisiologi Mikrobia dari Fermentasi Asam £-Glutamat

1. Permeabilitas Membran Sel dan Asam Glutamat dalam Hubungannya dengan Konsentasi Biotin

Biotin merupakan komponen kunci dalam fermentasi asam £-Glutamat. Akumulasi produk asam £-Glutamat. dapat mencapai maksimal ketika konsentrasi biotin dalam keadaan suboptimal. Kelebihan biotin dapat menunjang pertumbuhan sel, namun menurunkan akumulasi asam glutamat. Kandungan biotin untuk mengakumulasi asam glutamat adalah 0,5 pg per gram sel kering. Akan tetapi, adanya kelebihan biotin pada penambahan penicillin diketahui dapat menghentikan formasi cross-links peptidoglikan bakteri pada fase pertumbuhan sehingga memungkinkan sel untuk mengakumulasi asam £-Glutamat dalam jumlah yang besar. Antibiotik lain seperti cephalosporin C , yang menghentikan sintesis dinding sel, juga dapat menggantikan fungsi penisilin. Penambahan asam lemak jenuh C16-C18 maupun  esternya dengan polialkohol hidrofilik selama fase pertumbuhan  juga  memungkinkan sel untuk mengakumulasi asam £-Glutamat dalam medium yang kaya biotin. Penggunaan antibiotik dan asam lemak jenuh C16-C18

ini akan mempermudah suatu industri dengan bahan dasar kaya biotin, seperti gula tebu dan gula bit.

Akumulasi asam £-Glutamat tidak tergantung pada proses biosintesis tapi pada proses ekskresi. Ekskresi asam £-Glutamat sangat berkaitan dengan permeabilitas dinding sel yang terdiri atas kumpulan dari komponen kimia dan fisika dari membran sel. Produksi sel asam £-Glutamat dengan jumlah biotin terbatas atau berlebih dan diolah dengan penisilin ataupun Tween-60 terekskresi intraseluler asam £-Glutamat ketika dicuci dengan larutan buffer fosfat. Sel tidak dapat tumbuh tanpa adanya pengolahan dengan penisilin ataupun Tween-60 meskipun ada biotin

berlebih. Asam amino lain dikeluarkan dari sel bahkan ketika pertumbuhan berlangsung dengan biotin terbatas. Walaupun dengan jumlah biotin terbatas selama ekskresi sel asam £-Glutamat, pemenuhan kebutuhan asam oleik atau penambahan asam lemak jenuh C16-C18 mengandung sedikit fosfolipid dalam membran sel. Di lain sisi, sel dengan kemampuan rendah dalam mengakumulasi asam £-Glutamat pada medium dengan kandungan biotin tinggi akan mengandung lebih banyak konsentrasi membran fosfolipid.

Biotin merupakan kofaktor dari asetil KoA karboksilase, enzim pertama pada biosintesis asam oleik, dan asam lemak jenuh C16-C18 menghambat biosintesis pada asam oleik dengan menahan asam karboksilase asetil KoA. Jumlah biotin ataupun asam lemak jenuh C16-C18 yang terbatas dapat menyebabkan biosistesis asam oleik berjalan tidak sempurna dan menghasilkan penurunan konsentrasi fosfolipid. Akibatnya, fosfolipid seperti kardiolipin dan phosphatidynositol dimannoside dibutuhkan dalam pengaturan permeabilitas sel asam £-Glutamat.

Pengaruh penisilin pada permeabilitas asam £-Glutamat tidak dapat dijelaskan dengan kandungan fosfolipid pada membran sel. Permeabilitas pada sel dengan penisilin dipengaruhi oleh tekanan osmosis. Selama terjadi penurunan tekanan osmosis, penisilin meningkatkan ekskresi asam £-Glutamat dalam medium kaya biotin dan studi mikroskopik menunjukkan bahwa penisilin meningkatkan masa elongasi dan pembesaran sel. Sementara itu, asam lemak jenuh C16-C18 meningkatkan ekskresi asam £-Glutamat dalam medium kaya biotin tanpa tergantung pada tekanan osmosis. Berdasar hal tersebut, penisilin mempunyai pengaruh sekunder terhadap fungsi membran. Utamanya, penisilin menghambat sintesis dinding sel sehingga membran sel lebih mudah rusak.

