ČASOVNA ANALIZA VSEBNOSTI KONDENZIRANIH TANINOV V …

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

Mateja FELICIJAN

ČASOVNA ANALIZA VSEBNOSTI KONDENZIRANIH

TANINOV V LUBJU NAVADNE SMREKE PRI

NAPADU PODLUBNIKOV

DIPLOMSKO DELO

Maribor, 2011

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KMETIJSTVO

Mateja FELICIJAN

ČASOVNA ANALIZA VSEBNOSTI KONDENZIRANIH

TANINOV V LUBJU NAVADNE SMREKE PRI

NAPADU PODLUBNIKOV

DIPLOMSKO DELO

Maribor, 2011

POPRAVKI:

Felicijan M. Časovna analiza vsebnosti kondenziranih taninov v lubju … pri napadu … podlubnikov Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2011

III

Komisija za zagovor in oceno diplomskega dela:

Predsednik: doc. dr. Stanislav TOJNKO

Mentorica: doc. dr. Andreja URBANEK KRAJNC

Somentorica: doc. dr. Janja KRISTL

Član: red. prof. dr. Anton IVANČIČ

Lektor: Ivanka KRAJNC, predmetna učiteljica slovenskega jezika in DMV

Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Datum zagovora: 27. 9. 2011


IV

Časovna analiza vsebnosti kondenziranih taninov v lubju navadne smreke pri

napadu podlubnikov

UDK: 577.1:582.47:595(043.2)=863

Tanini so prevladujoče polifenolne spojine v lubju dreves, ki imajo pomembno vlogo pri lokalnem kot tudi

sistemskem odzivu na napad pred patogeni in škodljivci. V prvem sklopu diplomske naloge smo vzorce

ekstrahirali z različnimi topili in ekstrakcijskimi postopki. Koncentracije kondenziranih taninov v

ekstraktih lubja navadne smreke [Picea abies (L.) H. Karst.] smo določali z vanilin metodo. Na podlagi

rezultatov smo kot najprimernejše topilo izbrali vodno raztopino acetona (aceton : voda, 70 : 30, v/v) s 5

mM Na2S2O5 in ekstrakcijo z ultrazvočnimi valovi. V drugem sklopu naloge nas je zanimal vpliv salicilne

kisline (SK) na vsebnost kondenziranih taninov pri napadu osmerozobega smrekovega lubadarja (Ips

typographus L.). Tretiranje s SK je povišalo vsebnost kondenziranih taninov pri tretiranih kontrolnih

smrekah za 41 % oz. 15 % pri prvem in drugem vzorčnem terminu, ki smo ga opravili v mesecu aprilu. Za

inicialni odziv na napad podlubnikov štirinajst dni po izpostavitvi feromonskih ampul je značilen upad

vsebnosti kondenziranih taninov, ki se je signifikantno odrazil pri tretiranih smrekah. Prvotno povišana

vsebnost le-teh se je znižala na nivo kontrolnih smrek. Mesec dni kasneje je sledila akumulacija oz.

povišanje vsebnosti kondenziranih taninov pri zmerno napadenih smrekah. Na podlagi časovne analize

vsebnosti kondenziranih taninov smo določili tri tipe odziva na napad podlubnikov. Začetni upad vsebnosti

taninov je pri vitalnih drevesih vodil do aklimatizacije, pri močno napadenih pa do degradacije vsebnosti

kondenziranih taninov. Pri močno napadenih smrekah smo sredi junija izmerili do 50 % nižje vrednosti

kondenziranih taninov v primerjavi s kontrolnimi smrekami. Pri nekaterih napadenih drevesih smo izmerili

dinamičen odziv z akumulacijo taninov sredi maja in julija, ki sovpada s 1. in 2. maksimumom naleta in

upadom sredi junija. Iz časovne analize vsebnosti kondenziranih taninov v tretiranih napadenih smrekah je

razvidno, da je obrambni odziv sredi maja manj izrazit in vodi v aklimatizacijo najverjetneje zaradi

predhodne indukcije sistemsko pridobljene odpornosti.

Ključne besede: kondenzirani tanini/ osmerozobi smrekov lubadar (Ips typographus L.)/

Picea abies (L.) H. Karst./ salicilna kislina/ sistemsko pridobljena odpornost (SAR)

OP: XI, 48 s., 3 preg., 4 graf., 9 slik, 60 ref


V

Time-course analysis of condensed tannins in Norway spruce bark after attack by

bark beetles

Tannins are dominant polyphenol compounds in the bark of trees; with important role in local as well as in

systemic response against pathogenic microbes and pest infestations. In the first part of the graduation

thesis, bark samples of the Norway spruce [Picea abies (L.) H. Karst.] were extracted using different

solvents and extraction procedures for analysis of condensed tannins by vanillin method. The results

showed that the most efficient extraction procedure was sonication in a water bath using aqueous acetone

solution (acetone : water, 70 : 30, v/v) containing 5.0 mM Na2S2O5. In the second part of our research, we

were interested in the impact of salicylic acid (SA) on condensed tannins contents in bark of the Norway

spruce after the attack by eight-tooth spruce bark beetle (Ips typographus L.). Treatment with SA increased

the content of condensed tannins in treated control spruces for 41 % or 15 % in the first and the second

sampling term in April. The decrease of condensed tannins contents is distinctive for initial response to

attack of bark beetles a fortnight after pheromone ampoule exposure; this was significantly reflected on the

treated spruces. Originally increased content of those tannins was lowered on the level of control spruces.

A month later, accumulation of the condensed tannins was observed on moderately attacked spruces.

Three types of defence responses against bark beetles were specified according to the time analysis of

condensed tannins contents. Initial decrease of the tannin contents in viable trees lead to acclimatisation of

this substance. In trees severely attacked by bark beetles a degradation of the tannin contents occurred. In

the middle of June, 50 % lower levels of the condensed tannins were measured in severely attacked

spruces in comparison to the control trees. In some of the attacked trees a dynamic response, with

accumulation of tannins was measured in May and July which coincides with 1st and 2nd maximum

invasion, followed by the decrease in the middle of June. According to the time-course analysis of the

condensed tannin contents it may be concluded, that defensive response of the SA treated attacked spruces

in the middle of May was less distinct and leads into the acclimatisation, due to the initial induction of

systematic acquired gained resistance.

Keywords: condensed tannins/ eight-toothed spruce bark beetle (Ips typographus L.)/

Picea abies (L.) H. Karst./ salicylic acid/ systemic acquired resistance (SAR)

OP: XI, 48 P., 3 Tab., 4 Graph., 9 Pic., 60 Ref


VI

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ....................................................................................................................... 1

1.1 Opredelitev problema ................................................................................................ 1

1.2 Namen in cilji diplomskega dela ............................................................................... 3

1.3 Delovne hipoteze ....................................................................................................... 3

2 PREGLED OBJAV ................................................................................................... 4

2.1 Tanini ........................................................................................................................ 4

2.1.1 Kondenzirani tanini ................................................................................................... 6

2.1.2 Biokemična analiza kondenziranih taninov .............................................................. 9

2.2 Anatomske spremembe in kemična sestava lubja smreke pri odzivu na

patogene in škodljivce ............................................................................................. 10

2.3 Obrambne strategije pri napadu .............................................................................. 11

2.3.1 Konstitutiven obrambni sistem ............................................................................... 12

2.3.2 Inducirani obrambni sistem ..................................................................................... 18

2.3.3 Sistematsko aktivirana odpornost (SAR – systemic acquired resistance)............... 20

2.3.4 Indukcija sistemsko pridobljene odpornosti ............................................................ 21

3 MATERIALI IN METODE .................................................................................... 23


VII

3.1 Postavitev poskusa .................................................................................................. 23

3.2 Aplikacija eksogene salicilne kisline ...................................................................... 24

3.3 Načrtni vnos osmerozobega smrekovega lubadarja ................................................ 24

3.4 Uporabljene raztopine in reagenti ........................................................................... 24

3.5 Priprava vzorcev za biokemično analizo ................................................................. 25

3.6 Ekstrakcija vzorcev ................................................................................................. 25

3.7 Določanje koncentracije kondenziranih taninov z vanilin metodo ......................... 26

3.8 Priprava umeritvene krivulje ................................................................................... 27

4 REZULTATI Z RAZPRAVO ................................................................................. 30

4.1 Učinkovitost ekstrakcije kondenziranih taninov ..................................................... 30

4.2 Kvantitativne določitve kondenziranih taninov ...................................................... 31

4.3 Vpliv salicilne kisline na vsebnost kondenziranih taninov pri napadu

podlubnikov ............................................................................................................. 33

4.4 Priloga k vplivom salicilne kisline na vsebnost kondenziranih taninov pri

napadu podlubnikov ................................................................................................ 36

5 SKLEPI ................................................................................................................... 42

6 VIRI IN LITERATURA ......................................................................................... 43


VIII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Vsebnosti kondenziranih taninov v lubju smreke, dobljene z

različnimi ekstrakcijskimi protokoli. Rezultati so podani v mg/g suhe

snovi (SS). ............................................................................................... 31

Preglednica 2:Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju

vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007. Rezultati

biokemične analize predstavljajo mediane in odmike od median, ki so

bili statistično ocenjeni s pomočjo Kruskal-Wallis testa in testa

mnogoterih primerjav po Conoverju. ...................................................... 38

Preglednica 3: Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju

vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007. Rezultati

predstavljajo mediane in odmike od median pri uporabi internega

standarda. Rezultati biokemične analize predstavljajo mediane in

odmike od median, ki so bili statistično ocenjeni s pomočjo Kruskal-

Wallis testa in testa mnogoterih primerjav po Conoverju. ...................... 40


IX

KAZALO GRAFIKONOV

Grafikon 1: Vrednosti kondenziranih taninov (mg/g SS) pri posamičnih netretiranih

smrekah skozi celotno obdobje vzorčenja v letu 2007. Različne črke

(A–H) prikazujejo posamezna vzorčna drevesa. ........................................ 36

Grafikon 2: Vrednosti kondenziranih taninov (mg/g SS) pri posamičnih tretiranih

smrekah skozi celotno obdobje vzorčenja v letu 2007. Različne črke

(A–H) prikazujejo posamezna vzorčna drevesa. ........................................ 37

Grafikon 3: Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju

vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007 pri uporabi standarda

katehina. Rezultati biokemične analize predstavljajo mediane in odmike

od median, ki so bili statistično ocenjeni s pomočjo Kruskal-Wallis

testa in testa mnogoterih primerjav po Conoverju. ..................................... 39

Grafikon 4: Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju

vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007 pri uporabi internega

standarda. Rezultati biokemične analize predstavljajo mediane in

odmike od median, ki so bili statistično ocenjeni s pomočjo Kruskal-

Wallis testa in testa mnogoterih primerjav po Conoverju. ......................... 41


X

KAZALO SLIK

Slika 1: Viri taninov v gozdnem ekosistemu in fizikalni ter kemijski procesi, ki

potekajo pod vplivom okoljskih dejavnikov (Kraus in sod. 2003) ..................... 5

Slika 2: Osnovna strukturna formula flavanoidov (A), strukturna formula epikatehina

(B) in katehina (C) (Hagerman, 2002, 2011). ..................................................... 7

Slika 3: Biosinteza proantocianidina po Aerts in sod. (1999). ........................................... 8

Slika 4: Kemizem vanilin metode za kondenzirane tanine in tvorba barvnega

kompleksa. (Puščica kaže tudi drugo potencialno reaktivno mesto.). .............. 10

Slika 5: A) Zgradba debla, B) ilustracija klinastega segmenta, ki prikazuje glavne

strukturne značilnosti debla (Dinwoodie, 2000). .............................................. 16

Slika 6: Prečni prerez debla navadne smreke, ki prikazuje razvoj smolnih kanalov v

beljavi debla (Franceschi in sod., 2005). .......................................................... 16

Slika 7: Anatomija in porazdelitev polifenolnih parenhimatskih celic (PP celic) v

sekundarnem floemu navadne smreke po Franceschi in sod. (2005). A)

Prečni prerez prikazuje letne plasti PP celic, ločene s plastmi sitastih (S)

celic. B) Povečanje PP celic, ki prikazuje velike vakuole (V), napolnjene s

fenoli in škrobom (St). C) Tangencialni prerez skozi plasti PP celic. D)

Radialni prerez, ki prikazuje cilindrične plasti PP celic, ločene s plastmi

sitastih celic. ...................................................................................................... 17

Slika 8: A) Ekstrakte vzorcev smo centrifugirali 10 minut pri 3500 obratih/min in 4

°C. B) Vzorce smo za 20 minut postavili v ultrazvočno kopel in z ledom

regulirali temperaturo, da se niso pregreli. C) Iz vzorcev smo izparili topilo.

