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スズキ由来機能性コンドロイチン硫酸の発見
千葉大学 大学院薬学研究院
助教 東 恭平
海光物産株式会社 大野和彦社長より提供
コンドロイチン硫酸
1. ドラッグストアやインターネットで購入可能2. 効能（足腰の痛みの寛解、リウマチによる四肢関節の痛みの寛解、目の
かすみ、充血の予防)3. 骨・関節サポート商品 (含カルシウム、グルコサミン、コンドロイチン)の市
場規模は669億円/2014年 (機能志向食品市場, 8,294億円) https://www.fuji-keizai.co.jp/market/15013.html
6,199～7,800円 (270錠) 3,800円 (240錠) 9,000円 (360錠)
軟骨に存在するコンドロイチン硫酸の形態
From Glycoforum
http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA05/HA05E.html
老化や変形性膝関節症により、軟骨量が減ると関節に痛みが出る。
Ser
Ser
デルマタン硫酸
膜結合型プロテオグリカン
4S4S
4S
4S
GlcA IdoA GalNAc
Plasma membrane Uronic acid Hexosamine
軟骨の保護皮膚の保湿分化・形態形成神経軸索伸長細胞接着免疫制御創傷治癒抗血液凝固
FGFs, VEGF, PDGF, HGF,
BMP2, Shh, Ihh, MK, PTN,
L-selectin, N-CAM, HCII, etc.
コンドロイチン硫酸
4S4S
4S
6S
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6S
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6S
4S
4S
4S
6S
CS結合蛋白質
コンドロイチン硫酸とプロテオグリカン
マトリックス型プロテオグリカン
機能性コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸混成鎖による海馬神経細胞の軸索伸長促進
Higashi et al. PloS One. 2015
アオザメフカヒレ由来CS/DS
ヨシキリザメフカヒレ由来CS/DS
コントロール
CS/DSによる神経軸索伸長効果はCS結合タンパク質 (ミッドカインやプレイオトロフィン)との相互作用に基づくことが知られている。
R = H or SO3-
GlcAGalNAc
GlcA
GalNAc
クジラ、ウシ、ブタ、ニワトリ軟骨
サメ、サケ、エイ軟骨
1
23
4
5
6
123
4
6
5
1
2
3
455
6
1
2
3
4
6
4S
R = H or SO3-
GlcAGalNAc
GlcA
GalNAc
12
3
4
5
6
12
3
4
6
5
1
2
3
4
55
6
1
2
3
4
6
6S
4S
IdoA
HOOC
コンドロイチン硫酸の構造上の特徴
デルマタン硫酸
コンドロイチン硫酸原料の問題点
• クジラ ： 捕鯨禁止政策• ウシ ： 狂牛病• ブタ ： 口蹄疫、インフルエンザ• ニワトリ ： トリインフルエンザ• サメ ： 保護活動の活発化• サケ、エイ： 漁獲量
• スズキ ： 漁獲量
豊富で安全性が高い原料の探索が必要
4硫酸が多い
6硫酸が多い
4硫酸が多い
• 船橋漁港は漁獲量日本一(年間910トン)。• 食用として親しまれているので、消費者イメージが良い。(セイゴ→フッコ→スズキ: 出世魚)
• 成魚の重量は平均2kg、約60% (ヒレ、背骨、内臓など)が廃棄部分となる。
• 加工業から出る廃棄物を使えば原料価が安価。
コンドロイチン硫酸の原料としてスズキに着目した理由
コンドロイチン硫酸の抽出と構造解析の流れ
佐々木 彰央 , 海・人・自然 (東海大博研報), 2010, 10, 51-57
サンプルの採取
凍結乾燥
脱脂
タンパク質分解
アルコール沈殿
糖鎖の抽出
酵素分解
不飽和二糖の調製
HPLC分析
二糖分析
乾燥粉末 (5～10 g)
アセトン脱脂 (脂肪分を除く)
b脱離 (糖鎖をアミノ酸から切り離す)アクチナーゼE処理 (タンパク質を分解する)
透析 (アミノ酸など不純物を除く)
CPC沈殿 (酸性糖鎖のみを沈殿させる)
アルコール沈殿 (酸性糖鎖・Naを回収)
NaCｌで酸性糖鎖を溶かす(酸性糖鎖からCPCを剥がす)
乾燥
眼球: 1.38 mg/g
骨: 0.32 mg/g
鰭: 0.82 mg/g
粗酸性糖鎖(乾燥粉末)
糖鎖の抽出
Chondroitinase ABC
不飽和二糖
