CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬCỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ

I. I. Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ tổ

hợp)hợp)

II. Nghiên cứu gen tách dòngII. Nghiên cứu gen tách dòng

III. Kỹ thuật PCRIII. Kỹ thuật PCR

I. I. Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ hợp)hợp)

A. A. Khái niệmKhái niệm B. Enzym giới hạnB. Enzym giới hạn C. Vector tách dòngC. Vector tách dòng

A. Khái niệmA. Khái niệm

- Tách dòng gen là quá trình phân lập một gen véctơ tách dòng tế bào chủ để nhân lên thành nhiều bản sao.

- Để tách dòng gen cần:- + ADN (gen) cần tách dòng- + Enzym giới hạn- + Vector tách dòng- + Thể nhận (vi khuẩn)- + Các enzym khác (Các E. làm đứt gãy liên kết

phosphodieste, nối ADN, E. bảo vệ, giãn xắn, đóng xoắn ADN...)

B. Enzym giới hạn:B. Enzym giới hạn: Phát hiện Phát hiện enzym giới hạnenzym giới hạn

Hiện tượng Hiện tượng giới hạngiới hạn và và sửa đổisửa đổi::- Hiện tượng giới hạn vật chủ: Phagơ sinh Hiện tượng giới hạn vật chủ: Phagơ sinh

trưởng ở vật chủ này không có khả năng sinh trưởng ở vật chủ này không có khả năng sinh trưởng trên vật chủ khác dù đó đã từng là vật trưởng trên vật chủ khác dù đó đã từng là vật chủ của nó.chủ của nó.

- Cơ chế: Hai loại enzym tham gia vào quá Cơ chế: Hai loại enzym tham gia vào quá trình này: Enzym giới hạn cắt ADN ngoại lai ở trình này: Enzym giới hạn cắt ADN ngoại lai ở những vị trí xác định và enzym giới hạn sửa những vị trí xác định và enzym giới hạn sửa đổi ADN ngoại lai (methyl hóa ADN ở những vị đổi ADN ngoại lai (methyl hóa ADN ở những vị trí xác định) để sửa đổi nó phù hợp vật chủ trí xác định) để sửa đổi nó phù hợp vật chủ mới.mới.

B. Enzym giới hạnB. Enzym giới hạn

Các enzym giới hạn có hai đặc tính: Không cắt các liên kết phophodieste ở

đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phân tử ADN.

Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc thù, thường gồm 4 – 8 nucleotit, tạo ra các đoạn ADN có đầu dính (bổ trợ) hoặc đầu bằng.

Ví dụ: Eco RI thường cắt ở trình tự đọc theo chiều xuôi – ngược như nhau.

Một số enzym giới hạn và tính chấtMột số enzym giới hạn và tính chấtTên enzymTên enzym Nguồn vi khuẩnNguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết Trình tự nhận biết

trên ADNtrên ADNSố Số nucleotit nucleotit của đoạn của đoạn trình tự trình tự nhận biếtnhận biết

Cắt đầu dính:Cắt đầu dính:

SauSau3A3A

EcoEcoRIRI

BamBamHIHI

NotNotII

SacSacII

HaeHaeIIIIII

Staphilococus aureus 3AStaphilococus aureus 3A

Escherichia coliEscherichia coli

Bacillus amiloliquefaciensBacillus amiloliquefaciens

Norcadio otitidis-caviarumNorcadio otitidis-caviarum

Streptomyces Streptomyces achromogenesachromogenes

Haemophilus aegyptiusHaemophilus aegyptius

5’-5’-GATC- 3’GATC- 3’

3’- CTAG3’- CTAG-5’-5’

5’-G5’-GAATT C-3’AATT C-3’

3’-C TTAA3’-C TTAAG-5’G-5’

5’-G5’-GGATC C-3’GATC C-3’

3’-C CTAG3’-C CTAGG-5’G-5’

5’-G5’-GCGGCCG C-3’CGGCCG C-3’

3’-C GCCGGC3’-C GCCGGCG-5’G-5’

5’-G AGCT5’-G AGCTC-3’C-3’

3’-C3’-CTCGA G-5’TCGA G-5’

5’-G CGT5’-G CGTC-3’C-3’

3’-C3’-CGC G-5’GC G-5’