D) Intenzitete obarvanih produktov, ki so nastali pri reakciji med

standardnimi raztopinami katehina in internega standarda na različnih


XI

koncentracijskih nivojih z vanilin reagentom. E) Standardne raztopine

katehina (po reakciji z vanilinom). F) Po dodatku 4 % raztopine HCl in 10

% vanilin reagenta smo vzorce natančno 20 minut pustili v vodni kopeli pri

temperaturi 30 °C. G) Absorbance smo izmerili na spektrofotometru pri

valovni dolžini 500 nm (A500). .......................................................................... 29

Slika 9: Absorbanca (λ=500 nm) standardnih raztopin katehina in internega standarda

(standard iz sekundarnega lubja smreke), izmerjena po uporabi vanilin

metode. .............................................................................................................. 32


XII

Uporabljene kratice

ABS

JK

MJ

NI

NK

PP celice

PR proteins

ROS

SAR

SK

SS

TD

TI

TK

absorbanca

jasmonska kislina

metil jasmonat

netretirana napadena oz. inficirana drevesa

netretirana kontrolna drevesa

polifenolne parenhimatske celice

pathogenesis related proteins – proteini povezani s patogenezo

reactive oxygen species – reaktivne kisikove spojine

systemic acquired resistance – sistemsko inducirana odpornost

salicilna kislina

suha snov

traumatic duct – travmatski smolni kanal

tretirana napadena oz. inficirana drevesa

tretirana kontrolna drevesa


1

1 UVOD

1.1 Opredelitev problema

Slovenijo pokriva 58.5 % gozdov, kar jo uvršča med najbolj gozdnate države Evrope.

Gospodarsko najpomembnejša gozdna vrsta pri nas je navadna smreka [Picea abies (L.) H.

Karst.], ki so jo načrtno zasadili povsod po Sloveniji, tudi v legah, ki zanjo niso

najugodnejše. Zaradi neugodnih klimatskih razmer jo ogrožajo podlubniki in druge

bolezni. Najpogostejša predstavnika lubadarjev, ki v slovenskih gozdovih povzročata

težave in daleč največ škode, sta osmerozobi smrekov lubadar ali knaver (Ips typographus

L.) ter šesterozobi smrekov lubadar (Pityogenes chalcographus L.). Naseljujeta oslabelo in

posekano drevje, v primeru večje številčnosti populacij pa tudi vitalna drevesa. Povzročata

fiziološke motnje, saj uničujeta floem in kambij, lahko pa prekineta tudi pretok vode v

ksilemu. Posledica je navadno sanitarni posek, ki v Sloveniji predstavlja povprečno tretjino

celotnega poseka in v različnih letih predstavlja 19–45 %. Smrekove monokulture

povečujejo delež potrebnih negovalnih sečenj, hkrati pa zmanjšujejo bioekološko stabilnost

gozdov.

Lubje iglavcev je zakladnica hranilnih snovi in s tem tarča številnim organizmom. Iglavci

imajo razvit širok spekter obrambnih mehanizmov, ki temeljijo na anatomiji lubja in

njegovem fiziološkem stanju. Znanstveniki navajajo tri tipe obrambnih strategij, in sicer

konstitutivna, inducirana in pridobljena odpornost. Za uspešno obrambo je ključnega

pomena vitalno, s hranili in vodo dobro preskrbljeno drevo, ki ima enega ali več dobro

razvitih obrambnih mehanizmov. Glavno področje obrambnih mehanizmov je sekundarni

floem, ki predstavlja fizično in kemično zaščito lubja pred škodljivci, saj vsebuje

polifenolne parenhimatske celice (PP celice), sklerenhim, kristale kalcijevega oksalata in

shizogene smolne kanale.

Tanini so fenolni polimeri, ki so ključnega pomena v obrambi dreves pred napadom

škodljivcev in patogenov, saj kot antihranila in antimikrobna sredstva delujejo zaščitno

proti bakterijam, plesnim, virusom in škodljivcem. Negativni učinki taninov so povezani

predvsem z zmanjšanjem razpoložljivosti hranljivi snovi, zato se uvrščajo med


2

antinutritivne snovi. Njihova sinteza se vrši neprekinjeno, produkti pa se shranjujejo v vseh

tkivih rastline, še posebej v vakuolah znotraj polifenolnih parenhimatskih celic v lubju.

Vsebnost in struktura taninov v rastlini variira in je odvisna od okoljskih dejavnikov,

predvsem od temperature, količine padavin in vsebnosti hranil v tleh.

Zaradi zelo širokega spektra različnih učinkov taninov v bioloških sistemih ponovno

narašča zanimanje za kvantitativne določitve polifenolov v rastlinskih tkivih. Na dobljeni

rezultat vplivajo številni dejavniki; priprava vzorca, ekstrakcijsko topilo, standard, ki ga

uporabimo in izbrana analizna metoda. Da bi upoštevali kar največ omenjenih dejavnikov,

smo v diplomski nalogi primerjali učinkovitost petih različnih postopkov ekstrakcije

fenolnih spojin iz sekundarnega lubja navadne smreke. Za kvantitativne določitve smo kot

standardno substanco uporabili katehin in standard, ki smo ga pripravili iz smrekovega

lubja.

Eden izmed ključnih ciljev diplomske naloge je spremljanje učinkovitosti sistemsko

pridobljene odpornosti (SAR), ki predstavlja trajnejši način obrambe, tako da izzove

kvalitativne in kvantitativne spremembe v kemični sestavi dreves. Spojini, ki izzoveta SAR

in sta sposobni inducirati izražanje genov za obrambo rastline, sta jasmonska in salicilna

kislina (SK). Vpliv salicilne kisline na vsebnost taninov v lesnatih rastlinah je še

neraziskan, rezultati raziskav s tretiranjem SK na zelnatih rastlinah pa kažejo pozitivne

učinke preventivne uporabe za krepitev zdravja rastlin, saj dolgoročno zavira širjenje in

razmnoževanje patogenov in škodljivcev.


3

1.2 Namen in cilji diplomskega dela

Cilji diplomskega dela so:

− izbrati najučinkovitejši postopek ekstrakcije fenolnih spojin iz lubja navadne

smreke;

− primerjati rezultate, dobljene s katehinom kot standardno substanco z rezultati,

dobljenimi na osnovi proantocianidinov, ki so bili izolirani iz preiskovanega

materiala;

− podati časovno analizo obrambnega odziva kondenziranih taninov navadne smreke

pri napadu podlubnikov;

− določiti vpliv tretiranja s SK na vsebnost kondenziranih taninov v sekundarnem

lubju navadne smreke pri napadu podlubnikov.

1.3 Delovne hipoteze

Raziskave, povezane s to nalogo, temeljijo na naslednjih hipotezah:

− Glede na navedbe literature pričakujemo, da bomo z uporabo specifičnega

standarda (proantocianidini izolirani iz lubja navadne smreke) dobili točne rezultate

o vsebnosti kondenziranih taninov v analiziranem materialu.

− Drevesa se na napad podlubnikov odzovejo z dinamičnim obrambnim odzivom, ki

je izrazitejši pri netretiranih drevesih, saj tretiranje s SK vpliva na predčasno

imunizacijo drevesa pred napadom podlubnikov.

− Tretiranje s SK ima vpliv na vsebnost kondenziranih taninov, hkrati pa SK kot

signalna molekula sproži indukcijo sistemsko pridobljene odpornosti.


4

2 PREGLED OBJAV

2.1 Tanini

Izraz tanin izhaja iz keltske besede za hrast, ki je glavni vir taninov (Hagerman, 2002,

2011). Tudi v naših gozdovih največ taninov vsebujejo hrastova in kostanjeva črnjava ter

skorja. Dosti pa jih vsebuje tudi smrekova skorja (Leban, 2008).

Tanini ali čreslovine so zelo heterogena skupina fenolnih polimerov, ki se razlikujejo po

kemijski strukturi in reaktivnosti. Sodijo med vodotopne polifenolne spojine z molekulsko

maso med 500 in 3000 Da, znane pa so tudi že molekule z maso 20000 Da (Bate-Smith in

Swain, 1962; Kraus in sod., 2003), vendar pa se topnost z večanjem molekulske mase

zmanjšuje. Kemično so tanini polimerni flavonoidi iz skupine fenolov, ki jih rastline

proizvajajo kot sekundarne metabolite (Diaz in sod., 2009). Tanini so naravne rastlinske

spojine, ki s trpkim okusom, antinutritivnimi in antimikrobnimi lastnostmi ščitijo rastline

pred patogeni in herbivori. Antimikrobno delujejo na različne glive, bakterije, kvasovke in

viruse, zato v rastlinah služijo kot naravni obrambni sistem proti mikrobnim okužbam.

Prav ta zaščita pred glivami in mikroorganizmi je imela v evoluciji taninov v rastlinah

pomembno vlogo (Aerts in sod., 1999).

Mehanizmi antimikrobnega delovanja taninov so različni, in sicer lahko inhibirajo

delovanje mikrobnih ekstracelularnih encimov, se vežejo na substratne molekule, da

postanejo nedostopne za mikroorganizme, ali pa delujejo neposredno na mikrobni

metabolizem, tako da inhibirajo oksidativno fosforilacijo ali pa tvorijo komplekse s

kovinskimi ioni (Kraus in sod., 2003).

Predpostavlja se, da tanini delujejo kot naravni regulatorji mikrobne populacije v različnih

habitatih, tudi v tleh, kjer vplivajo na mikrobiološko aktivnost, pedogenezo, dušikov

ciklus, skladiščenje nitrata in na oblikovanje huminskih kislin v kompleksu tal (Kraus in

sod., 2003).


5

Tanini so v rastlinah zelo razširjeni, zato jih najdemo povsod. Nahajajo se v vseh

rastlinskih delih, tako v koreninah kot deblu, skorji, brstih, listih in plodovih (Kraus in

sod., 2003). V posebno velikih količinah se pojavljajo znotraj polifenolnih parenhimatskih

celic v lubju dreves. V višjih koncentracijah so shranjeni v vakuolah rastlinskih celic,

intenzivni depozit pa je odkrit tudi v epidermisu listov in listnih trihomih (Aerts in sod.,

1999).

Na vsebnost taninov v rastlini vplivajo okoljski dejavniki, kot so dostopnost vode in hranil,

svetloba, temperatura, količina CO2 in ozona (Kraus in sod., 2003; Hayat in sod., 2009).

Slika 1: Viri taninov v gozdnem ekosistemu in fizikalni ter kemijski procesi, ki potekajo

pod vplivom okoljskih dejavnikov (Kraus in sod. 2003).

Glede na kemijsko strukturo tanine običajno razdelimo v dve skupini, kondenzirani in

hidrolizabilni tanini (Shahidi in Naczk, 1995). Kondenzirani tanini se v vročih alkoholih


6

(npr. v butanolu) pretvorijo v antocianidine, zato jih imenujemo tudi proantocianidini

(Hümmer in Schreier, 2008). Hidrolizabilni tanini imajo ogljikohidratno jedro

(najpogosteje glukoza), katerega hidroksilne skupine so zaestrene z galno, elagno in

heksahidroksidifensko kislino. Estre z galno ali elagno kislino imenujemo galotanini, estre

s heksahidroksidifensko kislino pa elagitanini (Hagerman, 2002, 2011). V prisotnosti kislin

in alkoholov hidrolizirajo, po čemer so tudi dobili ime (Bruce in Palfeyman, 1998).

2.1.1 Kondenzirani tanini

Kondenzirani tanini so polimerni flavanoidi (Hagerman, 2002, 2011). V naravi so zelo

razširjeni, v velikih koncentracijah jih najdemo v lesu in lubju različnih dreves, kot so vrste

Acacia, Schinopsis, Tsuga in Pine (Bruce in Palfeyman, 1998). Monomerne enote

kondenziranih taninov predstavljajo flavanolne enote (flavan-3-oli in flavan-3,4-dioli), ki

se med seboj povezujejo s kovalentnimi C-C vezmi. Flavan-3-oli so zgrajeni iz 15

ogljikovih atomov in imajo značilni C6-C3-C6 flavanoidni skelet. Aromatska obroča B in

C nastaneta iz fenilalanina, obroč A pa po poliketoidni poti (slika 2A). Razlikujejo se po

številu hidroksilnih skupin na obeh aromatskih obročih (Bruce in Palfeyman, 1998;

Hagerman, 2002, 2011; Hümmer in Schreier, 2008).