2. Mekanisme Biosintesis Asam £-Glutamat

Produksi asam £-Glutamat membutuhkan dua enzim penting, yaitu Phosphoenol  Carboxylase dan α-Ketoglutarate Dehydrogenase. Phosphoenol Carboxylase  akan mengkatalis karboksilasi dari fosfofenol piruvat ke dalam bentuk oxaloasetat. Sedangkan α-Ketoglutarate Dehydrogenase, mengubah α-Ketoglutarat menjadi suksinil KoA. Efisiensi dari fiksasi karbondioksida oksaloasetat bergantung pada hasil dari aktivitas Phosphoenol  Carboxylase. Asam aspartat menunjukan adanya hambatan dan tantangan enzim. Penghambatan ini telah ditingkatkan oleh asam α-Ketoglutarat. Oleh karena itu, endogenus asam aspartat dan asam α-Ketoglutarat harus diminimalkan apabila produk asam £-Glutamatingin dimaksimalkan. α-Ketoglutarate Dehydrogenase ini penting untuk oksidasi glukosa menjadi CO2. Enzim ini dicegah oleh cisakonitat, suksinil KoA, NADH, NADPH, piruvat dan oksalat yang kemudian akan diubah menjadi asetil KoA. Kandungan α-Ketoglutarate Dehydrogenase dari bakteri penghasil asam glutamat sangat menguntungkan untuk sintesis asam glutamat dari asam α-Ketoglutarat, mencegah oksidasi asam α-Ketoglutarat menjadi CO2 dan H2O melalui suksinil KoA. Nilai K m

α-Ketoglutarate Dehydrogenase untuk asam α-Ketoglutarata adalah sekitar 1×17 glutamat dehydrogenase. Enzim ini kemudianmengkatalis formasi asam glutamat menjadi lebih luas daripada α-Ketoglutarate Dehydrogenase.  Akibatnya,, konsentrasi endogenus α-Ketoglutarat yang mengatur daur  metabolit α-Ketoglutarat mengikuti biosinteseis asam glutamat ataupun oksidasi. Hal ini ditunjukan dengan cukup tingginya produksi asam glutamat.

3. Perubahan Genetik Mikrobia Penghasil Asam £-Glutamat

Kelebihan produksi dari asam glutamat ditunjukan dengan adanya strain asing dalam dinding permeabilitas yang telah dimodifikasi. Akan tetapi, produktivitasnya ditingkatkan oleh adanya perkembangan mikrobia. Sebagai salah satu contoh, dinding permeabilitas sel asam £-Glutamat dimodifikasi dengan mutasi berupa mutan temperatur sensitif yang menunjukan pertumbuhan normal pada 30oC tetapi tidak tumbuh pada 37°C, asam £-Glutamat diproduksi dalam jumlah besar bahkan medium mengandung biotin secara berlebihan pada kultur bertemperatur 30°C sampai 40°C selama pembudidayaan. Sintesis membran dari mutan ini dibentuk agar tidak mampu bertahan pada suhu 37°C- 40°C. Oleh karena itu, terjadi pengurangan asam £-Glutamat. Tidak ada kontrol kimia dari penicillin ataupun asam lemak jenuh C16 – C18 yang dibutuhkan untuk produksi asam £-Glutamat dalam medium yang kaya akan biotin. Usaha yang lain untuk meningkatkan produksi, yaitu meningkatkan fiksasi karbondioksida. Asam £-Glutamat disintesis melalui siklus glioksilat sebagai sistem pembaharuan oksaloasetat tanpa fiksasi karbondoksida. Peningkatan fiksasi ini memungkinkan terjadinya peningkatan produksi.

Sebagian dari monofluoroasetat yang resistan terhadap mutan diturunkan dari Brevibacterium lactofermentum yang menunjukan peningkatan produktivitas dari asam glutamat dengan peningkatan aktivitas Phosphoenol Carboxylase. Penurunan aktivitasi Isositrat lyase  juga turut meningkatkan jumlah asam £- Glutamat. Fiksasi karbondioksida telah ditingkatkan oleh perubahan mutan tersebut. Piruvat hydrogen mutan yang tidak resisten diturunkan dari Brevibacterium lactofermentum yang menggunakan asam asetis dan glukosa secara kontinu. Asam asetis telah diasimilasi sebagai subtrat asetil KoA dan glukosa sebagai oksaloasetat.