44

66

66

88

66

44

Cắt đầu bằngCắt đầu bằng

HpaHpaII

ScaScaII

Haemophilus Haemophilus paraipluenzaeparaipluenzae

Streptomyces caespitosusStreptomyces caespitosus

5’-GTT5’-GTTAAC-3’AAC-3’

3’-CAA3’-CAATTG-5’TTG-5’

5’-AGT5’-AGTACT-3’ACT-3’

3’-TCA3’-TCATGA-5’TGA-5’

66

66

C. Vector tách dòng: Đặc C. Vector tách dòng: Đặc điểmđiểm

1. Phải có trình tự khởi đầu sao chép để có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ.

2. Có thể nhận biết nhờ các gen chỉ thị/hoặc gen đánh dấu (phải có dấu chuẩn chọn lọc).

3. Có vị trí gắn phân tử ADN ngoại lai (vị trí đa tách dòng – Multicloning site / MCS).

Vị trí đa tách dòngVị trí đa tách dòng

VÉCTƠ PLASMID

- Kích thước 1 – 200 kb, sợi kép, vòng.

- pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế, có 21 điểm cắt cho các enzym giới hạn, cho phép mang đoạn ADN cài đến 6 kb.

VÉCTƠ PLASMID pUC

* Nhóm pUC là nhóm véctơ plasmid thuộc thế hệ thứ 3.

* Chứa cả điểm khởi đầu sao chép của phage M13.

* Thường mang dấu chuẩn là Ampr và LacZ.

Sàng lọc xanh-trắngSàng lọc xanh-trắng pUC mang gen pUC mang gen LacZLacZ

trong vùng điều hòa trong vùng điều hòa ngược dòng. Khi ADN ngược dòng. Khi ADN ngoại lai xen vào điểm ngoại lai xen vào điểm cắt gới hạn, nó phá vỡ cắt gới hạn, nó phá vỡ khung đọc của gen khung đọc của gen --galactosidase, làm cho galactosidase, làm cho vi khuẩn không tổng vi khuẩn không tổng hợp được enzym này để hợp được enzym này để phân hủy cơ chất 5-phân hủy cơ chất 5-bromo-4-chloro-3-bromo-4-chloro-3-indodyl-indodyl--galactosidase -galactosidase (gọi tắt là X-gal) làm (gọi tắt là X-gal) làm cho cơ chất có mầu cho cơ chất có mầu trắng (khuẩn lạc trắng).trắng (khuẩn lạc trắng).

VÉCTƠ PLASMID

Ưu điểm

- Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ.

- Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp.

- Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh.

Nhược điểm

- Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp.

- Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote.

- Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích thước lớn (> 10 kb).

VÉCTƠ PHAGE

Phần lớn xuất phát từ phage : phần trung tâm hệ gen phage mang các gen liên quan đến quá trình gây tan vật chủ bị thay bằng ADN ngoại lai.

Kích thước khoảng 48,5 kb. Có thể mang các đoạn ADN

cài đến ~20 kb. (virut có thể đóng gói ADN đến 40-50 kb)

Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.

VÉCTƠ PHAGE

Ưu điểm:

- Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.

- Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.- Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở to lạnh (vd. 4oC).Nhược điểm:

- Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn.

- Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào thấp hơn số bản sao của plasmid.

VÉCTƠ COSMID

- Là véctơ lai của plasmid và phage , mang các ưu điểm của hai véctơ này: (1) khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage

- Có khả năng mang các đoạn ADN cài có kích thước đến 35 – 45 kb.

VÉCTƠ COSMID

VÉCTƠ CON THOI

- Các véctơ plasmid, phage và cosmid cần các trình tự khởi đầu sao chép khác nhau tùy theo từng loại tế bào chủ (trừ E. coli)

- Các véctơ con thoi có thể sao chép trong cả E. coli cũng như những tế bào khác, chẳng hạn ở eukaryote

- Các véctơ con thoi đặc biệt có hiệu quả khi nghiên cứu đặc tính các gen đồng thời ở prokaryote (vd. E. coli) và eukaryote (vd. Saccharomyces cerevisiae)

NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC)

Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd. gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo có thể mang các đoạn cài ADN dài từ 200 đến 500 kb. Véctơ này được tạo ra từ nhiễm sắc thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền.

NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO (BAC)

- Về cơ bản giống với nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo nhưng được tạo ra từ nhân tố giới tính F. Giống với YAC, BAC có thể mang các đoạn cài lớn, nhưng ngoài ra có khả năng sao chép trong E. coli giống như các véctơ plasmid, , cosmid.

- Vi khuẩn A. Tumefaciens - loại vi khuẩn lây nhiễm chủ yếu thực vật thực vật hai lá mầm (như cà chua, thuốc hai lá mầm (như cà chua, thuốc lá, đậu...) nhưng gần đây được lá, đậu...) nhưng gần đây được biết chúng cũng lây nhiễm cả biết chúng cũng lây nhiễm cả thực vật một lá mầm, lúa – có thực vật một lá mầm, lúa – có chứa plasmid Ti dài 200 kb chứa plasmid Ti dài 200 kb (plasmid sinh khối u). Khi lây (plasmid sinh khối u). Khi lây nhiễm, một phần của plasmid Ti nhiễm, một phần của plasmid Ti (là T-ADN) được lồng ghép vào (là T-ADN) được lồng ghép vào ADN nhiễm sắc thể của cây làm ADN nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào thực vật sinh cho các tế bào thực vật sinh trưởng không kiểm soát được, trưởng không kiểm soát được, tạo thành khối u.tạo thành khối u.

Các bước chính để tách dòng Các bước chính để tách dòng gengen

Phân lập gen: Tách ADN tổng số cắt bằng enzym giới hạn thích hợp ở hai đầu (thường dùng chung với véctơ).

Chọn véctơ tách dòng: tùy kích thước đoạn gen và tế bào chủ mà có thể chọn các véctơ plasmid, phage, cosmid, YAC…

Tạo véctơ tái tổ hợp và nhân dòng: sử dụng DNA/RNA ligase (vd. T4 DNA ligase) gắn véctơ với gen phân lập. Chuyển vào tế bào chủ để nhân lên.

Chọn lọc các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp: bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, hoặc sử dụng các gen chỉ thị/gen đánh dấu.

Các bước chính để tách dòng Các bước chính để tách dòng gengen

TÁCH DÒNG GEN VÀ XÂY DỰNG NGÂN HÀNG HỆ GEN

Có hai loại ngân hàng gen: 1) Ngân hàng hệ gen và 2) Thư viện cADN.- Ngân hàng ADN hệ gen Có mặt tất cả các trình tự trong hệ gen của tế bào. Các gen có trình tự các nucleotit và cấu trúc giống như trong hệ gen của

tế bào trong tự nhiên, bao gồm cả các trình tự điều hòa, các trình tự ADN đệm, trình tự liên gen và các trình tự không mã hóa (intron)

Ở sinh vật nhân chuẩn, phần lớn các trình tự ADN là các trình tự không mã hóa cho protein, như các đoạn trình tự lặp lại, các trình tự đệm, các trình tự điều khiển, bên cạnh đó là các gen cấu trúc.

ADN hệ gen là cấu trúc ADN đầy đủ và phức tạp của tế bào.- Thư viện cADN Chỉ là tập hợp nhỏ một phần của hệ gen, gồm các gen được biểu hiện. Các trình tự cADN phản ánh trình tự các sản phẩm mARN được hoàn thiện

sau quá trình phiên mã, không phải là trình tự thực sự và đầy đủ của gen tương ứng trên phân tử ADN hệ gen (không có các trình tự điều khiển, như promoter, operator, enhancer, v.v…).

Phần lớn cADN không phải là một bản sao có chiều dài đầy đủ của chính phân tử mARN.

Các protein được mã hóa bởi cADN có thể được tổng hợp (dịch mã) trong một tế bào chủ mà ở đó không cần có bộ máy hoàn thiện phân tử mARN (bao gồm quá trình cắt các intron).

cADN có trật tự và cấu trúc đơn giản hơn ADN hệ gen.