K flavan-3-olom prištevamo katehin in epikatehin, galokatehin in epigalokatehin. Največ

raziskav temelji na (+)-katehinu in (-)-epikatehinu (Hagerman, 2002, 2011) (slika 2B, 2C),

ki sta v naravi najbolj zastopana.

Proantocianidine, ki so zgrajeni izključno iz monomernih enot katehina ali epikatehina,

imenujemo procianidini in so v rastlinah najbolj razširjeni proantocianidini (Hümmer in

Schreier, 2008).

Ribérau-Gayon in sod. (2000) delijo dimere flavan-3-olov v skupini A in B, trimere pa v

skupini C in D. V skupino A spadajo dimeri falvan-3-olov (C30H26O12), ki so med seboj

vezani s C2-C7 vezjo. Dimeri s C4-C8 in C4-C6 vezjo pa so razvrščeni v skupino B

(Hagerman, 2002, 2011).


7

Momomeri, ki sestavljajo kondenzirane tanine, nastanejo v postopku biosinteze (slika 3).

Prva serija zaporednih encimskih postopkov je tako v biosintezi proantocianidinov kot

biosintezi antocianinov enaka do nastanka leukoantocianidinov. Nadaljnje se biosinteza

proantocianidinov loči, leukoantocianidini se reducirajo s pomočjo NADPH do katehinov.

Reakcijo katalizira encim leukoantocianidin reduktaza (LAR), pri nastanku antocianinov

pa sodeluje encim antocianin sintaza (ANS) (Aerts in sod., 1999).

Slika 2: Osnovna strukturna formula flavanoidov (A), strukturna formula epikatehina (B)

in katehina (C) (Hagerman, 2002, 2011).


8

Slika 3: Biosinteza proantocianidina po Aerts in sod. (1999).


9

2.1.2 Biokemična analiza kondenziranih taninov

Raziskovanje kondenziranih taninov je bilo zaradi njihove strukturne kompleksnosti dokaj

težavno. Za določevanje le-teh v rastlinskih materialih se uporablja več analiznih metod.

Pogosto uporabljene metode vključujejo oksidativno depolimerizacijo proantocianidinov,

reakcije obroča A z aromatskim aldehidom in oksidativno–redukcijske reakcije. Ostale

metode vključujejo oksidativno cepitev C-C vezi med flavanolnimi monomeri, obarjalne

reakcije, encimsko in mikrobno inhibicijo ter gravimetrične postopke. Večina metod

omogoča določevanje ekstrabilnih kondenziranih taninov v ekstraktih, ki jih dobimo z

ekstrakcijo rastlinskega materiala z acetonom ali metanolom. Nekatere metode pa se

poslužujejo tudi določevanja taninov, ki so v omenjenih topilih netopni. Gre za tanine z

višjimi molekulskimi masami in tanine, ki so vezani na vlakna (Schofield in sod., 2001).

Vanilin metoda

Pri biokemijski analizi kondenziranih taninov smo se odločili za vanilin metodo. Vanilin

metoda je ena od metod za določevanje kondenziranih taninov in temelji na reakciji

vanilina s kondenziranimi tanini, pri kateri se tvorijo barvni kompleksi (slika 4). Pri

uporabi te metode je ključnega pomena izbira ustreznega topila in standardne substance,

lastnosti in koncentracija kisline, reakcijski čas, temperatura, svetloba in koncentracija

vanilina (Sun in sod., 1998; Schofield in sod., 2001; Hümmer in Schreier, 2008). Sun in

sod. (1998) trdijo, da je za vanilin metodo, pri uporabi katehina kot standarda,

najpriporočljivejši reakcijski čas med 15 in 20 minut pri temperaturi od 25 do 30 °C. Prav

tako bi po njihovem mnenju bilo primerno uporabiti koncentracijo vanilina nad 10 g/l oz.

najprimernejše 10–12 g/l.


10

Slika 4: Kemizem vanilin metode za kondenzirane tanine in tvorba barvnega kompleksa.

(Puščica kaže tudi drugo potencialno reaktivno mesto.).

2.2 Anatomske spremembe in kemična sestava lubja smreke pri odzivu na patogene

in škodljivce

Iglavci so zaradi svoje izredne prilagodljivosti na podnebne razmere zelo razširjena

rastlinska vrsta in jih najdemo povsod po svetu. Ker je njihova življenjska doba dolga, je ta

vrsta toliko bolj izpostavljena številnim napadom različnih organizmov.

Njihovo lubje predstavlja zakladnico različnih hranil, zaradi česar so tarča tako insektom,

herbivorom, glivam in bakterijam. Floem in kambij predstavljata relativno majhen obseg

tkiva, ki je zaradi tega hitreje in lažje poškodovano in uničeno. Rane, ki jih v skorjo debla

naredijo organizmi, so idealna priložnost še za druge organizme, ki prodora v deblo sama

ne bi bila sposobna izvesti (Franceschi in sod., 2005). Takšen primer je npr. gliva

Ceratocystis polonica, ki infekcijo izvede šele, ko jo v notranjost debla prinese lubadar

(Schmidt in sod, 2005.). Tako so iglavci podvrženi raznovrstnim množičnim napadom s

strani živega sveta, seveda pa pri tem ne smemo zanemariti tudi abiotičnih dejavnikov, ki

jim prav tako povzročijo stres in porušijo njihovo ravnovesje.


11

2.3 Obrambne strategije pri napadu

Zaradi velike raznovrstnosti napadalcev in njihove raznolikosti po načinu napada imajo

iglavci širok spekter obrambnih mehanizmov. Razvili so različne načine, da so sposobni

inhibirati ali celo uničiti patogene in škodljivce. Vse to od njih zahteva veliko energije in

asimilatov, ki so potrebni za normalen razvoj in rast ter reprodukcijo rastline.

Franceschi (2005) v svojih raziskavah navaja tri različne tipe obrambnih strategij. To so:

konstitutivna, inducirana in pridobljena ali sistemska odpornost (SAR).

Konstitutivna obrambna strategija je prisotna v drevesu brez predhodnega napada in se deli

na mehansko ter kemično obrambo. Inducirana obramba je ustvarjena za zaznavanje tujka

in njegovega napada, pridobljena ali sistemska odpornost pa je del inducirane odpornosti in

je namenjena hitrejšim ter lažjim odzivom na napad škodljivcev v prihodnosti.

Učinkovito obrambo zagotavlja večstopenjski sistem, ki poteka v točno določenem

časovnem zaporedju in je reguliran kot serija večih odpornostnih mehanizmov. Kot prva je

efektivna konstitutivna obramba, ki lahko inhibira vdor infekcije v tkiva. V primeru, da ta

faza obrambe ne zadošča, sledi pomor nezaželjenih organizmov, nato rastlina popravi

nastale poškodbe in nadaljuje svoj razvoj. Zadnjo fazo obrambe predstavlja pridobljena ali

sistemska odpornost, ki zagotovi, da se rastlina v primeru naslednjega napada lažje in

hitreje odzove.

Ta sistem je hkrati povezan še s prostorsko in časovno komponento. Prostorsko

komponento si lahko predstavljamo kot nekakšen grad z jarki in obzidji, ki ga varujejo. Ta

prostorska komponenta se pri iglavcih izraža prek polifenolnih parenhimskih celic oz. PP

celic, ki so v deblu razporejene v koncentrične plasti ali t.i. letnice. Te predstavljajo tako

mehansko kot kemijsko obrambo pred napadom. Časovno je vse skupaj povezano s

sezonsko – ponavljajočo in izboljšano produkcijo obrambnih mehanizmov v novih tkivih

ali pa nastanek drugačnih obrambnih mehanizmov v že napadenem tkivu (Franceschi in

sod., 2005).


12

Bistvo obrambe je vsekakor zaščita energetsko in hranilno bogatega floema. Sekundarni

floem je obenem tudi glavno področje osnovnih obrambnih mehanizmov, ki pri večini

iglavcev temeljijo na sklerenhimu, kristalih kalcijevega oksalata in na s fenoli bogatimi

vakuolami (Hudgins in Franceschi, 2004). Poleg tega ne smemo pozabiti, da imajo iglavci

tudi shizogene smolne kanale. Tako k uspešni obrambni strategiji pripomoreta prisotnost in

velikost radialnih ter aksialnih smolnih kanalov, smolnih žepkov in smolnih celic.

2.3.1 Konstitutiven obrambni sistem

Ločimo mehansko in kemično konstitutivno obrambo. Mehanska obramba je sestavljena iz

strukturnih elementov, ki določajo žilavost ali debelino tkiva in s tem direktno preprečijo

mehanske poškodbe zaradi objedanja škodljivcev. V to skupino obrambnih sistemov spada

tudi »impregnacija« celične stene s polimeri, kot sta lignin in suberin, ki pripomoreta k

povečevanju odpornosti pri vdoru, degradaciji in objedanju tkiv manjših organizmov. V

drugo skupino konstitutivne obrambe, in sicer v kemično obrambo, spadajo različne

kemijske spojine, kot so fenoli, terpeni in alkaloidi, ki se iz vakuol sprostijo v času napada.

Kemična obramba vključuje antihranila, toksine, obrambne proteine in encime ter smolo iz

rezervoarjev smolnih kanalov (Franceschi in sod., 2005). Smola lahko »odplakne«, odvrne

ali pa fizično ujame manjše organizme. Vsi ti obrambni sistemi so prostorsko razporejeni

po sekundarnem floemu in peridermu znotraj skorje dreves.

Periderm

Prvo mehansko obrambo stebla pred škodljivimi biotskimi in abiotskimi faktorji

predstavlja periderm. Sestavlja ga plutni kambij (felogen) in njegovi produkti – pluta.

Periderm se razlikuje med rastlinskimi vrstami in ga zaznamujejo večplastne strukturno in

kemično različne celice, kot so ligninske, fenolne in plutaste celice. Pluta je sestavljena iz

plasti plutastih celic, ki so večinoma odmrle in imajo oplutenele ali lignificirane celične

stene. Ta plast lubja zaradi večjih plasti celic obogatenih z velikimi količinami fenolov in s

kristali kalcijevega oksalata, ter zaradi lignificiranih in suberiziranih celičnih sten, ki


13

zagotovijo hidrofobno oviro (Franceschi in sod., 2005), predstavlja kombinacijo kemičnih

in mehanskih lastnosti za obrambo.

Sekundarna skorja ali sekundarni floem

Naslednjo oviro po prečnem prerezu debla predstavlja sekundarna skorja, ki ima

pomembno vlogo obrambne ovire v začetnem stadiju razvoja debla. V vakuolah parenhima

vsebuje velike količine fenolov, skorja večine iglavcev pa tudi aksialne smolne kanale.

Prav tako kot v parenhimu se tu z mehansko funkcijo zaščite nahajajo kristali kalcijevega

oksalata, poleg njih pa tudi sklerenhim (Franceschi in sod., 2005).

Večina iglavcev ima v sekundarnem floemu kombinacijo ali vsaj enega od konstitutivnih

obramb, kot so že prej omenjeni sklerenhim, kristali kalcijevega oksalata in fenolna telesca

(Hudgins in Franceschi, 2004).

Najpomembnejšo obrambo iglavcev v sekundarnem floemu predstavljajo PP celice, ki se

kažejo kot letni tangentni prirast ali t.i. letnice. Te celice pri navadni smreki lahko živijo

tudi več desetletij, kar je posledica tega, da se zaradi sekundarne rasti skozi leta plasti PP

celic odmikajo od kambija, postajajo vedno večje in se vseskozi periklino delijo. Ker so PP

celice najštevilnejša skupina živih celic v sekundarnem floemu, so posledično

najpomembnejši in izredno dinamičen sestavni del obrambe lubja (Krekling in sod., 2000).

Ker skupaj s trakovnim parenhimom predstavljajo glavno področje za skladiščenje škroba

in lipidov (slika 7B), so še posebej ogroženi pred napadom podlubnikov in gliv. PP celice

so specializirane za sintezo in akumulacijo fenolnih spojin in so zgrajene tako, da v

vakuolah vsebujejo različne količine fenolnih snovi, ki služijo kot antihranila in

protiglivična sredstva. Njihova celična stena je odebeljena in vsebuje veliko količino

plazmodezm, ki omogočajo aksalno in tangentno izmenjavo informacij ter možnost za

obrambno signalizacijo. Tako plasti PP celic, med katerimi se nahajajo ostanki sitk (slika

7A, 7C, 7D), predstavljajo učinkovito fizično in kemično zaščito pred vdorom v lubje

(Beckman, 2000; Franceschi in sod., 2000).