Aplikasi dalam teknik DNA rekombinan untuk meningkatkan bakteri penghasil asam glutamat merupakan penawaran cara baru. Berbagai jenis plasmid  Brevibacterium lactofermentum dan plasmid Corynebacterium yang menghubungkan  spectinomycin resisten yang  ditemukan dicocokan sebagai sistem vektor yang memungkinkan.  Kontraksi dari plasmid ini mengandung kumpulan gen dengan asam glutamat yang ditunjukan Brevibacterium lactofermentum.

Gambar 1. Jalur  pembentukan  asam  glutamat  melalui siklus glioksilat  sebagai sistem pembentuk oksaloasetat tanpa pembentukan karbondioksida.

Gambar 2. Jalur pembentukan asam glutamat melalui fosfoenolpiruvat dengan pengikatan  karbondioksida

4. Fermentasi Asam Glutamat Skala Besar

Sterilisasi kontinu lebih berhasil daripada sterilisasi batchwise  untuk mengeliminasi mikrobia asing yang tidak diinginkan pada media volum besar. Beberapa manfaatnya adalah (1) hemat energi; (2) kendali mutu yang lebih baik; (3) meningkatnya produktivitas. Filter udara yang dilengkapi dengan wol kaca biasanya bagus untuk sterilisasi udara.

Pada fermentasi asam £-Glutamat, dibutuhkan input daya yang lebih sedikit untuk agitasi daripada fermentasi antibiotik, sebagaimana cairan kultur bakteri memiliki viskositas (kekentalan) lebih rendah daripada cairan kultur  mycelial . Meskipun demikian, perlu diperhatikan bahwa kebutuhan oksigen dan perubahan panas secara perlahan perunit waktu dan volum pada kultur adalah lebih tinggi, karena asimilasi gula dan respirasi sel yang juga pada laju yang lebih tinggi.

Untuk  keberhasilan  operasi  fermentasi,  tekanan  pelarutan oksigen,  suhu, dan pH harus dioptimalkan selama fermentasi.  Kelarutan oksigen dipelihara di atas 0,01 atm dengan mengubah laju aliran udara, suhu dikontrol lewat alat pendingin, dan kultur pH dipelihara pada level konstan dengan gas amonia. Pengendalian tersebut dapat dilakukan dengan sistem computer-aided . Selain itu, serangkaian kontrol pada beberapa operasi, contohnya mensterilisasikan sistem, penggunaan medium pada fermenter, pemberian larutan gula terkonsentrasi ke fermenter, dan kemudian pencucian fermenter dengan air, dapat dengan mudah diprogram sehingga dapat berlangsung secara serempak.

Proses Fermentasi

Fermentasi merupakan kegiatan mikrobia pada bahan pangan sehingga dihasilkan produk yang dikehendaki. Mikrobia yang umumnya terlibat dalam fermentasi adalah bakteri, khamir dan kapang. Contoh bakteri yang digunakan dalam fermentasi adalah Acetobacter  xylinum pada pembuatan nata decoco,  Acetobacter aceti pada pembuatan asam asetat. Contoh khamir dalam fermentasi adalah Saccharomyces cerevisiae dalam pembuatan alkohol sedang contoh kapang adalah  Rhizopus sp  pada pembuatan tempe,  Monascus purpureus pada pembuatan angkak dan sebagainya. Fermentasi dapat dilakukan menggunakan kultur murni ataupun alami serta dengan kultur tunggal ataupun kultur campuran. Fermentasi menggunakan kultur alami umumnya dilakukan pada proses fermentasi tradisional yang memanfaatkan mikroorganisme yang ada di lingkungan. Salah satu contoh produk pangan yang dihasilkan dengan fermentasi alami adalah gatot dan growol yang dibuat dari singkong. Tape merupakan produk fermentasi tradisional yang diinokulasi dengan kultur campuran dengan jumlah dan jenis yang tidak diketahui sehingga hasilnya sering tidak stabil. Ragi tape yang bagus harus dikembangkan dari kultur murni. Kultur murni adalah mikroorganisme yang akan digunakan dalam fermentasi dengan sifat dan karaktersitik yang diketahui dengan pasti sehingga produk yang dihasilkan memiliki stabilitas kualitas yang jelas. Dalam proses fermentasi kultur murni dapat digunakan secara tunggal ataupun secara campuran. Contoh penggunaan kultur murni tunggal adalah Lactobacillus casei pada fermentasi susu sedang contoh campuran kultur murni adalah pada fermentasi kecap, yang menggunakan Aspergillus oryzae pada  saat  fermentasi kapang dan saat fermentasi garam digunakan bakteri Pediococcus sp dan khamir  Saccharomyces rouxii