GlcA-GalNAc4S n
C-unit D-unitO-unit B-unitE-unit
A-unit
酵素分解による不飽和二糖の調製
カラム
蛍光検出器(Ex. 346 nm, Em. 410 nm)
PCインテグレーター
廃液
溶離液1 ポンプ1
オートサンプラー
恒温槽
溶離液2 ポンプ2
ポストカラムHPLCの流路系統図
ポンプ31 M NaOH
冷却コイル
リアクター(110℃)
0.5% 2-Cyanoacetoamide
1.2 mM TBA +
12% MeOH
1.2 mM TBA +
12% MeOH + 0.2 M NaCl
【サンプル】コンドロイチン硫酸不飽和二糖
NaClの濃度勾配を利用して不飽和二糖を分離
蛍光誘導体化
Flu
ore
scence in
ten
sity (
mV
)
Time (min)
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40
1
23
45
6 7
8
4S4S
4S
6S
コンドロイチナーゼ
HPLC
不飽和二糖
CS
GalNAc GlcAXyl Gal
蛍光ポストカラムHPLC法による不飽和二糖分析
2: A-unit
3: C-unit 7: D-unit
1: O-unit
6: B-unit
8: ∆Di-TriS
5: E-unit
4: ∆Di-UA2S
Mono-S
Di-S
Tri-S
検出下限
1 pmol
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
0 10 20 30 40-50
0
50
100
150
200
250
0 10 20 30 40
スズキ (鰭) スズキ (眼球)
Flu
ore
sce
nce
in
ten
sity (
mV
) A
CO
time (min)
スズキ由来CS/DS混成鎖から得られた不飽和二糖のクロマトグラム
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
0 10 20 30 40
time (min)
スズキ (骨)
粗酸性糖鎖画分に含まれるCSの割合
87.4% 91.0% 71.4%
O-unit C-unit E-unit B-unit D-unitA-unit
E B D
A
CO
E B D
A
C
O
E B D
time (min)
スズキ (ヒレ)
ブタ (気管支軟骨) サケ (鼻軟骨)
O-unit2% A-unit
13%
C-unit71%
E-unit3%
D-unit11%
サメ (軟骨)
スズキ (骨) スズキ (眼球)
O-unit2%
A-unit80%
C-unit10%
E-unit1%
B-unit4%
D-unit3%
スズキ由来CS/DS混成鎖の硫酸化パターンはブタ (哺乳類)に近い
O-unit3%
A-unit77%
C-unit7%
E-unit3%
B-unit5%
D-unit5%
O-unit3%
A-unit73%
C-unit16%
E-unit1%
B-unit2%
D-unit5%
O-unit20%
A-unit24%
C-unit54%
D-unit2%
O-unit8%
A-unit72%
C-unit19%
E-unit0%
B-unit1% D-unit
0%
Chemical shift, ppm
Ido
AH
-1
Glc
AH
-2
スズキ (鰭)CS/DS
スズキ (骨)CS/DS
スズキ (眼球)CS/DS
ブタ (皮膚)DS
IdoAGalNAc
GlcAGalNAc
1
2
3
4
1
2
3
4
スズキ由来CS/DS混成鎖に含まれるIdoAの割合
23.7%
15.3%
13.8%
90.1%
スズキ由来CS/DS混成鎖の分子量とブタ、サメとの比較
-10
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30
mV
Time(min)
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30
mV
Time(min)
スズキ (鰭)ブタ (気管支)
臓器 数平均分子量 (MN) 重量平均分子量 (MW) Mw/Mn
スズキ
ヒレ 41565 61078 1.52
骨 27972 44146 1.66
眼球 40135 50862 1.27
ブタ 気管支 11289 21826 1.93
サメ ヒレ 52312 76478 1.46
0
0.01
0.02
0.03
-40 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
0
0.01
0.02
0.03
0.04