Pomembna zaščita pred napadom je tudi sklerenhim. To je mehansko tkivo, sestavljeno iz

celic z odebeljenimi lignificiranimi sekundarnimi celičnimi stenami, ki je skupno vsem

iglavcem in služi kot strukturni sestavni del in kot mehanska zaščita. Sklerenhim se

pojavlja v obliki velikih celic, imenovanih sklereide, ali pa v obliki dobro razporejenih


14

nizov sklerenhimatskih vlaken. Sklereide, ki se lahko v floemu nahajajo kot samostojne

celice ali pa kot skupina celic različnih velikosti, fizikalno preprečujejo škodljivcem, da bi

se na lubju zadrževali ali vrtali vanj (Wainhouse in sod., 1990, 1997, 1998; Hudgins in

sod., 2004).

Kristali kalcijevega oksalata so še en način mehanske zaščite v sekundarnem floemu

iglavcev. Pojavljajo se lahko intracelularno, v zunajceličnih stenskih strukturah in v

peridermu. Čeprav je o teh kristalih še malo raziskanega, lahko trdimo, da njihove fizikalne

lastnosti in relativna številčnost v tkivu, odvračajo nezaželjene organizme (Franceschi in

sod., 2005). Borovci kristale kalcijevega oksalata vgrajujejo v vakuole modificiranih PP

celic. Hudings in sod. (2003) trdijo, da kombinacija teh kristalov in več različnih plasti

vlaken, ki predstavljajo popolno tangencialno plast lignificiranih celic, zagotavlja precej

močno in učinkovito obrambo pred lubadarji.

Eden izmed zelo pomembnih obrambnih sistemov so tudi strukture, ki proizvajajo in

skladiščijo smolo. Mednje sodijo radialni in aksialni smolni kanali, smolni žepki in smolne

celice (slika 6). Kanale in žepke obdaja plast epitelnih celic s plastidi, ki sintetizirajo

terpene in smolo, ter ju izločajo v zunajcelični lumen, od tam pa se smole zaradi notranjega

pritiska združujejo v večje strukture, imenovane smolni kanali. Iz njih se iz rane ob napadu

ali pa pri mehanski poškodbi izloči smola. Smola lahko škodljivce iz lubja odstrani fizično,

tako da jih zlepi ali pa jih zaradi toksikoloških lastnosti smole ubije. Ko smola zalije rano,

iz nje izhlapijo eterična olja, preostali sestavni deli pa kristalizirajo, kar povzroči

učinkovito sterilizacijo in zatesnitev poškodovanega dela od zunanjih dejavnikov

(Franceschi in sod., 2005). Tvorba smolnih kanalov se inducira tudi pri napadu škodljivcev

in patogenov (travmatski smolni kanali, TD). Navadno se tvorba začne po dveh do treh

tednih po napadu v primeru, da smole za obrambo v tem času primanjkuje. V TD se tvori

smola, ki je navadno drugačne kemijske sestave kot konstitutivna. Zaradi sprememb

terpenskih komponent ali s koncentriranjem fenolov je bolj toksična. Tvori se nad in pod

poškodovanim ali inficiranim mestom (Franceschi in sod., 2000; Hudings in sod., 2004;

Krekling in sod., 2004). Navadno TD nastajajo v ksilemu in so z aksialnimi smolnimi

kanali povezani z beljavo debla (Hudings in sod., 2003; Krekling in sod. 2004).

Ugotovljeno je, da tretiranje z metil-jasmonatom (MJ) povzroča tvorbo etilena, ki je


15

pomemben pri tvorbi TD. Prav tako tudi izzove aktivacijo radialnih smolnih kanalov, da

proizvedejo dodatno smolo (Hudings in Franceschi, 2004; Hudings in sod., 2004).

Sekundarni ksilem

Podobno kot aksialni in radialni sistem v sekundarnem floemu tudi sekundarni ksilem

vključuje sintezo in izloča ekstrakte, kot so lignini. Izloča jih v srčevino iglavcev in s tem

zagotavlja obrambo proti gnilobi, ki je lahko posledica napada gliv in drugih organizmov.

Radialni kanali omogočajo transport fenolov in njihovih produktov do meje med beljavo in

srčevino z namenom, da spodbudijo razvoj fenolne impregnacije ali pa odziv območij, ki

so namenjena, da zaustavijo širjenje gnilobe v srčevini. Prav tako ksilem svoj delež

prispeva pri pretoku smole v radialnih smolnih kanalih, kadar so le-ti prečno povezani med

ksilemom in floemom s ključnimi aksialnimi kanali (Franceschi in sod., 2005).


16

Slika 5: A) Zgradba debla, B) ilustracija klinastega segmenta, ki prikazuje glavne

strukturne značilnosti debla (Dinwoodie, 2000).

Slika 6: Prečni prerez debla navadne smreke, ki prikazuje razvoj smolnih kanalov v beljavi

debla (Franceschi in sod., 2005).


17

Slika 7: Anatomija in porazdelitev polifenolnih parenhimatskih celic (PP celic) v

sekundarnem floemu navadne smreke po Franceschi in sod. (2005). A) Prečni prerez

prikazuje letne plasti PP celic, ločene s plastmi sitastih (S) celic. B) Povečanje PP celic, ki

prikazuje velike vakuole (V), napolnjene s fenoli in škrobom (St). C) Tangencialni prerez

skozi plasti PP celic. D) Radialni prerez, ki prikazuje cilindrične plasti PP celic, ločene s

plastmi sitastih celic.


18

2.3.2 Inducirani obrambni sistem

Sistem obrambe ima več stopenj, ki si sledijo v pravilnem zaporedju. Kot je že omenjeno,

se obramba rastline začne s konstitutivno odpornostjo, kjer visoka vsebnost procianidinov

in njihovo neugodno razmerje proteinov motita ali celo zavreta napad podlubnikov.

Pri uspešnem napadu se obramba nadaljuje z induciranim sistemom. Inducirana obramba

poveča vsesplošno zaščito rastline. Zajema kombinacije večih mehanizmov, tako da

vključuje odzive na specifične organizme, poveča splošne odzive na napad, povečuje

postopek omejevanja obsega poškodb ter zapira ranjena mesta (Franceschi in sod., 2005).

Povezana je z lokalnimi spremembami metabolizma v tkivih, ki ležijo v bližini napadene

lokacije. Zdrava tkiva sprožijo izolacijo napadenih tkiv, kar privede do upada hranilnih

snovi, škodljivcem onemogoči širitev okužbe in nadaljnje bivanje v tem predelu. Če to ne

zaleže, se napad prepreči z zmanjšanjem topnih ogljikovih hidratov in s povečano

koncentracijo proteinov in procianidinov, ki se stopnjuje, dokler dokončno ne uniči

škodljivca. Takšni odzivi ne uničijo le odraslih patogenov, temveč tudi njihovo zalego

(Rohde in sod., 1996).

Inducirana obramba je precej raznolika, zato se deli na strukturno obrambo in na sintezo

kemičnih spojin za zatiranje poškodb.

Strukturna obramba

Strukturna obramba je pomembna pri obvladovanju in izolaciji napada različnih

organizmov, pri obnovi poškodovanega tkiva in pri omejevanju prilagojenih ali naknadnih

okužbah. Preko lokaliziranega odziva, ki se pojavi na mestu okužbe, je odziv na rano

navadno oblikovanje kalusnega tkiva. To tkivo kasneje postane lignificirano, suberizirano

ali se impregnira s fenoli, kar drevesu zagotovi pregrado oziroma zaščito pred nadaljnjimi

vdori. Kalus ima tudi sposobnost, da obnovi poškodovana tkiva tako, da ponovno

vzpostavi njihovo funkcijo (npr. reorganizacija poškodovanega kambija). Podobno kot

kalus tudi ranitveni periderm izzove aktivacijo PP celic v sekundarnem floemu, izolira

poškodovano območje (tvori se okrog poškodovanega tkiva) in omogoči trajno obnovo


19

tkiva. Poškodovano ali inficirano tkivo se tako znajde v izoliranem območju brez hranil,

zato odmre (Franceschi in sod., 2005).

Tudi lignifikacija vlaken je ena izmed strukturnih obramb (Hudgins in sod., 2003, 2004).

Ta se izvrši popolnoma do približno tretjega leta starosti. Nedavne raziskave so pokazale,

da lahko popolno lignifikacijo vlaken izvršimo s tretiranjm z MJ. Ta ustvari podoben odziv

kot pri ranitvi in najverjetneje zdravim tkivom signalizira navidezen napad, čeprav je

signal lažen oziroma je posredovan le zaradi etilena induciranega z MJ (Franceschi in sod.,

2004; Hudgins, 2004).

Inducirana kemična obramba

Inducirana kemična obramba je neselektivna, saj uporablja tako široko spektrne kot

izrazito specifične sestavine. Posledica tega je izrazita raznolikost obrambnih spojin, ki

pokrivajo celotno območje škodljivcev. Neproteinske kemične snovi, kot so fenoli, smole

in alkaloidi imajo močan vpliv na invazivne organizme. Njihova prednost je, da so pri

obrambi hitrejši od beljakovinskih obrambnih sestavin, saj se ponavadi le-ti že skladiščijo

v različnih tkivih in le čakajo na pravi trenutek. Ker učinkujejo na široko paleto

organizmov, lahko to upočasni napad, medtem pa obrambni mehanizem že uspešno

prepozna škodljivca in aktivira specifično obrambo proti njemu (Franceschi in sod., 2005).

Pri iglavcih so najpomembnejše kemijske spojine za zaščito pred napadom tanini in

terpeni. Tanini in fenoli v širšem smislu v skorji predstavljajo antihranila in protiglivična

sredstva. Vežejo lahko hidrolitične encime, ki jih izločajo škodljivci, kar prepreči njihov

prodor v tkiva. Ker se vežejo na prebavne encime, tako dodatno zmanjšujejo sposobnost

prebave in doseg hranil patogenim organizmom (Franceschi in sod., 2000). Produkcija

fenolov se v rastlinskem tkivu vrši neprekinjeno, produkti pa se shranjujejo v PP celicah.

Fenolne spojine, nastale med okužbo, so nekoliko drugačne od konstitutivnih fenolov, saj

vsebujejo več toksičnih ali bolj specifičnih snovi za posameznega škodljivca (Franceschi in

sod., 1998; Krekling in sod., 2000).


20

2.3.3 Sistematsko aktivirana odpornost (SAR – systemic acquired resistance)

Za drevo je med uspešnim napadom podlubnikov ključnega pomena vzpostavitev tretje

obrambne strategije, t.i. sistemsko pridobljene odpornosti (Christiansen in sod., 1999;

Franceschi in sod., 2005). Raziskave SAR na zelnatih rastlinah so pokazale, da le-ta lahko

vodi v dolgotrajen in širokospetralen nadzor bolezni in napadov, saj se lahko preventivno

uporablja za krepitev splošnega zdravstvenega stanja rastlin. Številni viri navajajo, da SAR

temelji na več naravnih obrambnih mehanizmih, zaradi česar je manjša verjetnost, da

patogen razvije odpornost nanjo (Hayat in sod., 2009).

Nekatere kemične snovi povzročajo pri rastlinah aktivacijo obrambnih mehanizmov. S

patogenezo povezani proteini (PR proteins – pathogenesis-related proteins) so lahko

analogi snovem, ki jih izločajo patogeni ali pa so analogi snovem, ki nastajajo pri

destrukciji rastlinskih tkiv ob napadu patogenov (Hayat in sod., 2009). Če takšne snovi

vnesemo v popolnoma zdrave rastline, se te odzovejo, kot bi doživele napad patogenov.

Začnejo proizvajati obrambne molekule ali pa spremenijo fiziološki režim v smer, ki je

neugodna za hitro invazijo patogenov. Vodilne signalne spojine, ki izzovejo SAR, so

salicilna kislina (SK), jasmonska kislina (JK) in etilen, saj so preko različnih mehanizmov

sposobni inducirati izražanje genov za obrambo rastline. Te signalne molekule značilno

pospešijo nastajanje obrambnih proteinov, vendar pa navadno ne nastopajo kot samostojni

aktivatorji, temveč pri tem v kaskadi sodeluje še veliko drugih spojin. Med drugim imajo

pomembno vlogo reaktivne kisikove vrste (npr. H2O2) (Hayat in sod., 2009).