Medium yang digunakan dapat berupa bahan mentah terutama yang mengandung karbon (C):glukosa, fruktosa, maltosa, sukrosa, xilosa, dan asam asetat serta sumber nitrogen (N): garam ammonium, ammonia (NH3). Selain sumber C dan N juga diperlukan biotin dalam medium yang merupakan faktor pembatas, tergantung sumber C yang digunakan. Contoh medium yang sering digunakan adalah molase atau tetes tebu. Mikroba yang dapat melakukan fermentasi asam glutamat  adalah bakteri gram positif non motil yang membutuhkan biotin untuk tumbuh dalam jumlah sedikit atau aktivitas α-ketoglutarate dehydrogenase dan aktivitas glutamate dehydrogenase yang tinggi seperti Micrococcus glutamicus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Arthrobacter. Perubahan permeabilitas dapat meningkatkan produksi asam glutamat oleh Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, dan Microbacterium. Kunci dari over produksi glutamate adalah karena spesies tersebut tidak mempunyai enzim α-ketoglutarat dehidrogenase yang memecah α-ketoglutarat menjadi suksinil-CoA, dan membutuhkan biotin (tidak dapat mensintesis biotin).

Jika ditumbuhkan pada glukosa, spesies ini dapat memproduksi glutamat, terkumpul di dalam selsampai 50 mg/g berat kering, dan karena adanya regulasi umpan balik, produksi glutamat dapat berhenti. Jika permeabilitas sel dinaikkan, glutamat menjadi lebih mudah dikeluarkan dari sel mengakibatkan konsentrasi glutamat di dalam sel tetap rendah, dan produksi glutamat terus berlangsung.

Perubahan permeabilitas dapat dilakukan dengan cara : 1. Penggunaan biotin yang terbatas (konsentrasi sangat rendah, biasanya 9-5 mg/L), 2. Penambahan Penicillin atau turunan asam lemak. Konsentrasi biotin yang rendah dan penambahan Penicillin atau turunan asam lemak akan menurunkan konsentrasi fosfolipid di dalam membran sehingga permeabilitas membran berubah. Fermentasi berlangsung dalam kondisi yang aerobik sehingga membutuhkan sistem aerasi. Reaksi yang terjadi selama fermentasi adalah sebagai berikut:

C6H12O6 + NH3 + 1,5 O2 C4H9O4N + CO2 + 3 H2O

(glukosa) (asam glutamat)

3 C2H4O2 + NH3 + 1,5 O2 C4H9O4N + CO2 + 3 H2O

(asetat) (asam glutamat)

Lintasan atau jalur biosintesa asam glutamat perlu dipelajari untuk pengenalan sifat-sifat mikroba dan kondisi fermentasi optimum sehingga yield yang diperoleh lebih banyak.

Pembentukan asam glutamat dari glukosa membutuhkan sekurang-kurangnya 16 tahap reaksi enzimatis. Asam α-ketoglutarat diubah menjadi asam glutamat melalui reaksi reduktif aminasi (penambahan NH3). Enzim yang mengkatalisa reaksi tersebut adalah NADP-specific glutamic acid dehidrogenase. Untuk mengaktifkan enzim tersebut diperlukan NADPH2.

Untuk mengubah glukosa menjadi senyawa dengan tiga atom dan dua atom karbon, disamping menggunakan jalur HMP (hexomonophosphat) juga menggunakan jalur EMP (embdenmeyerhoff-parnas). Lintasan HMP menghasilkan lebih banyak NADPH2 yang diperlukan untuk reaksi konversi asam α-ketoglutarat menjadi asam glutamat.

