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GALOPHE Nathalie Mémoire bibliographique de Master 2
Expression génique et protéines recombiantes 2005-2006
Biotechnologies et peptides
amyloides β
2
Les dépôts de protéines fibreuses insolubles sont à l’origine de
nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie de
Parkinson, la maladie de Creutzfeld-Jacob et la maladie
d’Alzheimer.
La maladie d’Alzheimer est une démence neurodégénérative qui
touche la zone mémoire du cerveau altérant ainsi les comportements
sociaux des personnes atteintes, qui représentent aujourd’hui 350000
malades en France. Dans la maladie d’Alzheimer on observe des
dépôts de fibres d’amyloide à l’extérieur des neurones ce sont les
plaques séniles. Ces fibres d’amyloide sont constituées d’une
agrégation de peptides β amyloide. Ces peptides, de 39 à 43 résidus,
sont produits par un clivage anormal de l’ amyloid precursor protein
(APP) par deux enzymes la β et γ sécrétase. Au niveau des plaques
séniles on trouve majoritairement le peptide Aβ 1-42 qui présente
une forte propension à s’agréger en formant des feuillets β et dont la
toxicité dans la maladie d’Alzheimer est la plus forte. Ainsi dans un
but thérapeutique des études sont menées sur ce peptide Aβ42 afin
de mieux comprendre son rôle dans l’amyloidogénèse et peut-être
pouvoir un jour contrer ses effets neurotoxiques.
3
Abréviations
A A: Acide aminé
Aβ: Amyloide beta
DTT: di-thiothréitol
E. coli: Escherichia coli
G: Glycine
GFP: Green fluorescent protein
h : heure
His: Histidine
I: Isoleucine
IPTG: Isopropyl-β D thiogalactopyranoside
K: Lysine
L: Leucine
MTT: 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltétrazolium bromide
PMSF: Phenylméthanesulfonyl fluoride
R: Arginine
SDS-PAGE: Sodium dodécyl sulfate
TFA: Acide trifluoro-acétique
Ub: Ubiquitine
YUH-1: Yeast ubiquitin hydrolase
4
- SOMMAIRE –
Introduction …………………………………………………………….. 1-6
La maladie d’Alzheimer ……………………………………………………… 1
Les plaques séniles …………………………………………………………… 1
L’amyloïdogénèse ……………………………………………………………. 2-6
La protéine précurseur d’amyloïde APP………………….. 2
Les sécrétases …………………………………………………….. 2-3
Les peptides d’amyloïde β ……………………………………. 4
La formation des fibres d’amyloide ........................... 4-6
La fusion à l’ubiquitine ……………………………………………… 7-11
L’ubiquitine ……………………………………………………………………… 7-8
La technique des gènes synthéthiques ……………………………… 8-9
Construction du vecteur pET/Ub …………………………… 8
Construction du vecteur pET/Ub-Aβ 1-42 ………………. 9
L’ubiquitine hydrolase-1 …………………………………………………… 10-11
Propriétés ……………………………………………………………. 10-11
Production ………………………………………………………….. 11
La production de peptides Aβ 42 recombinants ………………. 11-14
Expression ……………………………………………………………………… 11-12
Purification …………………………………………………………………….. 12-14
Chromatographie d’affinité au nickel………………………. 12
Clivage de la fusion ……………………………………………… 13
Chromatographie en phase inverse ………………………… 14
Comportement de peptides Aβ42 sur la viabilité cellulaire … 14-17
Test impliquant la réduction du MTT …………………………………… 14-15
Test impliquant le trypan blue dye exclusion ……………………….. 15-16
Chromatographie d’exclusion ……………………………………………… 16-17
Conclusion, discussion et perspectives ………………………….. 18-24
Conclusion et discussion……………………………………………………… 18-20
Perspectives …………………………………………………………………….. 21-24
Annexe …………………………………………………………………… 25
Bibliographie……………………………………………………………… 26-27
- 1 -
Introduction
La maladie d’alzheimer
Le premier cas de la maladie d’Alzheimer a été découvert par Alois Alzheimer en 1906. A
peine 100 ans plus tard cette maladie touche 5% des plus de 65 ans et 20% des plus de 85 ans,
ce qui représente environ 350000 personnes en France.
La maladie d’Alzheimer (MA) est une démence neurodégénérative à dominante corticale qui
touche en premier lieu les fonctions cognitives et se répercute sur le comportement et
l’adaptation sociale des patients. Elle se caractérise donc par la mort des neurones
cholinergiques du système limbique particulièrement ceux de l’hippocampe (zone mémoire
du cerveau).
La maladie d’Alzheimer présente trois principaux types de lésions que sont l’atrophie
corticale (le cerveau peut perdre de 8 à 10% de son poids tous les 10 ans), les
dégénérescences neurofibrillaires (échevaux de filaments anormaux à l’intérieur des
neurones) et les plaques séniles (dépôts extracellulaires de substances amyloïde).
C’est particulièrement cette dernière lésion qui va nous intéresser ici puisse qu’elle découle de
la substance amyloïde.
Les plaques séniles
La substance amyloïde est constituée de filaments d’un polypeptide de 40 à 43 acides aminés
appelé peptide β amyloïde (Aβ) [ref. 1]. Ce peptide est extrêmement insoluble du fait de la
présence de feuillets β. Le cerveau ne pouvant pas l’éliminer on observe la formation, autour
des neurones, de plaques séniles. Ces plaques libèrent une substance neurotoxique que sont
les radicaux libres. Cette sécrétion entraîne une déshydrogénation de la membrane des
cellules, une entrée de radicaux libres qui vont attaquer l’ADN du neurone et ainsi le faire
entrer en apoptose.
