Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU

1

17.12.2014/Çarşamba

Laboratuvar 10

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER: Kromotografi ve

Spektrofotometri

AMAÇ: Moleküler biyolojide kullanılan temel tekniklerler olan kromotografi ve

spektrofotometrinin çalışma prensibini anlamak.

KAZANIMLAR:

Bitkilerde fotosentezde yer alan pigmentleri ve ekstraksiyon ve tayin yöntemlerini

öğrenir.

Kromatografi ile klorofil ve karotoneidlerin ayrılmasını öğrenir.

Spektrofotometre kullanabilmeyi öğrenir.

GENEL BİLGİ:

Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak

üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir. İlk

kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu

yöntemi bitki pigmentlerinin renkli bileşenlerini ayırmakta kullanmıştır. Kullandığı kolonda

renkli bantlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermiştir.

Kromotografinin kolon, kağıt, sıvı, gaz ve ince tabaka gibi çeşitleri vardır.

Spektrofotometri, ışık kaynağı ile prizma arasına yerleştirilen renkli maddenin ışık

spektrumunun bazı renklerini absorplaması ve konsantrasyona göre spektrumda zayıf veya

kuvvetli bant göstermesi özelliğine dayanan miktar tayin yöntemidir. Analiz edilen örnek

üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre

veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği

yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar.

Spektrofotometreler, madde renginin yoğunluğunun ölçülmesiyle madde miktarının

veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan cihazlardır. Spektrofotometrelerde

konsantrasyonu bilinen bir standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans, optik

dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır.

Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli absorpladığı dalga boyunda

seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda (yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga

boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda)

ışık seçilir.

Spektrofotometrelerde çözeltideki madde için uygun seçilen dalga boyundaki ışığın

örneğe ve standarda (bilinen konsantrasyondaki çözelti) ait absorbansları veya optik

densiteleri (A, OD) karşılaştırılıp matematiksel işlemler yapılarak örnekteki maddenin

konsantrasyonu bulunur.

Bir spektrofotometre düzeneği; başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi

(monokromatör), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal

bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür (Şekil 1).

Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU

2

Şekil 1: Spektrometre kısımları.

Spektrofotometrede doğru bir ölçüm yapabilmek için;

Dalga boyuna uygun, birbiriyle uyumlu, iyi kalite küvetler kullanılmalı,

Küvetlerin temiz ve çizilmemiş olmasına dikkat edilmeli,

Aşınma ve eskimeden gelebilecek farklılıkları belirlemek için küvetler düzenli olarak

birbirlerine karşı kalibre edilmeli,

Küvetler cihaza yerleştirilirken ışık giriş ve çıkış yönlerine küvetlerin cilalı kısımlar

gelmeli,

Kullanım esnasında cilalı olan kısımlardan tutulmamalı,

Küvetler kurutma veya başka amaçlarla ısıtılmamalıdır.

Spektrofotometrelerin Çalışma Prensibi

Spektrofotometrelerin temel çalışma prensibi, hazırlanan çözeltiden belirli dalga

boyunda ışık geçirilmesi ve bu ışının ne kadarının çözelti tarafından tutulduğunun bulunması

esasına dayanır. Çözeltinin içerisindeki madde miktarı ne kadar fazla ise çözelti tarafından

tutulan ışın miktarı da o oranda fazla olur. Çözelti içerisindeki bütün maddeler, ışının bir

dalga boyunu tutarken diğerlerini yansıtır veya geçirir. Maddenin belli bir dalga boyundaki bir

ışını tutması, onun diğer fiziksel ve kimyasal özellikleri (yoğunluk, erime, kaynama noktası,

donma noktası vb.) gibi sabit bir özelliğidir.

Spektrofotometrik Ölçümün Yapılışı

Spektrofotometrede ölçüm yapılırken numuneye belirli bir dalga boyundaki ışın

gönderilerek numunenin absorbe ettiği ışın miktarı ölçülür. Yapılan analize göre ölçümde

hangi dalga boyundaki ışının kullanılacağı analiz metodunda belirtilmektedir. Kullanılacak

ışın dalga boyu bilinmiyorsa miktarı tespit edilecek maddenin 1 molar çözeltisi hazırlanıp

çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. En yüksek değerin ölçüldüğü dalga

boyu belirlenerek kullanılır. Spektrofotometre bu dalga boyuna ayarlanarak çözeltilerin

ölçümüne geçilir.

Spektrofotometrik ölçüm için üç tip çözelti hazırlanır. Bunlar: Kör, numune ve

standart çözeltileridir.

1- Kör (tanık, şahit) Çözelti: Spektrofotometrede okuma yapmadan önce absorbansı

sıfıra veya % transmittansı 100’e ayarlamak için kullanılan çözeltidir. Bu amaçla yapılan

işleme “kör ayarı” veya “0 ve 100 ayarı” denir.

Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU

3

2- Standart Çözelti: Miktarı bulunmak istenen maddenin bilinen

konsantrasyonlardaki çözeltisidir. Bir veya birden fazla olabilir. Birden fazla olduğunda

grafik çizilir.

