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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA JDIV#IK)N DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
SECRETARIA ACADEMICA !
A Q U I E N CORRESPONDA:
J Pon. medio d e t a piluente 5e hace COn5XM que el V R . JORGE SORIANO SANTOS. pa0,juoil d e l Uepailtamento de BiotecnoLogia a,5uoiló el .s iguiente S e ~ ~ v i c i o So&L:
~ I T U L O : "So&ubCe¿dad d e &A p i l o t ~ h u sae¿no-so&btu de un concen.tilado p o t d n i c o d e l gilano d e m i l a n t o en c l o u o d e .)odio y 5d6ato de bodio" .
/ A L U M N O (SI : Ma. Gabhiela Madhigat Guenileilo, 86236539 Ae¿c¿a Ca.tilejón Ced¿eto, U 2 3 6 4 3 3
~ I C E N C I A T U R A : IngenLehía de Lo5 Aeimnt05
3 0 d e a W a l 30 de j u t i o d e 1992 2 / P E R I O D O :
Se ext¿ende La p i luen te a p e t i c i ó n d e l i n t m u a d o , paila tos que a EL convengan.
UNIDAD mAPAUPA Av. Mlchoacán y La Puríslma Iztapalapa 09340. MBxlc~ F. A.P. 55535 Fax: 1516868866 Telex: 1764296 UAMME Tel. 686.0322 ext. 302
i
I I il I I
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
DEPTO. DE LOS ALIMENTOS (1992)
REPORTE FINAL
"SOLUBILIDAD DE LAS PROTEINAS SALINO-SOLUBLES DE UN CONCENTRADO PROTEINICO DEL GRANO DE AMARANTO EN CLORURO DE SODIO Y SULFATO DE SODIO"
ALICIA CASTREJON CEDILLO
MA. GABRIELA MADRIGAL GUERRERO
ASESOR: DR. JORGE SORIANO SANTOS.
I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I 1
I N D I C E.
página
1.INTRODUCCION ......................................... 1
II.OBJETIVOS............ .............................. 15
1II.MATERIALES Y METODOS .............................. 16
1V.RESULTADOS Y DISCUSION ............................. 23
V.CONCLUSION.. ........................................ 44
VI.BIBLIOGRAFIA... .................................... 46
I I
I I 1 I I I I I I I I J 1 1 1 1 I
1.INTRODUCCION.
Generalidades
Las especies de A. hypochondriacus y A. cruentus son
nativas de México y Guatemala, predominando en México la
variedad de A. cruentus, se les puede hallar también en
Nepal, India y Estados Unidos, mientras que en Perú,
Argentina y Bolivia se localizan las especies de A.caudatus,
también conocida como A. edulis, siendo todas productoras de
semillas. Las hojas de algunos amarantáceas son comestibles y
su valor nutritivo es similar a las especies productoras de
semillas, p. ej. A. hybridus que en México se conoce
popularmente como "quintonil" también conocida en Tailandia
como "phakhom", "bayam" en Malasia e Indonesia o "urai" en
Filipinas. Un ejemplo adicional es el A. lividus que se
conoce en Grecia con el nombre de "vleeta".
En México actualmente el amaranto se cultiva en pequeña
escala. Los rendimientos del cultivo se determinan tanto por
factores genéticos como ambientales. Los agricultores
norteamericanos consideran como buenos rendimientos de 400 a
500 kg de semilla/ha (Martinez, 1985) pero en la literatura
se han registrado rendimientos de 1.1 tonlha (Rutle, 1 9 7 6 ) ,
en nuestro país se han encontrado rendimientos de 100 a 2500
Kg/ha (Sánchez-Marroquín, 1 9 8 0 ) .
El uso de la semilla como alimento en México actualmente,
es en forma de "alegría", i.e. un panecillo dulce hecho con
I II il I I I I I I I I I I I 1
2
semillas reventadas O tostadas mezcladas con miel o
piloncillo (Macazaga, 1985) Y que por coincidencia
gastronómica, algunos campesinos peruanos elaboran de manera
similar (sumar,1983). También en diversas regiones de nuestro
país la semilla se usa en la elaboración de alimentos típicos
como el pinole, tamales y atole (Sánchez-Marroquín, 1980).
Como verdura se conoce como t'huazontle't en México a l a
inflorecencia a manera de racimo que se prepara capeada con
huevo y luego frito con queso en su interior, acompañada de
caldo de jitomate; pero antes de inflorecer y tierno se le
consume cocido en l a forma de "quintonil" (Macazaga, 1985).
Comwosición Ouímica
La composición química y el valor nutritivo de la semilla
de amaranto varía principalmente a causa de las prácticas
agronómicac. La mayoría de los investigadores (Becker y
co1.,1981; Sánchez-Marroquin, 1983; NRC,1984; Teutonic0 y
Knorr,1985) han observado la siguiente composición:
Proteína
Lípidoc
Almidón
Azúcares totales
Cenizas
Fibra
Vitaminas
12- 16 0
6- 7.5%
62- 69 %
2- 3 s
3- 3.5%
4 - 7 . 2 %
1- 1 . 5 %
I I I I I ' 1 I I I I I I 1 I I 1 II
3
El almidón es el carbohidrato más abundante de la semilla
de amaranto y está constituido principalmente por
amilopectina, con sólo un 5 o 7% de amilosa
Los ácidos grasos del amaranto están constituidos en un
7 6 % por los ácidos oleico (C18:1), linoléico (C18:2), y
palmltico (16:O); 20% de ac. esteárico (C18:O) con trazas de
linolénico (C18:3) y 4% de escualeno; contiene además
cantidades traza de esteroles y ésteres de estero1 (Becker y
col., 1981; Anónimo, 1983; Bressani, 1983; NRC, 1984). El
contenido mineral de las especies de amaranto generalmente es
más alto que el de los cereales de consumo tradicional, con
prevelecencia de fósforo, magnesio,potasio, calcio y hierro.
Estudios de molienda han demostrado que las cenizas estan
concentradas en un 66% en el revestimiento de la semilla y en
la fracción del germen. La semilla de amaranto es rica en
vitamina C, niacina y vitamina B1 y B2 además de B-caroteno.
(Teutonic0 y Knor, 1985).
Tiene factores antinutricionales, como inhibidores de
tripsina, polifenoles y saponinas, (actividad hemolftica que
aunque su concentración es relativamente baja, si no se
eliminan antes del consumo, el valor nutritivo disminuye
considerablemente. (Correa y Jokl, 1984; Calderón de la Barca
y col., 1985). El proceso de cocción es adecuado para su
eliminación (Becker y Saunders, 1984; Bressani, 1983)
I
. . . .. . - ..~ ..