Sơ đồ tách dòng Sơ đồ tách dòng cADNcADN

CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬCỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ

I. I. Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ tổ

hợp)hợp)

II. II. Nghiên cứu gen tách dòngNghiên cứu gen tách dòng

Nghiên cứu gen tách dòngNghiên cứu gen tách dòng

1.1. Dò tìm gen trong ngân hàng genDò tìm gen trong ngân hàng gen

2.2. Lập bản đồ giới hạnLập bản đồ giới hạn

3.3. Giải trình tự đoạn ADN tách dòngGiải trình tự đoạn ADN tách dòng

Dò tìm gen trong ngân hàng genDò tìm gen trong ngân hàng gen

- Có một số phương pháp để tìm dòng gen mong muốn trong ngân hàng hệ gen:

- (1) Mẫu dò ADN từ sinh vật khác. Ví dụ dùng gen insulin đã biết trình tự của lợn để dò tìm gen của người.

- (2) Mẫu dò từ sản phẩm của gen (ví dụ: enzym hoặc protein) tổng hợp một đoạn mARN, rồi ADN để làm mẫu dò.

Kỹ thuật Southern blottingKỹ thuật Southern blotting Kỹ thuật này dùng để phát hiện gen cần Kỹ thuật này dùng để phát hiện gen cần

tìm.tìm.

Nghiên cứu gen tách dòngNghiên cứu gen tách dòng

1.1. Dò tìm gen trong ngân hàng genDò tìm gen trong ngân hàng gen

2.2. Lập bản đồ giới hạnLập bản đồ giới hạn

3.3. Giải trình tự đoạn ADN tách Giải trình tự đoạn ADN tách dòngdòng

Lập bản đồ giới hạnLập bản đồ giới hạn

Bản đồ giới hạn Bản đồ giới hạn của đoạn ADN tách của đoạn ADN tách dòng là sơ đồ cho dòng là sơ đồ cho thấy số điểm cắt và thấy số điểm cắt và vị trí tương đối của vị trí tương đối của các điểm cắt bởi các điểm cắt bởi enzym giới hạn enzym giới hạn trên đoạn ADN đó.trên đoạn ADN đó.

Giải trình tự đoạn ADN tách Giải trình tự đoạn ADN tách dòngdòng

Phương pháp Sanger (1970) hay phương pháp Phương pháp Sanger (1970) hay phương pháp dideoxydideoxy

Nguyên tắc: Nguyên tắc: - Loại bỏ nhóm 3’OH ở Loại bỏ nhóm 3’OH ở

đường deoxyribose của đường deoxyribose của các deoxyribonucleotite các deoxyribonucleotite để tạo ra các để tạo ra các dideoxyribonucleotite dideoxyribonucleotite (ddNTP).(ddNTP).

- Khi ddNTP gắn vào Khi ddNTP gắn vào chuỗi đang tổng hợp thỉ chuỗi đang tổng hợp thỉ quá trình tổng hợp quá trình tổng hợp dừng lại.dừng lại.

Giải trình tự đoạn ADN tách Giải trình tự đoạn ADN tách dòngdòng

1.1. Gây biến tính ADN đã Gây biến tính ADN đã được tinh sạch để được tinh sạch để tách hai mạch.tách hai mạch.

2.2. Trộn với mồi đã được Trộn với mồi đã được đánh dấu phóng xạ.đánh dấu phóng xạ.

3.3. Chia dung dịch trên Chia dung dịch trên vào 4 ống nghiệm có vào 4 ống nghiệm có bổ sung ddNTP bổ sung ddNTP (khoảng 1%). Phản (khoảng 1%). Phản ứng tổng hợp dừng ứng tổng hợp dừng lại khi mạch mới lại khi mạch mới được bổ sung ddNTP.được bổ sung ddNTP.

4.4. Điện di trên gel Điện di trên gel polyacrylamide.polyacrylamide.

5.5. Xác định trình tự Xác định trình tự nucleotitnucleotit

Đánh dấu phóng xạ

Mồi oligonucleotide + ADN polymerase, dATP, dGTP, dCTP & dTTP

Chia hỗn hợp vào 4 ống rồi bổ sung mỗi loại ddNTP vào mỗi ống

Giải trình tự đoạn ADN tách Giải trình tự đoạn ADN tách dòngdòng

Phân tích tự động trình tự basePhân tích tự động trình tự base

Kết quả từ một Kết quả từ một phản ứng giải trình phản ứng giải trình tự ADN tự độngtự ADN tự động Mỗi làn phản ánh Mỗi làn phản ánh

trình tự thu được từ trình tự thu được từ một mẫu ADN với một mẫu ADN với việc sử dụng một việc sử dụng một mồi nhất địnhmồi nhất định