SAR izzove spremembe v kemični sestavi gostitelja, ki je sposoben vzdrževati SAR proti

škodljivcu daljše časovno obdobje, odvisno od vrste rastline in napredovanja patogena

(Rohde in sod. 1996, Fodor in sod. 1997), kar predstavlja trajnejši način obrambe. Pri

vzpostavitvi SAR se poveča sinteza signalnih molekul, ki potujejo po rastlini in izzovejo

sistemske spremembe v metabolizmu drevesa v korist sinteze obrambnih spojin. Drevo

tvori manj ogljikovih hidratov in večje količine proteinov ter fenolov, ki so potrebne v

reakcijah obrambnega odziva (Rohde in sod., 1996; Franceschi in sod., 2005). Med

številnimi obrambnimi odzivi, povezanimi s SAR, sta pomembni sinteza antioksidantov


21

(askorbinska kislina, cistein, glutation in skupni fenoli) in aktivacija antioksidativnih

encimov (Urbanek Krajnc 2004, 2009), ki varujejo rastlino pred reaktivnimi kisikovimi

spojinami (ROS – reactive oxygen species) (Hayat in sod., 2009).

2.3.4 Indukcija sistemsko pridobljene odpornosti

Koncept SAR je bil v povezavi s povečano odpornostjo na glive, bakterije in viruse na

kmetijsko pomembnih rastlinah širše sprejet in raziskovan zadnjih 30 let. Vzpodbuditev

SAR in uporaba te obrambne strategije v gozdno – varstvenih ukrepih je deležna malo

znanstvene pozornosti, čeprav nudi potencialno rešitev kontrole drevesnih patogenov

(Christiansen in sod., 1999; Evensen in sod., 2000; Percival 2001; Wermelinger, 2004;

Erbilgin in sod., 2006; Zeneli in sod., 2006; Urbanek Krajnc, 2009).

V zadnjih letih je postala odpornost dreves na škodljivce ena pomembnejših področij

raziskovanja. Raziskave na iglavcih so osredotočene predvsem v proučevanje vpliva

apliciranega eksogenega MJ na indukcijo fenolov in terpenov ter anatomijo lubja. V

zadnjih letih so številni avtorji (Franceschi in sod., 2002; Hudings in Franceschi, 2004;

Hudings in sod., 2004; Schmidt in sod., 2005; Erbilgin in sod., 2006) proučevali vpliv

tretiranja z MJ v kombinaciji z inducirano odpornostjo navadne smreke in poročajo o

pozitivnem učinku eksogenega MJ pri zatiranju podlubnikov in glive Ceratocystis

polonica. Ugotovili so, da tretiranje smreke z MJ pri napadu podlubnikov povzroči

kompleksne anatomske spremembe, kot npr. povečana tvorba smolnih kanalov in izločanje

smole. Posledično eksogen MJ vzpodbuja sintezo in akumulacijo terpenov, povzroča

spremembe v njihovi sestavi, vendar ne vpliva na vsebnost topnih fenolnih spojin

(Kozlowski in sod., 1999; Franceschi in sod., 2002; Martin in sod., 2002, 2003; Fäldt in

sod., 2003; Hudgins in Franceschi, 2004; Hudgins in sod., 2004; Miller in sod., 2005;

Erbilgin in sod., 2006; Zeneli in sod., 2006).


22

Cilj diplomske naloge je ugotoviti, kakšen vpliv ima SK na stimulacijo obrambnih

mehanizmov in na vsebnost taninov v sekundarnem lubju. Ker sta metabolni poti SK in JK

v interakciji (Kozlowski in sod., 1999; Kunkel in Brooks, 2002; Martin in sod., 2003;

Kopriva in Rennenberg, 2004) pričakujemo, da bo tretiranje povečalo endogene vsebnosti

ter stimuliralo pri napadu škodljivcev.


23

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Postavitev poskusa

Terenske raziskave so potekale na Meranovem (Pohorje, Slovenija), ki spada pod okrilje

Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede, Univerze v Mariboru. Izbrali smo 35 let star

smrekov drogovnjak s tesnim sklopom (razdalja med drevesi: 4–7 m, ekspozicija rastišča:

S–SZ, nagib: 5°), na 474–493 m nadmorske višine ter pri zemljepisni širini 46°32'17,25''–

46°32'23,36'' in zemljepisni dolžini 15°33'12,53''–15°33'17,30''. Raziskovalno parcelo, ki

je v skupnem obsegu merila 600 m2, smo razdelili na dve parceli (kontrolna in inficirana

parcela). Obe parceli je mejil širok pas, območje 5 m okrog parcel pa je bilo tretirano z

insekticidom (Fastac®, 0.3 %, BASF, Pinus, Rače), ki je preprečil migracijo podlubnikov.

Posamezna naključno izbrana drevesa so bila razdeljena v štiri skupine po osem dreves, in

sicer:

1) Prva skupina je bila tretirana z 100 mM SK in 3 dni kasneje izpostavljena

osmerozobemu smrekovemu lubadarju (tretirana napadena drevesa – TI).

2) Druga skupina je bila prav tako tretirana s SK (sočasno s skupino ena), le da ta

skupina dreves ni bila izpostavljena podlubnikom (tretirana kontrolna drevesa – TK).

3) Tretja skupina je ostala netretirana, vendar je bila sočasno s prvo skupino

izpostavljena podlubnikom (netretirana napadena drevesa – NI).

4) V četrti skupini so ostala netretirana zdrava drevesa (kontrolna skupina – NK), ki so

služila vrednotenju sezonskih sprememb v vsebnosti kondenziranih taninov navadne

smreke.

Vzorčenje dreves za biokemijske analize je potekalo petkrat skozi vegetacijsko dobo (od

13. 4. 2007 do 11. 7. 2007) v skladu s časovno aktivnostjo podlubnikov.


24

3.2 Aplikacija eksogene salicilne kisline

SK se je poskusnim drevesom aplicirala konec aprila 2007. Odseki debel poskusnih dreves

(iz prve in druge skupine), med višino 0.1 in 3 m nad tlemi, so bili razdeljeni na vzhodno

in zahodno polovico. Vzhodna polovica debla je bila tretirana s 500 ml 100 mM SK

(Sigma–Aldrich) v vodni raztopini [0.1 % (v/v) Tween 20], medtem ko je druga

(kontrolna) polovica ostala netretirana. SK je bila nanesena na odsek debla s pleskarskim

valjem, pri čemer smo preprečili kontaminacijo kontrolne strani. Postopek smo ponovili po

5-ih minutah, da bi zagotovili enakomeren nanos SK (prirejeno po Hudgins in Franceshi,

2004; Erbilgin in sod., 2006).

3.3 Načrtni vnos osmerozobega smrekovega lubadarja

Vnos je bil opravljen 13. aprila 2007, tri dni po tretiranju. Na poskusna drevesa iz prve in

tretje skupine smo izobesili feromonske ampule (Pheroprax®). Le ta so bila izobešena 2 m

nad tlemi na severni strani, in sicer na meji med tretirano in netretirano polovico debla.

Feromonske ampule so bile izobešene tri tedne in nato odstranjene.

3.4 Uporabljene raztopine in reagenti:

V poskusu smo uporabili naslednje raztopine in reagente:

− metanol (Sigma),

− aceton (Sigma),

− Na2S2O5 (Merck),

− ocetna kislina (Sigma),

− katehin (Sigma),

− Sephadex-LH (Sigma),

− 32% HCl (Sigma-Aldrich),

− 10 % raztopina vanilina [1 g vanilina (Sigma) + 100 ml absolutnega metanola],


25

− vanilin reagent [10 % raztopina vanilina: 8 % HCl (Sigma, 35,5 %), 50 : 50 (v/v)],

− 9 % raztopina katehina [9 mg katehina (Sigma) na 10 ml absolutnega metanola],

− 9 % raztopina internega standarda pripravljenega iz lubja smreke (9 mg standarda

na 10 ml absolutnega metanola),

− 4 in 8 % raztopina HCl.

3.5 Priprava vzorcev za biokemično analizo

Da bi dobili časovno sekvenco obrambnega odgovora kondenziranih taninov, so bila

poskusna drevesa za biokemijsko analizo skozi vegetacijsko obdobje vzorčena petkrat.

Prvi vzorec je bil odvzet 13. 4. 2007, in sicer 72 ur po apliciranju s SK. Drugi vzorčni

termin je bil dva tedna kasneje, to je 26. 4. 2007, naslednji termini pa so si sledili v

približno enomesečnih intervalih, in sicer 18. 5., 15. 6. in 11. 7. 2007.

Vzorci so bili pobrani v dnevih z jasnim vremenom med 11:00 in 14:00 uro. Pobrani so bili

tako, da so bili na vsakem testnem drevesu na višini 1.3 in 3.3 m odvzeti štirje vzorci lubja

(širina 6 cm × višina 6 cm × globina 1 cm), dva na vzhodni in dva na zahodni strani

drevesa. Terciarno skorjo smo odstranili, skupno floemsko tkivo pa nemudoma zamrznili v

tekočem dušiku in kasneje prenesli v zamrzovalnik (-80 °C). Sledili sta liofilizacija in

mletje vzorca. Nato smo vzorce zaprli v viale s tesnilom in jih zmrznili pri -20 °C. Vse

postopke priprave vzorcev smo izvedli po Tausz in sod. (2003).

3.6 Ekstrakcija vzorcev

Ker ima po navedbah različnih avtorjev (Sun in sod., 1998; Yu in Dahlgren, 2000;

Schofield in sod., 2001; Hümmer in Schreier; 2008) ekstrakcijsko topilo zelo pomembno

vlogo pri določevanju kondenziranih taninov, smo vzorce ekstrahirali s petimi različnimi

topili. Ta so bila:

− metanol,

− aceton,


26

− vodna raztopina metanola (metanol : voda, 70 : 30, v/v),

− vodna raztopina acetona (aceton : voda, 70 : 30, v/v) s 5 mM Na2S2O5,

− vodna raztopina acetona nakisana z ocetno kislino (aceton : voda : ocetna kislina,

70 : 29.5 : 0.5, v/v/v).

Prav tako smo preizkusili tri različne postopke ekstrakcije:

− Vzorce (50 mg) smo ekstrahirali s 3 ml ekstrakcijskega topila tako, da smo jih za

24 ur pustili na stresalniku v temi pri sobni temperaturi. Nato smo ekstrakte

centrifugirali (10 minut pri 3500 obratih/min), supernatant odlili. K preostanku smo

dodali še dvakrat po 3 ml topila, ponovno centrifugirali in združili supernatante (Yu

in Dahlgren, 2000).

− K 50 mg vzorca smo dodali 3 ml ekstrakcijskega topila, stresali 1 uro pri sobni

temperaturi, nato pa centrifugirali (10 minut pri 3500 obratih/min) in supernatant

odlili. Postopek smo ponovili trikrat (Pérez-Jiménez in sod., 2009).

− Vzorce (50 mg) smo ekstrahirali s 3 ml ekstrakcijskega topila v prisotnosti

ultrazvočnih valov. Ekstrakte smo za 20 minut postavili v ultrazvočno kopel s

temperaturo 4 °C (slika 8B). Konstantno temperaturo kopeli smo vzdrževali z

dodajanjem ledu. Ekstrakte smo nato centrifugirali 10 minut pri 3500 obratih/min

(slika 8A) in supernatant odlili. Tudi ta postopek smo ponovili trikrat in dobljene

supernatante združili (Hagerman, 2002).

3.7 Določanje koncentracije kondenziranih taninov z vanilin metodo

Koncentracijo kondenziranih taninov v ekstraktih smo določili po postopku, ki ga opisuje

Hagerman (2002, 2011) z manjšimi modifikacijami.

V mikrocentrifugirke smo odpipetirali 500 µl ekstrakta in topilo izparili na vakuumskem

koncentratorju (slika 8C). Suhe preostanke smo nato raztopili v 1 ml metanola. V

mikrocentrifugirke smo odpipetirali 200 µl tako pripravljenih raztopin. Vsako raztopino

smo pipetirali dvakrat in tako pripravili dva seta. K enemu setu raztopin smo dodali 1 ml


27

vanilin reagenta, k drugemu setu raztopin pa 1 ml 4 % raztopine HCl. Z dodatkom 4 %

raztopine HCl smo pripravili slepe vzorce. Raztopine smo postavili v vodno kopel, ki je

bila predhodno segreta na 30 °C (slika 8F). Po 20 minutah smo na spektrofotometru (slika

8G) izmerili absorbanco pri valovni dolžini 500 nm (A500). Na enak način smo pripravili

tudi standardne raztopine, vendar samo v enem setu, kateremu smo dodali 1 ml vanilin

reagenta.

3.8 Priprava umeritvene krivulje

Za pripravo umeritvene krivulje smo uporabili dva standarda, in sicer komercialno

dosegljiv katehin ter standard, ki smo ga pripravili iz vzorcev sekundarne skorje smreke

(interni standard).