Calidad Proteínica.
La calidad proteínica del grano de amaranto; para el A.
caudatus el factor de conversión de nitrógeno a proteína es
5.85; en otras especies de amaranto los factores de
conversión a proteína varían entre 5.2 y 5.6 (Becker y
Saunders, 1984). La NRC considera adecuado para cualquier
especie de amaranto el factor 5.85.
La semilla de amaranto contiene un nivel promedio más alto
de proteína que la mayorla de los granos de uso convencional.
Su contenido de lisina, es casi tres veces mayor que el de
maíz y casi el doble del que contiene el trigo, de hecho el
contenido de este aminoácido en e l amaranto es similar al de
la leche (NRC, 1984). La proteína de amaranto es excepcional
porque su balance de aminoácidos es cercano al balance óptimo
requerido por el humano, por lo tanto, suplementa a los
cereales convencionales que son deficientes en lisina y
aunque la proteína de amaranto se ha encontrado limitante en
leucina, este aminoácido se encuentra en exceso en los demás
cereales (Becker y col., 1981; Bertschart y col., 1981;
Sánchez-Marroquln, 1983; NRC, 1984; Teutonic0 y Xnor, 1985).
Se ha propuesto que el triptofano pudiese ser el
aminoácido limitante (Martine de Lespinasse,l979), pero Tovar
y Carpenter (1982), Cánchez-Marroquin y col. (1985~) e
incluso observaron que el triptofano se encuentra en niveles
aún más elevados que en la leche, y con respecto a otros
aminoácidos escenciales presentes en la proteína de amaranto,
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1 5
I ''1
II I I I 1 II I 1 I I E i 1 I I
t
n
no se han encontrado deficiencias. La relación de eficiencia
proteínica (PER) para el grano cocido es similar al de la
caselna que es de 2.5 con una digestibilidad del 90% y un
valor biológico (BV) de 75 que es cercano al balance ideal de
aminoácidos esenciales que teoricamente es de 100.00 (NRC,
1984).
Aislamiento Y fraccionamiento de txoteínas de fuentes
vecretales.
Tradicionalmente, las proteínas de granos y semillas se
han aislado mediante una extracción secuencia1 con solventes.
La extracción acuosa rinde una fracción definida como
albúminas; las soluciones salinas extraen globulinas; las
soluciones etanólicas las prolaminas y los ácidos y álcalis
las glutelinas (Osborne, 1924). Inicialmente Abdi y Sahib
(1976) encontraron una relación de globulina/albúmina (G/A)
de 0.3 y la albúmina como principal fracción proteínica de
reserva del grano de A. hypochondriacus, de acuerdo al método
de Mitchel (1948). Konishi y col. (1985) reportaron como
principal fracción proteínica de reserva a la globulina y la
relación G/A en este caso fue de 2 . 1 para A . hypochondriacus,
por el método de Landry y Moreaux (1975). Contrariamente,
Duarte y col. ( 198ú ) aislaron l a s proteínas de la misma
especie de amaranto mediante el complejo método de
............ ........ ..
.. . . . . . . . . .. . . . . . . . .. ...LI_I
1 I I
I I 1 I 1 1 I I I I
I I
6
fraccionamiento de Padhye y Salunke ( 1 9 7 7 ) . La relación G/A
en este caso fue de 0.3 y la albúmina como la principal
fracción proteínica de reserva en el grano de amaranto.
Recientemente Bressani y Garca (1990) han reportado la
relación G / A de diferentes especies de amaranto: 0.89 para A.
caudatus, 0.94 para A. hypochondriacus y 0.95 para A.
cruentus. Estos resultados fueron obtenidos mediante el uso
de una modificación al método de Landry y Moureaux (1970).
Finalmente, Soriano y col (1992) encontraron una relación G/A
de 0 . 5 y albúmina como principal proteína de reserva del
grano de A . cruentus, mediante el método de Padhye y Salunke
(1977).
Por otro lado, con respecto a las condiciones para lograr
una mejor extracción de proteínas para la obtención de
aislados proteínicos, se han realizado varios estudios con
algunos cereales como el maíz, cártamo y amaranto entre
otros.
Paredes-López y Ordorica (1986) encontraron que a partir
de un concentrado proteínico de cártamo obtenido en
laboratorio (SML) con un contenido proteínico del 46.8% y
otro concentrado proveniente de la industria aceitera (SMI)
con un contenido de proteina del 28.2%,se extrajeron con NaCl
0.8M, a pH 1.0 obteniendose una gran cantidad de proteína de
los mariales preferentemente para SML. La mayor recuperación
de proteína fué para el aislado obtenido por precipitación
isoeléctrica obteniéndose, para SHL y SMI valores de 78.8 y
46.9% respectivamente. r
~
1 I I I 1 I I I I I I I I I I I d 1 1
7
Por su parte, Paredez - López, realizó estudios con harina de A. hypochondriacus, utilizando dos muestras: harina entera
y harina desengrasada. El estudio se llevó a cabo, utilizando
varias concentraciones de NaC1, obteniendo una alta
recuperación de proteínas salino-solubles en un rango de
concentración de 0 . 8 a 1 . 0 M de NaCl de esta manera, la
extracción de proteínas (albúmina y globulina) se incrementó,
con el aumento de la concentración de NaC1; además la
producción optima de proteína solubilizada fue a pH 11 y
precipitadas entre 4 . 5 y 5.5 para ambas harinas. Por otro
lado, determinaron que, las glutelinas constituyen la
principal proteína de reserva en el amaranto.
Contrariamente Konishi y col. (1991) reportaron que la
fuente principal de proteína en el grano de amaranto, eran
las fracciones de albúmina y globulina, para A.
hypochondriacus y A. cruentus (10.7g/lOOg y 9.975g/lOOg,
respectivamente). También se encontraron 2 fracciones de
albúmina, mediante la extracción secuencial. Alb-1 extraída
con NaCl al 0.5M y agua. Alb-2 se extrajo con agua después de
la extracción de las globulinas y la alb-1, utilizando una
modificación al método de Landry y Moureaux.
Soriano y col (1992) encontraron que para A.cruentuc, la
albúmina fue la mayor fracción de proteínas de la semilla de
amaranto, seguida de la globulina, prolamina y glutelinas.
Utilizando una sal divalente, la mayor extracción se obtuvo a
una concentración de 0.04M de Na2S04; pero con una sal
monovalente como NaCl se obtuvo que la concentración de 0.5M
I I I
I I I I I I .I
a
el nitrógeno soluble se incrementó de manera considerable
(53%), esto si se lleva a cabo a un pH entre 2-5, pero a p~ 6
se observó un decremento del 50% de nitrógeno soluble. En
general la extracción de nitrógeno soluble de albúmina y
globulina de A. cruentuc pueden darse a pH alcalino, como en
otros aislados proteínicos.
