Biyoteknoloji 12/05/2011

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

1/37

BYOTEKNOLOJ IBYOTEKNOLOJ I20052005--20062006

Prof. Dr. ule ARIProf. Dr. ule ARI

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

2/37

Mikroorganizmalarn rettikleriMikroorganizmalarn rettikleri

dk molekl arlkldk molekl arlklmaddelermaddeler

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

3/37

BiyodnmBiyodnm(Biyotransformasyon) Yoluyla(Biyotransformasyon) Yoluyla

retilen Metabolitlerretilen Metabolitler Mikroorganizmalar ok eitli organik bileikleri

kimyasal olarak deiiklie uratma

(biyodnmler veya biyotransformasyonlarbiyodnmler veya biyotransformasyonlar)yeteneine sahiplerdir. Biyodnm: mikroorganizmalarn bir bileii

yapsal olarak ilikili rnlere dntrmeleri B

u enzimatik reaksiyonlarda bir taraftanmikroorganizmann remesi iin gerekli substratmetabolize edilirken dier taraftan dabiyodnme uratlacak substrat metabolizeedilir=kometabolizma

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

4/37

BiyodnmBiyodnm

Biyodnmde bir veya az sayda enzimatikreaksiyon kullanlr

Genellikle tampon solsyonlarda gerekletirilir

Oysa fermentasyonla retimde ok saydaenzimatik reaksiyon sonucu rn oluur

Yzlerce farkl biyodnm reaksiyonunun

belirlenmesine karn fermentasyon ok pahalya da zor olduu durumlarda biyodnmreaksiyonlar ticari olarak kullanlr

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

5/37

BiyodnmBiyodnm

Biyodnm prosesinin kullanlmas iin nemligerekeler :

1. Substrat spesifisitesi: sadece bir spesifik reaksiyonaamas bir enzim tarafndan katalizlenir.

2. Blge spesifisitesi: moleklde birden fazla fonksiyonelgrup varlnda sadece spesifik bir pozisyona sahipolan etkilenir

3. Stereospesifite: rasemik karmlarda sadece bir form

dnme urar4. Reaksiyon koullar: enzimatik reaksiyonlar dahayumuak koullarda gerekletiinden daha azevresel zarara neden olma.

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

6/37

retimde biyodnmnretimde biyodnmnavantajlaravantajlar

y Reaksiyon says azaltlp, maliyetdrlebilir

rr:: Steroid biyotransformasyonlarndankortizol sentezi rneinde orijinalkimyasal sentez 37 aamal ve 1g kortizolmaliyeti 200$.

Mikrobiyal biyodnmle aama says11e gram bana maliyet ise 6$adrlmtr.

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

7/37


Verim arty mmobilizasyon uygulamas iin ideal (hcre ya da enzim

kullanm)y mmobilize hcre ya da enzim kullanmnn avantajlar ise;y canl hcrelerin blnmesini inhibe edebilecek yksek

konsantrasyonlarda substratn (r. 10g/l) kullanlabilmesi,y hcre remesi iin kullanlan kontaminant maddelerin gerekli

olmay,y rnn geri kazanlmasnn kolay olmas,

y verimin yksek (%85-100) olmas,y pH ve temparatr gibi koullarn tm hcre iin gereken

deerlerden bamsz seilebilmesi

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

8/37


Enzim araclyla yaplan dnmlerolduklarndan ve sadece birkaparametreyi ilgilendirdiinden kolaylklabyk lekli retime uygulanabilirlik

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

9/37


y Rekombinant DNA teknolojisinin uygulanmas iin idealadaydrlar

y Mevcut prosesin enzim dzeyi artrlabilir

yEkonomik olmayan prosesler ekonomik hale getirilebilir

y Enzim geninin klonlanmas ile enzim dzeyininartrlmas

y Klonlanma sonras side directed mutagenesis-blgeyezg mutagenez uygulamasyla enzimin termostabiltesi

veya substrat spesifisitesinin deitirilmesiy Sentetik sentez yollar oluturulabilir.r: CC vitaminivitamini retimi

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

10/37

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

11/37

Rekombinant DNA teknolojisi ile,

Oysa Corynebacteriumun 2,5-diketo-D- glukonik asit redktaz geniErwiniaya aktarlarak proses basite indirgenmitir.

