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09/11/2014
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Capítulo 17
Tecnología del DNA Recombinante
Ingeniería genética – modificación deliberada de la información genética de un organismo al cambiar directamente la secuencia de nucleótidos en su genoma.
Tecnología del DNA recombinante – técnicas utilizadas para llevar a cabo la ingeniería genética:◦ Identificación y aislamiento de un gen específico
◦ La inserción de un gen en un vector – ej. un plásmido – para formar una molécula recombinante
◦ La producción de grandes cantidades de un gen o sus productos
“Clon o clono” – colección de moléculas o células todas idénticas a la molécula o célula original.
Clonar un gen significa hacer muchas copias de éste - por ejemplo replicándolo en un cultivo de bacterias.◦ El gen clonado puede ser una copia normal del gen (wild type)◦ El gen clonado puede ser la versión alterada (mutante)
La tecnología el DNA recombinante, hace posible la manipulación de genes
Plasmid
Chromosome: Most bacteria have one circular DNA chromosome ranging in size from 1,000 to 8,000 kilobase pairs.
Plasmid: Extrachromosomal genetic element also made of a circular DNA molecule.
Bacterial Genome: The collection of all of the genes present on the bacteria’s chromosome or its extrachromosomal genetic elements.
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Vea tabla 15:1 Finales 1960’s – Werner Arber & Hamilton Smith, descubren las
enzimas de restricción 1969 – Herbert Boyer aisla EcoRI 1970 – se descubre la transcriptasa inversa 1972 – Paul Berg, Stanford, hace la primera molécula
recombinante 1973 – Herbet Boyer & Stanley Cohen producen el primer
organismo recombinante
Técnica del DNA Recombinante: VistazoBacterial cell
Bacterialchromosome
Plasmid
Gene of interest
DNA containinggene of interest
Isolate plasmid.
Enzymatically cleaveDNA into fragments.
Isolate fragmentwith the gene ofinterest.
Insert gene into plasmid.
Insert plasmid and gene intobacterium.
Culture bacteria.
Harv est copies ofgene to insert intoplants or animals
Harv est proteinscoded by gene
Eliminateundesirablephenotypictraits
Produce v accines,antibiotics,hormones, orenzymes
Createbeneficialcombinationof traits
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Mutágenos Transcriptasa inversa ◦ Se obtiene de retrovirus◦ Utiliza templado de RNA para sintetizar cDNA
Oligonucleótidos Enzimas de restricción (endonucleasas) Sondas genéticas Electroforesis PCR Hibridación Secuenciación
Aislamiento de genes
“Gene splicing”
“Cloning vectors”
“Cloning hosts”
Genotecas
Expresión y aislamiento de proteínas
Hormonas/drogas
Vacunas-Ej. Hepatitis B
Enzimas
Pesticidas
Sondas genéticas
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(2) Production of medically useful biologicals (e.g. insulin)
Recombinant Human Growth Hormone
Recombinant insulin (Humulin)
Organismos transgénicos◦ Microbios
◦ Plantas
◦ Animales
Análisis genético
Tratamiento genético◦ Ej. Terapia génica
Enzimas de Restricción
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Cuts usually occurs at a palindromic sequence
SmaI: produces blunt ends
5´ CCCGGG 3´
3´ GGGCCC 5´
EcoRI: produces sticky ends
5´ GAATTC 3´
3´ CTTAAG 5´
EcoRI – Escherichia coli strain R, 1st enzyme BamHI – Bacillus amyloliquefaciens strain H, 1st enzyme
DpnI – Diplococcus pneumoniae, 1st enzyme HindIII – Haemophilus influenzae, strain D, 3rd enzyme
BglII – Bacillus globigii, 2nd enzyme PstI – Providencia stuartii 164, 1st enzyme
Sau3AI – Staphylococcus aureus strain 3A, 1st enzyme
KpnI – Klebsiella pneumoniae, 1st enzyme
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Enzimas de Restricción Clivan el DNA en Lugares (Secuencias) Específicos
Vea tabla en el libro de texto
Plásmidos
Bacteriófagos
Cósmidos
Cromosomas artificiales◦ YAC
◦ BAC◦ Otros
Plásmidos
Plásmidos
• Son moléculas de DNA extra- cromosómicas
• Son circulares y bicatenarias
• Son el medio principal mediante el cual la resistencia a los Abs es transferida de una bacteria a otra
• Pueden ser clivados por enzimas de restricción dejando extremos romos y/o “sticky”
• Se pueden construir plásmidos artificiales al unir nuevos fragmentos de DNA a los extremos “sticky” del plásmido
Tetr
Ampr
Ori pBR3224361bp
OripUC18
Ampr
MCSLacZ
Tetr
Ampr
Ori pBR3224361bp
OripUC18
Ampr
MCSLacZ
• Plásmidos como Vectores• Un vector puede ser un plásmido que
puede ser modificado para acarrear nuevos genes.