3- Numune Çözeltisi: İçindeki madde miktarını tespit etmek istediğimiz çözeltidir.

Spektrofotometrik ölçüm yapılırken şu aşamalar takip edilir:

Ölçümden yeterli süre önce cihaz çalıştırılarak ısınması sağlanır.

Cihaz ölçümün yapılacağı dalga boyuna ayarlanır.

Küvete kör çözelti konularak cihaza yerleştirilir.

Kör çözelti ile cihazın 0 ve 100 ayarı yapılır.

Küvete standart çözeltilerden konularak cihaza yerleştirilip okumaları yapılır.

Küvete numune çözeltisi konularak cihaza yerleştirilip okuması yapılır.

Kalibrasyon (absorbans) eğrisi çizilerek, numunenin konsantrasyonu hesaplanır.

Hesaplamalar

Milimetrik kâğıt üzerinde hazırlanan kalibrasyon grafiğinde, numuneye ait absorbans

değerinin grafikle kesiştiği nokta işaretlenip bu noktanın x ekseni (apsis) ile kesiştiği

noktadaki konsantrasyon tespit edilir. Bulunan bu değer numune çözeltisinin

konsantrasyonudur.

Bu metotla konsantrasyon hesaplanmasında;

Öncelikle standartlara ait kalibrasyon eğrisi hazırlanıp y eksenine (ordinat) numunenin

absorbans değeri (cihaz okuması) işaretlenir.

İşaretlenen noktadan kalibrasyon eğrisine dik bir doğru çizilip kesişme noktası tespit

edilir.

Çakışma noktasından x eksenine (apsis) dik bir doğru çizilir.

Çizilen dik doğrunun apsisle kesişme noktası numunenin konsantrasyonunu verir.

Numune çözeltisine seyreltme uygulanmışsa analiz numunesine ait konsantrasyon

tespit edildikten sonra bu değer seyreltme faktörü ile çarpılarak numuneye ait gerçek

konsantrasyon tespit edilir.

Milimetrik Kâğıtta Kalibrasyon Eğrisi Çizme

Milimetrik kâğıtta kalibrasyon eğrisi şu şekilde çizilir:

Öncelikle milimetrik kâğıt üzerine koordinat düzlemi çizilir.

Konsantrasyonlar x eksenine (apsis), konsantrasyonlara ait absorbans değerleri y

eksenine (ordinat) işaretlenir.

Her bir konsantrasyonun absorbans değerleri ile birleşme noktaları işaretlenir.

İşaretlenen noktalar birleştirilerek kalibrasyon eğrisi elde edilmiş olur.

Konsantrasyonlar ve absorbans değerleri koordinat düzlemine yerleştirilirken 0

noktasından başlanarak küçükten büyüğe doğru ve büyüklüklerine uygun aralıklarla

yerleştirilmelidir. İki değer arasındaki aralık değerlerin büyüklüğü ile doğru orantılı olmalıdır.

En küçük değer yerleştirildikten sonra takip eden değerler bununla orantılı olarak

yerleştirilmelidir.

Örnek: Konsantrasyonları ve bu konsantrasyonlara ait absorbans değerleri aşağıda verilen

standart çözelti serisine ait kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ile Şekil 2’deki grafik elde edilir.

Konsantrasyonlar (mg/l) Absorbans Değerleri

0,0 0,0

0.5 0.2

1.0 0.4

1.5 0.6

2.0 0.8

Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU

4

Şekil 2. Kalibrasyon grafiği.

UYGULAMA 1: Bitkilerde fotosentezde yer alan pigmentlerinin ekstraksiyonu ve

klorofilin bazı özelliklerinin belirlenmesi

Fotosentezde rol alan pigmentlerin en önemli görevi güneş ışınlarını absorbe etmektir.

Bu pigmentlerin cinsi, organizmadan organizmaya değişebilir. Bunlar klorofiller,

karatenoidler, ve fikobilinlerdir. Klorofiller yeşil renkli pigmentler olup fotosentezde esas

rolü üstlenmişlerdir. Klorofil a, klorofil b, klorofil c ve klorofil d olmak üzere dört ayrı tipi

vardır. Karotenoid pigmentleri renkleri sarıdan mora kadar değişen lipid yapısındaki

bileşiklerdir. Fotosentezde rollerine ilave olarak, başka görevlerde yaparlar. Fikobilinler ise

fikobilin adı verilen pigment maddesi ve proteinlerin oluşturdukları komplekslerdir.

Fikoeritrin ve fikosiyanin gibi fikobilin çeşitleri fotosentez olayında ışık absorbe ederek

klorofil moleküllerine yardımcı olurlar ve yüksek bitkilerde bulunmazlar.

MATERYAL:

Yeşil bitki yaprağı (ıspanak)

Santrifüj

Havan ve havan eli

Spektrofotometre

Pipet

%80’lik aseton

Santrifüj tüpü

Eppendorf tüpü

Tülbent

YÖNTEM:

a) Fotosentezde Rol Alan Pigmentlerin Ekstraksiyonu

Bitkilerin yeşil yapraklarından (örn. Ispanak) 0,1 g tartarak, bir havanda 5 ml, %80

aseton içerisinde iyice ezilir.