-40 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
0
0.01
0.02
0.03
-40 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
A. プレイオトロフィン B. ミッドカイン
C. L-セレクチン
スズキ (鰭)
スズキ (骨)
Time (sec) Time (sec)
Time (sec)
Response (
nm
)
ブタ気管支 (CS-A)
Resp
on
se
(n
m)
Ligand AnalyteKinetic parameter
KD (M)
プレイオトロフィン
スズキ (鰭) 4.29×10-7
スズキ (骨) 1.35×10-7
ブタ (CS-A) 2.56×10-5
ミッドカイン
スズキ (鰭) 1.28×10-7
スズキ (骨) 6.01×10-9
ブタ (CS-A) 8.25×10-5
L-セレクチン
スズキ (鰭) 8.06×10-9
スズキ (骨) 3.58×10-6
ブタ (CS-A) 5.38×10-6
スズキ由来CS/DS混成鎖とCS結合蛋白質の親和性
スズキ (鰭)
スズキ (骨)
ブタ気管支 (CS-A)
スズキ (鰭)
スズキ (骨)
ブタ気管支 (CS-A)
まとめ
• スズキ由来CS/DS混成鎖の硫酸化パターンはブタ由来CSに類似していた。
• スズキ由来CS/DS鎖の分子量は約44,000～61,000であり、ブタ由来CS (22,000)に比べると大きく、サメ由来CS (76,000)と比べるとやや小さかった。
• スズキ由来CS/DS鎖とCS結合タンパク質との親和性はブタ由来CSに比べて高かった。
スズキの鰭、骨および眼球は機能性CSの原料として有用であると考えられる。
病態分析化学研究室教授：戸井田敏彦助教：東恭平 代表取締役：大野和彦
千葉県船橋市海光物産株式会社スズキ
の提供
原料発注
水産加工廃棄物(鰭、骨)提供可能
薬品会社
1. スズキのコンドロイチン硫酸について特許出願済み
(特願2016-170377)
2. 論文により報告済み(東等. 応用糖質科学. 2017)
3. In vivoでの機能性評価
コンドロイチン硫酸抽出法のノウハウ提供
企業様
スズキ由来コンドロイチン硫酸の開発千葉大学大学院薬学研究院
機能性健康食品の原料機能性化粧品の原料医薬品の原料
コンドロイチン硫酸の大量生産
販売
コンドロイチン硫酸
の提供
想定される用途
実用化へ向けた課題
• 食品であるため、安全性が高い。• 人畜共通感染症が発生した際の代替資源として注目される可能性が高い。
• 船橋漁港は漁獲量日本一であり、ブランドの確立が可能。• 原料が水産加工後の廃棄物であるため、原料価が安い。• 4硫酸化CSを有するプロテオグリカンは、効能が未知であり、新たな生理活性が見つかる可能性がある。
4S
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4S
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4S
6S
サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンに結合する糖鎖は6硫酸化CS
新技術の特徴・従来技術との比較
22
企業への期待
• 天然物由来機能性成分抽出の技術を持つ、企業との共同研究を希望しています。
• また、コンドロイチン硫酸やプロテオグリカンを開発中の企業、健康食品分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 ：コンドロイチン／デルマタン硫酸並びにこれを含む抗炎症剤、保湿剤及び抗血液凝固剤
• 出願番号 ：特願2016-170377
• 出願人 ：千葉大学
• 発明者 ：東 恭平
24
お問い合わせ先
千葉大学 産業連携研究推進ステーション
産業連携コーディネーター 小柏 猛
ＴＥＬ ０４３－２９０－３５６５
ＦＡＸ ０４３－２９０－３５１９
e-mail [email protected]
![デュアルセンサブレーキサポートtoolplanet.jp/files/pdf/tpm-r/car/files20180803123410.pdf[スズキ] デュアルセンサブレーキサポート（例：スイフト](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5e931102479cd13aca249c9c/ffffffffff-ffffffffffiiff.jpg)
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