Fermentasi asam glutamat merupakan fermentasi aerobik, maka kekurangan oksigen selama proses fermentasi menyebabkan jalur EMP lebih dominan. Hasilnya adalah banyak dihasilkannya asam-asam organik lain, seperti asam laktat, akibatnya asam glutamat yang terakumulasi berkurang.

Fermentasi berlangsung selama 35-45 jam kemudian hasil fermentasi tersebut disentrifus untuk menghilangkan biomassa yang terbentuk dan bahan-bahan padat organik lainnya. Asam glutamat  yang ada dalam larutan induk dipisahkan dengan resin, di mana asam glutamat akan tertahan didalam resin.

Pengujian secara kualitatif terhadap adanya asam glutamat dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (thin layer chromatography). Laju spesifik (Rf) spot dari sampel hasil fermentasi di dalam labu Kolben dibandingkan dengan spot asam glutamat standar.

Bila ditemukan bakteri penghasil asam glutamat maka kemudian dilakukan percobaan-percobaan dengan berbagai perlakuan untuk mendapatkan hasil yang optimal. Sebagai contoh ialah percobaan teknik mutasi dan percobaan variasi media sehingga dihasilkan strain serta kondisi fermentasi yang optimal menghasilkan asam glutamat.

Sintesis asam amino menggunakan dua galur mikroba, yaitu stringent strain dan relaxed strain. Stringent strain adalah mikroba yangn berhenti membentuk asam amino apabila jumlah asam amino yang diproduksi sudah mencukupi kebutuhannya. Mikroba ini bersifat menghemat sumber-sumber makanan yang jumlahnya terbatas di alam. Sintesa asam amino dihambat karena terbentuknya senyawa Guanosin Tetra Phosphat dan Guanosin Penta Phosphat. Relaxed strain tidak membentuk kedua zat tersebut, sehingga dapat mensintesa asam amino dalam jumlah yang melebihi kebutuhannya.

Mikroba penghasil asam glutamat termasuk dalam relaxed strain. Hal ini disebabkan karena mikroba tersebut kekurangan enzim α-ketoglutarat dehidrogenase yang diperlukan untuk mengubah asam α-ketoglutarat menjadi suksinil-CoA dalm siklus Kreb. Dengan adanya NH3 yang diberikan selama fermentasi, asam α-ketoglutarat diubah menjadi asam glutarat.

Fermentasi asam glutamat dapat dibedakan menjadi dua grup berdasarkan kelompok mikroba yang digunakan, yaitu fermentasi galur liar dan fermentasi galur mutan.

1. Galur Liar

Galur liar yang dapat memproduksi asam glutamat adalah Arthrobacter,  Corynebacterium, Brevibacterium dan Microbacterium. Kebanyakan bakteri pembentuk asam glutamat adalah gram positif, non motil, tidak membentuk spora, dan yang terpenting adalah bakteri-bakteri tersebut semuanya membutuhkan biotin untuk pertumbuhannya, serta kekurangan enzim α-ketoglutarat dehidrogenase.Telah diketahui bahwa biotin mempunyai peranan dalam ekskresi asam glutamat. Asam glutamat banyak terakumulasi dalam media kultur bila konsentrasi biotin berada di bawah kondisi optimum yang diperlukan untuk pertumbuhan sel bakteri. Pemberian lebih banyak biotin akan meningkatkan pertumbuhan sel tetapi menurunkan akumulasi asam glutamat. Konsentrasi kritis biotin untuk ekskresi asam glutamat adalah 0.5 mikrogram per liter media.

Kekurangan biotin tidak berarti menyebabkan berkurangnya aktifitas sintesa asam glutamat,tetapi berkurangnya permeabilitas mebran sel. Kekurangan biotin menyebabkan perubahan komposisi membran sel yaitu menurunkan kandungan fosfolipid dan meningkatkan rasio molar dari asam lemak jenuh dan asama lemak tak jenuh menjadi lebih besar dari satu. Dalam hal ini biotin berperanan dalam sintesa asam lemak di dalam sel.

