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学校编码：10384 分类号密级
学号：21620101152342 UDC
硕士学位论文
广州管圆线虫三种半胱氨酸蛋白酶在其各
期虫体中的免疫荧光定位
Immunofluorescence localization of three
kinds of Cathepsins in of each stage of
Angiostrongylus cantonensis
作 者 姓 名：余长茂
指导教师姓名：罗大民教授
专 业 名 称：生物化学和分子生物学
论文提交日期：
论文答辩时间：
学位授予日期：
答辩委员会主席：
评阅人：
2013 年月
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厦门大学学位论文原创性声明
本人呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立完成的研究成果。
本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文
中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究生学术活
动规范（试行）》。
另外，该学位论文为（）课题（组）的研究成果，获得（）课题
（组）经费或实验室的资助，在（）实验室完成。（请在以上括号内
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年 月 日
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本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》
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本学位论文属于：
（）1.经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于
年 月 日解密，解密后适用上述授权。
（）2.不保密，适用上述授权。
（请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应
是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委
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公开学位论文，均适用上述授权。）
声明人（签名）：
年月日
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目录
I
目录
目录………………………………………………………………………I
Contents……………………………………………..…………………III
摘要………………………………………………………………………1
Abstract………………………………………………………………….3
第一章前言……………………………………………………………..5
1.1 广州管圆线虫生活史及广州管圆线虫病………………………………...5
1.2 线虫结构简介……………………………………………………………....6
1.3 寄生虫半胱氨酸蛋白酶简介……………………………………………...8
1.4 广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶目前研究情况………………………….10
第二章实验材料、仪器和方法………………………………………11
2.1 实验材料和仪器…………………………………………………………..11
2.2 实验方法…………………………………………………………………..14
第三章三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫各期虫体中的免疫荧光
定位结果………………………………………………………21
3.1 半胱氨酸蛋白酶表达载体的构建………………………………………...21
3.2 三种半胱氨酸蛋白酶重组蛋白的诱导表达……………………………...23
3.3 三种半胱氨酸蛋白酶重组蛋白的纯化和蛋白浓度测定………………...24
3.4 western blot 检测三种抗体的特异性和三种抗体的效价评估…………..25
3.5 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫幼虫中的荧光定位………………26
3.5.1 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫L1中的荧光定位…………...27
3.5.2 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫L2中的荧光定位………...…28
3.5.3 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫L3中的荧光定位………...…30
3.5.4 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫L4中的荧光定位…………...33
3.5.5 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫L5中的荧光定位…………...34
3.6 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位…………38
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目录
II
3.6.1 Ac-CathB-1 在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位………………..38
3.6.2 Ac-CathB-2 在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位………………..43
3.6.3 Ac-Hem 在广州管圆线虫成虫中的免疫荧光定位……………………47
3.6.4 三种半胱氨酸蛋白酶在广州管圆线虫中的免疫荧光定位阴性对照..51
第四章讨论……………………………………………………………53
参考文献………………………………………………………………..59
致谢…………………………………………………………………..66
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Contents
III
Contents
Contents……………………………………………………………..…III
Abstracts…………………………………………………………………3
Chapter 1 Introduction…………………………………………………5
1.1 The brief introduction of the life cycle of Angiostrongylus cantonensis and
Angiostrongyliasis Cantonensis………………………………………………..5
1.2 The brief introduction of the structure of nematodes……………………….6
1.3 The brief introduction of Cathepsins of parasites…………………………...8
1.4 The progress of the Cathepsins of Angiostrongylus cantonensis…………..10
Chapter 2 The materials, instrumentation and experimental
methods..………………………………………………………………..11
2.1 The materials and instrumentation………………………………………..11
2.2 The experimental methods…………………………………………………..14
Chapter 3 The results of the Immunofluorescence localization of
three kinds of Cathepsins in of each stage of Angiostrongylus
cantonensis……………………………………………………………...21
3.1 Construction of the expression vectors of three kinds of Cathepsins……..21
3.2 Induced expression of three kinds of recombinant Cathepsins……………23
3.3 Purification and concentration determination of the recombinant
Cathepsins…………………………………………………………………….24