• Plásmidos útiles como vectores deben tener:
• Un origen de replicación (A)
• Un marcador (gen resistencia a los antibióticos, como (ampr
and tetr). (B)
• Múltiples sitios de clonación (C)(MCS) (lugares donde la inserción de DNA foráneo no interfiera con la replicación o inactive marcadores esenciales
• Fáciles de purificar
A
B
B
C
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Clonación Genética y
cDNA (DNA complementario)
Produciendo un un Vector Recombinante (Clonando un Vector)Antibioticresistancegene
Restrictionsite
mRNA for humangrowth hormone (HGH)
Rev ersetranscription
Plasmid (v ector)cDNA for HGH
Restrictionenzyme
Restrictionenzyme
Sticky ends
Gene for humangrowth hormone
Ligase
Recombinant plasmid
Introduce recombinantplasmid into bacteria.
Recombinantplasmid
Bacterialchromosome
Inoculate bacteriaon media containingantibiotic.
Bacteria containingthe plasmid withHGH gene surv ivebecause they alsohav e resistance gene.
Clonación G
enética
2 enzimas necesarias:• Enzima de
restricción• Ligasa
Síntesis de cDNA
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GENOTECAS
Biblioteca de genes (Genoteca)◦ Una colección de clonos bacterianos o de fagos
Cada clono en la biblioteca consiste usualmente de un gen del genoma del organismo
◦ La biblioteca puede contener todos los genes de un cromosoma
◦ La biblioteca puede contener de cDNA complementario al mRNA
Producción de una Biblioteca de GenesGenome
Isolate genomeor organism.
Generate fragments usingrestriction enzymes.
Insert each fragmentinto a vector.
Introduce vectorsinto cells.
Culture recombinant cells;descendants are clones.
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Técnicas del DNA Recombinante
Polimerase Chain Reaction (PCA)
Electroforesis de gelatina (Gel electrophoresis”)
Southern Blotting
Nothern Bloting
Otras….
Multiplicación del DNA in vitro: The Polymerase Chain Reaction (PCR)◦ Un número grande de moléculas de DNA se producen in vitro
◦ Crítico para amplificar DNA en una variedad de situaciones Los epidemiólogos la utilizan para amplificar el genoma de un patógeno
The Polymerase Chain Reaction (PCR)◦ Proceso repetitivo que consiste de 3 pasos Desnaturalización
Priming
Extensión
◦ Puede automatizarse utilizando un “thermocycler”
© 2012 Pearson Education Inc.
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Figure 8.5a The use of PCR to replicate DNA, steps 1-33´Original DNA
molecule5´
5´
3´
Heat to 94°C
DNA primer
DNA polymerase
Deoxyribonucleotidetriphosphates
Denaturation
Priming
Cool to 65°C
DNA polymerase
DNA primerExtension
3´
72°C
3´ 5´
5´
5´
5´
A thermophilic (heat-loving) bacteria called Thermus aquaticusis the source of Taq DNA polymerase used in PCR reactions.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
94°C 37-65°C 70-75°C
The First Round of PCR of PCR
Desnaturalización Priming
Repeat
First cycle
2 DNAmolecules
4 DNAmolecules
Second cycle Third cycle Fourth cycle
8 DNAmolecules
16 DNAmolecules
PCR Ciclos
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PCR increases the yield of DNA exponentially Begins with DNA containing a sequence to be
amplified and a pair of synthetic oligonucleotide primers that flank the sequence.
Next, denature the DNA to single strands at 94˚C.
Rapidly cool the DNA (37-65˚C) and annealprimers to complementary single strand sequences flanking the target DNA.
Extend primers at 70-75˚C using a heat-resistant DNA polymerase such as Taq polymerase derived from Thermus aquaticus.
Repeat the cycle of denaturing, annealing, and extension 20-45 times to produce 1 million (220) to 35 trillion copies (245) of the target DNA.
Extend the primers at 70-75˚C once more to allow incomplete extension products in the reaction mixture to extend completely.
Cool to 4˚C and store or use amplified PCR product for analysis.
A typical PCR protocol
• Desde 1987, PCR ha tenido un impacto
◦ importante en la detección de enfermedades prenatales causadas por un solo gen defectuoso. Enf. de Tay-Sachs,fenilcetonuria, fibrosis quística, hemofilia, Huntingdon's
disease, distrofia muscular de Duchenne (DMD).