Giải trình tự ADN tự động Giải trình tự ADN tự động

Máy tính đọc trình tự bổ sung với mạch khuôn theo Máy tính đọc trình tự bổ sung với mạch khuôn theo chiều từ trái qua phải (tương ứng chiều 5’ chiều từ trái qua phải (tương ứng chiều 5’ 3’). 3’). Chương trình máy tính tự động suy ra trình tự mạch Chương trình máy tính tự động suy ra trình tự mạch khuôn. Các nucleotide bị “nhiễu” được ghi là “N” và đôi khuôn. Các nucleotide bị “nhiễu” được ghi là “N” và đôi khi có thể suy luận được bằng các kỹ thuật bổ trợ hoặc khi có thể suy luận được bằng các kỹ thuật bổ trợ hoặc bởi cán bộ nghiên cứu giàu kinh nghiệm.bởi cán bộ nghiên cứu giàu kinh nghiệm.

Giải trình tự ADN tự động Giải trình tự ADN tự động

III. Kỹ thuật PCRIII. Kỹ thuật PCR

K. B. Mullis phát minh năm 1986K. B. Mullis phát minh năm 1986 Cho phép nhân nhanh chóng đoạn Cho phép nhân nhanh chóng đoạn

trình tự ADN đặc hiệutrình tự ADN đặc hiệu Sử dụng ADN-polymerase và hai Sử dụng ADN-polymerase và hai

đoạn mồi chứa khoảng 20 nu để giới đoạn mồi chứa khoảng 20 nu để giới hạn hai đầu đoạn trình tự cần nhânhạn hai đầu đoạn trình tự cần nhân

Phản ứng PCR gồm ba giai đoạn Phản ứng PCR gồm ba giai đoạn

Nguyên tắc của kỹ thuật Nguyên tắc của kỹ thuật PCRPCR

Phản ứng PCR gồm Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ giai đoạn gồm ba : kỳ giai đoạn gồm ba : gây biến tính – gắn gây biến tính – gắn mồi – tổng hợp.mồi – tổng hợp.

Thường được lặp lại 20 Thường được lặp lại 20 – 30 chu kỳ.– 30 chu kỳ.

Sử dụng Taq ADN Sử dụng Taq ADN polymerase (tách từ vi polymerase (tách từ vi khuẩn khuẩn Thermus Thermus aquaticusaquaticus) có khả ) có khả năng chịu nhiệt cao.năng chịu nhiệt cao.

Giai đoạn IGiai đoạn I

Nâng nhiệt độ (lên Nâng nhiệt độ (lên khoảng 94khoảng 94ooC để C để tách hai mạch của tách hai mạch của ADN rồi hạ nhiệt độ ADN rồi hạ nhiệt độ xuống khoảng 40 – xuống khoảng 40 – 5050ooC để gắn mồi C để gắn mồi (nhiệt độ hạ xuống (nhiệt độ hạ xuống phụ thuộc vào hàm phụ thuộc vào hàm lượng GC của đoạn lượng GC của đoạn ADN cần nhân).ADN cần nhân).

Giai đoạn 2Giai đoạn 2

Gây biến tính và Gây biến tính và làm lạnh. làm lạnh. Polymerase tổng Polymerase tổng hợp mạch mới.hợp mạch mới.

Giai đoạn này sinh Giai đoạn này sinh ra 4 ADNra 4 ADN

Giai đoạn 3Giai đoạn 3

Lặp lại phản ứng gây Lặp lại phản ứng gây biến tính và gắn mồi biến tính và gắn mồi để tổng hợp tiếp.để tổng hợp tiếp.

Giai đoạn này sinh ra Giai đoạn này sinh ra 2 phân đoạn ADN có 2 phân đoạn ADN có trình tự đúng gen trình tự đúng gen đích.đích.

Lặp lại các chu kỳ Lặp lại các chu kỳ tổng hợp.tổng hợp.

1 bản sao

2bản sao

4bản sao

8 bản sao

16

32

64

ADN được nhân dòng theo cấp số ADN được nhân dòng theo cấp số

nhânnhân