3.4 Specificity test and titer evaluation of the three antibodies………………..25
3.5 Immunofluorescence localization of three kinds of Cathepsins in of each
stage of larva………………………………………………………………….26
3.5.1 Immunofluorescence localization of three kinds of Cathepsins in the first
stage of larva……………………………………………………………….27
3.5.2 Immunofluorescence localization of three kinds of Cathepsins in the second
stage of larva……………………………………………………………….28
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Contents
IV
3.5.3 Immunofluorescence localization of three kinds of Cathepsins in the third
stage of larva………………………………………………………………30
3.5.4 Immunofluorescence localization of three kinds of Cathepsins in the forth
stage of larva………………………………………………………………33
3.5.5 Immunofluorescence localization of three kinds of Cathepsins in the fifth
stage of larva………………………………………………………………34
3.6 Immunofluorescence localization of three kinds of Cathepsins in adult
worms…………………………………………………………………………38
3.6.1 Immunofluorescence localization of Ac-CathB-1 in adult Angiostrongylus
cantonensis…………………………………………………………………38
3.6.2 Immunofluorescence localization of Ac-CathB-2 in adult Angiostrongylus
cantonensis…………………………………………………………………43
3.6.3 Immunofluorescence localization of Ac-Hem in adult Angiostrongylus
cantonensis………………………………………………………….………47
3.6.4 Negative control of Immunofluorescence localization of three kinds of
Cathepsins in adult worms………………………………………….………51
Chapter 4 Discussion…………………………………………………..53
Reference……………………………………………………………….59
Acknowledgement……………………………………………………..66
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摘要
1
摘要
广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)依靠软体动物作为其中间宿主，并
以啮齿类动物等作为其终宿主完成其整个生活史。人类是广州管圆线虫的偶然宿
主，因误食其感染性L3而引起广州管圆线虫病，其可入侵人体并停留在中枢神
经系统，引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。近年来，广州管圆线虫病作为一种
新发的传染病正受到越来越多的重视。但是我们对此寄生虫的了解仍然比较欠缺，
对一些与其寄生生活相关的基因更是知之甚少，对这些基因的研究包括了基因全
长的克隆，序列的比对，各期虫体基因表达量的测定，目的蛋白的免疫组化等。
这些都有助于我们进一步研究该基因并将之应用于广州管圆线虫病的防治中。
寄生虫半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的寄生生活中起着关键的作用，包括寄生虫
的营养摄取，组织入侵，免疫逃避，生长发育等等，不同的半胱氨酸蛋白酶存在
于寄生虫的不同组织，营着不同的功能，因此我们可以通过这些不同的半胱氨酸
蛋白酶的定位来推测其在寄生虫中的功能，为我们进一步的寄生虫防治工作打好
理论基础。
本研究通过在NCBI上下载广州管圆线虫的三种半胱氨酸蛋白酶全长序列，
分别是Ac-CathB-1，Ac-CathB-2和Ac-Hem，用primer 5分别设计特异性引物并将
这三种半胱氨酸蛋白酶表达序列以虫体mRNA反转录得到的cDNA为模板进行体
外扩增，并将得到序列分别构建表达载体，之后分别转入大肠杆菌BL21表达菌
中大量诱导培养，获得重组蛋白并纯化，然后将这些纯化后重组蛋白免疫小鼠，
制备多克隆抗体。之后我们将这些得到的抗体作为一抗，Cy3标记的羊抗小鼠IgG
作为二抗对这三个半胱氨酸蛋白酶在各期幼虫和成虫中进行免疫荧光定位。
结果显示，Ac-CathB-1从一期幼虫（L1）到成虫中，都集中而且大量的分布
于其消化系统中，在三期幼虫（L3）中还分布于侧翼上，成虫肠道肌肉层有着
少量而弥散的分布，肠道上皮微绒毛层则大量集中的分布，而且肠道内容物也可
见其分布，推测Ac-CathB-1在广州管圆线虫中起降解宿主血红细胞，参与食物泡
形成等营养摄取的功能。Ac-CathB-2在幼虫的神经环中没有分布，Ac-CathB-2在
L1到四期幼虫（L4）中不仅存在于消化系统上，而且存在于侧翼上，在成虫中
大量分布于消化系统，原体腔，成虫性腺尤其是输精管壁和卵巢壁、子宫壁上，
这些组织都涉及向外排出虫体自身物质的过程如外分泌蛋白，精子和卵子等，但
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摘要
2
在L4和五期幼虫（L5）性腺形成期中，其并没有分布于性腺上，因此推测其是
作为一个协同参与外分泌作用的酶类，它有可能保证寄生虫分泌，产卵，射精等
过程顺利进行。Ac-Hem则是较为均匀的分布于幼虫到成虫的各个组织中，由于
其分布差异不大，因此推测其可能对广州管圆线虫的生长发育起着关键的作用。
关键词：广州管圆线虫半胱氨酸蛋白酶免疫荧光定位
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Abstract
3
Abstract
Angiostrongylus cantonensiscompletes its whole life cycle by using Mollusca as
its intermediate host and Glires as its final host. The human, the occasional host of this
nematode, can catch theAngiostrongyliasis cantonensis by eating its infective larvae 3,
which can invade the human body and stay in our center nervous system, causing the
eosinophilic meningitis. Increasingly, the Angiostrongyliasis cantonensis, as a new
infectious disease, are arousing people’s attention in recent years. However, we now
have known little about this nematode and less about its genes that are relevant to its
parasitism. The research of these genes include the clone of gene’s full-length,
sequence alignment, measurement of gene expression of each stage, the
immuohistochemical localization of interest protein and so on, all these research will
help us to make a further step on the our understand of these genes and then on the
prevention and control of the Angiostrongyliasis cantonensis.