Standard iz preiskovanega materiala, tj. sekundarne skorje smreke, smo pripravili po

postopku, ki ga opisuje Hagerman (2011). Postopek je trajal tri dni. Prvi dan smo pripravili

Sephadex, na katerega se vežejo tanini iz alkoholne raztopine. K 25 g Sephadexa smo

dodali 100 ml 80 % etanola (Sigma), premešali, pustili, da se je polnilo usedlo na dno čaše

in odlili tekočino. Postopek smo ponovili še dvakrat in nato polnilo čez noč postavili v

hladilnik. Naslednji dan smo 1 g vzorca ekstrahirali z vodno raztopino acetona na

ultrazvočni kopeli. Ekstrakcija je potekala pri enakih pogojih, kot so navedeni v točki 3.6

Supernatante smo združili in izparili aceton. Vodno fazo smo filtrirali, nanesli na

pripravljen Sephadex, mešali s stekleno palčko 3 minute in nato filtrirali skozi Wathman

filtrirni papir. Sephadex smo nato spirali z 95 % etanolom, dokler se absorbanca filtrata pri

280 nm ni začela približevati vrednosti nič. Tanine smo nato eluirali s 50 % acetonom.

Uporabili smo toliko topila, da smo dobili Sephadex bele barve, eluat pa skoraj brezbarven.

Eluat smo zamrznili in ga dali v liofilizator. Dobili smo puhast svetlo rjavi prah, ki smo ga

uporabili kot interni standard.

Standardno raztopino smo pripravili tako, da smo zatehtali 0.9 mg katehina oz. internega

standarda in dodali 1 ml metanola.


28

V serijo mikrocentrifugirk smo nato odpipetirali 0, 40, 80, 120, 160 in 200 µl standardne

raztopine in dodali toliko µl metanola, da je bil skupni volumen 200 µl. Tako pripravljene

raztopine so imele koncentracije 0.18, 0.36, 0.54, 0.72, 0.90 mg/ml.


29

Slika 8: A) Ekstrakte vzorcev smo centrifugirali 10 minut pri 3500 obratih/min in 4 °C. B)

Vzorce smo za 20 minut postavili v ultrazvočno kopel in z ledom regulirali temperaturo, da

se niso pregreli. C) Iz vzorcev smo izparili topilo. D) Intenzitete obarvanih produktov, ki

so nastali pri reakciji med standardnimi raztopinami katehina in internega standarda na

različnih koncentracijskih nivojih z vanilin reagentom. E) Standardne raztopine katehina

(po reakciji z vanilinom). F) Po dodatku 4 % raztopine HCl in 10 % vanilin reagenta smo

vzorce natančno 20 minut pustili v vodni kopeli pri temperaturi 30 °C. G) Absorbance smo

izmerili na spektrofotometru pri valovni dolžini 500 nm (A500).


30

4 REZULTATI Z RAZPRAVO

4.1 Učinkovitost ekstrakcije kondenziranih taninov

V prvem sklopu diplomske naloge smo primerjali učinkovitost ekstrakcije kondenziranih

taninov iz lubja smreke z uporabo petih ekstrakcijskih topil. Ta so bila metanol, aceton,

vodna raztopina metanola (metanol : voda, 70 : 30, v/v), vodna raztopina acetona (aceton :

voda, 70 : 30, v/v), vodna raztopina acetona s 5 mM Na2S2O5 in vodna raztopina acetona z

dodatkom 0.5 % ocetne kisline. Z vsakim topilom smo vzorce ekstrahirali s stresanjem pri

sobni temperaturi 24 ur (preglednica 1). V nadaljevanju smo pri preostalih dveh postopkih

ekstrakcije (3 x po 1 uro stresanja in 3 x po 20 minut na UZ kopeli) uporabili le tri

ekstrakcijska topila. To so bila metanol in vodna raztopina acetona ter vodna raztopina

acetona s 5 mM Na2S2O5, ki so se izkazala za najučinkovitejša (preglednica 1)

Na podlagi dobljenih vrednosti smo se odločili za ekstrakcijo na ultrazvočni kopeli, saj je

bila učinkovitost ekstrakcije ne glede na uporabljeno topilo boljša kot stresanje na sobni

temperaturi za 24 ur in stresanje trikrat po eno uro. Predvidevamo lahko, da dolgi

ekstrakcijski časi pospešijo razkroj kondenziranih taninov v ekstraktih smreke, saj so bile

vsebnosti najnižje pri ekstrakciji, ki je potekala 24 ur. O razkroju kondenziranih taninov v

ekstraktih evkaliptusovih listov pri dolgih ekstrakcijskih časih poročata tudi Yu in

Dahlgren (2000).

Za ekstrakcijsko topilo smo izbrali vodno raztopino acetona s 5 mM Na2S2O5, ki je v

postopku preverjanja metod dala najvišje vsebnosti kondenziranih taninov v vzorcu

sekundarnega lubja smreke.


31

Preglednica 1: Vsebnosti kondenziranih taninov v lubju smreke, dobljene z različnimi

ekstrakcijskimi protokoli. Rezultati so podani v mg/g suhe snovi (SS).

metoda

ekstrakcijsko topilo

Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) pri uporabi katehina

stresanje 24 ur stresanje 1 uro UZ kopel

metanol 229 278 273

aceton : voda (70 : 30, v/v) 197 272 295

aceton : voda (70 : 30, v/v) s

5 mM Na2S2O5 221 274 302

aceton : voda : ocetna kislina

(70 : 29.5 : 0.5, v/v/v) 199 / /

metanol : voda (70 : 30, v/v) 137 / /

aceton 121 / /

4.2 Kvantitativne določitve kondenziranih taninov

Kvantitativne določitve kondenziranih taninov v ekstraktih vzorcev so temeljile na

merjenju intenzitete obarvanih produktov reakcije – antocianidinov. Na sliki 8D so

prikazane intenzitete obarvanih produktov standardnih raztopin katehina in internega

standarda na različnih koncentracijskih nivojih.

Katehin je le eden izmed kondenziranih taninov, ki ga je po Schmidt in sod. (2005) v lubju

smreke relativno malo, prevlada namreč isorhapontin. Zato smo iz vzorcev lubja smreke

pripravili tudi interni standard. Novejše raziskave namreč poročajo, da takšen standard daje

zanesljivejše rezultate kot največkrat uporabljen katehin, saj vsebuje skupne kondenzirane

tanine, ki so prisotni v posameznem materialu (Wolfe in sod., 2008; Hagerman, 2002,

2011). Tudi v našem poskusu smo ugotovili, da se vrednosti kondenziranih taninov pri

uporabi obeh standardov bistveno razlikujejo. Pri standardu, pripravljenem iz

sekundarnega lubja smreke, smo namreč izmerili za 40 % višje absorbance kot pri katehinu

(slika 9).


32

y = 0,3646x - 0,0024

R2 = 0,9998

y = 0,8523x - 0,0451

R2 = 0,9984

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

koncentracija (mg/ml)

AB

S interni standard

katehin

Slika 9: Absorbanca (λ=500 nm) standardnih raztopin katehina in internega standarda

(standard iz sekundarnega lubja smreke), izmerjena po uporabi vanilin metode.


33

4.3 Vpliv salicilne kisline na vsebnost kondenziranih taninov pri napadu

podlubnikov

Tretiranje s SK je v kontrolnih drevesih povišalo vsebnost taninov za 21.4 % v primerjavi z

netretiranimi kontrolnimi drevesi, vendar trend ni signifikanten.

Dva tedna kasneje, 26. 4. 2007, smo v primerjavi s prvim vzorčenjem izmerili povišano

vsebnost kondenziranih taninov v lubju napadenih dreves. Upoštevati moramo odziv

drevesa na mehanske poškodbe, ki smo jih povzročili pri prvem vzorčenju in se odražajo z

znatnim povišanjem vsebnosti kondenziranih taninov predvsem v netretiranih kontrolnih

drevesih. Odziv fenolnih spojin na mehansko poškodbo opisujejo tudi Christiansen in sod.

(1999). Povišane koncentracije kondenziranih taninov po tretiranju kontrolnih smrek s SK

se odražajo tako v prvem kot v drugem vzorčnem terminu, medtem ko Schmidt in sod.

(2005) poročajo, da ni opaznih sprememb v vsebnosti kondenziranih taninov pri tretiranju

z MJ. Prav tako je iz rezultatov razvidno, da je odziv tretiranih dreves na poškodbe in

napad podlubnikov uspešnejši. Pri napadenih s SK tretiranih smrekah koncentracije

ostajajo na nivoju kontrolnih smrek, kar potrjuje pozitiven vpliv tretiranja s SK, vendar pa

so v primerjavi s tretiranimi kontrolami nižje za 12.7 %. Dobljeni rezultati sovpadajo z

inicialnim odzivom rastlin v splošnem ekofiziološkem konceptu, ki ga navajajo Tausz in

sod. (2004) ter Larcher (2003).

Pri tretjem vzorčenju, mesec dni po naselitvi podlubnikov, se je stopnja napadenosti dreves

odražala v dobljenih vrednostih kondenziranih taninov. Odvzete vzorce napadenih dreves

smo ločili na dve skupini, in sicer zmerno in močno napadena drevesa. Opazili smo, da so

se netretirana zmerno napadena in tretirana zmerno napadena drevesa odzvala z

akumulacijo, saj so se vrednosti kondenziranih taninov signifikantno povečale v primerjavi

s kontrolnimi (netretiranimi in tretiranimi) drevesi ter z netretiranimi in tretiranimi močno

napadenimi (NI**, TI**) drevesi. V primerjavi z drugim vzorčnim terminom so se

koncentracije v netretiranih in tretiranih zmerno napadenih (NI*, TI*) drevesih zvišale za

22 oz. 25.9 %. Najvišji porast (23.1 %) vsebnosti kondenziranih taninov smo v primerjavi s

tretiranimi kontrolnimi drevesi zabeležili pri tretiranih zmerno napadenih drevesih. Močno


34

napadena drevesa po vsebnosti kondenziranih taninov v tem terminu še niso bistveno

odstopala od kontrol. Rezultati vzorčenja v sredini junija so pokazali občuten padec

vsebnosti kondenziranih taninov v lubju vseh obravnavanih dreves v primerjavi s

predhodnim vzorčenjem, ki ga razlagamo z obdobjem visokih temperatur in suše

(Urbanek, 2009). Najmanjši upad je opazen pri netretiranih zmerno napadenih (16.7 %) in

tretiranih zmerno napadenih drevesih (13.28 %), najmočnejši pa pri netretiranih močno

napadenih (42.5 %) in tretiranih močno napadenih drevesih (54.29 %) v primerjavi z

vrednostmi, ki smo jih izmerili sredi maja. Degradacijo oz. močno zmanjšanje vsebnosti

kondenziranih taninov in neuspešen obrambni odziv na napad podlubikov najbolje

predstavita najmočneje napadeni vzorčni smreki (netretirana 2NI in tretirana 4TI), katerih

vrednosti skozi obdobje vzorčenja so predstavljene v spodnjima grafoma (grafikon 1B,

grafikon 2D). V nasprotju z netretiranim močno napadenim drevesom (2NI) smo pri

tretiranem močno napadenem drevesu (4TI) zabeležili zmernejše in počasnejše upadanje

koncentracije kondenziranih taninov. Močno napadena drevesa so bila po vzorčenju

odstranjena.

Pred zadnjim vzorčenjem je drevesa prizadela še druga generacija podlubnikov, zato smo

11. 7. 2007 zabeležili ponovno rast koncentracije kondenziranih taninov. Zmerno

povišanje smo zaznali pri kontrolnih (tretiranih in netretiranih) drevesih. Ponovni

obrambni odziv je prispeval k temu, da so se vrednosti netretiranih napadenih (zmerno in

močno) in tretiranih zmerno napadenih dreves signifikantno povečale v primerjavi s

kontrolnimi (netretiranimi in tretiranimi) in tretiranimi močno napadenimi drevesi. Vzorec

obrambnega odziva je podoben tistemu iz 18. 5. 2007, saj so vrednosti kondenziranih

taninov pri netretiranih zmerno napadenih drevesih v primerjavi z netretiranimi

kontrolnimi drevesi višje za 16.6 %, pri netretiranih močno napadenih pa za 20.2 %.

Podobne rezultate smo dobili pri tretiranih vzorcih, kjer so vrednosti tretiranih zmerno

napadenih dreves za 29.7 % višje kot pri tretiranih kontrolnih drevesih.

