Embed Size (px)
Citation preview
14dansk kemi, 86, nr. 9, 2005
Ny LC-MS/MS?- Så er det også os!
48 16 62 00 · Gydevang 17-19 · 3450 Allerød
AAS · ICP/MSUV-VIS · LC/MSGC/MS · FT-IR/NIR
Viden om proteiner er vigtig i mange forskellige sammenhænge.Er det rekombinante protein korrekt udtrykt? Er proteinkilden iråvaren som forventet? Hvad er det for et protein, mælkesyre-bakterien udskiller - og hvilken rolle spiller det? Hvilke protei-ner interagerer med hinanden? Teknologisk Institut har gennemde sidste år har opbygget en ekspertise, der kan give svar påmange af de spørgsmål, der opstår i en forsknings- ogudviklingsproces.
For mange bioteknologiske virksomheder er viden om protei-ner essentiel - lige fra opdagelsen af et potentielt medicinskprodukt til introduktionen af produktet på markedet. Og dele affødevareindustrien har et stort behov for at kunne karakterisereproteiner, både i forhold til kvalitetskontrol, men også mhp. atgive proteiner nye egenskaber og dermed skabe højværdipro-dukter.
Opbygning af proteinerProteiner og deres funktioner i levende organismer er stærktvarierede. Nogle proteiner er samlet i strukturer som muskel-fibre eller bundet i cellemembraner og fungerer som receptorer.Andre har friere bevægelighed og deltager i signalkaskaderinde i cellerne eller som enzymer i biokemiske omsætnings-veje, og endnu andre, f.eks. antistoffer, transporteres rundt ihele kroppen.
Alle proteiner har dog byggestenene til fælles, nemlig de 20forskellige aminosyrer, som kan sammensættes på så mangemåder, at de tusindvis af proteiner, der er defineret af en orga-nismes DNA, er unikke.
Beslægtede arter kan have homologe proteiner, der er no-genlunde ens i opbygning og virkemåde. De indeholder oftemeget konserverede områder, hvilket betyder, at aminosyrese-kvensen stort set er uforandret. Mellem homologe proteiner erder typisk forskelle i bestemte områder. Nogle gange ikke retmeget - det kan være en udskiftning eller udeladelse af enaminosyre, eller det kan være en tilføjelse af en hel række afaminosyrer. Det er interessant rent evolutionsmæssigt, menkan også bruges direkte til at identificere proteiner ved se-kvenssammenligning. Så ud over at kunne identificere et gi-vet protein er det derfor også ofte muligt at afgøre, hvilken artdet stammer fra, hvis man kender dele af proteinets aminosy-resekvens.
Proteinkarakteriseringved massespektrometri- fra fødevarer til kræftforskningAf Mette Rindom Nørrelykke, Hans Peter Sørensen og Hans Christian Beck, Teknologisk Institut
BIOTEKNOLOGI
Karakterisering af proteinerTidligere har det været et stort arbejde at identificere et protein.Der kunne foregå et stort karakteriseringsarbejde bestående afaktivitetsmålinger, størrelsesseparation og affinitetsoprensning.Det gik forud for sekventering af en mindre del af proteinetmed Edman-degradering, hvor aminosyrer spaltes fra proteinetén efter én og bestemmes. Den opnåede aminosyresekvenskunne derefter sammenholdes med de relativt få kendte se-kvenser, for at opnå identifikation af proteinet.
I dag er mange organismers genom sekventeret og oversat tilproteinsekvenser, som er tilgængelige i databaser. Dette, sam-menholdt med udviklingen inden for massespektrometri, harbetydet, at proteiner kan identificeres hurtigere end nogensinde[1]. Ud over at være hurtigere end tidligere anvendte metoderudmærker massespektrometri sig ved stor specificitet og brugaf en meget lille prøvemængde og er derfor blevet »the methodof choise« til identifikation af proteiner.
Selvom man kan undgå en stor del af det tidligere karakteri-seringsarbejde, er de klassiske proteinkemiske metoder imid-lertid ofte relevante, når proteiner af særlig interesse skal isole-
Figur 1. Eksempel på separation af proteiner ved todimensionel gelelektroforese.
15 dansk kemi, 86, nr. 9, 2005
BIOTEKNOLOGI
res og karakteriseres. Kromatografi, isoelektrisk fokusering oggelelektroforese bruges ofte til at separere proteiner før enmassespektrometrisk identifikation.