The Cathepsins of the parasites play such pivotal roles in their parasitism as
nutrition intake, tissue invasion, immune evasion, growth and development and so on.
Different kinds of Cathepsins exist in different organs of the parasite and function
differently, so we can speculate their functions in parasite by locating these cathepsins
to lay a good theoretical foundation against the parasite.
On this research, we use primer 5.0 to design the specific primers of the three
Cathepsins’ expressed sequences, which were got from the NCBI, namely
Ac-CathB-1, Ac-CathB-2 and Ac-Hem respectively. Then we amplified the expressed
sequence by using the cDNA got from the reverse transcription of this worm’s mRNA
as the template, and constructed the expression vectors. The vectors were then
transduced into the E.coli BL21 to induce to produce the recombinant protein. After
the recombinant protein were collected and purified, they were used to immunizate
the mice to prepare the polyclonal antibodies. Finally, the three Cathepsins were
Immunofluorescence located in larvas of each period and adult worm by using the
polyclonal antibodies as primary antibodies and Goat Anti-mouse IgG/Cy3 as
secondary antibody.
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Abstract
4
The results show that the Ac-CathB-1 concentrated abundantly on the digestive
system. In Larva 3, it also distributed in lateral fin. It distributed dispersively in
muscle layer of gut and oesophagus, but largely in their epithelium microvilli layer,
also it can be found in gut contents. According to that, Ac-CathB-1 was speculated to
have the function of nutrition intake in A.cantonensis, like digesting host red blood
cells and participating in the formation of food vacuole. Even though Ac-CathB-2 was
not found in the excretory pore, it existed mainly in digestive system as well as lateral
fin. It can also be detect in the sex organ of adult worm, especially in walls of vas
deferens and uterus. All these tissue are related to the worm’s secretion, such as
secreting protein, ejaculation and ovulation. But the Ac-CathB-2 do not be found in
the sex system of the forth and fifth stage of larvas, the period when the sex system
develop rapidly. So it is thought to be the kind of enzyme that collaboratively
