Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Energía Renovable

ESTUDIO DEL GEN hycE Y LA ESTRUCTURA DE

LA ENZIMA [NiFe]-HIDROGENASA DE

Escherichia coli

Tesis que presenta:

Q.I. Angela Francisca Ku González

En opción al título de:

MAESTRO EN CIENCIAS EN ENERGÍA RENOVABLE

Mérida, Yucatán, México

Febrero 2012

DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las

actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para

desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de

Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en

contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados,

dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la

Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación.

Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los

productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo

correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de

Investigación Científica, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este

trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se

regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley

de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.

Mérida Yucatán, México al 13 de febrero de 2012

____________________________

Q.I. Angela Francisca Ku González

EL PRESENTE TRABAJO FUE REALIZADO EN LA UNIDAD DE BIOQUÍMICA Y

BIOLOGÍA MOLECULAR DE PLANTAS DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN

CIENTÍFICA DE YUCATÁN A.C., BAJO LA DIRECCIÓN DEL DR. ENRIQUE

CASTAÑO DE LA SERNA.

____________________________

Dr. Oscar A. Moreno Valenzuela Director Académico

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

AGRADECIMIENTOS

A la dirección general del CICY.

A la dirección académica del CICY.

A la dirección de la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas por

su autorización y apoyo para desarrollar este proyecto de tesis.

A mi director de tesis, Dr. Enrique Castaño de la Serna.

A mi comité tutoral y revisores, Dra. Virginia A. Herrera Valencia, Dra. Laura

Solís Ramos, Dra. Ruby Valdéz Ojeda, Dra. Ana Luisa Ramos Díaz. Les

agradezco infinitamente su tiempo, paciencia y sobre todo su aporte científico.

A mis compañeros de laboratorio, compañeros de la segunda generación ER y

amigos de toda la vida por su ayuda y estar siempre apoyándome.

Y a todas las personas que de alguna forma contribuyeron a la realización de

este trabajo.

DEDICATORIA

A mi querida y gran familia, especialmente y con mucho amor a mis hijos, José,

Mónica, Héctor e Iván.

i

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1

1 CAPITULO 1. ANTECEDENTES........................................................................................4

1.1 El hidrógeno como vector energético ..................................................................... 4

1.2 Métodos de producción de hidrógeno .................................................................... 5

1.3 Producción biológica de hidrogeno ........................................................................ 6

1.4 Las enzimas hidrogenasas ..................................................................................... 8

1.5 El biohidrógeno ..................................................................................................... 12

1.6 Distribución de las hidrogenasas.......................................................................... 12

1.7 Biocatálisis de las hidrogenasas .......................................................................... 14

JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 19

OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................ 20

OBJETIVOS PARTICULARES .................................................................................................. 20

HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 21

2 CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 22

2.1 Diseño experimental ............................................................................................. 22

2.2 Alineamiento de secuencias de aminoácidos. ................................................... 24

2.3 Análisis de estructura de la enzima [NiFe]-hidrogenasa ..................................... 24

2.4 Diseño de oligonucleótidos ................................................................................... 25

2.5 Material biológico .................................................................................................. 27

2.5.1 Cepas de Escherichia coli. ............................................................................ 27

2.6 Extracción de ADN genómico. .............................................................................. 28

ii

2.7 Reacción de PCR con oligos diseñados para amplificar al gen que codifica

para la [NiFe]-hidrogenasa. ............................................................................................. 29

2.8 Clonación del fragmento amplificado. .................................................................. 30

2.9 Extracción de ADN plasmídico. ............................................................................ 31

2.10 Digestión de plásmidos ......................................................................................... 32

2.11 Subclonación en un plásmido de expresión con una etiqueta de histidina ......... 32

2.12 Análisis del perfil de expresión de proteínas totales y extracto purificado de

una clona de E. coli BL21 putativamente transformada con pET 15b-hidrogenasa:6

his-tag. ............................................................................................................................. 34

3 CAPITULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 36

3.1 Análisis in silico de secuencias de [NiFe]-hidrogenasas ..................................... 36

3.2 Análisis de la estructura tridimensional de la subunidad grande de la enzima

[NiFe]-hidrogenasa .......................................................................................................... 38