Erwinia

D-glukoz 2,5-diketo-D-glukonik asit

Corynebacterium

2-keto-L- guloik asit

Kimyasal

Askorbik asit

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

12/37

Biyodnm verimlerine ait

rneklerMikroorganizma Substrat r n Verim (%%)

Gluconobacter suboxydans sorbitol Sorboz 98Gluconobacter suboxydans gliserin dihidroksiaseton 90Gluconobacter suboxydans glukoz 5-ketoglukonik asit 90

Gluconobacter suboxydans mannitol fruktoz 95Aspergillus niger glukoz glukonik asit 100Aspergillus oryzae L-triroksin L-dopa 100Pseudomonas fragi glukoz L-ketoglukonik asit 92Rhizopus nigricans progesteron 11-a-hidroksiprogesteron 90

Alcaligenes faecalis maleik asit fumarik asit 98Bacillus fructosus sorbitol fruktoz 90

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

13/37

Biyodnm prosedr

Mikrobiyal dnm iin, Sporlar

blnen hcreler dinlenme halindeki hcreler

Enzimler

immobilize hcreler

immobilize enzim ve enzim sistemleri

kullanlabilir

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

14/37

Biyodnm prosedrBlnmekte olan hcrelerinkltrleri kullanmndaBlnmekte olan hcrelerinkltrleri kullanmnda,1. uygun besiyerinde kltrleme2. remenin uygun bir evresinde (6.-24. saatler)

biyodnm istenen substratn konsantre biimde

kltre ilavesiYA DA1. ok fazla miktarda inokulm2. reme periyoduna giri beklenmeden konsantre edilmi

substrat ilavesi

SORUN: Konsantre substratn znmemesi Az znen maddelerin znrln artrmak iin

emlsifiye edici madde (deterjan, etanol, aseton, dimetilformamid, dimetil slfoksit gibi dk toksisiteli suyla

karabilir zcler) ilavesi

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

15/37

Biyodnm prosedr

Dinlenme halindeki hcrelerinkullanm ilave edilen substrat ile enzim indksiyonu gerekli

olmad durumlarda substrat tarafndan reme inhibisyonunu ortadan

kaldrd iin nemli bir avantajmmobilize hcre kullanm proses sreklilii tekrar tekrar hcre kullanm bir ya da birden fazla reaksiyon aamasn

katalizleyebilmer:Alanin, maleik asit, aspartik asit immobilize bakteri

hcreleri ile retilmektedir.

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

16/37

Biyodnm prosedr

Hcresiz enzim ekstrelerininkullanm immobilize enzimlerle yaplan proseslerde istenmeyen reaksiyonlarn gereklememesi iin

veya reaksiyon rnlerinin daha ileri ykmlarauramamasnn istendii durumlarda veyasubstratn hcre membran yoluyla transportedilerek kaybedildii durumlar iin

mmobilize enzim kullanm

srekli prosesler iinr: penisilin ailaz, glukoamilaz, glukoz izomeraz

biyotransformasyonlar

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

17/37

Biyodnm prosedr

1. Hcrelerin ortamdan ayrlmas (transformasyonreaksiyonlarnda son rnler genellikle ekstrasellerdirveya znm hale ya da sspanse olmu formdabulunurlar. Bakteri ve mayalar genellikle ayrlmazken

fungus miselleri filtrasyonla ortamdan uzaklatrlarlar)2. Hcrelerin tekrar tekrar ykanmas (nemli miktarda

reaksiyon rn hcrelere absorbe olmu haldedir)3. r nn znrlne bal olarak geri kazanma

ilemi (kalsiyum tuzlar halinde ktrme, iyondeitiricilerle adsorbsiyon, uygun zclerleekstraksiyon, buharlaan maddeler iin dorudanbesiyerinden distilasyon )

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

18/37

Biyodnm uygulamalar

Biyodnm reaksiyonlar ok eitli Ticari olarak kullanlanlar fazla deildir NK: biyodnm yoluyla retilecek rnn

pazarnn olmamas ya da retimin pahalya malolmasdr

Ancak , immobilize hcre/enzim kullanm veprosese spesifik genetik modifikasyonlar

yaplm mikroorganizmalarn gelitirilmesiyleticari lee uygun biyodnmreaksiyonlarnn says artmakta

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

19/37

Ekonomik adan nemli

biyodnm reaksiyonlar(1) steroid ve sterollerin biyodnm,

(2) steroid olmayan bileiklerinbiyodnm (C vitamini)