Métodos de Cuantificación de Nitróseno Proteínico Y No
Protefnico.
a)Determinación de Nitrogen0 Total.
El método de Kjeldahl (Jacobs,1965) se basa en la
digestión de la muestra en presencia de ácido sulfúrico y un
catalizador. Posteriormente se logra la separación del amonio
con exceso de NaOH, e l cual se destila y es recogido en ácido
bórico con un indicador, finalmente se valora con HC1 y se
cuantifica la cantidad de nitrogen0 total presente en la
muestra, el cual pudo formar parte de:proteínas, ácidos
nucleicos, carbohidratos nitrogenados, alcaloidec, llpidos
nitrogenados, porfirinas, pigmentos nitrogenados y algunas
vitaminas como niacina, riboflavina, piridoxina, ácido
fólico, boitina, colina y cianocobalamina
b)Determinación de Nitrógeno Proteínico.
Para la cuantificación de nitrógeno proteínico se puede
utilizar el método de proteína ligada al colorante, que se
basa en el cambio de color, ro jo a Azul Brillante de
~
1 1 1 I I I I I I I I I I I I 1 P I I
9
Coomassie G-250 (figura 1 y 2). Donde la forma roja es
convertida a a z u l , cuando el colorante se liga a la proteína.
Existe una reproducibilidad del 1.2% De acuerdo a lo
reportado por Bradford (1976) los agentes alcalinos no
afectan la densidad Óptica a 595nm. Pero se producen algunos
efectos menores debidos a sustancias como: Tris, ac. acético,
2-mercaptoetanol, sacarosa, glicerol, EDTA, trazas de
detergentes, etc.
Compton y Jones (1985) estudiaron los mecanismos de
respuesta del colorante y su interferencia en el ensayo de
proteínas de Bradford. Se encontró que el colorante Azul
Brillante de Coomasie G-250 ligado a la proteína, existe en
tres formas: catiónica, neutra y aniónica. La forma aniónica
no se encuentra en forma libre, ya que forma el complejo con
la proteína, dando el color azul.
Fig. 1.1.Estructura del colorante A z u l Brillante de Coomacsie
(CBBG) G-250.
I I I I I I I I I I I 1 I I I 1 I 1
-OH -OH
Anion -> Neutral -> Cation
H+ €I+
595nm 650nm 470nm
(azul) (verde) (rojo)
Fig. 1.2.Especies de absorción del Azul Brillante de
Coomassie G-250.
A 650 y 470 nm y con un decremento del pH, las especies se
identifican como una simple y una doble protonación, con una
forma neutral y un cambio positivo, respectivamente.
Para que el colorante adquiera la característica de
ligante, debe presentar la forma macromolecular con ciertos
grupos reactivos funcionantes. Las interacciones con arginina
primariamente con grupos amino, otras bases (histidina,
lisina) y residuos aromáticos (tirosina,tripsina y
fenilalanina) dan altas respuestas; estas respuestas son
provocadas por las fuerzas de Van der Waals y a las
interacciones hidrofóbicas. Por lo que las interferencias con
las bases, detergentes y otros conpuestos, se explican de
acuerdo a los equilibrios entre las tres formas que presenta
el colorante.
~
T- il
1 I I I I I I I I I I I I I 4 1 I
b.1) Método Turbidimétrico.
Vera ( 1 9 8 8 ) realizó estudios modificando el método
turbidimétrico para la determinación de protelnas, utilizando
ácido tricloroacético como un agente precipitante, también
utilizó dodecil sulfato de sodio para evitar la interferencia
por grupos aniónicos y catiónicos de detergentes lípidos;
utilizando albúmina como estándar encontró una relación
lineal entre la turbidez a 340 nm y la concentración de
proteína si es observada entre 2 y 4 0 pg de proteína. Se
encontró que este método es insensible a compuestos de bajo
peso molecular tales como aminoácidos, glucosa (0.1M) y
hexosaminas(0.lM). Mediante esta modificación se pueden
detectar hasta menos de 2 l.(g de proteína en un volumen de 0.3
ml (6.7 pg de proteína/ml). Este método es una alternativa
común a otros métodos para la cuantificación de proteína,
posee una elevada selectividad y sensibilidad y muestra una
gran tolerancia a reactivos que se utilizan en la
purificación y la caracterización de las proteínas.
b.2) Método de Biuret.
La reacción de Biuret (Scopes, 1982) involucra un fuerte
reactivo cúprico alcalino el cual produce una coloración
púrpura con la proteína. El reactivo cúprico reacciona con la
cadena de peptidoc melor que con otros grupos. Existe
interferencia por amoniaco formando complejos con el cobre,
a 1
I I I I I I I
I I I I I II rn
12
también fracciones de sulfato de aaonio dando resultados poco
exactos. La gran sensibilidad de l a reacción de Biuret es
llevada a cabo por observación del complejo proteína-cobre a
310 nm.
b . 3 ) Método de Lowry.
Una combinación de la reacción cúprica usada en el método
de Biuret y la reacción de los reactivos de Folin-Ciocalteau
con fenoles tal como la tirosina en la proteína fue hecha
dando un fuerte color azul obscuro con proteinas
(Scopes,1982). La sensibilidad del método da un buen color
con O.lmg/ml de proteína o menos. Para manbtener el sistema
donde la reacción se controle y se desarrolle un color rápido
se debe tener un pH de 11.0, esto se logra mediante la
adición de una solución concentrada de NaOH.
píétodos de extracción de vroteínac
Los métodos de extracción se basan en la diferencia de
solubilidad de las proteínas en solución, la cual depende de
la interacción electrostática, por lo que el ajuste del medio
iónico y del pH se realiza para obtener la mínima interacción
electrostática. Para un p~ con carga neta igual a cero, la
solubilidad de l a proteína es mínima y sólo la albúmina es
soluble. El ajuste del pH al punto isoeléctrico ayuda a
I I I I I I I I I I I I I I I 1 I 1 i
13
mantener a la proteina en su forma nativa. Además la
solubilidad de las proteínas es dependiente de la
concentración y de la cinética de la disolución, por lo que
un incremento en el mezclado puede desnaturalizar a las
proteinas.
Para la solubilización de las globulinas, se requieren
concentrados de ácidos o bases, provocandose daños por
desnaturalización local debido a pHs extremos. En el caso de
proteínas de grupos sulfidrilos lábiles, la presencia de
agentes reductores como el 2-mercaptoetanol actua protegido a
bajos pH's.