3.3 Obtención de ADN genómico de E. coli. .............................................................. 42

3.4 Obtención de un amplicón con los oligos diseñados para amplificar al gen

hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa................................................. 44

3.5 Obtención del plásmido de expresión pET 15b-hidrogenasa y transformación

de E. coli cepa BL21........................................................................................................ 48

3.6 Patrón de expresión de proteínas totales y de extracto purificado de las

clonas obtenidas de E. coli.............................................................................................. 49

CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 54

PERSPECTIVAS ......................................................................................................................... 55

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 63

iii

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Ventajas y desventajas de los principales métodos de producción de

hidrogeno por procesos biológicos [32]. ................................................................................ 7

Tabla 2. Grupos homólogos del gen hidrogenasa que codifica para [NiFe]-

hidrogenasas en Proteobacteria [4] ..................................................................................... 10

Tabla 3. Números de accesión de las secuencias de aminoácidos de las enzimas

[NiFe]-hidrogenasa seleccionadas para este estudio. ...................................................... 24

Tabla 4. Secuencias de oligonucleótidos sintetizados ..................................................... 27

Tabla 5. Genotipos de cepas de E. coli utilizadas en este estudio. ................................ 28

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Métodos de producción de hidrogeno para la industria [13]. ............................ 5

Figura 2. Modelo propuesto de la síntesis del sitio activo de la [NiFe]-hidrogenasa 3 en

E. coli.. ..................................................................................................................................... 11

Figura 3. Estructuras de los sitios activos, (a) [NiFe] hidrogenasa, (b) [FeFe]

hidrogenasa. ........................................................................................................................... 14

Figura 4. Estructura atómica de los sitios catalíticos de [FeFe]-hidrogenasa y [NiFe]-

hidrogenasa. ........................................................................................................................... 15

Figura 5. Estructura de la hidrogenasa unida a membrana de R. eutropha.. ............... 16

Figura 6. Cofactores metálicos unidos a membrana. La malla azul representa la

densidad de electrones en estudios de cristalografía de rayos X.. ................................. 17

Figura 7. Arquitectura del grupo proximal [4Fe-3S]. .......................................................... 18

Figura 8. Secuencia de nucleótidos del ge hycE de la enzima [NiFe] hidrogenasa E.

coli K12.. .................................................................................................................................. 26

Figura 9. Vector de clonación pCR 2.1 TOPO (Invitrogen). ............................................ 30

Figura 10. Mapa del vector de expresión pET-15b. ........................................................... 33

Figura 11. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de microorganismos que

contienen la [NiFe]-hidrogenasa.. ........................................................................................ 38

v

Figura 12. Modelo estructural molecular de la enzima [NiFe]-Hidrogenasa. ................. 39

Figura 13. Modelo propuesto para mutagénesis dirigida de la enzima [NiFe]-

hidrogenasa de E. coli.. ......................................................................................................... 40

Figura 14. Modelo estructural de la enzima [NiFe]- hidrogenasa. .................................. 41

Figura 15. Electroforesis de ADN genómico de E. coli...................................................... 43

Figura 16. Electroforesis del producto de PCR gradiente de temperatura con oligos

hidrogenasa 2o.. ...................................................................................................................... 45

Figura 17. Electroforesis del producto de PCR con los oligos H2° diseñados para

amplificar al gen hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa. .................... 46

Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa 1% de la minipreparación de clonas

positivas con ADN plasmídico de hidrogenasa. ................................................................. 46

Figura 19. Electroforesis en gel de agarosa 1% del producto de PCR de hidrogenasa

con los oligos H3o, ................................................................................................................. 47

Figura 20. Electroforesis de la minipreparación de clonas del vector de expresión pET

15b-hidrogenasa:6 his-tag.. .................................................................................................. 49

Figura 21. Patrón de proteínas de dos clonas de pET 15b: hidrogenasa ...................... 51

Figura 22. Purificación de proteínas por columna de níquel de la clona 1 de E. coli