Elde edilen pigment ekstraktı 3000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir.

Süpernatant (üstte kalan kısım) kısmı bir tüpe aktarılır.

Spektrofotometre küvetine %80’lik aseton konularak alet sıfırlanır.

Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU

5

Başka bir küvete aynı miktarda aseton ve 6 damla ekstrakt ilave edilerek karıştırılır.

Küvet spektrofotometreye yerleştirilir; 380 nm dalga boyundan başlanarak 700 nm’e

kadar 20 birimlik aralıklarla değişik dalga boylarında absorbans değerleri kaydedilir.

Grafiğin apsisine dalga boyları, ordinatına ise absorbans değerleri yazılır ve elde

edilen noktalar birleştirilerek bir grafik çizilir ve maksimum absorbans gözlenen pik

yerleri belirlenir (Şekil 3).

Şekil 3. Klorofil a, b ve karotenoidlerin absorbsiyon apektrumu ile fotosentez hızı

arasındaki ilişki

Not: Aletin her defasında sıfırlanması gerekir.

b) Klorofil ve Karotenoid Pigmentlerinin Kantitatif Tayini

Elde edilen pigment ekstraktının 645 ve 663 nm’lerdeki absorbans değerleri aşağıdaki

formüllerde yerine konarak; kla, klb ve toplam klorofil miktarları mg/1000 ml

cinsinden hesaplanır.

Klorofil a = 12,7 x A663 – 2,69 x A645

Klorofil b = 22,9 x A645 – 4,68 x A663

Toplam Klorofil = 20,2 x A645 + 8,02 x A663

Aynı zamanda ekstraktın 450 nm’deki absorbans değeri ölçülerek, ve yukarıda

hesaplanan kla ve klb miktarları aşağıdaki formülde yerine konularak karotenoid

miktarı mg/1000 ml cinsinden hesaplanır.

Toplam karotenoid (mg/1000 ml) = 4,07 x A450 – (0,0435 x kla miktarı + 0,3367 x

klb miktarı)

Not: Kalan pigment ekstraktları bir tüpe konarak ağzı sıkıca kapatılır ve bir sonraki

uygulamada kullanılmak üzere buzdolabında muhafaza edilir.

Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU

6

UYGULAMA 2: Fotosentezde Yer Alan Bitki Pigmentlerinin Kromotografi Yöntemiyle

Ayrılması

Burada kullanacağımız ince tabaka yönteminin esası, tabakalar üzerine yayılmış

silikajel destek ortamında, yürütücü (etanol) kullanarak pigmentleri ayırmaktır. Pigmentler,

etanolde çözünme durumlarına ve molekül büyüklüklerine göre birbirinden ayrılırlar.

Etanolde iyi çözünen ve molekül boyutu küçük olanlar daha hızlı yürür.

MATERYAL:

4 adet pasteur pipeti

Cetvel

4 adet beher

Alüminyum folye

Silikajel veya Whatmann Kağıdı (No1,3)

Pigment ekstresi

200 ml etanol

YÖNTEM:

Silikajelli yürütme plakları dikkatlice alınarak masanın üzerine konur.

Alt kısmından 1,5 cm olacak şekilde işaretlenerek; daha önceki deneyde hazırlanan

pigment ekstraktından pasteur pipetiyle 5-6 damla damlatılır. Damlatma işlemi

esnasında bir önceki damlanın kuruması beklendikten sonra diğeri damlatılmalıdır

(Şekil 4)

Şekil 4. Destek ortamlar ve numune uygulaması

Kromatografi tankına veya bir behere 1 cm yüksekliğinde etanol konarak ağzı sıkıca

kapatılır (Şekil 5).

Şekil 5. Pigmentlerin yürütülmesi

Biyoloji Laboratuvarı I-MBG113 Öğr. Gör. Dr. Fatma AYDINOĞLU

7

Ekstrakt damlatılan plaklar işaretli kısmı aşağıya gelecek şekilde tanka yerleştirilir.

Etanol yukarıdan 2 cm yüksekliğe ulaştığında plaklar tanktan çıkarılır ve pigmentlerin

yerleri (renklerine bakılarak) ile etanolün en son vardığı yer işaretlenir (Şekil 6).

Şekil 6. Kromotogram

Damlatma noktasından itibaren etanolün ve her pigmentin yürüdüğü mesafe cetvelle

ölçülerek kaydedilir ve aşağıdaki formül kullanılarak her pigment için Rf değerleri

hesaplanır ve tabloya yazılır (Tablo 1).

Rf = Pigmentin aldığı yol / etanolün aldığı yol

Bu şekilde çok sayıda ayrım yapıldıktan sonra pigmentlerin bulundukları yerlerdeki

silikajel bir kap içerisine kazınarak, biraz etanol veya aseton ilave edildikten sonra

santrifüjlenerek üstteki sıvı kısmı alarak her pigmenti ayrı olarak elde etmek ve ayrı

ayrı absorbsiyon spektrumlarını tayin etmek mümkündür.

Tablo 1: Kromatogram bulguları

Pigmentin adı Rf Değeri