Se puden obtener concentrados enriquecidos de fracciones
de proteína por varios métodos. Uno de ellos es l a
clasificación por aire, si se requiere un alto valor
nutricional, se utiliza una combinación de procesos de
clasificación por aire y de secado-tostado. Existe uno que
involucra la acción de un solvente para lograr la separación,
el ciclon líquido, donde la diferencia de sedimentación de
los cuerpos de proteína se recuperan en hexano, en este caso
el objetivo es la detoxificación de la semilla, se obtiene
una elevada recuperación de proteína cerca del 66%, este
proceso tiene la ventaja de no alterar la estructura de la
proteína, pero una remoción siguiente con solventes, un
secado y esterilización pueden causar daño.
Durante l o s pasos intermedios que se llevan a cabo en l a
extracción de proteínas, como son la ultrafiltración, el pH
es un factor crítico, por lo que se deben controlar efectos
I I 1
14
I I : I I I I I I I I I I 1 I 1 Y
de electroviscocidad. Durante la coagulación por calor ocurre
una desnaturalización y e s limitante.
En la precipitación isoeléctrica que comunmente se
utiliza, se lleva a cabo una concentración por centrifugación
que provoca una extensa agregación y modificación de la
solubilidad. Además si se utiliza un secado posterior, este
causa danos por calor y desnaturalizando a las proteínas.
1 I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I
15
1I.OBJETIVOS.
.l) Determinar las mejores condiciones de extracción de las
proteínas salino-solubles en Cloruro de sodio y Sulfato
de sodio.
2) Adecuar el método de Landry y Moureaux tanto en concen-
tración, tipo de sal empleada y as€ como tiempos de ex-
tracción de las proteínas salino-solubles.
3) Proponer una metodología para l a obtención de un aislado
proteínico del grano de amaranto a partir de un concen-
trado proteínico del mismo.
I I I I I I I I I 1 I I I I I I I 1 I
16
111. MATERIALES Y METODOS
Se utilizó para todas las pruebas un concentrado
proteínico de amaranto (CPA) , proporcionado por la industria San Miguel de Proyectos Agropecuarios, el cual fue obtenido
mediante un método de clasificación por aire.
semilla cruda
tostada o - - - - - - - - - 9 Limpieza-------+ Molienda
reventada I I
I I I I I w
Harina
Clasificación e------- integral neumática
I
I
I I I
V I
V (Concentrado amiláceo) (Concentrado proteínico)
10-15% Prot. 35-40% Prot.
La muestra fué hornogenizada y desengrasada, se almacenó en
bolsas dobles de plástico perfectamente cerradas para que la
humedad permaneciera constante.
I I I I I .I I I I I I I I I I I I I 3
17
Desensrasado del CPA con acetona
El CPA fué desengrasado con acetona en una proporción de
1: 10 (harina/acetona) con agitación mecánica durante 36
horas a -20 C después se realizaron dos cambios de solvente
(1250 ml) cada 24 horas, se filtró y se sometió a secado al
aire en la campana de extracción, se almacenó en bolsas
dobles de plástico cerradas y en refrigeración.
i
METODOS OUIMICOS
Análisis Ouímico Proximal
El análisis químico - t n para e CPA y CPA
desengrasado se efectuó siguiendo los métodos oficiales del
AOAC ( 1 9 8 0 ) que incluyeron:
Determinación de humedad por el método de la estufa
(método No. 14004); determinación de cenizas por incineración
(método No. 14006); determinación de proteína cruda por
Microkjeldahl (método No.2.049); determinación de fibra cruda
por hidrólisis ácida y alcalina (método No.7.054);
determinación de carbohidratos (por diferencia).
Determinación de Nitróqeno Proteínico
1. Preparación del reactivo Colorante para Proteína.
Se utilizaron 100 mg de azul brillante de Coomassie G-
18
250 obtenido de Sigma, 50 ml etanol a l 9 5 % , 100 ml de ácido
fosfórico al 85% ( w / v ) y se afOrÓ a un litro con aqua
destilada. I I I I I I
I 1 I I I I 1
2. Preparación de Buffer pH 7.0.
Se mezclaron 29.54 ml de NaOH 0.2M con 50 ml de KH2P04
' 0.2M y se aforaron a 200ml con agua destilada.
3. Curva Patrón de Proteína.
3.1. Se realizó empleando albúmina sérica bovina(Sigma),
con la cual se prepararon soluciones que contenían de 10 a
100 pg de albúmina en un volumen de 0.1 ml
3.2. Se le adicionaron 5 ml de reactivo de colorante.
Se preparó un blanco tomando 0 . 1 ml de buffer y 5 ml de
reactivo de colorante.
3.3. Se leyó la absorbancia de cada una de la5 muestras a
595 nm, después de 2 minutos y antes de 1 hora de haberse
adicionado el reactivo de Proteína.
3.4. Se contruyó una curva de Absorbancia vs
Concentración de albúmina.
I I I I I I I I I I I I I I I I 1 1 I
19
Prueba de Solubilidad del CPA Desengrasado
Para efectos de esta determinación se prepararon las
siguientes series de soluciones:
SOLUCION
A- 1
A-2
A-3
A-4
A-
A- 6
A-7
A-8
A-9
A-10
Todas
NaCl (M)
0 .05
0 .10
0 .15
0 . 20
0.25
0 . 3 0
0 . 4 0
0.60
0 . 8 0
1 .00
las soluciones
SOLUCION
1A-1
1A-2
1A-3
1A-4
1A-5
1A-6
1A-7
1A-8
1A-9
1A-10
se ajustaron a pH 7. O
Procedimiento
1. Se pesaron 0.2g de CPA desengrasada
precipitados de 50 ml
Na2S04 (M)
0 .05
0 .10
O . 15
0.20
0.25
0 .30
0 . 4 0
0.60
0 . 8 0
1 . 0 0
en un vaso de
2. Se le adicionaron 5 ml de solución (de la serie A O
1A) y se ajustó el pH a 7.0
3 . Se sometió a agitación magnética durante 60 minutos a
4 o c
4 . Se centrifugó durante 10 minutos a 42000g
5. Del sobrenadante se tomaron 0 . 1 mi para medir proteína
~
I I 1 I I I I I I I 1 I I 1 I I 1 1 I
20
por el método del Colorante ligado a la Proteína a 595 nm, el
resto del sobrenadante se almacenó.
6. Al residuo se le adicionaron 5 ml más de solución
(serie A o 1A).
7 . Se sometió a agitación magnética por 30 minutos a 40C
8 . Se repitió la secuencia a partir del paso 4 hasta que
la lectura del método colorimétrico dió el cero de la curva
estandar.