• Importante también para detectar portadores de enfermedades genéticas
• Importante para detectar enfermedades infecciosas
Detectar enfermedades infecciosas como:◦ Otitis media
◦ Lyme disease
◦ Helicobacter pylori◦ ETS Herpes
Virus del papiloma humano (HPV)
Clamidia
Detectar genomas virales◦ HIV
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Evidencia forense crucial puede estar presente en cantidades pequeñas
• a veces muy poco material disponible para un análisis directo de DNA
• PCR puede generar DNA suficiente a partir de una sola célula
• PCR posible en DNA extensamente degradado• Ejemplos incluyen: DNA de una gota de sangre seca, saliva en la colilla de un cigarrillo, tejido
debajo de las uñas, raíz del pelo
Otras ventajas de PCR en las ciencias forenses son:
• fácil de llevar a cabo, fácil de estandarizar
• resultados obtenibles en 24 horas
El principal problema legal del PCR es el potencial para la contaminación cruzada entre las muestras y la complejidad para explicar los resultados al jurado
Ejemplo de su Uso en el Caso de OJ Simpson
Separando las Moléculas de DNA: Gel Electroforésis y Southern Blot◦ Electroforésis en gelatina (Gel Electrophoresis) Separa las moléculas basada en carga eléctrica, tamaño y forma◦ Permite a los científicos aislar el gen de interés ◦ DNA (-) es atraído al electrodo +◦ Agarosa se usa para hacer el gel; actúa como un cedazo molecular◦ Fragmentos más pequeños emigran más rápido que los grandes◦ Tamaño se determina al comparar las distancias emigradas con
estándares
Electroforésis de Gelatina
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Separando las Moléculas de DNA: Electroforesis de Gelatina y Southern Blot◦ Southern blot DNA es transferido de la gelatina a una membrana de nitrocelulosa
Sondas se utilizan para localizar la secuencia de DNA
de interés
Northern blot: se utiliza para detectar RNA
Técnica del Sothern BlotDNA molecules
Restriction enzymes
Restriction fragmentsUse gel electrophoresis to separatefragments by size; denature DNAinto single strands with NaOH.
Side v iew
DNA
DNA bands Gel
NitrocellulosemembraneAbsorbentmaterial
The DNA fragmentsare inv isible to theinv estigators atthis stage.
ElectrophoresisgelNitrocellulosemembraneAbsorbentmaterial
Nitrocellulose membranewith DNA fragments atsame locations as in gel(still inv isible) is baked topermanently affix DNA.
Add radioactive probescomplementary to DNAnucleotide sequenceof interest.
Probes bind to DNAof interest.
Incubate with film; radiation exposes film.Dev elop film.
Dev eloped film
-Purificar el DNA genómico-Cortarlo con enzimas de restricción-Correr gel de agarosaPasarlo a la membrana de nitrocelulosaAñadir marcador radioactivoAutoradiografía
Resumen
◦ Usos del Southern blot Genetic “fingerprinting” o DNA fingerprinting
Diagnóstico de enfermedades infecciosas
Demonstrar la incidencia y prevalencia de organismos que no pueden ser cultivados
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Insertando DNA en las Células ◦ El blanco de la tecnología del DNA es la inserción del DNA en las células
◦ Métodos naturales Transformación
Transducción
Conjugación
◦ Métodos Artificiales Electroporación
Fusión de protoplastos
Inyección: gene gun and microinyección
Electroporación
Chromosome
Electroporation
Pores in wall and membrane
Competent cell
Electricalfield applied
DNA fromanother source
Cell synthesizesnew wall
Recombinant cell
Fusión de Protoplastos
Cell walls
Protoplast fusion
Polyethyleneglycol
Protoplasts
Enzymes removecell walls
Fused protoplasts
Recombinant cellNew wall
Cell synthesizesnew wall
Gene Gun
Gene gun
Protoplasts
Nylonprojectile
Nylonprojectile
Blank .22caliber shell
DNA-coated beads
Vent
Target cell
Plate to stopnylon projectile
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Figure 8.9d Artificial methods of inserting DNA into cells: microinjection
Microinjection
Target cell
Suction tubeto hold targetcell in place
Target cell’snucleus
Micropipettecontaining DNA
Técnica del DNA Recombinante: VistazoBacterial cell
Bacterialchromosome
Plasmid
Gene of interest
DNA containinggene of interest
Isolate plasmid.
Enzymatically cleaveDNA into fragments.
Isolate fragmentwith the gene ofinterest.
Insert gene into plasmid.
Insert plasmid and gene intobacterium.
Culture bacteria.