Na podlagi rezultatov biokemijske analize kondenziranih taninov lahko potrdimo, da

tretiranje s SK predhodno inducira obrambni odziv dreves, upočasnjuje oz. zavira

degradacijo taninov ter zavre naselitev in razmnoževanje podlubnikov (Urbanek Krajnc in


35

sod., 2011). Iz časovne analize vsebnosti kondenziranih taninov posameznih dreves, ki je

predstavljena v grafikonu 1 in 2, je razvidno, da sicer odgovor na napad podlubnikov sledi

eko-fiziološkemu konceptu, vendar je odziv posameznih dreves časovno zamaknjen,

odvisen od stopnje napadenosti in s tem vitalnosti dreves. V časovnem poteku je razviden

tudi vpliv vremenskih dejavnikov. Konec aprila smo beležili nekaj deževnih dni, ki so

zavrli aktivnost podlubnikov. Dvig temperatur in dvotedensko obdobje suše sredi maja (od

14. do 28. maja 2007) sovpada s prvim maksimumom naleta podlubnikov, večjim številom

vhodnih odprtin (Urbanek Krajnc, 2009) in s tem akumulacijo taninov kot odziv na napad.

Začeten odziv sredi aprila in akumulacija taninov sredi maja je pri nekaterih drevesih

privedel do uspešne obrambe pred podlubniki (aklimatizacija in »steady state« vsebnosti

kondenziranih taninov), pri drugih pa do propada (degradacija kondenziranih taninov).

Aklimatizirana zmerno napadena drevesa ne kažejo degradacije, ampak vrednosti prehajajo

na »steady state«, in sicer nad nivojem kontrole. Ta faza je najbolj razvidna pri zmerno

napadenem tretiranem drevesu 5TI (grafikon 2E). Razvidna je tudi pri netretiranih drevesih

4NI, 7NI in 8NI (grafikon 1D, 1G, 1H). Pri nekaterih drevesih je odziv dinamičen,

akumulacija kondenziranih taninov sredi maja in sredi julija sovpada namreč z 1. in 2.

maksimumom naleta podlubnikov. Takšen dinamičen odziv je predvsem značilen za

netretirane smreke 1NI, 3NI, 6NI (grafikon 1A, 1C, 1F). Pri tretiranih smrekah se na

dinamičen način odzovejo 1TI in 2TI (grafikon 2A, 2B). Faza velja za primerno vitalna

drevesa, nikakor pa ne za močno napadena. Ta se zaradi uspešne naselitve podlubnikov in

močnega napada ne morejo več aklimatizirati, zato prehajajo v fazo degradacije, ki je

najbolj razvidna pri 2NI in 4TI (grafikon 1B, grafikon 2D).

Ugotovili smo, da se odziv kondenziranih taninov na napad podlubnikov časovno odraža

po principu ekofiziološkega odziva rastlin na stres, ki ga opisuje Tausz in sod. (2004).


36

4.4 Priloga k vplivom salicilne kisline na vsebnost kondenziranih taninov pri

napadu podlubnikov

Grafikon 1: Vrednosti kondenziranih taninov (mg/g SS) pri posamičnih netretiranih

smrekah skozi celotno obdobje vzorčenja v letu 2007. Različne črke (A–H) prikazujejo

posamezna vzorčna drevesa.

Legenda: *NI – netretirana zmerno napadena, **NI – netretirana močno napadena,

N.D. – vzorci niso bili določeni, χ – posekana drevesa zaradi premočne okužbe

2**NI

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

1*NI

0

100

200

300

400

500

600

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

3**NI

0

100

200

300

400

500

600

700

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

4*NI

0

100

200

300

400

500

600

700

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

5*NI

0

100

200

300

400

500

600

700

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

6**NI

0

100

200

300

400

500

600

700

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

7**NI

0

100

200

300

400

500

600

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

8*NI

0

100

200

300

400

500

600

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

B

C D

F E

G H

N.D.

χ

A


37

Grafikon 2: Vrednosti kondenziranih taninov (mg/g SS) pri posamičnih tretiranih smrekah

skozi celotno obdobje vzorčenja v letu 2007. Različne črke (A–H) prikazujejo posamezna

vzorčna drevesa.

Legenda: *NI – netretirana zmerno napadena, **NI – netretirana močno napadena,

N.D. – vzorci niso bili določeni, χ – posekana drevesa zaradi premočne okužbe

1*TI

0

100

200

300

400

500

600

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

2*TI

0

100

200

300

400

500

600

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

3*/*TI

0

100

200

300

400

500

600

700

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

4**TI

0

100

200

300

400

500

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

5*TI

0

100

200

300

400

500

600

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

6**TI

0

50

100

150

200

250

300

350

400

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

7*/*TI

0

100

200

300

400

500

600

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

8*TI

0

100

200

300

400

500

600

700

800

13.4. 26.4. 18.5. 15.6. 11.7.

A B

D C

F E

G H

N.D. N.D.

N.D.

χ


38

Preglednica 2:Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007.

Rezultati biokemične analize predstavljajo mediane in odmike od median, ki so bili statistično ocenjeni s pomočjo Kruskal-Wallis

testa in testa mnogoterih primerjav po Conoverju.

Različne črke (a–c) prikazujejo pomembne statistične razlike (P < 0.09) med vzorčnimi drevesi.

Legenda: NVK – netretirana kontrolna, NVI* – netretirana zmerno napadena, NVI** – netretirana močno napadena, TVK – tretirana

kontrolna, TVI* – tretirana zmerno napadena, TVI** – tretirena močno napadena

NVK NVI* NVI** TVK TVI* TVI**

13.4. 371,633 ± 54,4827 a 344,5353 ± 36,1981 a 451,1741 ± 39,45 a 319,6933 ± 70,077 a

26.4. 416,299 ± 50,60246 a 411,0912 ± 74,6057 a 458,5831 ± 49,563 a 400,2296 ± 72,484 a

18.5. 467,051 ± 45,17792 ab 501,5434 ± 29,2628 a 514,188 ± 86,043 ab 409,2468 ± 44,882 b 503,7972 ± 31,081 a 402,9561 ± 50,184 b

15.6. 316,616 ± 41,81826 b 427,8332 ± 53,5882 a 295,266 ± 200,27 abc 358,8207 ± 31,391 ab 436,9121 ± 118,45 a 183,798 ± 37,491 c

11.7. 422,645 ± 40,75119 b 492,9547 ± 40,3044 a 508,143 ± 77,078 a 385,7822 ± 21,639 b 500,4419 ± 28,9 a 410,0883 ± 16,488 b


39

Grafikon 3: Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007 pri

uporabi standarda katehina. Rezultati biokemične analize predstavljajo mediane in odmike od median, ki so bili statistično ocenjeni s

pomočjo Kruskal-Wallis testa in testa mnogoterih primerjav po Conoverju.





40

Preglednica 3: Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007.

Rezultati predstavljajo mediane in odmike od median pri uporabi internega standarda. Rezultati biokemične analize predstavljajo

mediane in odmike od median, ki so bili statistično ocenjeni s pomočjo Kruskal-Wallis testa in testa mnogoterih primerjav po

Conoverju.




NVK NVI* NVI** TVK TVI* TVI**

13.4. 205,796 ± 2,9098 a 207,6734 ± 21,8475 a 157,6209 ± 35,5835 b

26.4. 259,838 ± 30,12 a 240,66 ± 23,51508 a 268,5424 ± 30,3375 a 239,5059 ± 62,4377 a

18.5. 255,666 ab 283,97 ± 16,4672 a 234,0107 b 239,5042 ± 43,5107 ab

15.6. 217,9584 ± 19,17 b 252,379 ± 13,437605 a 204,201 ± 91,5235 abc 241,9907 ± 10,0324 ab 276,6180 ± 30,66979 a 165,9370 ± 12,0055 c

11.7. 247,3959 ± 15,4629 b 284,84 ± 7,9732446 a 292,6353 ± 31,5932 a 231,2337 ± 13,67949 b 291,6052 ± 19,03595 a 239,714 ± 39,7585 b


41

Grafikon 4: Vsebnost kondenziranih taninov (mg/g SS) v sekundarnem lubju vzorčnih dreves ob različnih terminih v letu 2007 pri

uporabi internega standarda. Rezultati biokemične analize predstavljajo mediane in odmike od median, ki so bili statistično ocenjeni s

pomočjo Kruskal-Wallis testa in testa mnogoterih primerjav po Conoverju.





42

5 SKLEPI

V prvem sklopu diplomske naloge smo izbrali najučinkovitejši postopek ekstrakcije

kondenziranih taninov iz preiskovanega materiala. Preizkusili smo več različnih postopkov

in ekstrakcijskih topil ter se na podlagi dobljenih rezultatov odločili za ekstrakcijo na UZ

kopeli in uporabo vodne raztopine acetona (aceton : voda, 70 : 30, v/v) s 5 mM Na2S2O5.

Koncentracije kondenziranih taninov smo določali po vanilin metodi (Hagerman, 2011).

V drugem sklopu poskusov diplomske naloge nas je zanimal vpliv tretiranja s SK na

vsebnost kondenziranih taninov v lubju navadne smreke in njihov odziv na napad

podlubnikov. Po tretiranju s SK smo pri prvem in drugem vzorčnem terminu (13. 4. 2007

in 26. 4. 2007) izmerili povišane vsebnosti kondenziranih taninov, vendar trend ni

signifikanten.

Za inicialni odziv na napad podlubnikov je značilen upad vsebnosti kondenziranih taninov,

ki se je signifikantno odrazil pri tretiranih smrekah. Prvotno povišana vsebnost le-teh se je

znižala na nivo kontrolnih (netretiranih/nenapadenih) dreves.

Na podlagi časovne analize vsebnosti kondenziranih taninov smo določili tri tipe odziva na

napad podlubnikov. Začetni upad vsebnosti kondenziranih taninov je namreč pri vitalnih

drevesih vodil do aklimatizacije, pri močno napadenih pa do degradacije vsebnosti

kondenziranih taninov. Pri nekaterih drevesih smo izmerili dinamičen odziv, ki se je

pokazal z indukcijo vsebnosti taninov sredi maja in julija, kar sovpada s 1. in 2.

maksimumom naleta, in upadom sredi junija. Inicialni odziv na napad je močnejši pri

tretiranih drevesih, medtem ko se v času 1. in 2. maksimuma naleta podlubnikov (sredi

maja in sredi julija) z akumulacijo oz. indukcijo sinteze taninov dinamično odzovejo

netretirana napadena drevesa. Močno napadena netretirana drevesa se tudi ob prvem in

drugem maksimumu naleta podlubnikov odzovejo z višjimi vrednostmi taninov kot

tretirana napadena drevesa. Iz rezultatov lahko sklepamo na predhodno imunizacijo dreves,

ki smo jih tretirali s SK. Pri tretiranih smrekah je obrambni odziv manj izrazit in vodi v

aklimatizacijo (»steady state«) najverjetneje zaradi predhodne indukcije sistemsko

pridobljene odpornosti.


43

6 VIRI IN LITERATURA

1. Aerts RJ, Barry TN, McNabb WC. 1999. Polyphenols and agriculture: beneficial

effects of proanthocyanidins in forages. Agric. ecosyst. Environ., 75: 1–12

2. Bate-Smith EC, Swain T. 1962. Flavonoid compounds. In Florkin M, Mason HS.

Comparative biochemistry. New York: Academic Press., pp. 75–809

3. Beckman CH. 2000. Phenolic-storing cells: keys to programmed cell death and

periderm formation in wilt disease resistance and in general defence responses in

plants? Phys. Mol. Plant Path., 57: 101–110

4. Biologija lubja (elektronski vir)

http://www.partonbarksiding.com/quality-poplar-bark-siding/bark-biology

5. Bruce A, Palfreyman JW. 1998. Forest products biotechnology. London,

Taylor&Francis: 151–181 str.

6. Díaz AM, Caldas GV, Blair MW. 2009. Concentrations of condensed tannins and

anthocyanins in common bean seed coats. Food Res Int

7. Dimwoodie JM. 2000. Timber: Its nature and behaviour. London,

Taylor&Francis: 257 str.

