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大阪府立大学 大学院生命環境科学研究科
糸状菌セルロース系バイオマス分解酵素の
大量生産技術の開発
大阪府立大学 大学院生命環境科学研究科
教授 川口剛司
准教授 炭谷順一
助教 谷修治
1
21世紀の産業革命 ～バイオリファイナリ～
糖類(Glucose等)
150
200
250($ Billions) 市場規模予想
バイオマス
合成ガス(CO/H2)
燃料・化成品
0
50
100
2007 2012 2020(Year)
World economic forum 20102
21世紀の産業革命 ～バイオリファイナリ～
3引用：http://bpe.epfl.ch/page-34016-en.html
バイオリファイナリに向けて糸状菌を用いるメリット
バイオマス バイオマス分解酵素高タンパク質分泌能C5 & C6 資化能有機酸産生
燃料・化成品
有機酸産生酸性域で生育可能ゲノム配列分子生物学的解析
糸状菌
4
有用物質生産工場として糸状菌を利用~ Consolidated Bioprocess ~
Exoglucanases Endoglucanases HemicellulasesLignin-degrading Enzymes -Glucosidases
Monosaccharides
Oligosaccharides
Phenol compounds
Organic acids
Plant
Woody wastes
A. aculeatus 5
糖化力に優れたセルラーゼを分泌する糸状菌 Aspergillus aculeatus の単離
Trichodermareesei
Aspergillus aculeatus
セルラーゼ生産量 > 100 g/l ～ 数 g/l
セルラーゼの特長結晶性セルロース分解能 -グルコシダーゼ（強）
6
セルラーゼの特長結晶性セルロース分解能高い
-グルコシダーゼ（強）ヘミセルラーゼ（強）
セルラーゼの改善点-グルコシダーゼ（弱）
ヘミセルラーゼ（弱）結晶性セルロース分解能（弱）
A. aculeatus の酵素生産量を増大
セルロース系バイオマス分解酵素の生産制御
Inducer
Transcriptionfactor
Targets
mannan cellulose xylan arabinan
mannan-degradingenzymes
cellulose-degradingenzymes
xylan-degradingenzymes
arabinan-degradingenzymes
AraR未同定 XlnRManR
pectin
pectin-degradingenzymes
PecR
enzymes enzymes enzymes enzymes enzymes
7
cellulose
pectin
hemicellulose
Inducer
Signal
Cellobiose
Cellulose
Xylose
新規セルラーゼ遺伝子発現調節因子の同定～未同定の経路により制御される遺伝子の同定～
cmc1, xynIbGGCTAAGGCTAA
XlnR
Aspergillus aculeatus
XX
cbhI, cmc2
SignalTrans-duction
Trans-cription CCGNCCGN22CNCN88GG
8
新規セルラーゼ遺伝子発現調節因子の同定～T-DNAタギング＆ポジティブスクリーニング系～
T-DNA
Cellulose
CelR
Cellulose
lRce celRCelR
gene X ge X
Bingo! Out...