2
L’amyloïdogénèse
La protéine précurseur d’amyloïde APP
Le gène de l’APP, situé sur le chromosome 21, peut subir un épissage alternatif pouvant
donner plusieurs ARNm (695, 751 et 770 nucléotides) dont celui de l’APP entier (770
nucléotides).
La protéine APP est une protéine transmembranaire aux rôles très divers tels que récepteur de
surface, molécule d’interaction entre les cellules mais elle intervient également dans la
régulation de la concentration en Ca++. Néanmoins cette protéine peut-être sécrétée afin de
protéger le neurone contre le stress oxydatif.
Il existe des formes familiales de la maladie qui se caractérisent par un début beaucoup plus
précoce, une évolution plus rapide et la présence de mutations entre autre au niveau du gène
de l’APP. [ref. 2].
Les sécrétases
Les enzymes responsables de la coupure de l’APP en peptide d’amyloïde β ont été mises en
évidence en 1999 comme étant des sécrétases.
Il existe 3 types de sécrétases : α, β, γ dont l’action sur le domaine amyloide β de l’APP est
illustré figure 1 [ref. 3]
Figure 1 Schéma représentant l’APP transmembranaire avec l’action des différentes sécrétases α, β, γ sur sa séquence aboutissant à la formation de Aβ40 et Aβ42. Les acides aminés au-dessus de la séquence matérialisent les principales mutations qui touchent l’APP. [ref 4]
Introduction
3
Les sécrétases β et α coupent au niveau du domaine extracellulaire du précurseur
La sécrétase γ coupe au niveau du domaine transmembranaire du précurseur.
C’est la γ sécrétase qui conditionne la nature du peptide amyloide. Les propriétés physico-
chimiques des peptides Aβ40 et Aβ42 sont sensiblement différentes, puisqu’il semble que la
longueur de la partie hydrophobe en C-terminal de peptides Aβ est importante pour la
solubilité et les propriétés d’agrégation de ces peptides [ref 5].
Une coupure alternative engendrée par l’α sécrétase prévient ainsi la formation du peptide Aβ
et produit un fragment sécrété présentant une activité neuroprotectrice (figure 2).
Dans la voie amyloidogénique, l’APP (figure 3) est clivée par les sécrétases β et γ qui
libèrent respectivement les extrémités N et C-terminales du peptide Aβ1-40/42 [ref 3 et 6].
Figure 2 Schéma représentant la voie physiologique de maturation de la βAPP. Coupure par l’α sécrétase au niveau de l’appareil de Golgi . Cependant une partie de la βAPP échappe à ce clivage et est intégrée à la membrane plasmique où une α sécrétase membranaire intervient. Dans tous les cas il n’y a pas formation de peptide d’amyloide. [ref 4] Figure 3 Schéma représentant la voie amyloidogénique de maturation de la βAPP. Il semble que le peptide Aβ42 apparaisse dés le reticulum endoplasmique alors que pour Aβ40 ce soit au niveau de l’appareil de Golgi. Néanmoins une partie deβAPP échappe aux coupures par β,γ sécrétases et s’intègre dans la membrane plasmique. Après endocytose, la βAPP est soit
Introduction
4
clivée par les β,γ sécrétases ce qui va engendrer la formation de peptide amyloide soit être dégradé par le lysosome. [ref 4]
Les peptides d’amyloïde β
La partie N-terminale de 28 résidus du peptide Aβ dérive du domaine extracellulaire du
précurseur, il s’agit donc de résidus polaires tandis que les résidus 29 à 42 représentent la
partie transmembranaire de l’APP constituée de résidus hydrophobes [ref. 7]. Les deux
principaux isoformes que l’on trouve au niveau des plaques séniles sont le peptide Aβ42 et
Aβ40. La voie amyloidogénique n’est pas systématiquement synonyme de pathologie.
Chacun produit du peptide amyloide, ce n’est que le dérèglement de cette production qui est
pathogène. Il peut se produire soit une augmentation de la concentration de peptide Aβ40, soit
une variation du rapport Aβ40/Aβ42. En effet chez des individus sains la proportion d’Aβ
sécrétée au niveau du fluide cérébro-spinal est de : 90% : 10% (Aβ40 : Aβ42) tandis que chez
un individu touché par la maladie d’Alzheimer on atteint 50% : 50% [ref. 8]. En tout cas ces
deux mécanismes conduisent au passage d’un état soluble à un état agrégé favorisant le dépôt
des plaques séniles.
Formation des fibres d’amyloides
Les résidus 29 à 40, de Aβ1-40, sont insérés dans la membrane cellulaire, cet environnement
stabilise la structure en hélice de l’Aβ. Des études tendent à montrer que le peptide Aβ aurait
tendance à quitter cette bicouche lipidique. On le retrouverait au niveau de la solution extra-
cellulaire où le segment 29-40 aurait une forte tendance à former des feuillets
β induisant ainsi l’agrégation des peptides Aβ en fibres d’amyloide [ref. 9]. La conformation
du peptide est fortement dépendante de l’hydrophobicité de son environnement, les
interactions hydrophobes semblent favoriser la formation d’hélices α tandis que les
interactions électrostatiques induisent la formation de feuillets β [ref. 10].