8. Erbilgin N, Krokne P, Christian E, Zeneli G, Gershenzon J. 2006. Exogenous

application of methyl jasmonate elicits defenses in Norway spruce (Picea abies)

and reduces host colonization by the bark beetle Ips typographus. Oecologia 148:

426–436

9. Evensen PC, Solheim H, Hoiland K, Stenersen J. 2000. Induced resistance of

Norway spruce, variation of phenolic compounds and their effects on fungal

pathogens. Forest Pathol., 30: 97–108

10. Fäldt J, Martin D, Miller B, Rawat S, Böhlmann J. 2003. Traumatic resin defense

in Norway spruce (Picea abies): methyl jasmonate-induced terpene synthase gene

expression, and cDNA cloning and functional characterization of (+)-3-carene

synthase. Plant Mol. Biol., 51: 119–133

11. Fodor J, Gullner G, Adam AL, Barna B, Kömives T, Kiraly Z. 1997. Local and

systemic response of antioxidants to tobacco mosaic virus infection and to


44

salicylic acid in tobacco. Role in systemic acquired resistance. Plant Physiol.,

114: 1443–1451

12. Franceschi VR, Krekling T, Berryman AA, Christiansen E. 1998. Specialized

phloem parenchyma cells in Norway spurce (Pinaceae) bark are an important site

of defense reactions. Am. J. Bot., 85: 601–615

13. Franceschi VR, Krekling T, Christiansen E. 2002. Application of methyl

jasmonate on Picea abies (Pinaceae) stems induces defense-related responses in

phloem and xylem. Am. J. Bot., 89(4): 578–586 , 602–610

14. Franceschi VR, Krokene P, Christiansen and Krekling T. 2005. Anatomical and

chemical defenses of conifer bark against bark beetles and other pests. New

Phytol., 167: 353–376

15. Franceschi VR, Krokene P, Krekling T, Christiansen E. 2000. Phloem

parenchyma cells are involved in local and distant defense responses to fungal

inoculation or bark-beetle attack in Norway spurce (Pinaceae). Am. J. Bot., 87:

314–326

16. Gjergek R. 2010. Lokalni odziv skupnih proteinov v lubju navadne smreke na

tretiranje s salicilno kislino in napad podlubnikov. Univerza v Mariboru.

Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede. Diplomsko delo

17. Gross GG. 2008. From lignins to tannins: Forty years of enzyme studies on the

biosynthesis of phenolic compounds. Phytochemistry., 96: 3018–3031

18. Gu L, Kelm MA, Hammerstone JF, Beecher G, Holden J, Haytowitz D, Prior RL.

2003. Screening of foods containing proanthocyanidins and their structural

characterization using LC-MS/MS and thiolytic degradation. J. agric. food chem.,

51: 7513–7521

19. Hagerman, A.E. 2002, 2011. Tannin handbook. Oxford, Miami University

(elektronski vir)

http://www.users.muohio.edu/hagermae/

20. Hayat Q, Hayat S, Ifran M Ahmad A. 2009. Effect of exogenous salicylic acid

under changing enviroment: A review. Envirom. Exp. Bot., 68: 14–25


45

21. Hudgins JW, Christiansen E, Franceschi VR. 2003a. Methyl jasmonate induces

changes mimicking anatomical and chemical defenses in diverse members of the

Piniaceae. Tree Physiol., 23: 361–371

22. Hudgins JW, Krekling T, Franceschi VR. 2003b. Distribution of calcium oxalate

crystals in the secondary phloem of conifers: a constitutive defense mechanism?

New Phytol., 159: 677–690

23. Hudings JW, Christiansen E,Franceschi VR. 2004. Induction of anatomically

based defense responses in stems of diverse conifers by methyl jasmonate: a

phylogenetic perspective. Tree Physiol., 24: 251–264

24. Hudings JW, Franceschi VR. 2004. Methyl jasmonate-induced ethylene

production in responsible for conifer phloem defense responses and

reprogramming of stem cambial zone for traumatic resin duct formation. Plant

Physiol., 13: 2134–2149

25. Hümmer W, Schreier P. 2008. Analysis of proanthocyanidins. MNF Education.,

52: 1318–1398

26. Jakša J. 2005. Bark beetles in Slovene forests in the period 1995-2004

(Podlubniki v slovenskih gozdovih v obdobju 1995–2004, in Slovene language).

UJMA.; 19: 154–162

27. Kopriva S, Rennenberg H. 2004. Control of sulphate assimilation and glutathione

synthesis: interaction with N and C metabolism. J Exp Bot., 55 (404): 1831–1842

28. Kozlowski G, Buchala A, Metraux JP. 1999. Methyl jasmonate protects Norway

spruce (Picea abies (L.) Karst.) seedlings against Pythium ultimum Trow. Phys.

Mol. Plant Path., 55 (1): 53–58

29. Kraus TEC, Dahlgren RA, Zasoski RJ. 2003. Tannins in nutrient dynamics of

forest ecosystems – a review. Plant soil., 256: 41–66

30. Krekling T, Franceschi VR, Berryman AA, Christiansen E. 2000. The structure

and development of polyphenolic parenhyma cells in Norway spurce (Picea

abies) bark. Flora., 195: 354–369

31. Krekling T, Franceschi VR, Krokene P, Solheim H. 2004. Differential anatomical

responses of Norway spruce stem tissues to sterile and fungus infected

inoculations. Trees., 18: 1–9


46

32. Kunkel BN, Brooks DM. 2002. Cross talk between signaling pathways in

pathogen defense. Curr Opin Plant Biol., 5 (4): 325–331

33. Larcher W. 2003. Physiological plant ecology. Springer Verlag, Berlin.

34. Leban, I. 2008. Les zgradba. Škofja Loka, Srednja lesarska šola Škofja Loka

(elektronski vir)

http://www.cpi.si/files/cpi/userfiles/Lesarstvo_tapetnistvo/3-

LES_ZGRADBA.pdf

35. Martin D, Gershenzon J, Bohlmann J. 2003. Induction of volatile terpene

biosynthesis and diurnal emission by methyl jasmonate in foliage of Norway

spruce. Plant Physiol., 132: 1586–1599

36. Martin D, Tholl D, Gershenzon J, Bohlmann J. 2002. Methyl jasmonate induces

traumatic resin ducts, terpenoid resin biosynthesis, and terpenoid accumulation in

developing xylem of Norway spruce stems. Plant Physiol., 129: 1003–1018

37. Miller B, Madilao LL, Ralph S, Bohlmann J. 2005. Insect-induced conifer

defense: White pine weevil and methyl jasmonate induce traumatic resinosis, de

novo formed volatile emissions, and accumulation of terpenoid synthase and

octadecanoid pathway transcripts in Sitka spruce. Plant Physiol., 137: 369–382

38. Percival GC. 2001. Induction of systemic acquired disease resistance in plants:

Potential implications for disease management in urban forestry. Journal of

Arboriculture., 27(4): 181–192

39. Pérez-Jiménez J, Arranz S, Saura-Calixto F. 2009. Poanthocyanidin content is

largely underestimated in the literature data: An approach to quantification of the

missing proanthocyanidins. Food Res. Int., 42, 1381-1388.

40. Rohde M, Waldmann R, Lunderstädt. 1996. Induced defence reaction in the -

phloem of spruce (Picea abies) and larch (Larix decidua) after attack by Ips

typographus and Ips cembrae. Forest Ecol. Manag., 86: 51–59 Riberau_Gayon P,

Glories Y, Maujean A, Dobourdieu D. 2000. Handbook of enology. Vol. 2: The

chemistry of wine stabilization and treatments. Paris, Dunod: 404 str

41. Santos-Buelga C, Scalbert A. 2000. Review: Proanthocyanidins and tannin-like

compounds – nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrion and health.

J. Sci. Food Agric., 80: 1094–1117


47

42. Schmidt A, Zeneli G, Hietala AM, Fossdal CG, Krokene P, Christiansen E,

Gershenzon J. 2005. Induced chemical defenses in conifers: Biochemical and

molecular approaches to studyung their function. Schmidt A; Zeneli G; Hietala

AM; Fossdal CG; Krokene P; Christiansen E; Gershenzon J; Romeo JT (Eds.):

Chemical Ecology and Phytochemistry in Forest Ecosystems. Vol. 39. Elsevier,

Amsterdam. pp 1–28

43. Schofield P, Mbugua DM, Pell AN. 2001. Analysis of condensed tannins: a

review. Anim. feed sci. technol., 91: 21–40

44. Shahidi, Naczk. 1995. Food phenolics, Lancaster, Technomic Publishing Co.,

Inc: 75-107, 178

45. Sun B, Ricardo-da-Silva JM, Spranger I. 1998. Critical factors of vanillin assay

for catechins and proanthocyanidins. J. agric. food chem., 46: 4267–4274

46. Tausz M, Sircelj H, Grill D. 2004. The glutathione system as a stress marker in

plant ecopysiology: is a stress-response concept valid?. J. Exp. Bot., 55: 1955-

1962

47. Tausz M, Wonisch A, Grill D, Morales D, Jimenez MS. 2003. Measuring

antioxidants in tree species in the natural enviroment: from sampling to data

evaluation. J. Exp. Bot., 54: 1505–1510

48. Terrill TH, Windham WR, Evans JJ, Hoveland CS. 1990. Condensed tannin

concentration in Sericea Lespedeza as influenced by preservation method. Crop

Sci., 30: 219–224

49. Urbanek Krajnc A. 2004. Effects of endogenously increased levels of thiol

compounds and salicylic acid on Zucchini yellow mosaic virus infected Styrian

oil pumpkin plants. Thesis. Uni Graz

50. Urbanek Krajnc A. 2009. A temporalanalysis of antioxidative defense responses

in the phloem of Picea abies after attack by Ips typographus. Tree Physiol., 1–10

51. Urbanek Krajnc A, Kristl J, Ivančič A. 2011. Application of salicylic acid induces

antioxidant defense responses in the phloem of Picea abies and inhibits

colonization by Ips typographus. Forest Ecol. Manag., 261: 416–426

52. Visočnik M. 2010. Vpliv salicilne kisline na vsebnost skupnih fenolov v lubju

navadne smreke [Picea abies (L.) H. Karst.] pri napadu osmerozobega


48

smrekovega lubadarja (Ips typographus L.). Univerza v Mariboru, Fakulteta za

kmetijstvo in biosistemske vede. Diplomsko delo.

53. Wainhouse D, Ashburner R, Ward E, Boswell R. 1998. The effect of lignin and

bark wounding on susceptibility of spruce to Dendroctonus micans. Journal of

Chemical Ecology., 24: 1551–1561

54. Wainhouse D, Cross DJ, Howell RS. 1990. The role of lignin as a defence against

the spruce bark beetle Dendroctonus micans: effect on larvae and adults.

Oecologia., 85: 257–265

55. Wainhouse D, Rose DR, Pearce J. 1997. The influence of preformed defences on

the dynamic wound response in Spruce bark. Funct. ecol., 11: 564–572

56. Wermelinger B. 2004. Ecology and management of the spruce bark beetle Ips

typographus – a review of recent research. Forest Ecol. Manag., 202: 67–82

57. Wolfe RM, Terrill TH, Muir JP. 2008. Drying method and origin of standard

affect condensed tannin (CT) concentrations in perennial herbaceous legumes

using simplified butanol-HCI CT analysis. J. Sci. Food Agric., 88: 1060–1067

58. Yu Z, Dahlgren RA. 2000. Evaluation of methods for measuring polyphenols in

conifer foliage. Journal of Chemical Ecology., Vol.26, No.9: 2119–2140

59. Zavod za gozdove Slovenije. 2007. Usmeritve za obvladovanje podlubnikov.

Ljubljana, junij 2007

60. Zavod za gozdove Slovenije (elektronski vir)

http://www.zgs.gov.si/ (12. julij 2011)

61. Zeneli G, Krokene P, Christiansen E, Krekling T, Gershenzon J. 2006. Methyl

jasmonate treatment of mature Norway spruce (Picea abies (L) Karst.) protects

trees against Ceratocystis polonica infection and increases the accumulation of

terpenoid resin components. Tree Physiol., 26 (in press)

62. Zeneli G, Krokene P, Christiansen E, Krekling T, Gershenzon J. 2006. Methyl

jasmonate treatment of mature Norway spruce (Picea abies) trees increases the

accumulation of terpenoid resin components and protects against infection by

Ceratocystis polonica, a bark beetle-associated fungus. Tree Physiol., 26: 977–

988

ZAHVALA

Najprej se zahvaljujem mentorici doc. dr. Andreji Urbanek Krajnc in somentorici doc. dr.

Janji Kristl, ki sta me vseskozi spodbujali, mi pomagali in svetovali s svojimi strokovnimi

nasveti.

Zahvaljujem se predsedniku komisije doc. dr. Stanislavu Tojnku in članu komisije red.

prof. dr. Antonu Ivančiču za pregled in strokovno mnenje o diplomskem delu.

Hvala tudi univ. dipl. biokem. Andreji Šober za pomoč in vzpodbudo pri laboratorijskem

delu.

Posebej se zahvaljujem svojim staršem in sestri Maji za potrpežljivost in razumevanje v

času študija. Hvala, da ste mi stali ob strani, zaupali vame, me podpirali in mi omogočili,

da sem še en korak bližje zastavljenim ciljem.

Hvala tudi vsem, ki ste mi na kakršen koli način pomagali med študijem ali pri

diplomskem delu.

Documents

ČASOVNA ANALIZA VSEBNOSTI KONDENZIRANIH TANINOV V …