(3) pestisitlerin biyodnm

(4) antibiyotiklerin biyodnm

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

20/37

Steroid ve sterollerin

biyodnm Mikroorganizmalarn steroid ve sterol

substratlarn okside ve redkte etmeleriselektif ve spesifik biyotransformasyonlararnek oluturur

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

21/37

Steroid ve steroller

Glukokortikoidler, mineralokortikoitler, androjen, strojen,progesteron gibi steroidler hormon zelliinde olan doalmaddelerdir

Tm steroidlerin ortak zellikleri bir

siklopetanoperhidrofenantren yapsnda olmalar Hormon zelliinde olan steroidler tedavi amacyla

yaygn ekilde kullanlr Antitmr ve antienflamatuar zellikte steroidler var

Kortizon antienflamatuar olarak romatoid artrit ve eitlideri hastalklarnn tedavisinde kullanlmaktadr.

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

22/37

Steroid eitleri Kortikosteroidler:Adrenal korteks tarafndan

retilen hormonlar

strojenler ve Progesteron: Dii cinsiyethormonlar

Androjenler: Erkek cinsiyet hormonu

Karbohidrat ve protein metabolizmasnda,elektrolit, su dengesi,kardiyovaskular sistem iskelet kaslar, bbrek ve dier

organlarn fonksiyonlarnda etkin

Sekonder cinsiyet karakterlerinden, reme fonksiyonlarndan

sorumlu, doum kontrolnde kullanlmakta

Erkek sekondercinsiyet karakterlerinden, reme fonksiyonlarndansorumlu. Ayrca meme kanseri tedavisinde, androjen eksikliinde,geliimi kas bymesini ve krmz kan hcrelerinin yapmn

tevik eder

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

23/37

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

24/37

3 tane primer 18 tane sekonder

karbon atomu

18 karbon atomunun her biri Eya da F formu eklinde hidrolizeolabilir

Bu formlarn her biri farkl birmikrobiyal hidroksilaz ileoluturulur.

Hidroksilasyona ek olarak bazmikrobiyal enzimler A halkasn

aromatize ederler. Bylecealternatif steroid trevi oluumuartar.

ADC

B

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

25/37

Steroid hidroksilasyon rnekleri

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

26/37

Examples of SteroidExamples of Steroid--based Drugs in Use Todaybased Drugs in Use Today

CH3

O

CH3

O

CH3

Female SexHormone

CH3

CH3

CH2OH

O

O

OHOH

Anti-inflammatoryAgent

O

CH3

CH3

H

OH

OH

O

Congested HeartSymptoms

CH3

OH

O

CH3

Male SexHormone

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

27/37

Steroid ve sterollerin biyotransformasyonu,

steroid hormon maliyetini ok azaltr Orijinal kimyasal prosesle

1 gram kortizon asetat 31 ayr reaksiyonla 615 gram deoksikolikasitten meydana gelir, sentetik hormonun maliyeti 200$

Deoksikolik asit kz safrasndan elde edilir ve birok proses iinsubstrat

Mikrobiyal hidroksilasyon ile pogesteronun 11. karbon atomununE formunda hidroksile olmas rn fiyatn 1$a drmtr

Kortizonun ucuza mal edilmesindeki bir dier etken de substratolarak deoksikolik asit yerine soya ya retiminde ortaya kanyan rnlerden sitosterol ve stigmasterol gibi ucuz substratlarnkullanmdr

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

28/37

Steroid olmayan maddelerin

biyodnmAlkanlarn, aromatik, heterosiklik bileiklerin,

terpenlerin, alkoloidlerinmikroorganizmalarca transformasyonu

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

29/37

Steroid olmayan maddelerinbiyodnm

NEML TCAR RNEK ASKORBK AST RETM(L- askorbik asit C vitamini retiminde ve gda endstrisinde

antioksidan olarak kullanlr)Yllk retimi 40.000 ton

Askorbik retimi iin iki yol vardr1. Klasik yol (Reichstein-Grssner sentezi): Reichstein-GrssnersentezindeAcetobacter suboxydansn 30-35oCdeki oksijenli vekuvvetli kartrmal retimiyle D-sorbitol, L-sorboza dntrlr.Tm prosesin tamamlanmasyla 2kg glukozdan 1kg L-askorbik asitretilir