Biotin diperlukan dalam sintesa asam-asam lemak. Biotin dan ATP diperlukan oleh enzim asetil-CoA karboksilase dalam mengubah asetil-CoA menjadi malonil-CoA yang seterusnya menjadi asam-asam lemak. Peranan biotin dapat digantikan oleh asam oleat. Mutan yang memerlukan asam oleat dapat mengakumulasi asam glutamat bila ditumbuhkan pada media dengan kandungan asam oleat terbatas, walaupun kelebihan biotin.

Penambahan turunan asam lemak yaitu POEFE (poly oxyethilene fatty acid ester) mempunyai efek yang sama dengan biotin dalam ekskresi asam glutamat, yaitu menyebabkan perubahan komposisi membran sel.

Penisilin juga menyebabkan ekskresi asam glutamat, namun dalam hal ini efek penisilin berbeda dengan biotin atau POEFE. Penisilin menghambat sintesa membran

sel, sehingga membran seltipis dan dapat mengekskresikan asam glutamat. Hal ini diikuti dengan perubahan bentuk sel menjadi lebih panjang atau lebih cembung.

Kerja POEFE tidak tergantung pada tekanan osmotik media, sedangkan penisilin hanya dapat mengekskresikan asam glutamat bila tekanan osmotik cukup rendah, sehingga penisilin tidak efektif digunakan dalam media dengan tekanan osmotik tinggi.

Penambahan asam lemak jenuh C16-18 menghambat sintesa asam oleat dengan cara menahan enzim asetil-CoA karboksilase. Penurunan asam oleat menghambat pembentukan fosfolipid, sehingga terjadi kebocoran sel. Fermentasi dengan menggunakan galur liar memproduksi asam glutamat dalam jumlah sedikit,karena tergantung pada mekanisme pengaturan dalam jalur

biosintesa. Galur liar Collobacterium coliform  mengakumulasi 15 gram asam glutamat per liter media.

2. Galur Mutan

Mutasi terhadap galur liar dimaksudkan untuk memperoleh galur yang memproduksi asam glutamat dalam jumlah yang tinggi, mempunyai toleransi besar terhadap perubahan kondisi, mempunyai kisaran pH dan suhu yang lebar serta tahan terhadap kadar gula tinggi.

Dua cara yang biasa digunakan untuk pengaturan biosintesa asam amino ialah feed back inhibition dan feed back repression. Mekanisme FBI dapat dijelaskan dengan teori protein alosterik dimana hasil metabolit akhir dari jalur biosintesa menghambat enzim sebelumnya. Enzim yang dihambat ini adalah protein alosterik yang mempunyai sisi aktif dan sisi regulatori pada permukaannya. Sisi regulatori dapat bereaksi dengan inhibitor dan menyebabkan perubahan bentuk (pengkerutan) protein alosterik serta mempengaruhi sisi aktif. Hal ini menyebabkan sisiaktif tidak dapat bereaksi dengan substrat dan enzim tidak aktif lagi. Dengan demikian, inhibisi menghambat kerja enzim.

Berbeda dengan inhibisi, represi menghambat pembentukan enzim. Dalam proses ini produk akhir mengontrol jumlah enzim dalam jalur biosintesa. Ada empat gen yang berperan dalam sintesa protein, yaitu RPOS (operon) yang terdiri dari R (gen represor), P (gen promotor), O (genoperator), dan S (gen struktural). Pembentukan enzim secara normal terjadi bila tidak ada korepresor yang bergabung dengan aporepresor dan menghalangi proses transkripsi. Korepresor  biasanya produk akhir atau turunannya. Jika represor aktif menyerang pada gen O pada DNA, transkripsi atau transfer kode-kode genetik dari gen S kepada mRNA tidak terjadi.

Untuk memproduksi beberapa asam amino intermediat pada biosintesa asam amino, termasuk asam glutamat, dapat digunakan auksotrop dimana jalur biosintesa telah dihalangi, yaitu dengan membunuh mikroba pada media yang mengandung sedikit asam amino represor. Dengan demikian, mikroba masih tetap hidup dan terbebas dari FBI dan FBR. Mutan tersebut dikenal sebagi mutan auksotrop. Dalam fermentasi asam glutamat dikenal Brevibacterium thiogenitalis yang merupakan mutan auksotrop asam oleat dan Corynebacterium alcanolyticum, suatu mutan auksotrop gliserol.