Il a été montré (tableau 1) que le peptide Aβ42 forme des fibres d’amyloide insolubles plus
rapidement que le peptide Aβ40 et sa toxicité in vitro se fait à des concentrations de l’ordre du
Introduction
5
nanomolaire [ref. 11]. Ces différentes caractéristiques et sa principale abondance au niveau
des plaques séniles en font un protagoniste incontournable dans la maladie d’Alzheimer.
Tableau I Résultats obtenus à partir de test de viabilité cellulaire (MTT) sur des cellules PC12 utilisant différents peptides β dont la taille varie de 40 à 42 acides aminés et dont la séquence varie du sauvage à une séquence mutée au niveau de la methionine 35. Corrélation entre la toxicité de ces peptides(EC50) et la morphologie des fibres à la fin de l’incubation (apparition des fibres = seeds, fibre immatures= diamètre 10 à 30nm et fibre mature= diamètre ~150nm). La présence de fibres matures engendre une toxicité de l’ordre du nanomolaire.
Au cours de ce rapport bibliographique nous allons nous intéresser au peptide Aβ1-42 et plus
particulièrement à sa production, dont la difficulté principale repose sur le fait qu’il s’agisse
d’une protéine toxique de par sa forte tendance à s’agréger en formant des feuillets β.
En général, la synthèse chimique est employée pour produire de petites protéines présentant
ce type de comportement. Pour le peptide Aβ42 cette technique a été réalisée en tenant
compte de la partie C-terminale hydrophobe [ref 12]. La synthèse chimique est coûteuse et
rend difficile toute modification de la séquence en acides aminés (envisagée pour comprendre
les phénomènes d’agrégation) d’où le développement d’autres voies de production.
Les biotechnologies ont développé les protéines de fusion [ref 13-14] pour permettre
l’expression dans les bactéries de protéines peu solubles, peu exprimées ou peu stables. Cette
technique favorise la détection (tag HA), la purification (tag 6His, GST, MBP) et/ou la
solubilité (Tag, NusA, Thioredoxine, Ubiquitine) cependant l’inconvénient majeur ici
rencontré est le clivage par sa non spécificité ainsi que par l’hétérogénéité apportée à
l’extrémité N-terminale de la protéine.
Introduction
6
Dans le cas du peptide Aβ1-42, on recherche la production de ce peptide avec uniquement et
exactement les acides aminés qui le composent. Diverse stratégies de protéines de fusion en
N-terminal ont déjà été réalisées employant soit un clivage enzymatique à la thrombine de la
fusion ce qui nécessite d’introduire dans la séquence le site de coupure par cette protéase (ex :
LVPRGS ). Or le clivage va introduire 2 acides aminés supplémentaires en N-terminal du
peptide ce qui peut entraîner une modification de son comportement. Dans un second temps il
a été envisagé un clivage chimique au CNBr (bromure de cyanogène) [ref 15] qui nécessite
une méthionine entre la fusion et la protéine, l’avantage est que l’on a aucune hétérogénéité
de la partie N-terminale du peptide mais la présence de la méthionine 35 dans l’Aβ42 oblige
sa protection face au réactif afin d’éviter une coupure non souhaitée.
Face à tous ces inconvénients une autre stratégie a été développée pour la production de
peptides Aβ1-42 soluble utilisant la fusion à l’ubiquitine [ref 16]. Nous allons donc étudier
cette stratégie dans le cas du peptide Aβ1-42. puis dans les perspectives nous verrons une
autre application des protéines de fusion afin d’aider à comprendre le phénomène
d’agrégation de ce peptide Aβ1-42.
Introduction
7
La fusion à l’ubiquitine
L’ubiquitine Il s’agit d’une petite protéine exclusivement eucaryote de 76 acides aminés (8.6kDa)
hautement conservés (figure 4).
Figure 4 Schéma de la structure cristalline de l’ubiquitine avec la représentation des feuillets β (4) et de la longue hélice α (résidus 23 à 34)
L’ubiquitine joue un rôle majeur dans le turnover des protéines au niveau du protéasome 26S
mais elle intervient également au niveau du contrôle du cycle cellulaire, de la régulation de la
transcription, dans la réponse au stress… [ref. 17 et 18]
La fonction de l’ubiquitine dans la dégradation par le protéasome, se fait au travers d’une
liaison entre le C-terminal de l’ubiquitine et le C-terminal d’une lysine de la protéine de
fusion. En plus de cette liaison isopeptidique, le C-terminal de l’ubiquitine peut former des
liaisons peptidiques sur les groupements amines des carbones α (figure 5) [ref.19].
Figure 5 Représentation schématique de la famille de gènes ayant une fusion naturelle à l’ubiquitine UBI1,2,3 sont constitués de la séquence de l’ubiquitine en fusion avec une queue de 52 acides aminés pour UBI1 et 2 et de 76AA pour UBI3, cette fusion contient un site de liaison à un ion métallique et un site de liaison à l’ADN. UBI4 est une répétition de 5 séquence d’ubiquitine. [ref 19]
La fusion à l’ubiquitine
8
Le clivage naturel de la fusion est réalisé par des protéases dé-ubiquitinylantes.
Les fusions à l’ubiquitine, réalisées dans diverses autres expériences, ont montré une
expression allant de 20 à 50% des protéines totales d’Escherichia coli [ref 17].
La technique des gènes synthétiques [ref. 16] Il semble favorable dans l’expression de protéines eucaryotes, chez Escherichia coli
d’optimiser les codons, d’où l’intérêt de passer par la technique des gènes synthétiques.