participate in secretion to ensure the process like secreting protein, ejaculation and
ovulation.Ac-Hem was distributed uniformly in all the tissue of each stage of the
worm, hence it did not show apparent difference in its distribution, we suspected that
it may play a critical role in the worm’s development.
Key words: Angiostrongylus cantonensis, Cathepsins, Immunofluorescence
localization
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第一章前言
5
第一章前言
1.1广州管圆线虫和广州管圆线虫病
广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)隶属于圆线虫目，后圆线虫科，
后圆线虫亚科，管圆线虫属，虫体丝状，口、交合伞均较简单，表皮有被鞘。主
要分布在热带、亚热带地区。最早由陈心陶于1933年在广州家鼠及褐家鼠体内发
现并命名为广州肺线虫，后由Matsumoto于1937年在台湾报道，到1946年才由
Dougherty订正为广州管圆线虫[1]。广州管圆线虫病，又称嗜酸性粒细胞增多性脑
膜炎或嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎(Eosinophilic meningitis or
Meningoencephalitis, EM)，是由广州管圆线虫引起的一种人兽共患病[1-3]。该病是
因进食了含有广州管圆线虫感染性第三期幼虫（L3）幼虫的螺肉或由其幼虫污
染的食物而感染的。L3会侵犯人体中枢神经系统，人并非其正常宿主，它在人
体能只能发育为第四期幼虫（L4）或童虫，引发脑膜炎和脑炎、脊髓膜炎和脊
髓炎。极个别感染虫体数量多者，可致死亡，或留有后遗症，广州管圆线虫
甚至可以寄生在病人眼中，引起不可逆的病变 [2, 3]，该病主要在东南亚及太平
洋各岛屿流行，近年来, 在澳大利亚和美国南部也出现流行[4, 5]。台湾省及广东、
广西、上海、浙江、福建、辽宁、北京等省市均有病例报道。截止到1992年，已
有超过2500例感染广州管圆线虫的病例被报道[6]。随着人们饮食习惯的改变和水
陆交通日趋发达，该病的流行呈上升趋势[4, 6, 7]。近年福建和浙江的大规模的爆
发使得该病愈发引起人们的重视，而且这两次爆发都和福寿螺相关[8]。
图 1.1 广州管圆线虫生活史
(源自 http://ch.sysu.edu.cn/hope/sitesdemo/parasite/paranet/ShowArticle.asp?ArticleID=526)
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第一章前言
6
广州管圆线虫的生活史如图1.1所示：广州管圆线虫成虫寄生于鼠心肺动脉
中，产卵于血液，成熟后孵出第一期幼虫（L1），L1随粪便排除体外。L1在水中
或湿润的环境中被软体动物吞食或主动钻入其体内而感染中间宿主，8~10.5 d后
蜕皮为L2，螺体内的幼虫发育随温度不同有发育不一致的现象[9]。2周后再经一
次蜕皮成为L3（感染期幼虫）[10]，鼠类等吞食含感染期幼虫的软体动物或饮用
受污染的水被感染，鼠体L3沿颈总动脉到达脑部。感染后第5d，鼠脑中可见行
动缓慢的L3末期幼虫。第5.5～10d，脑部可见经第3次蜕皮可辩雌雄的L4；第
10.5~12.5d，大部分幼虫经第4次蜕皮成L5，广泛寄生在脑的表层；第13～22 d 为
L5 迅速生长阶段，第23～29.5d，大部分虫体逐渐从脑部转移至心、肺定居，期
间性腺发育迅速。30 d 后鼠脑检测不出虫体，已全部转移入肺动脉血管，大约
39~45 d之后，可见L1由终宿主粪便排出[11-14]。人类只是广州管圆线虫的偶然宿
主，在人体中，广州管圆线虫不能发育为成虫，但是会停留在L4或者L5并引发
嗜酸性粒细胞增多的脑膜炎。
1.2广州管圆线虫结构简介
广州管圆线虫L1（图 1.2.1）虫体细长，体长 0.25～0.29mm；宽 0.014～0.018mm。
L1 具侧翼[15, 16]，咽管约为虫体长度之 1/2，生殖原基约在肠中部稍前，尾稍尖，
背侧有一凹陷[17]。
图 1.2.1 L1（朱天成，1983） 图 1.2.2 L2（HIDEKAZU HATA，1990）
广州管圆线虫 L2 较 L1 略大，较为肥大，体表具外鞘。体内有许多折光颗粒，
尤以肠道内最明显。
广州管圆线虫 L3（图 1.2.3），体长 0.462～0.525mm；宽 0.022～0.027mm。
体表具有两层外鞘。体表有侧翼，头端稍圆，尾部顶端变尖细，可见排泄孔、肛
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第一章前言