Kajian Islam Mengenai Pemanfaatan Mikroorganisme dalam Biosintesis Asam Glutamat

Produksi asam glutamat dari bahan berupa makhluk hidup menunjukkan tanda – tanda kekuasaan Allah SWT sesuai firman Allah SWT dalam surat An Nahl ayat 5 :

Artinya : “Dan Dia telah menciptakan binatang ternak untuk kamu, padanya ada (bulu) yang menghangatkan dan berbagai – bagai manfaat dan sebahagiannya kamu makan”

Dalam hal ini dapat kita ketahui bahwa Allah SWT  menciptakan sejenis  mikroorganisme yang dapat melakukan metabolisme dan pertumbuhan. Dari hasil metabolisme dan pertumbuhan tersebut dapat menghasilkan asam glutamat yang dapat digunakan untuk produksi MSG.

Pemanfaatan mikroorganisme dalam produksi asam glutamat dengan menggunakan berbagai jenis mikroorganisme tergolong dalam mikrobiologi industri. Contohnya Brevibacterium flavum dan Corynebacterium glutamicum merupakan anggota bakteri. Selama ini bila kita mendengar kata bakteri, maka yang terbayang di benak kita adalah sesuatu yang merugikan saja, misalnya penyebab suatu penyakit. Padahal sebenarnya Brevibacterium flavum dan Corynebacterium glutamicum tidaklah demikian.

Fenomena ini sesuai dengan firman Allah dalam Al Quran surat Al- Imran ayat 191 :

Artinya: (yaitu) orang-orang yang mengingat Allah sambil berdiri atau duduk atau dalam keadan berbaring dan mereka memikirkan tentang penciptaan langit dan bumi (seraya berkata): “Ya Tuhan kami, tiadalah Engkau menciptakan ini dengan sia-sia, Maha Suci Engkau, maka peliharalah kami dari siksa neraka.

Dalam surat  Al-Imran ini menjelaskan bahwa segala sesuatu yang di ciptakan oleh Allah SWT dimuka bumi ini dari hal terkecil sampai hal terbesar mempunyai maksud dan tujuan untuk kehidupan manusia dimuka bumi.

Kesimpulan

Biosintesis sebagai salah satu kegiatan jasad hidup di dalam metabolisme, berbeda dengan nutrisi, karena di sini diperlukan sumber energi. Asam glutamat merupakan asam amino non-essensial. Asam glutamat sebagian dapat dihasilkan dengan cara menggunakan mikroba. Berbagai teknik yang telah diketahui dalam pembuatan asam L-glutamat, tapi memiliki bermacam variasi efisiensi dalam konversi gula menjadi asam glutamat.

Dalam proses fermentasi oleh mikroba dilakukan pengoptimalan parameter fermentasi dengan proses kontinu dan efisiensi konversi gula menjadi asam glutamat. Pengoptimalan tersebut dengan memperhatikan aspek-aspek penting, seperti : 1. Strain Mikrobia, 2. Kondisi Kultur yang meliputi : a). sumber karbon, b). sumber nitrogen dan kontrol pH, c). faktor tumbuh, dan d). ketersediaan oksigen, 3. Akumulasi  Produk  Lain  yang Dipengaruhi oleh Perubahan  Kondisi  Kultur  yang  meliputi : a). asam laktat dan asam suksinat, b). asam α-ketoglutarat, dan c). asam £-glutamin, 4. Fisiologi Mikrobia dari Fermentasi Asam £-Glutamat yang meliputi : a).

permeabilitas membran sel dan asam glutamat dalam hubungannya dengan konsentasi biotin, b). mekanisme biosintesis asam £-glutamat, c). perubahan genetik mikrobia penghasil asam £-glutamat, dan d). fermentasi asam glutamat skala besar, 5. Proses Fermentasi yang meliputi : a). galur liar, dan b). galur mutan.

Oleh karena itu berdasarkan aspek-aspek diatas diharapkan proses fermentasi oleh mikroba dapat dilakukan dengan optimal serta efisien sehingga dapat meningkatkan proses produksi asam glutamat.