Isoelektrisk fokusering og gelelektroforese anvendes ofte ikombination, og kaldes todimensional-gelelektroforese (2DE).Ved 2DE separeres proteinerne først i forhold til deres isoelek-triske punkt, hvorefter de separeres efter størrelse (figur 1).Forskning, der tager udgangspunkt i at sammenligne en celleseller en organismes totale proteinindhold (proteomet) underforskellige påvirkninger, anvender ofte 2DE til at sammenlignemængden af de enkelte proteiner udtrykt ved forskellige betin-gelser. Interessante protein-pletter på gelen kan dernæst skæresud til massespektrometrisk analyse.
Proteinidentifikation ved massespektrometriIdentifikation af proteiner med massespektrometri indledesmed en enzymatisk spaltning af proteinet til peptider (figur 2,side 16). Det gøres for at opnå mindre fragmenter i nogenlundeensartet størrelse, som derefter ioniseres og analyseres imassespektrometret.
Det hyppigst anvendte enzym er trypsin, der kløver efteraminosyrerne arginin og lysin. Den ønskelige størrelse på pep-tiderne er 7-15 aminosyrer, men større og mindre peptider kanogså analyseres.
De resulterende peptider introduceres i massespektrometretpå to forskellig måder, enten ved »matrix assisted laser desorp-tion« (MALDI) eller ved »elektrospray-ionisering« (ESI).
Ved MALDI fordampes og ioniseres peptiderne ved beskyd-ning med en laserstråle, hvorefter de detekteres i massespektro-metret. Teknikken er hurtig, men giver kun information om,hvor store de analyserede peptider er - såkaldt »peptide map-ping«. ESI adskiller sig ved, at peptiderne tilføres i en væskefa-se og ioniseres i spændingsfeltet ved indgangen til massespek-trometret. ESI er en langsommere teknik, men giver også mu-lighed for at få information om aminosyrerækkefølgen af deenkelte peptider.
På Teknologisk Institut karakteriseres proteiner med et mas-sespektrometer med ESI, hvor der før instrumentet er tilkobleten nanoflow HPLC. Herved separeres den komplekse peptid-blanding på en nano-LC-kolonne med en indre diameter på 75µm og ved flow på 250 nl/min før MS-analyse. Først bestem-mes peptidernes masser (masse/ladningsforhold), og derefterfragmenteres de ved tandem-massespektrometri (MS/MS). Detresulterer i forskellig størrelse af peptidfragmenter, som detek-teres og samles til præcis information om peptidets aminosyre-sekvens. Med disse informationer kan proteinet identificeresved søgning i sekvens-databaser med forskellige søgealgorit-mer.
Post-translatoriske modifikationerUd over identifikation af de udvalgte proteiner er det relevant
16dansk kemi, 86, nr. 9, 2005
at se på de kemiske modifikationer. De tilføres ofte reversibelttil proteinet efter endt proteinsyntese, de såkaldte posttrans-latoriske modifikationer (PTM). Typer af modifikationer om-fatter bl.a. fosforylering, acetylering, methylering ogglykosylering.
Modifikationerne bidrager til yderligere at differentiere protei-nerne efter proteinsyntesen og har bl.a. til formål at regulere de-res funktion og aktivitet. PTM er essentielle, når det drejer sig
om f.eks. signaloverførsel i cellen, enzymaktivitet, hormonsti-mulering og regulering af cellevækst. Undersøgelser af PTM erderfor vigtige for forståelsen af en række cellulære processer.
Massespektrometri er et naturligt værktøj til at analyserePTM [2]. En modifikation afsløres i MS/MS-spektret ved atden aminosyre, hvorpå modifikationen er placeret, opnår enmasseforøgelse, svarende til den pågældende kemiske gruppe.
Det kan være vanskeligt at måle, at et protein er modificeret,idet det ofte kun er en mindre del afden samlede mængde, der er modifi-ceret. Derfor kan den modificeredefraktion opkoncentreres på forskelligmåde inden massespektrometrisk ana-lyse. Affinitetsoprensning er ofte be-nyttet. F.eks. kan fosfopeptider opren-ses effektivt med Immobilized MetalAffinity Chromatography (IMAC) in-den MS-analyse.
Patenterbare resultaterOvennævnte teknikker anvendes i vo-res laboratorium til løsning af mange
www.rtpumps.dke-mail: [email protected]
+45 59 44 40 50
VakuumpumperLavtrykskompressorer
Sidekanalblæsere
Figur 2. Proteinidenti-fikation ved masse-spektrometri.(A) Den oprensedeproteinblandingsepareres vedgelelektroforese, 1Deller 2D.(B) Relevante gelbåndeller pletter udskæresog enzymbehandles(in-gel digestion).(C) Peptiderneekstraheres oganalyseres ved nano-LC og full-scan-MS ogderefter ved tandem-massespektrometriskanalyse, hvor peptiderudvælges til MS/MS-analyse.(D) Sekvensinformati-on fra MS/MS-spektrebruges til at søge iproteinsekvensdataba-ser.(E) for identitet afproteinet.