Construction du vecteur H6-Ub La séquence nucléique de l’ubiquitine fait 126 paires de bases, pour réaliser un gène
synthétique à partir de cette séquence, les auteurs ont construit 8 oligo-nucléotides (figure 6).
Après une étape de phosphorylation des oligos fUB2, fUb3, fUb4, rUb1, rUb2 et rUb3 par la
T4 polynucléotide kinase ils sont hybridés et ligués (T4 DNA ligase) par PCR afin de
reconstituer le gène de l’ubiquitine avec aux extrémités les sites des enzymes de restriction
BamHI et XhoI. Après digestion de ce fragment et du plasmide pET28a par les enzymes de
restriction, on a ligation des deux entités afin de réaliser le vecteur pET/Ub (figure 7).
La construction permet d’exprimer, après transformation dans E. coli BL21(DE3), la protéine
d’ubiquitine ayant un tag 6His en N-terminale.
Figure 6 Représentation de la séquence nucléotidique de l’ubiquitine qui va servir de matrice à la construction de 8 oligo-nucléotides pour la fabrication d’un gène synthétique [ref 16]
Figure 7 Schéma global de la réalisation d’un géne synthétique d’ubiquitine par des étapes d’hybridation, ligation, amplification par PCR puis digestion par les enzymes de restriction BamHI et Xho I et ligation dans le vecteur pEt 28a « ouvert »[ref 16]
La fusion à l’ubiquitine
9
Construction du vecteur Aβ42 Par la même technique que précédemment, les auteurs ont construit 6 oligo-nucléotides
(figure 8) afin de couvrir les 126 paires de bases de la séquence nucléotidique de Aβ1-42.
Figure 8 Schéma de la séquence de Aβ42 qui sert de matrice à la fabication du gène synthétique avec emplacement des 6 oligonucléotides utilisés [ref 16].
Après les mêmes étapes de phosphorylation, hybridation-ligation (par PCR) le peptide Aβ 1-
42 est reconstitué entièrement avec à ses extrémités les sites de coupures par les enzymes de
restrictions AflII et XhoI. Le vecteur pET/Ub-Aβ 1-42 est réalisé par digestion simultanée du
vecteur pET/Ub et du gène synthétique du peptide Aβ 1-42, puis ligation des deux éléments
(figure 9).
Figure 9 Schéma global de la réalisation du gène synthétique (voir figure 7) puis insertion dans le vecteur pEt28a-Ub [ref 16].
La transformation des bactéries E. coli BL21 (DE3) par ce vecteur pET/Ub-Aβ1-42 va
permettre l’expression du peptide d’amyloide Aβ1-42 ayant une fusion en N-terminal avec
l’ubiquitine afin de le stabiliser et un tag 6 His pour faciliter les étapes de purification.
La fusion à l’ubiquitine
10
L’ubiquitine hydrolase-1
Propriétés
Chez les eucaryotes il existe naturellement des fusions à l’ubiquitine aussi bien en position ε
que α d’une chaîne peptidique. La protéolyse en C-terminal de l’ubiquitine est réalisée par
des enzymes dé-ubiquitinylases. On trouve ces enzymes dans deux familles de protéases à
cystéine : UBP (ubiquitin-specific protéase) et UCH (ubiquitin C-terminal hydrolase)
capables d’hydrolyser la liaison peptidique, en position ε ou α, après la glycine 76 de
l’ubiquitine [ref. 20]. L’enzyme YUH-1 provient de la levure mais il existe des homologues chez l’humain UCH-L1
et UCH-L3 [ref 20]. C’est à partir de la structure de UCH-L3, obtenu par cristallographie aux
rayons X, que l’on a pu mettre en évidence la présence de la triade catalytique : Cys90,
His166 et Asp181 (coordonnées pour YUH-1) et du résidu Gln84 dans la poche de
l’oxyanion, caractéristique de cette famille de protéase [ref 21].
YUH-1 montre une spécificité de coupure envers la partie C-terminale de l’ubiquitine,
cependant la présence uniquement de la séquence RLRGG (5 dernier acides aminés de
l’ubiquitine) ne suffit pas à conférer cette spécificité, YUH-1 doit reconnaître la structure
tertiaire de l’ubiquitine. L’étude de la séquence de l’ubiquitine a permis de mettre en avant
certains résidus présents à la surface de la protéine. On trouve les résidus basiques R42, R72
et K74 qui semblent interagir avec des résidus acides chargé négativement chez YUH-1. De
plus d’autres résidus hydrophobes semblent importants dans ces interactions
enzyme-substrat, L8, I44, F45, V70, L71 et L73 mais tout particulièrement la L8 et la V70 qui
se localisent à la surface de YUH-1.
Les contacts entre l’enzyme (YUH-1) et son substrat (l’ubiquitine) passent par une liaison
covalente entre l’extrémité C-ter de l’ubiquitine et la chaîne latérale de la cystéine 90 de
YUH-1, par 20 liaisons hydrogènes dont un pont salin et de nombreuses interactions de Van
Der Waals [ref 21]. La spécificité semble principalement dû à des interactions entre
l’extrémité C-ter de l’ubiquitine et l’extrémité N-ter de YUH-1 . De cette observation il a été
mis en évidence, et ce grâce à la structure cristalline, un pont salin entre Arg 72 (Ub) et Asp
35 de YUH-1, de même il a ainsi pu être mis en avant l’importance de la Leu8 de l’ubiquitine
dans la reconnaissance du substrat. En plus de ces interactions spécifiques, la spécificité de
YUH-1 est soutenue par une inaccessibilité au site actif, du fait de la présence de Ile11, en
La fusion à l’ubiquitine
11
absence d’ubiquitine. Ainsi la liaison du substrat dans le site actif entraîne un déplacement de
cet acide aminé. Un autre changement de conformation implique une boucle (résidus 144-164
de YUH-1) qui passe au dessus du site actif, et qui semble limité l’accès au grosse protéine ce
qui pourrait se traduire par une efficacité moindre de clivage [ref 20].