La metodología se aplicó a cada una de las soluciones de
la serie A y l A , con el fin de encontrar las condiciones más
favorables para una mayor extracción de proteínas salino-
solubles.
Caracterización de las mroteínas salino-solubles
Preparación del aislado proteínico a partir de CPA
desengrasado.
1. El Nitrógeno soluble se extrajo con Na2S04 0.25M hasta
la cuarta extracción a partir de 4 g de CPA desengrasado
2 . Se obtuvieron 4 0 0 ml de sobrenadante, de los cuales se
tomó una muestra para determinar proteína ligada al colorante
y otra para determinar Kjeldahl
3. Al residuo también se le determinó Kjeldahl y se
almacenó en cuarto frío y con azida de sodio al 0.02%
4 . El sobrenadante se concentró hasta 100 ml por
~
I 1 I I I I I I I 1 I I I I I 1 I I B
^. L L
ultrafiltración a 4 O C y se dializó durante 2 4 horas con agua
destilada con cuatro cambios de la misma
5. Se concentró nuevamente por ultrafiltración hasta 50
ml .
* Preparación de la columna de tamizado molecular
1.Se preparó un buffer de Eosfatos con la siguiente
composición: 32.5mM K2HP04 - 2.6mM KH2P04 - 0.4M NaCl - 2OmM 2-Mercaptoetanol y 0.02g de azida de sodio por cada litro de
solución, la cual fue ajustada a pH 7.5.
2.E1 gel que se utilizó fue Sephacril 5-200 de Sigma,
mismo que se lavó con el buffer de fosfatos en un matraz con
trampa de vacío para eliminar el aire y en un baño de agua a
4OoC.
3.üna vez que se verificó que la columna no tuviera fugas,
se adicionó el gel en suspención, permitiendo que se fuera
acentando, hasta que llegó a la marca establecida, entonces
se adicionó un poco de buffer y se colocaron los aditamentos
de la columna.
4.Se estableció un flujo de 6 ml/h
5.La columna se calibró aplicando 0.3 ml de una solución
de colorantes que contenían 0.1% de Azul de dextran0 y 0.05%
de rojo de fenol.
6. Una vez determinado el volumen muerto, se procedió a
aplicar 2 m l de muestra previamente preparada con un poco de
sacarosa, para aumentar su viscosidad.
22
I I I I I I I I I I I I I I I 1 1
7. Se dejó correr l a muestra por 24 horas y se colectaron
fracciones de 3ml
a. Cada una de l a s fracciones se leyeron en el
espectrofotómetro a 230nm y 280nm.
9. Se identificaron las fracciones que contensan proteína
por el método de Colorante ligado a la Proteína.
I
I I ;I I I I I I I f I I I I I I I 1 I
23
1V.RESULTADOS Y DISCU'jm.
La semilla de amaranto tuvo un contenido de proteína de
10.8% (tabla IV.l), el concentrado proteínico de la misma
(CPA) tiene 24.31% de proteína y éste una vez desengrasado
(CPAD) contiene 26.25% de proteína en base seca. La protefna
del CPAD fué solubilizada en soluciones salinas de NaCl y
Na2S04 a diversas concentraciones.
La solubilidad de las proteínas salino-solubles es
variable y esta influenciada por el pH y concentración de la
solución (fuerza iónica), entre otras cosas (Myers,1988). Los
valores de pH entre 3 y 8 . 5 pueden no ser perjudiciales
directamente para las proteínas. Pero en el caso de las
globulinas este parámetro es una variable en el control de la
solubilidad , por lo que durante los ensayos realizados se
mantuvo un control estricto del pH, se ajustaron las
soluciones a pH de 7.0+0.2. Este parámetro también fué
controlado en las determinaciones de nitrógeno proteínico,
mediante el método del Colorante ligado a la Proteína el
cual presenta desviaciones causadas por iones en solución,
buffer alcalinos, detergentes, etc. (Read y Northcote, 1981).
Las proteínas almacenadas en semillas y legumbres son
generalmente extraibles en medio acuoso, pero se encontró que
la extracción de proteína con soluciones salinas se
solubilizan más a baja fuerza iónica de sales neutras y sales
divalentes, las cuales son más efectivas que las monovalentes
I I I I I I I I I I I I I I 1 I I 1 I
2 4
(Soriano y col., 1 9 9 2 ) . Este comportamiento se presentó en
los ensayos realizados.
Al aislar una proteína no debe sufrir desnaturalización,
causada por agentes como el calor, la fuerza iónica o el pH,
se tiene as1 una mejor solubilidad de la proteha, de aqul la
importancia de controlar los parámetros antes mencionados.
Pero en algunos casos se ha observado que una
desnaturalización alcalina durante el aislamiento ayuda
posteriormente a la dispersión del aislado, aumentando las
propiedades de emulsificación de la proteína, así como las de
gelificación de baja fuerza iónica (Myers, 1 9 8 8 ) .
Cuando una proteína se aisla de una fuente protelnica y
concentrada como parte de un proceso, la solubilidad llega a
ser uno de los atributos más importantes y como las protelnas
son polielectrolíticas, el comportamiento de su solubilidad
es gobernado principalmente por interacciones elactrostáticas
(iónicas).
Según Franks (1988), existen dos principios importantes:
primero, la solubilidad experimenta un mínimo alrededor del
pH isoeléctrico y segundo, los efectos de las sales en la
solubilidad tienen un comportamiento cualitativamente
similar, siendo producido por todas las sales, a bajas
concentraciones de sal los efectos de la fuerza ibnica
predominan y todas las sales aumentan la solubilidad.
En el presente trabajo experimental se ajustó el pH a
7.0f0.2 en la respectiva solución salina y la solubilidad se
monitoreó como nitrógeno solubilizado medido por el método
I I 1 I I I I I I 1 I I I 1 1 I 1 1 1
25
microkjeldahl (1965) y como nitrógeno salino-soluble
(Bradford, 19 ) . El valor máximo de nitrógeno soluble, como
se aprecia en la Tabla IV.2 fué de 16.Eg/lOOg en 1.0 M de
NaC1. El mínimo de extracción se obtuvo en NaCl 0.05 M con
valores de 7.5g/lOOg de CPAD obteniendose una diferencia de
55%.
Para la sal divalente Na2S04 el máximo de extracción
presente fué a 0.3 M con un valor de 19.5g/lOOg de CPAD y el
valor mínimo se obtuvo en Na2S04 1.OM con l2.OOg/lOOg de
CPAD, con una diferencia de 38.5%, (Tabla IV.3).