FOA resistant (grown)
Agrobacterium
FOA sensitive (lethal)
T-DNA
A. aculeatus A. aculeatus
CelR lRce
PcbhI pyrG PcbhI
celR
pyrGpyrG
CelR
9
プレート 液体培養
比率Agro : conidia
104：１(1x108：1x104)
50 : 1(5x108:1x107)
アセトシリンゴン濃度
200 M 200 M
Agrobacteriumsuspension
A. aculeatus spore suspension
新規セルラーゼ遺伝子発現調節因子の同定～アグロバクテリウム形質転換系の構築～
harvest & wash
100 ml induction medium
selection medium
濃度
共培養時間 48 hours 48 hours
形質転換体数 30株/plate 210株/100 ml
培地必要量 72 l(＞3500枚)
35 l
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新規セルラーゼ遺伝子発現調節因子の同定～新規因子欠損候補株のスクリーニング～1. A. aculeatus をアグロバクテリウム
を用いて形質転換（17,000 株）
2. FOA培地上で生育した株 （198 株）
3. 候補株の生育、セルラーゼ遺伝子発現量、酵素生産量などを観察（9 株）
はずれ
候補株 はずれ
発現量、酵素生産量などを観察（9 株）
4. 遺伝子を特定（PCR法で容易に増幅）
5. 遺伝子破壊株を作出（高頻度）
6. 表現系の確認
7. 予測される因子の機能を詳細に解析 11
FOA含有培地
新規セルラーゼ遺伝子発現調節因子の同定～新規因子欠損候補株～
GlucoseXyloseXylanASCAvicel
NCP2(コントロール株)
S9-12aS9-12a(タンパク質生産)
S9-3a(遺伝子発現)
S4-22a(cgaF)
12
cbhID Av X D Av XHost S4-22a
(A) (B)
0.8
1
1.2
cbhI
mRN
A
半定量的RT-PCR 定量的PCR
新規転写因子の機能解析～S4-22a株の解析～
cmc2
gpdA
0
0.2
0.4
0.6
Host S4-22Re
lativ
e cb
hI
13
新奇セルラーゼ遺伝子発現制御因子の同定～S4-22a株におけるT-DNA挿入座位を同定～
(2,407 bp)
Zn finger domain
Spe I
XbaI
vector backbone
T-DNA RBLB
XbaI
S4-22a 株におけるT-DNA挿入部位の概略図
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S4-22a株の破壊遺伝子の機能解析～cellulase-genes activating factor～
control
Rela
tive
mRN
A le
vel
Rela
tive
mRN
A le
vel
Cellobiose/DNJ
Avicel
**
**** * *
15
control
complement
cgaF
cbhI cmc2
Rela
tive
mRN
A le
vel
cbhI cmc2 cmc1 xynIbRe
lativ
e m
RNA
leve
l
* P<0.05, ** P<0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
CMCa
se (U
/ml)
新奇転写因子CgaFの高発現
4
6
8
10
12
14
Xyla
nase
(U/m
l)
0
0.1
0.2
0 100 200 300
CMCa
se (U
/ml)
Time (h)
cgaF高発現株
宿主株16
0
2
4
0 100 200 300
Xyla
nase
(U/m
l)Time (h)
新技術の特徴・従来技術との比較
一種類の因子を高発現することで、種々の基質特異性を有すセルラーゼ・キシラナーゼを高生産することに成功
想定される用途
産業用酵素（セルラーゼ・ヘミセルラーゼ）の
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産業用酵素（セルラーゼ・ヘミセルラーゼ）の大量生産
条件特異的に機能する因子の同定とその機能解析
Consolidated Bioprocessの宿主として利用
想定される業界
想定されるユーザー
発酵などによる物質生産企業
製紙産業
想定される市場規模
バイオリファイナリ
産業用酵素
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実用化に向けた課題
現状の酵素の反応効率は、実用レベルには達していないと考えられる。しかし、今後、新たな因子を同定しその機能を利用することで、更に生産量を向上させる事が可能であると考えている。
企業への期待
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企業への期待
糸状菌を宿主とした酵素生産、セルロース系バイ
オマスを原料とした有用物質を生産する技術をも
つ、或いはその分野への展開をお考えの企業との
共同研究を希望。
真菌の分子育種をお考えの企業
本技術に関する知的財産権
発明の名称：セルラーゼ・ヘミセルラーゼ転写因子
出願番号 ：特願2011－066797
出願人 ：大阪府立大学
発明者 ：谷修治, 炭谷順一, 川口剛司
２０１１年度
JST 研究成果最適展開支援プログラム
A-STEP 探索タイプ に採択20
発明者 ：谷修治, 炭谷順一, 川口剛司
産学官連携の経緯
お問い合わせ先
公立大学法人 大阪府立大学
府大・市大連携共同オフィス
統括コーディネータ 野村 幸弘統括コーディネータ 野村 幸弘
TEL: 072-254-8263
FAX: 072-254-9874
E-mail: [email protected]
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