Production [ref. 15] Les auteurs ont utilisé une ubiquitine C-terminal hydrolase: UCH nommée Yuh1 (yeast
ubiquitin hudrolase). Yuh 1 clive l’ubiquitine sur des fusions dont la protéine d’intérêt est de
petite taille. Comme la majorité des UBP le clivage après la glycine 76 est moins efficace
lorsque l’acide aminé qui suit est une proline [ref. 22].
Le gène de Yuh-1 est cloné dans le plasmide pTrp afin de réaliser le vecteur d’expression
pTrp/Yuh-1 qui permettra de transformer des bactéries E. coli de souche W3110. L’induction
de l’expression de Yuh-1 est réalisée, par ajout d’acide indolarylique à 50mg/L. Après avoir
récupéré la fraction protéique, la purification de l’enzyme Yuh-1 est accomplie par des étapes
de chromatographies successives d’échange anionique (DEAE-sepharose et MonoQ) et
d’hydrophobicité (phenyl-sepharose). Une fois Yuh-1 purifiée une étape de concentration
précède le stockage à –20°C .
La production de peptides Aβ42 recombinants
Expression L’expression est réalisée chez Eschericia coli BL21 (DE3) qui se caractérise par son
chromosome bactérien portant le gène de la polymérase T7 du phage λDE3 sous promoteur
inductible à l’IPTG.Les bactéries, une fois transformées par le vecteur pET/Ub-Aβ1-42, sont
mises en culture puis induites à l’isopropyl-β D thiogalactopyranoside (IPTG) (figure 10A).
La production de peptides Aβ42 recombinants
12
La production de peptides Aβ1-42 recombinants
Figure 10 A) gel d’électrophorèse SDS-PAGE 10-20% représentant l’expression de pEt-Ub (à gauche) et pEt –Ub/Aβ42 (à droite) avant (-) et après (+) induction. Après induction l’expression de H6Ub représente 30% des protéines totales. Après 3 heures l’induction est stoppée par centrifugation. Le culot bactérien est solubilisé
dans un tampon 50mM Tris pH 8, 150mM NaCl, 1mM EDTA et 1mM
phenylméthanesulfonyl fluoride (PMSF) puis soumis à une lyse bactérienne par sonication .
Après centrifugation , le culot est repris par le même tampon que précédemment. A ce stade,
la protéine n’est pas soluble d’où addition de 8M urée dans le tampon afin de la solubiliser.
Une ultime centrifugation à 10000g 30min permet de récupérer la fraction protéique au niveau
du surnageant.
Purification
Chromatographie d’affinité au Nickel La colonne Ni-NTA ( nickel- acide nitrilotriacétique) est chargée avec la fraction protéique,
lavée avec 10 fois le volume de la colonne par le tampon additionné de 8 M urée, puis 10
volumes de tampon additionné de 50mM imidazole afin d’éliminer l’urée. L’élution de la
protéine est réalisée à 400mM imidazole (figure 10B). Enfin la protéine ainsi purifiée est
soluble, l’ubiquitine prévient donc l’agrégation des peptides Aβ 42 lors de la production et de
la purification. Une fois concentrée et dialysée contre du tampon Tris 10mM pH 8 la
concentration en protéine est déterminée par la méthode du Bradford : 25mg/L
13
La production de peptides Aβ1-42 recombinants
Figure 10B) Gel d’électrophorèse SDS-PAGE 10-20% représentant H6Ub-Aβ42 avant (à gauche) et après purification (à droite) par chromatographie d’affinité au nickel
Clivage de la fusion La protéine ainsi purifiée possède toujours son tag à l’ubiquitine, afin de l’éliminer on va
incuber cette protéine purifiée avec YUH-1(ratio molaire 1000 :1) dans un tampon 50mM Tris
pH 7.5, 2mM DTT à 37°C pendant 1 heure. La réaction est arrêtée par centrifugation (figure
11A et B).
Figure 11 A) Gel d’électrophorèse SDS-PAGE 10-20% représentant les différents états visualisés en chromatographie en phase inverse. B) Profil d’élution en phase inverse C8 par gradient d’acétonitrile 2 à 80% de la fraction contenant H6Ub-Aβ42 puis profil au moment du clivage par YUH-1 et enfin profil après le clivage avec purification de Aβ42.
14
La production de peptides Aβ1-42 recombinants
Purification par chromatographie en phase inverse
La séparation des peptides sur la colonne va ainsi éviter leur agrégation.
Le surnageant précédemment isolé est injecté sur chromatographie en phase inverse (matrice
C8) préalablement équilibrée avec 0.05% acide trifluoroacétique (TFA) et 2% acétonitrile.
L’élution des peptides fixés à la colonne est accomplie grâce à un gradient d’acétonitrile de 2
à 80%, la fraction Aβ42 est éluée à 33% d’acétonitrile (figure 11A et B). Cette fraction est
concentrée puis lyophilisée afin d’être conservée à –20°C. Le rendement final de Aβ42 est de
4mg/L de culture (ce qui nous fait un rendement de 43% par rapport aux 25mg/L de Aβ42-
Ub).