En cuanto a la eficiencia de extracción de nitrógeno
proteínico para la solución de NaC1, la máxima extracción se
obtuvo a una concentración de 0.25M, con un valor de
8.5g/iOOg del CPAD, el mínimo se presentó en NaCl 0.8 M con
4.4g/lOOg de CPAD. La diferencia entre estos valores es de
48.3%.
Con la sal divalente, el máximo de nitrógeno proteinico
extraído se presentó en Na2S04 1 .0 M con un valor de
7.3g/lOOg; el mínimo fué en Na2S04 0.25M con 5.7g/lOOg.
Resultando una diferencia del 21.9%. Con sales divalentes se
aprecia un efecto constante en todo el rango de la fuerza
iónica probadas, lo que indica que el Na2S04 puede
considerarse la solución más adecuada para la extracción de
proteínas salino-solubles del C P A D . El efecto de la sal
monovalente NaC1, en la solubilidad del nitrógeno proteínico
es inverso a l incremento en la fuerza iónica (concentración).
Este efecto se aprecia claramente en la Fiq.IV.1. La
I I I I I 'I I I I I I I I I I 1 I I I
26
eficiencia de extracción de nitrógeno salino-soluble por el
uso de NaCl 1.0 M f u e cerca del 64% del total del nitrógeno
contenido en el CPAD. Con Na2S04 (Fig.IV.2) la eficiencia de
nitrógeno soluble fué de 74.28% con respecto al total de
nitrógeno contenido en CPAD (26.25g/lOOg).
La relación entre nitrógeno proteínico y nitrógeno
soluble. por lo tanto es mayor en 0.25 M de NaC1, sin embargo
la relación de nitrógeno proteínico y nitrógeno soluble es
mayor a 0.15 M de NaC1, que es de 84.7%; esto es porque a
esta fuerza iónica, se extrae menor cantidad de nitrógeno
soluble medido por microkjeldahl, comparado con la solución
de 0.25 M donde hay mayor extracción de nitrógeno proteinico.
Un efecto similar se observa con la sal divalente, donde la
relación de nitrógeno proteínico y nitrógeno soluble es mayor
en 0.05 M (44.9%), aunque esta concentración no sea la máxima
para la extracción de nitrógeno proteínico.
. r ,
El contenido de nitrógeno soluble total de una proteína
esta marcadamente influenciado por varios factores
relacionados con las condiciones de proceso como el
aislamiento, la precipitación, la concentración, extracción y
otras.
Todo método de extracción, tanto para proteína total como
para fracciones selectivas, depende de la solubilidad
diferencial de las proteínas en solución acuosa. En general,
se obtienen mínimas interacciones electrostáticas ajustando
el medio iónico y pH (Lillford.1988). La extracción de
I I I I I I* I I I I I I I I I 1 I 1 I
27
nitrógeno proteínico y no proteínico del CPAD a diferentes
concentraciones de NaCl y Na2S04 se observan gráficamente en
las figuras.IV.1 y IV.2 respectivamente; la comparación de la
eficiencia de extracción entre las dos sales se encuentra en
la figura IV.3.
Una vez que la proteína fui5 extraída, se 'empleó una
columna de tamizado molecular para identificarla, dicha
columna primero se calibró con una mezcla de colorantes de
elevado peso molecular, para estimar el volumen de elucidn
inicial y final; el volumen muerto indicó las fracciones de
mayor peso molecular que no fueron retenidas por la columna
utilizada y el volumen total determinó las fracciones
colectadas de más bajo peso molecular que pueden obtenerse en
dicha columna, esta determinación se puede apreciar en la
figura IV.4, en la cual se identifica el volumen muerto (Vo)
a los 10 ml y el volumen total (Vt) a los 39 ml.
La cromatografía en columna es una técnica inicial
recomendada para examinar un aislado y compararlo con la
fuente material. La forma particular de examinar por
cromatografía puede ser particularmente determinado por la
cantidad de proteína. Mediante el método de filtración en gel
se puede estimar el peso molecular de proteínas y separar
especies individuales por espectro y otros análisis (Myers,
1 9 8 8 ) .
Entre las proteínas, la mayoría de las mediciones de
absorción en la región de 260 - 280 nm resulta de los
I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I
28
residuos de aminoácidos aromáticos como fenilalanina,
triptofano y tirosina, en el üV más lejano otros grupos son
absorbidos, así a menos de 230 nm otros aminoácidos con carga
secundaria absorben, pero también los electrones desplazan al
peptido principal produciendo espectro de absorción (Franks,
1 9 8 8 ) . En la figura IV.5 se observa el perfil de elución de
la albúmina obtenida del CPAD a 230, 260 y 280 nm, en donde
se tiene que los valores mayores de absorbancia son a 260nm y
el menor espectro fué a 230 nm. Cuando una proteína pura es
caracterizada por W , es de utilidad calcular la proporción
del máximo, al rededor de 280 nm, sobre el mínimo a 260 nm,
para la mayoría de las proteínas se encuentra un valor mayor
a 2, estos valores son utilizados en un último examen de
aislados, para evaluar la posible contaminación.
La medición de la absorbancia ultravioleta puede ser
utilizada directamente en soluciones aisladas, con alguna
purificación cromatográfica. La relación A280/A260 puede ser
usada para monitorear empiricamente impurezas que absorben a
260 nm. Si la fuente material del aislado contenía ácidos
nucleicos, entonces estos serán los principales posibles
contribuyentes a la absorbancia a 260 nm. Para los aislados
preparados de semillas de plantas como fuente, sin embargo,
los carbohidratos, ácido fítico y otros materiales son los
contaminantes más probables, éstos también proporcionan una
mayor contribución a 2ú0 nm que a 280 nm, aunque no hay
cromóferos a 260 nm (Myers, 1988).
En la figura IV.5 se observó la presencia de proteína en
I I I I I I I I I I I I I I I I I fl 3
29
el volumen muerto y en el pico I medida por el método del
colorante ligado a la proteína a 595 nm, pero en el pico 11
no se presentó una absorción significativa a la misma
longitud de onda que indicase la presencia de protelna en
cantidades considerables, sin embargo, se observó que a 260
nm se presentó la máxima absorción en dicho pico lo que
indicaba la presencia de una gran cantidad de impurezas que
absorben a esta longitud de onda.