Harv est copies ofgene to insert intoplants or animals
Harv est proteinscoded by gene
Eliminateundesirablephenotypictraits
Produce v accines,antibiotics,hormones, orenzymes
Createbeneficialcombinationof traits
Mapeo Genético◦ Localización de genes en una molécula de DNA ◦ Provee datos importantes concernientes al metabolismo, características de
crecimiento, y relaciones entre los organismos
Localización de Genes◦ Hasta 1970, los genes eran identificados por métodos que consumían
mucho tiempo, esfuerzos ◦ Métodos universales y sencillos están disponibles ahora◦ Fragmentación por restricción◦ Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Figure 8.10 FISH
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Estudios Ambientales◦ La mayoría de los microorganismos nunca han sido cultivados o
crecido en el laboratorio
◦ Los científicos los conocen solamente por sus huellas genéticas (DNA fingerprints)
◦ Han permitido la identificación de sobre 500 especies de bacterias de la boca humana
◦ Han determinado que las bacterias Archaea productoras de CH4
(metanógenas)son un problema en la agricultura del arroz
Aplicaciones Farmacéuticas y Terapéuticas◦ Síntesis de proteínas Creación de péptidos sintéticos usados en clonación
◦ Vacunas Producción de vacunas más seguras
“Subunit vaccines”
Genes de patógenos introducidos dentro de frutas y vegetales comunes
Inyectar humanos con plásmido que acarrea gen del patógeno
Humanos sintetizan las proteínas del patógeno
Aplicaciones Farmacéuticas y Terapéuticas◦ Cernimiento genético
“DNA microarrays” – utilizados para screen individuos para enfermedades hereditarias causadas por mutaciones
Puede identificar también el DNA de patógenos en la sangre o en los tejidos
“DNA fingerprinting”
Identificar individuos u organismos por la secuencia única y distintiva de su DNA
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Figure 8.8 DNA microarray-overview Figure 8.12 DNA fingerprinting
Aplicaciones Farmacéuticas y Terapéuticas Terapia génica Genes defectuosos o que no están presentes, son reemplazados con
copias normales del gen Sistema inmune de algunos pacientes reacciona de forma negativa
Diagnóstico médico Muestras o especímenes del pte pueden ser examinadas para detectar
la presencia de secuencias de genes únicas de ciertos patógenos Xenotransplantes Células, tejidos y órganos de animales introducidos en el cuerpo
humano
Producción de plantas transgénicas◦ Plantas recombinantes alteradas por la adición de genes de otros organismos
Tolerancia a herbicidas◦ Gene de Salmonella confiere resistencia a Glysophato (round up)
Tolerancia a la sal◦ Los científicos han insertado genes para la tolerancia a la sal en plantas de
tomate y canola
◦ Plantas transgénicas no solamente sobreviven sino que producen fruto y remueven la sal del terreno
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Plantas resistentes a las heladas◦ Cosechas se rocían con bacterias genéticamente modificadas y pueden
tolerar heladas leves
Plantas resistentes a las plagas◦ Bt toxin
Genes que codifican para la Bt toxin insertados en varias plantas de cosecha
Genes para la resistencia a Phytophtora insertados en las cosechas de papas
Mejorar el valor nutritivo y la producción en las plantas de cosecha◦ Tomate Gen que codifica para enzima que degrada la pectina suprimido – tomate madura
en la planta
◦ Arroz
Gen que codifica para β caroteno (vit A) insertado en plantas de arroz
VNTR is based on hypervariable microsatellite sequence polymorphisms within the human genome. These sequences (e.g., CACACA …) are found in many locations in the human genome and
vary greatly from person to person.
Individuals A & C are excluded by this analysis. The samples from individual B will be subjected to further tests.
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Definición – inserción de un gen normal en una célula para corregir un desorden especifico genético o adquirido que es causado por un gen defectuoso.
Vectores utilizados - virus◦ Adenovirus◦ Retrovirus◦ Adeno associated virus◦ Herpesvirus
Usos◦ Tx de fibrosis quística◦ Tx de SCID, ADA
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Los estudios no han mostrado riesgo para los seres humanos y el ambiente?
Hay protocolos, estándares, restricciones impuestos en laboratorios que envuelven la tecnología del DNA Rec
Pueden crear armas biológicas utilizando la misma tecnología◦ Rusia
Asuntos éticos◦ ¿Cernimiento rutinario?
◦ ¿Quién debe pagar?◦ ¿Derechos de privacidad genética?
◦ ¿Ganancias o lucro económico por organismos genéticamente alterados?◦ Cernimiento genético requerido u obligatorio?◦ Corrección forzada de “anormalidades genéticas”