Comportement de différents peptides Aβ42 sur la viabilité cellulaire Afin de vérifier que les peptides Aβ1-42 ainsi synthétisés ont gardé toute leur capacité à
s’agréger, des expériences de viabilité cellulaire ont été réalisées à partir du peptide Aβ42,
Ub-Aβ42 et d’un peptide synthétique Aβ42 commercialisé. Ce type d’étude est mené sur des
neuroblastomes, ce sont des lignées cancéreuses de neurones.
Test impliquant la réduction du MTT Cf. annexe
MTT : 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltétrazolium bromide
Les tests de viabilité faisant varier soit la concentration de peptides Aβ42 soit la durée
d’exposition sont réalisés grâce au MTT. De cette manière il a pu être déterminé que la
viabilité des cellules diminuait face à une augmentation de la concentration en peptides
(jusqu’à 4μM) (figure 12).
Figure 12 Graphique représentant un test de viabilité au MTT sur des neuroblastomes SH-SY5Y en fonction de la concentration en peptide Aβ42. Les cellules sont incubées soit avec Aβ42 recombinant, soit Aβ42 commercial (synthèse chimique), soit Ub-Aβ42 ou soit un témoin H6-Ubà différentes concentrations 1, 2 et 4μM. La viabilité cellulaire est mesurée au bout de 48h. Le profil similaire de Aβ42 recombinant et commercial montre une diminution de la viabilité cellulaire de 60% pour une concentration de 4μM.
H6-Ub
H6-Ub/ Aβ42Aβ42 commercialAβ42 recombinant
15
0 μM 4 μM
H6-Ub (témoin) 100% viabilité 100% viabilité
H6-Ub-Aβ42 100% viabilité 60% viabilité
Aβ42 100% viabilité 35% viabilité
Aβ42 synthétique 100% viabilité 40% viabilité
De la même façon il a été montré que la viabilité des cellules diminuait face à l’allongement
de la durée d’exposition aux peptides Aβ42 ( figure 13).
Figure 13 Graphique représentant un test de viabilité cellulaire au MTT sur des neuroblastomes SH-Sy5Y en fonction du temps d’exposition 12, 24 et 48h avec différents peptides Aβ42 présentés à la figure 12 à une concentration de 5μM.
0 h 50 h
H6-Ub (témoin) 100% viabilité 100% viabilité
H6-Ub-Aβ42 100% viabilité 60% viabilité
Aβ42 100% viabilité 30%viabilité
Aβ42 synthétique 100% viabilité 30%viabilité
Test impliquant le Trypan blue dye exclusion Cf. annexe
Le test permettant de comparer la viabilité des cellules face aux différents peptides (Aβ42,
μb-Aβ42, Aβ42 synthétique) emploie la technique du Trypan blue dye exclusion. En mettant
en présence des neuroblastomes et 5μM de peptides Aβ42 pendant 36h, il a été constaté que
pour Aβ42 recombinant ou issu de synthèse chimique on avait ~50% de mort cellulaire alors
que Aβ42 en fusion avec l’ubiquitine n’engendrait que 35% de mort cellulaire (figure 14).
Le comportement de différents peptides Aβ42 sur la viabilité cellulaire
16
Figure 14 Test de viabilité cellulaire au trypan blue dye exclusion où on visualise le pourcentage de cellules mortes en fonction des différents peptides Aβ42 à une concentration de 5μM après 36h d’incubation. On remarque une nouvelle fois le profil similaire du peptide recombinant et commercial et une viabilité tout de même plus importante pour Ub-Aβ42.
Toutes ces expériences mettent en avant un comportement identique du peptide recombinant
et du peptide commercial (synthèse chimique) mais un comportement différent du peptide
fusionné à l’ubiquitine par rapport à ce même peptide dont la fusion à été clivée. Les effets
toxiques de Aβ42 et Ub-Aβ42 relèvent-ils d’une différence dans leur état d’oligomérisation ?
Chromatographie d’exclusion
La chromatographie d’exclusion permet, en regardant les volumes d’élution (figure 15), de
caractériser les différentes formes de peptides présentes en solution avant et après incubation
pendant 24h.
Figure 15 Profil d’élution en sortie de chromatographie d’exclusion.
A) Cas pour le peptide Aβ42 avant (trait gras) et après (trait pointillé) incubation B) Cas pour le petide de fusion Ub- Aβ42 avant (trait gras) et après (trait pointillé)
incubation Dans les deux cas l’échantillon est de 200μl à une concentration peptidique de 0.5mg/ml incubée à température ambiante pendant 24h. On remarque après incubation un état
Le comportement de différents peptides Aβ42 sur la viabilité cellulaire
17
d’oligomérisation beaucoup plus avancé pour le peptide seul que pour le peptide toujours en fusion
Les échantillons sont dissous dans du tampon 100mM Tris-HCl pH 7.5 à une concentration de
0.5mg/mL. On peut remarquer d’après les profils que l’incubation favorise les formes
oligomériques au détriment du peptide Aβ42 de manière beaucoup plus rapide pour le peptide
dont la fusion à l’ubiquitine a été clivée. Dans les deux cas on observe la formation
d’oligomères mais la fusion ralentirait néanmoins ce phénomène, ce qui pourrait expliquer la
différence de toxicité de ces deux composés.
Le comportement de différents peptides Aβ42 sur la viabilité cellulaire
18
Conclusion, discussion Par cette stratégie de protéine de fusion à l’ubiquitine, les auteurs ont voulu conserver tous les
avantages des protéines de fusions en évitant l’inconvénient majeur du clivage de cette fusion.