En el perfil de elución de l a globulina (Fig. IV.6) se
observó una absorción elevada a 595 nm en seguida del volumen
muerto, lo cual significaba que estas fracciones protelnicas
eran de elevado peso molecular, ya que a medida que se
acercaran al volumen muerto (Vo), aumentaba el peso
molecular,sin embargo a 280 nm se observó no sólo éste sino
otro pico más que indicaba un alto contenido de contaminantes
en las fracciones y sabiendo que la globulina tiene un alto
contenido de aminoácidos aromáticos, dicha absorción puede
deberse a éstos. Por otra parte, al compararse los perfiles
de elución de la albúmina (Fig. IV.5) y la globulina
(Fig.IV.6) a 2 8 0 nm se observó que el de la globulina
presentó una mayor concentración de impurezas dadas las
absorbancias de los picos que presentaron.
Finalmente, se debe tener presente, al seleccionar la
longitud de onda a la cual se van a efectuar las lecturas, el
solvente (agua, buffer o algún otro), ya que el espectro de
absorbancia es dependiente del solvente que se emplee,
observandoce e s t e efecto se ve más claramente en las figuras
I I I I I I I I I 1 I I I 1 I I I I I
30
1v.7, IV.8, IV.9 y IV.10. Utilizando el agua como solvente el
máximo de absorbancia se obtuvo a los 230 nm aproximadamente,
tanto para albúmina sérica bovina ( F i g . IV.7), como para el
extracto cruda de albúmina extraído del CPAD (Fig. IV.8). Por
otro lado, empleando buffer como medio solvente, la máxima
absorbancia se obtuvo en el rango de longitud de onda entre
260-280 nm, tanto para albúmina sérica bovina (Fig. IV.9)
como para el extracto crudo de albúmina extraído del CPAD
(Fig.IV.10). Por esta razón el espectro de absorción a 230 nm
en las figuras IV.5 y IV.6 es tan pequeño ya que se trabajó
con buffer como medio solvente y en cambio los espectros a
260 y 280 nm son mayores.
I I I I I I I I I I I 1 I 1 I 1 1 I 1
SEMILLA DE AMARANTO
CRUDA
gll0Og
31
CPA CPAO
9 / 1009 gl100g
TABLA I V . l . Analisis qsiaico proxiaal de l a semilla be anaranto cruda y del CPA' y CPAD'
10.80?0.03 14. 1 8 1 0 . 0 0 15.90
6.77?0. 22 7 . 6 0
2.86f0.00 5.00 4.4Sf0.00 3.21
60.93 68.29
COYPONENIE
9.1820. o2 24.31t0.66 26.77 9.U1'0.03 10.80 [email protected] 8.26 4.8810.02 5.29
44.48 4 8 . 8 8
~
HUMEOAO
PROTEINA
EXTRACTO EIEREO
CENIZAS
FI3RA CRUDA
CARBOHIORATOS
' Concentrado P I
8.2OfO.06 26.2510.39 28.59 O. 79f0.06 O. 86
1 8.2410.00 8.97 5.27f0.00 5.74
5 5 . 8 2 I 1 51.24 t e i T d e anaranto. 1
Concentrado proteinico de anarano desengrasado.
A Base huneda.
B Bate teca.
I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I 1
32
labla I V . 2 . Solnbilidad del nitrbgeno sal ¡ir-soluble y nitrbgeno proteinico del CPi'
en diferentes concenti8cioner de WaCl a pH 7.0
Y g ~ a I o = gY1OOg x v g110og X X I
0 .05 1.520.1 7.520.,03 28.6t1.7 1.22B.O 6.520.0 24.2tO.O 70.721.6 0.15 2.020.2 10.3fl.YD 39.2i4.0 1.4tB.3 7.520.2 27.720.6 84.726.0 0 . 2 5 2.420.2 t2.0f0.9 45.823.5 1.620.2 8 . 5 2 0 . 1 31.520.4 68.'720.8 0.30 3.-020.'0 14.4t0.9 57.5tO.O 1 . M - I 4.7tO.O 18.120.2 31.120.3
0.40 3.020.0 13.9t0.9 51.120.0 1.020.0 4.820.0 18.220.1 31.8t0.2 0.60 3 . 1 2 0 . 0 14.321.3 58.1t0.9 1.010.0 4.720.2 18.121.0 30.621.6 0 . 8 0 2.920.0 14.321.3 58.324.7 0.9fB.4 4.420.2 17.020.8 30.721.4 1.00 3.42Ó.O 16.8!1.3 58.824.7 1.0t0.6 4.920.3 18.021.2 28.7$1.8
1.50 3.0iO.O 14.7rO.O 57.120.0 1.2tB.2 6 . O t O . l 23.220.3 40.620.6 2.00 3.4tO.O 16.7i0.3 63.a20.9 1.320.1 6.520.0 2 4 . 9 2 0 . 1 38.4t0.2 ' Concentrado de proteinas de amaranto :\ - * Nitrbgeno soiubilizadolen . L l a respectiva solución salina (sétodo de Kjeldahl).