Figur 3. Proteom-analyse af torske-
muskel der har væretfrosset ved -30°C i 3,
6 eller 12 måneder.Proteinet i cirklen er
identificeret somtropomyosin, mens
proteinerne ifirkanterne er
identificeret somaktinfragmenter.
BIOTEKNOLOGI
17 dansk kemi, 86, nr. 9, 2005
forskelligartede problemstillinger, både i langvarige forsk-ningsprojekter med virksomheder, sektorforskningen og uni-versiteter, men også i korterevarende, rekvirerede ad hoc-opgaver. Der er mange forskellige eksempler på samarbejds-projekter, der har ført til spændende, patenterbare resultater.
Et samarbejde med en bioteknologisk virksomhed havde tilformål at karakterisere overfladeproteiner fra mælkesyrebakte-rier. Disse bakterier indtages sammen med syrnede mælkepro-dukter og har en helbredsfremmende, en såkaldt probiotisk ef-fekt. Vha. bakteriernes specielle overfladeassocierede proteinerkan de hæfte sig til slimlaget i tarmen og giver dermed en øn-skelig bakterieflora. Viden om disse proteiner muliggør en mål-rettet forskning i at øge den probiotiske effekt.
En anden bioteknologisk virksomhed, der arbejder inden forkræftforskning, er interesseret i at kende en bestemt post-trans-lationel modifikation på et protein. Denne modifikation har ef-fekt på cancercellers levedygtighed, og resultaterne skal brugestil at udvikle ny medicin.
Inden for fødevareforskningen har vi isoleret og karakterise-ret skimmelhæmmende proteiner fra plantefrø. Disse proteinerer en naturlig del af spirende frøs forsvarsmekanisme mod net-op skimmelsvamp, og det forretningsmæssige ønske er at kun-ne bruge disse proteiner som erstatning for nuværende konser-veringsmidler.
Proteinændringer i fiskFryselagringsforsøg med fisk har vist tab af strukturelle ogsmagsmæssige egenskaber [3]. Danmarks Fiskeriunder-søgelser har gennem flere år arbejdet med proteinkvalitet affisk med en proteomics-orienteret vinkel for at forstå og imø-degå kvalitetsændringer på proteinniveau. Ændringerne kanomfatte oxidation, krydsbinding eller nedbrydning af prote-inerne. Viden, om hvilke proteiner, der ændrer sig, er vigtigfor at kunne forstå mekanismen i kvalitetsændringen underlagring.
I samarbejde med Teknologisk Institut er der identificeret fle-re proteiner, der ændrer mængde ved langtidsopbevaring, bl.a.aktin og tropomyosin, der stammer fra fiskens muskelvæv. I fi-gur 3 ses udsnit af 2D-geler, hvor intensiteten af de markeredepletter angiver en ændring. Proteom-gelerne er lavet på Dan-marks Fiskeriundersøgelser og analyseret af Inger V. H. Kjærs-gård. En nærmere beskrivelse af proteomanalysen og MS/MSaf torskeproteinerne er beskrevet i [4].
Fra forskning til kvalitetskontrolKarakterisering og identifikation af proteiner ved massespek-trometri er relevant i mange forskellige discipliner, både pådet klassiske proteinkemiske område, i den bioteknologiskeforskning, men også i den fødevareteknologiske udviklings-proces.
Anvendelsesområdet strækker sig fra forskning til kvalitets-kontrol.
E-mailadresser:Mette Rindom Nørrelykke: [email protected] Peter Sørensen: [email protected] Christian Beck: [email protected]
Referencer1. Lane, C.S. Mass spectrometry-based proteomics in the life sciences.
Cell. Mol. Life Sci. 2005; 62: 848-8692. Mann, M., Jensen, O.N. Proteomic analysis of post-translational
modifications. Nat. Biotech. 2003; 21: 255-261.3. Mackie, I. M. The effects of freezing on flesh proteins. Food Rev. Int.
1993; 9: 575-610.4. Kjærsgård, I.V.H., Nørrelykke, M.R., Jessen, F. Changes in cod muscle
proteins during frozen storage revealed by proteome analysis andmultivariate data analysis. Proteomics. Indsendt.
BIOTEKNOLOGI