En général le clivage des protéines de fusion peut-être soit enzymatique et de ce fait pas
toujours très spécifique mais surtout il apporte une hétérogénéité de l’extrémité N-terminale
de la protéine d’intérêt, soit chimique mais dans ce cas on se doit de protéger les acides
aminés susceptibles d’être modifiés par la réaction. Or dans le cas de la production de
peptides Aβ1-42, on veut obtenir une séquence comprenant exactement les acides aminés 1 à
42 avec le plus de facilité possible, c’est donc pour cela que la fusion à l’ubiquitine fût
envisagée dans le cas de ce peptide ayant de forte tendance à s’agréger au cours de sa
production.
Comme il a déjà été mentionné précédemment, il existe naturellement chez les eucaryotes
uniquement des protéines de fusion à l’ubiquitine mais également des enzymes spécifiques
capables de cliver cette fusion. Ces enzymes ne se retrouvent pas chez E. coli de ce fait on
pourra produire des protéines fusionnées à l’ubiquitine sans craindre un clivage dans la
bactérie. Malgré cela certains auteurs ont constaté un clivage de leur fusion sans toute fois
pouvoir en expliquer l’origine (figure 16).
Figure 16 Gel d’électrophorèse SDS-PAGE 10% De la purification par chromatographie d’affinité au Ni de protéines de fusion à l’ubiquitine exprimée chez Escherichia coli. La ligne portant un astérisques représente l’ubiquitine clivée de sa fusion or il n’existe pas chez la bactérie d’enzymes capables de réaliser ce type de coupure. Ce phénomène reste inexpliqué [ref 24].
Conclusion, discussion et perspectives
19
L’utilisation de l’ubiquitine en temps que fusion a été largement étudié à la fois dans la levure
[ref 23] où elle semble considérablement augmenter les rendements de productions protéiques
apparemment en favorisant l’initiation de la traduction mais également dans la bactérie où elle
semble avoir les mêmes répercussions sur le rendement protéique [ref 24].
Au vue de tous les avantages apportés par la fusion à l’ubiquitine, on peut donc imaginer une
prochaine fusion avec la protéine SUMO qui comme l’ubiquitine existe naturellement en
protéine de fusion chez les eucaryotes mais pas chez les procaryotes. La fusion SUMO
augmente la solubilité des protéines. De même, il existe des SUMO C-terminal hydrolase-
isopeptidase qui clivent la fusion de manière spécifique en reconnaissant la structure
tridimentionnelle de SUMO sans amener d’acides aminés supplémentaire en N-ter [ref 25].
Ces enzymes sont des protéases à cystéine qui peuvent cliver des fusions où la protéine
d’intérêt a une masse comprise entre 6 et 110Kda, dans des conditions extrêmes de pH,
température et force ionique, cependant le clivage n’est pas efficace si l’acide aminé qui suit
est une proline.
Néanmoins comparé aux ubiquitine hydrolases il semble que le clivage de SUMO requière
une quantité moindre en enzyme. Enfin cette technique s’est même améliorée en faisant une
deuxième génération de protéine SUMO qui augmente l’expression des protéines ainsi que
des protéases plus robustes que Ulp1 [ref 25 et 26].
L’utilisation de la fusion à l’ubiquitine nécessite donc la production de l’enzyme capable de
réaliser son clivage. Dans le cas étudié ici les auteurs ont choisi une ubiquitin C-terminal
hydrolase de levure (26Kda) : YUH-1 dont l’utilisation semble limitée à la fusion avec de
petites protéines de 50 à 80 acides aminés dont l’acide aminé N-ter doit être autre que la
proline. Cependant il existe d’autres protéases insensibles à la taille de la fusion : les UCH.
Les auteurs ne mentionnent à aucun moment les rendements de purification, la pureté finale et
l’activité de l’enzyme, ce qui ne nous permet pas de comparer avec la production d’autres
enzymes (par exemple la production de Usp2-cc est de 20mg/L de culture avec une pureté de
95% et une activité de clivage de 6.3mg de produit/min/mg d’enzyme [ref 18]).
Finalement cette technique de fusion à l’ubiquitine a permis de produire le peptide Aβ42 en le
préservant de l’agrégation sans toutefois altérer sa toxicité vis à vis des cellules. Cependant on
retiendra que la protéine de fusion n’a pas été directement soluble puis que cela a nécessité
l’utilisation de tampon 8M urée. Ceci sous-entend donc la production en corps d’inclusion
Conclusion, discussion et perspectives
20
non mentionné dans la publication tout comme les étapes permettant la purification de ces
corps d’inclusion des débris cellulaires.
Néanmoins la stratégie des protéines de fusion se trouve être d’une grande aide dans la
production de protéines peu exprimées, peu stables, peu solubles ou encore toxiques. Mais
face à la synthèse chimique elle présente encore un avantage supplémentaire qui repose sur la
facilité à réaliser des mutations sur la séquence peptidique. Plus particulièrement dans le cas
du peptide Aβ puisqu’il a souvent été démontré l’importance de la séquence en acides aminés
sur son comportement soluble ou insoluble ce qui est largement démontré avec le
comportement très différent de Aβ42 face à Aβ40 et ce par un écart de 2 acides aminés
seulement.