2. Rekombinant DNA teknolojinin uyguland modern yol:Rekombinant DNA teknolojisi ile Corynebacteriumun 2,5-diketo-D-glukonik asit redktaz geni Erwiniaya aktarlarak proses basiteindirgenmi

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

30/37

Steroid olmayan maddelerinbiyodnm

GLSEROLDEN DHDROKSASETON RETMDihidroksiaseton gne kremi ve dier kozmetik rnlerde

yer alreitli asetik asit bakterileri uygun besiyerinde 28oCda ve

6nn altndaki pHlarda gliseroln %10unu 72-96 saattedihidroksiasetona dntrrler.Gluconabacter melanogenus IFO 3293n oksijence zengin

ortamda retilmesiyle sre 33 saate dm ve rnmiktar 12.2g/g biyomastan, 35.8g/g biyomasakarlmtr.

Acetobacter suboxydans (%97)Gliserol dihidroksi aseton

Acetobacter xylinum (%100)

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

31/37

Antibiyotik transformasyonu

Biyotrasformasyonlar mevcut antibiyotiklerden; yeni antibiyotik retimi spektrumun geniletilmesi antibiyotik etkinliinin artrlmas toksisitenin azaltlmas oral emilimin artrlmas diren geliiminin ve alerjik etkinin azaltlmasgibi zelliklerinin gelitirilmesi/kazandrlmas iin kullanlr.

Ancak biyodnm iin kullanlacak antibiyotiin total ya da ksmiinaktivasyonu tehlikesine kar antibiyotik seimi nemlidir.

Antibiyotik biyotransformasyonuna ait ok sayda olas reaksiyonvardr.

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

32/37

Dolayl transformasyon

nhibitr veya modifiye prekrsrlerin ilavesi iledeiik antibiyotiklerin sentezi

r: cis-4-metil prolin varlnda Streptomycesparvulus iki yeni antibiyotik oluturur. Bu yeniantibiyotiklerden antinomisinde prolin yerineprolin analou olan cis-4-metil prolin gemitir.

Antibiyotik sentezinde baz zel yollarn blokeedilmesiyle yeni rnlerin retilmesi

r: Neomisin reticisi Streptomyces fradiaedebyle byle bir mutantta neomisin biyosentezininara rnlerinden ribostamisin antibiyotii birikimiolur.

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

33/37

Dorudan transformasyon

Mevcut antibiyotiklerin

asetilasyonu (Ac),

fosforilasyonu (P), ve adenilasyonu (Ad) ile yeni antibiyotiklerin

elde edilmesi

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

34/37

Dorudan transformasyon

Asetilasyon reaksiyonlar: eitli antibiyotikler iinbelirlenmi

Biyolojik olarak aktif olmayan deasetile rnlerin

semisentetik rnlerin oluumu iin kullanlmas

Farkl fosfotransferazlarla fosforilasyon Adenil transferazlarla adenilasyon aminoglikozid cinsi

antibiyotiklerin biyodnm iin kullanlan reaksiyon

tipleri

Adenilasyon, fosforilasyon ve deadenilasyongentamisinde deiikliklere yol aar ve aminoglikozidlerekar bakteriyal direncin gelimesinde rol oynar.

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

35/37

F laktam antibiyotik hidrolizi,

nemli,Hidrolizle penisilinlerde lakton halkasnn kopmas

ile antibiyotik inaktivasyonu

F-laktamazlar penisilinlerin ve sefalosporinlerinlakton halkalarn hidrolizle paralarlar(F-laktamantibiyotiklere bakteriyal diren)

Penisilin ailaz ile penisilinin 6-APAya dnm

reaksiyonu ekonomik adan ok nemlink 6-APA yeni semi sentetik penisilin

trevlerinin yapmnda kullanlr

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

36/37

penisilin ailaz

penisilin ailaz6-APA+D-fenil glisin metil ester Ampisilin(yar sentetik penisilin)

6-APA

F-laktamazlar

8/6/2019 Biyoteknoloji 12/05/2011

37/37

Yar sentetik penisilinlerin;

sentetik olanlara gre asit stabilitesi, plazmitveya kromozomal olarak kodlanan F-laktamazlara direnlilik, geni mikrobiyaletkinlik gibi nitelikleri gelitirilerek eldeedilen semi sentetik penisilinler tedavi iinartan ekilde kullanlmakta

Documents

Biyoteknoloji 12/05/2011