' X de nitrbgeno salino-soluble de harina desengrasada
, 0 p.4 ,, i)
&\
. ' j ., :,r. I , -; I . ;- ./
. . C ' . - . , ' , .;J Witrbgeno soluble/Witrogeno total ' , 2 ~ ~ j ~ , ~ l ; ~ ? ? * ~ ) d>!;'O..-, ,:a. 5.i c c
N i t r b g e n o proteinico extraido por la solncibn salina (método de Bradford)
* X de nitrógeno proteinico salino-soluble de la harina desengrasada
' Wit rogeno protein icolni t rogeno Lotal
Witrbgeno pioteinicolnitrogeno solubte
I I I I I I I I I I I I I I I I -I 1 1
Tabla I V . 3 . Solubilidad del nitrógeno salino-soluble y nitrógeno proteinico del CPA'
en diferentes concentraciones de Nado. a pH~7.0
Y gx102 g/1oog x gx102 gl100g. x x 0 . 0 5 2 . 8 2 0 . 1 1 4 . 0 2 0 . 5 5 3 . 3 t 4 . 8 1 . 3 t e . i 6 . 3 t 0 . 4 2 3 . 9 t 3 . 3 44-;9+2;8
0 . 1 0 3 . 3 t 0 . 5 1 6 . 5 t 2 . 5 6 1 . 8 2 9 . 5 1 . 2 2 0 . 6 5 . 8 2 0 . 3 2 4 . 5 t 4 . 1 39 .026 .5
6 . 0 i 0 . 1 2 4 . 6 t 2 . 7 3 7 gi'0.3
0 . 2 0 3 . 3 t 0 . 2 1 6 . 5 t 1 . 0 6 3 . 3 t 5 . 0 1 . 2 t 0 . 6 6 . 0 t 0 . 3 2 4 . 8 f 3 . 4 3 : 5 ? 1 . 4
0 . 2 5 3 . 8 t 0 . 5 1 9 . O t 2 . 5 7 1 . 7 ? 8 . 1 1 . 2 t B . 7 5 . 7 t 0 . 4 2 3 . 9 i 1 . 4 3 0 . 2 t d O
0 . 3 0 3 . 9 t o . 6 i g . s t 3 . 0 7 3 . 6 2 1 2 . 1 1 . 3 t e . g 6 . 2 2 0 . 5 2 3 . 6 t 1 . 3 31/Út1.7
0 . 4 0 3 . 2 2 0 . 4 1 6 . 0 ? 2 . C 6 0 . 3 t 7 . 9 1 . 4 t 0 . 3 7 . O t O . 1 25 .3t2 .8 : 4 1 . 5 t 4 . 6
0 . 5 0 3 . 1 t O . O 1 5 . 5 t 9 . C 5 9 . 0 t O . O 1 . 4 r 2 . 3 i . l t 1 . 2 2 5 . 2 2 4 . 5 4 1 . 1 i 5 . 4
0 . 6 0 3 . 6 t 0 . 8 1 8 . O ? C . O 5 8 . 6 2 1 5 . 1 1 . 2 t 2 . 2
0 . 5 0 3 . 0 t O . O 1 5 . O t O . O 5 1 . 1 t 2 5 . 5 1 . 3 t 2 . 3 6.7t1.1 2 5 . 6 2 3 . 1 4 4 . 8 t 5 . 4
1 . 0 0 2 . 4 t 0 . 6 1 2 . 0 2 0 . 0 4 6 . 3 2 0 . 0 1 . 5 i 0 . 8 7 . 3 t 0 . 4 2 5 . 9 t 3 . 8 4 4 . p t 4 . 8
1
c 0 . 1 5 3 . 2 t o . 3 i 6 . o t i . 5 6 2 . s ? 5 . 0 t . 2 te . t
/ 6 . 1 2 1 . 1 2 4 . 0 t 2 . 9 4 4 . 6 t 4 . 3
I
. ~~
' Concentrado de proteinas del aaaranto Nitrógeno solubilizado en la respectiva solucion salina (método de Kjeldahl).
X de nitrogeno salino-soluble de harina desengrasada
Nitrógeno solublelnitrógena total.
Nitrógeno proteinico exlraido por l a solucion salina (netodo de Bradford).
x de nitrogeno pioteinico sal ¡no-soluble de harina desengrasada.
Nitrógeno proteinicolnitr6geno total
Nitrogeno proteinicolnilrogeno soluble
I I I I I I I I I I I I I 1 1 1 d i l
i4
I ~
I I I I I I I I I I I
\
, P
I
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I
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\ , , ,
I I I 1 I I I I I I I I I 1 I 1 I 1
35
iI
Iu P o) o, O 1 I I I
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O U O O
I I I 1 I I I I I 1 I I I I I I I I I
d O (B cu ai 2 c O o xi 3
O ra z
* O ai z c Q Q
3
O ra
z
-
-
- n - n
t - ';Q z c O o n 3
O ra z
-
I
36
37
I I I I I I I I I I 1 I 1
Fig.IV.4 Determinación del volumen muerto (Vol y el volumen total (Vt ) d e la columna de tamizado molecular con una mez- cla de azul de dextran0 2000 0.1% y rojo d e fenol al 0.06%
en buffer de fosfatos pH 7.6.
vo
t
A I I 1 I I
O 10 20 30 40 50 60 70 ml
4_ Abs 2 3 0 n m - Abs 2 8 0 n m
I I I I I I I I I I I I I 1 I I I 1 1
Fig.iV.5 Perfil de eiución de la albúmina obtenida del CPA desengrasado a diferentes longitudes d e onda
en Sephacrii 5-200.
1 II
A b
r b a n C i
35
t
1 0,4
O L O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Fracción (mi)
Abs. 230nm
+Y Abs. 280nm
A 4- Abs. 260nm
ü- Abs. 595nm
Fig.IV.6 Perfil de elución de la globulina obtenida del CPA desengrasado a diferentes longitudes de onda en
Sephacril 5-200
295
2
A b S 1,5
r b a n
i a
O
1 C
095
O
- I 39
I I I I I I I I I 1 I I I I 1 I 1 1
Vt
t
O 10 20 30 40 50 Fracción (mi)
2 8 0 n m -C- 595nm -
I I
40
I I I
w h) " " O " 0 - O
P O O
I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I
w u " " O " O O
I
I I I I I I I I I I I I I 1 I 1 I I 1
CI u
O u
O u
O " O " O O
1.
E, a 0
O 3 a w
P O O
I I I I I I
I
O t3 "F 0 - O
I I I I I I 1 1 1 I
s s
O E) a p>
A 0 - O
.~ .~. .......I" . .......I .I.__ I.x -.-
1 I I I I I 1 I I I 1 I I I I I 1 I 1
43
V.CONCLUSION.
Uno de los objetivos que se plantearon fué determinar las
mejores condiciones de extracción de las protelnas salino-
solubles en NaCL y Na2S04. la sal monovalente la mejor
extracción de nitrógeno soluble (16.8 g/lOOg de CPAD) se
obtuvo con una concentración de UaCl 1.00 M y para la sal
divalente la mejor extracción (73.6 g/iOOg de CPAD) €u& con
Na2S04 0.25 M, pero la eficiencia de extracción es mejor con
Na2S04, ya que esta resulta ser más o menos constante en todo
el rango de, es decir, la diferencia entre el máximo y el
mínimo de extracción con Na2S04 es menor a la de NaC1.
Otro de los objetivos fué adecuar el método de Landry y
Moureaux tanto en concentración, tipo de sal empleada y
tiempos de extracción de las proteínas salino-solubles. La
modificación al método fué la siguiente: los tiempos
utilizados se dividieron en rangos de 60, 30, 30, 30 minutos
para cada extracción y hasta no obtener presencia de proteína
monitoreada por el método del colorante ligado a la protelna
después de cada extracción, se emplearon además, soluciones
con un amplio rango de concentraciones y se trabajó con una
sal monovalente (NaC1) y otra divalente (Na2S04).
La metodologla propuesta para la obtención de un aislado
proteínico del grano de amaranto a partir de un concentrado
proteínico del mismo fue, en principio, solubilizar las
proteínas salino-solubles con una sal divalente, empleando un
ampli rango de concentraciones de la sal, para encontrar un
4 4
optimo, realizar extracciones de proteína a los tiempos
necesarios hasta que ésta no se detecte más, para lo cual se
debe medir la cantidad extraída por el método del colorante
ligado a la proteína, después de cada extracción, por Último,
se emplea una columna de tamizado molecular para separar e
identificar las fracciones de proteína.
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