Conclusion, discussion et perspectives
21
Perspectives De cette dernière observation est apparue l’idée d’étudier l’influence des acides aminés de
Aβ1-42 sur sa capacité à s’agréger. Pour de telles expériences la mutagénèse aléatoire peut
donc être envisagée, mais afin de pouvoir rapidement cribler les différentes mutations et leurs
conséquences l’utilisation de protéine rapporteuse en fusion avec notre peptide semble être
une bonne stratégie. Partant de cette hypothèse des chercheurs ont réalisé une fusion C-
terminale de Aβ1-42 avec la GFP (figure 17-18).
Figure 17 Représentation de la structure cristalline de la proteine GFP (green fluorecent protein) On note la structure en « tonneau β » (représentation en vert sur la structure) qui forme une cage protégeant le fluorochrome( en jaune) formé par un repliement particulier de trois acides aminés. (en bleu on visualise les hélices α et en brun des séquences moins ordonnées)
Figure 18 A) schéma de la construction de la protéine de fusion. La séquence génique comprend sous promoteur T 7 la séquence de Aβ1-42 suivie en C-terminal par un linker de 36 paires de bases faisant la jonction avec la séquence de la GFP [ref 27]. B) Schéma global du principe de cette fusion à la GFP en fonction de l’état d’agrégation de notre protéine. Selon la voie de gauche, on observe une agrégation du peptide Aβ42 qui va entraîner l’agrégation de la GFP qui ne pourra donc pas fluorescer. Tandis que la voie de droite montre un repliement correct du peptide qui permet à la GFP de se replier et d’émettre de la fluorescence. La visualisation de la solubilité de Aβ1-42 par la présence de fluorescence (criblage) et illustré par l’image C [ref 27].
Conclusion, discussion et perspectives
C
22
Acides aminés et agrégation
L’agrégation rapide du peptide Aβ42 rend difficile toutes les études structurales. Néanmoins
il est possible d’observer le comportement de ce peptide face à l’agrégation, en réalisant des
mutants géniques [ref. 27].
De précédentes études ont révélé l’importance de certains acides aminés dans le phénomène
d’agrégation du peptide Aβ42. Une technique de criblage à haut débit utilise la fusion en C-
terminal de l’Aβ42 avec un gène rapporteur (GFP) (figure 17) afin de visualiser l’agrégation.
L’utilisation de la GFP pour suivre le phénomène d’agrégation repose sur le fait que pour que
cette protéine émette de la fluorescence, elle doit être convenablement repliée or cela prend
environ 30min. Si le peptide qui lui est fusionné s’agrége alors la GFP n’aura pas le temps de
se replier et donc n’émettra pas de fluorescence. C’est sur cette base que repose le criblage
des différentes mutations en fonction de l’intensité voire l’absence de fluorescence (figure
18).
Trois types de banques de mutants sont réalisés, la première utilise les erreurs de
polymérisation de la Taq polymérase, qui cible principalement les bases A et T, au cours des
cycles PCR, la seconde utilise la polymérase Mutazyme, qui cible les bases GC et la dernière
est réalisée par une synthèse de novo du gène Aβ42 en utilisant des oligos « dopé » dont le
principe est de mettre à chaque position 97% de la bonne base et 1% de base incorrecte.
Si le peptide Aβ42 ainsi muté devient soluble on aura émission de fluorescence plus ou moins
intense.
Sur la séquence du peptide Aβ42 on trouve 4 zones hydrophobes pouvant engendrer
l’agrégation : L17,V18,F19 / I31, I32 / L34, M35, V36 / V39, V40, I41, A42
(Tableau II)
Sur les 94 mutations pour lesquelles on a émission de fluorescence, 54 sont situées sur ces
zones hydrophobes et présentent une agrégation moindre que le peptide Aβ42 sauvage. Ces
résultats pourront servir à la construction de peptides interagissant principalement au niveau
de ces zones hydrophobes pouvant ainsi diminuer l’agrégation des peptides d’amyloide.
Conclusion, discussion et perspectives
23
24
Finalement toutes ces informations obtenues à partir de diverses expériences permettent petit
à petit de mieux comprendre les phénomènes d’agrégations du peptides Aβ42 ainsi que son
comportement in vivo. Cependant le chemin est encore long avant d’arriver à un modèle de
fonctionnement de ce peptide et ensuite parvenir à trouver des inhibiteurs capables de contrer
ses effets toxiques sur les cellules nerveuses.
25
Annexe
La technique de coloration au Bradford
On observe une fixation non covalente du bleu de coomassie G250 sur les protéines. Cette
méthode quantitative est peu sensible à la composition en acides aminés des protéines. La
variation de coloration se mesure par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 580nm.
L’absorbance est convertie en concentration grâce à une courbe d’étalonnage établie avec la
serum albumine bovine (BSA).
Principe du test de viabilité au MTT
MTT : 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltétrazolium bromide
Le MTT est un sel de tétrazolium, de couleur jaune. Dans les cellules vivantes il est
métabolisé par les oxydoréductases, dans les mitochondries, en molécule cristalline de
formazan. Cette molécule de couleur bleu/violet absorbe la lumière à 570nm. Plus
l’absorbance à cette longueur d’onde est élevée plus la viabilité cellulaire est bonne.
Principe du test de viabilité au trypan blue dye exclusion
Il s’agit d’un colorant non toxique pour la cellule, qui a tendance à entrer naturellement dans
les cellules. Si la cellule a une bonne viabilité elle rejettera ce colorant dans le milieu. Dans le
cas contraire c’est à dire lorsque la cellule est morte le colorant va s’accumuler dans la cellule.
Grâce à cette technique on peut visualiser les cellules vivantes des cellules mortes.
26
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