7
孔及生殖原基，此时虫体性腺尚未发育，在距肛门约 158μm 处可见其生殖原基，
消化系统仍较为细小，食道长约占体长 1/3，结构较为简单[15-17]。
图 1.2.3 玛瑙螺体内分离得到的 L3（朱天成，1983）
广州管圆线虫 L4（图 1.2.4）出现于感染终宿主后第 6~8 d，体长约为 L3 的
2 倍，肠内充满折光颗粒，此时，肠道更加明显，雄雌可辨，雄虫后端在直肠背
面和肛门前膨胀并有一生殖管和直肠连接占虫体后端 1/5，交合刺袋及其背面发
育具有纹状的交合刺到达泄殖腔。雌虫尾部不涨大，但直肠的腹面有一生殖管向
前生长[17]。
图 1.2.4 L4 雄虫和雌虫（朱天成，1983）
A 为雄虫尾部，B 为雄虫整虫，C 为雌虫尾部
广州管圆线虫 L5（图 1.2.5）雄虫可见单管生殖腺，形成了尾部交合伞和交
合刺，雌虫出现双管子宫，卵巢膨大，虫体体积增大加快，生殖系统发育迅猛很
快[17]。
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第一章前言
8
图 1.2.5 L5 雄虫和雌虫（朱天成，1983）
A 为虫体头部，B 为雄虫尾部交合伞和交合刺，C 为雌虫（可见双管子宫形成），
D 为雌虫尾部
广州管圆线虫成虫线状细长，体表光滑有微细环状横纹。头端钝圆，头顶中
央有一小圆口，无口囊，食道呈棍棒状，肛孔在虫体末端。雄虫为 11～26mm×
0.21～0.53mm，尾端略向腹面弯曲，交合伞对称，呈肾形。雌虫 17～45mm×0.3～
0.66mm，尾端呈斜锥形，子宫双管型，白色、与充满血液的肠管缠绕成红、白
相间的螺旋纹，阴门位于虫体尾端，开口于肛孔之前。
1.3寄生虫半胱氨酸蛋白酶简介
半胱氨酸蛋白酶，是一类含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶，属于木瓜蛋白酶
家族，包括组织蛋白酶B、L和H等，存在于许多蠕虫中并有重要的生物学意义[18-23]。
半胱氨酸蛋白酶对寄生虫的营养代谢起关键作用，如血吸虫的组织蛋白酶B
型和L1型能催化降解宿主血红蛋白[24]。恶性疟原虫同样利用半胱氨酸蛋白酶裂
解宿主的血红蛋白[25, 26]。锥虫、毛滴虫、溶组织内阿米巴等的半胱氨酸蛋白酶
通过降解宿主血红蛋白酶为寄生虫提供营养，利用宿主的血红蛋白作为他们的主
要营养和氨基酸来源，并参加寄生虫的发育过程，也间接促进侵入宿主组织[27]，
布氏锥虫半胱氨酸蛋白酶可消化宿主的纤维蛋白原[28]。
半胱氨酸蛋白酶还参与脱包囊和包囊形成，脱鞘和羽化。如蓝氏贾第鞭毛虫
包囊形成需要半胱氨酸蛋白酶的参与[29]。
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9
半胱氨酸蛋白酶参与裂解和入侵血红细胞过程，因此其也必然参与虫体的入
侵过程，在恶性疟原虫、夏氏疟原虫和伯氏疟原虫中，其半胱氨酸蛋白酶都可以
定位于裂殖子的顶端，在虫体侵入细胞时释放，在裂殖子介导红细胞的破裂过程
中发挥作用，伯氏疟原虫分泌的半胱氨酸蛋白酶中还参与子孢子对肝细胞的侵入
[26]。刚地弓形虫释放的表面蛋白MIC2要经过半胱氨酸蛋白酶的加工处理，虫体
才能入侵红细胞[30]。
半胱氨酸蛋白酶还和寄生虫的致病性有紧密联系，在利什曼原虫中，其主要
以无鞭毛体期合成L样半胱氨酸蛋白酶，只有少数以后期发育的体前鞭毛形式表
达和活化，使得它具有感染哺乳动物并宿主体内增殖的能力。敲除半胱氨酸蛋白
酶基因家族后，硕大利什曼原虫的致病力明显降低[31, 32]。
半胱氨酸蛋白酶还和寄生虫的免疫逃避息息相关，半胱氨酸蛋白酶能够通过
降解宿主免疫效应器或调整细胞免疫反应来帮助寄生虫实现免疫逃避，如肝吸虫
L样半胱氨酸蛋白酶能够裂解宿主免疫球蛋白而遏制抗体介导的嗜酸性粒细胞
附着的免疫效应[33]；半胱氨酸蛋白酶还能消除寄生虫宿主补体介导的免疫效应，
锥虫锥鞭毛体表面补体调节蛋白CRP可结合人的补体成分C3b和C4b并能抑制C3
转化酶的形成，而C3b与CRP 的结合使CRP对寄生虫半胱氨酸蛋白酶变得敏感从
而被裂解导致C3b-CRP 从虫体表面脱落，从而遏制了补体介导的溶解、清除作
用[34]。半胱氨酸蛋白酶还能通过阻断抗原递呈和免疫识别而起到免疫逃避的作
用。如利什曼原虫无鞭毛体的半胱氨酸蛋白酶可能参与了宿主巨噬细胞中一些免
疫相关分子的降解而逃避了抗原递呈和宿主的免疫识别过程[28]。第4个途径是通
过调节细胞因子的分泌来实现免疫逃避，如利什曼原虫的半胱氨酸蛋白酶可调节
细胞因子的分泌来改变宿主的免疫作用和毒性作用，如刺激其IL-4与IL-1 表达以
促进其前体细胞向辅助性T细胞的分化，并刺激所在巨噬细胞产生转化生长因子
β，降低产生NO，以利于虫体的增殖[31]。
不同的半胱氨酸蛋白酶存在于不同的虫种中，不同的半胱氨酸蛋白酶存在的
位置不同，营不同的作用，同一虫种的不同时期，半胱氨酸蛋白酶存在部位也有
所不同。捻转血矛线虫的成虫肠组织中，半胱氨酸蛋白酶的活性最高。其四期幼
虫可检测到半胱氨酸蛋白酶活性但三期幼虫却不可以[35]。巴西日本圆线虫中，
其半胱氨酸蛋白酶存在于虫体抽提物和排泄分泌物中[36]。曼氏血吸虫B和L1样半
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