BL21 ......................................................................................................................................... 52

vi

ANEXO

Anexo 1. Articulo de divulgación aceptado en la revista Ciencia de la Academia

Mexicana de Ciencias. ................................................................................................ 56

vii

ABREVIATURAS

ADN Acido Desoxirribonucleico

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

H2asa enzima hidrogenasa

pb pares de bases

kDa kilodaltones

CO ligando carboxil

CN ligando ciano

Tm temperatura de fusión

viii

RESUMEN

La producción de biohidrógeno es una alternativa energética debido a que su uso

ofrece varias ventajas como vector energético. Sin embargo, el bajo rendimiento en su

producción es una limitante actualmente. Una forma de obtener este energético es

mediante el uso de organismos vivos. En este sentido numerosos microorganismos se

han identificado tales como E. coli y Clostridium spp, los cuales a través de la

actividad enzimática de proteínas tales como la enzima hidrogenasa tienen la

capacidad para producir hidrógeno. Se han identificado tres tipos de estas enzimas,

los cuales se clasifican en función al metal en el sitio activo que poseen, [FeFe]-

hidrogenasa, [NiFe]-hidrogenasa e [Fe]-hidrogenasa libre de metales. La función

catalítica de estas enzimas reside en la formación de H2 a partir de protones o de la

oxidación de protones. Se ha reportado en una cepa de E. coli top ten (Invitrogen) un

rendimiento de 2.014 mol de H2/mol de glucosa. Por lo que se espera obtener mayores

rendimientos en la producción de hidrógeno en la sobreexpresión de la enzima en

cepas de E. coli. En este trabajo, se decidió estudiar al gen hycE de la subunidad

grande de la [NiFe]-hidrogenasa debido a su participación en la inserción del níquel en

el sitio activo de la enzima. El estudio in silico de la secuencia de aminoácidos

predicha para la cual codifica este gen, permitió identificar dominios estructurales que

podrían permitir futuros estudios de mutagénesis de este gen con el fin de ampliar sus

aplicaciones biotecnológicas para la producción de hidrógeno a gran escala en E. coli.

Por lo tanto, se sintetizaron los oligonucleótidos correspondientes de acuerdo con la

secuencia de nucleótidos reportadas en GenBank. Se amplificó por PCR un fragmento

de aproximadamente 1700 pb con los oligos específicos para este gen. El fragmento

de PCR se clonó en un vector de expresión con etiqueta a histidina, el cual se utilizó

para la transformación de células de E. coli BL21. Posteriormente se realizó la

extracción de proteínas totales, la cual fue analizada mediante electroforesis en gel de

acrilamida con tinción de azul de Coomassie y se realizó la purificación de extracto

mediante una columna de Ni-agarosa, donde se observó una banda de masa

molecular aparente de 55 kDa, como la esperada para la subunidad grande de la

[NiFe]-hidrogenasa.

ix

ABSTRACT

Biohydrogen production is an alternative energy source because its use offers several

advantages as an energy carrier. However, the low yield in production is currently a

limitation. One way of obtaining this energy is through the use of living organisms. In

this sense have identified numerous microorganisms such as E. coli and Clostridium

spp, which through the enzymatic activity of proteins such as the enzyme hydrogenase

have the capacity to produce hydrogen. We have identified three types of these

enzymes, which are classified according to the metal in the active site they own,

[FeFe]-hydrogenase, [NiFe]-hydrogenase and [Fe]-hydrogenase metal free. The

catalytic function of these enzymes is the formation of H2 from protons or proton

oxidation. Has been reported in a strain of E. coli top ten (Invitrogen) yielding 2.014 H2/

mol of glucose. As expected higher yields in production of hydrogen in the

overexpression of the enzyme in strains of E. coli. In this paper, we studied the gene

hycE of the large subunit of [NiFe]-hydrogenase because of their involvement in the

insertion of nickel into the active site of the enzyme. The study of the in silico predicted

amino acid sequence which encodes for this gene, identified structural domains that

could allow for future mutagenesis studies of this gene in order to extend their

biotechnological applications for hydrogen production on a large scale in E. coli.

Therefore, the corresponding oligonucleotides were synthesized according to the

nucleotide sequence reported in GenBank. Was amplified by PCR an approximately

1700 bp fragment with oligonucleotides specific for this gene. The PCR fragment was

cloned into an expression vector with a histidine tag, which was used for transformation

of cells of E. coli BL21. Subsequently extraction was performed for total protein, which

was analyzed by acrylamide gel electrophoresis with Coomassie blue staining was

performed and the extract by purification of a Ni-agarose column, where there was a

band of apparent molecular mass of 55 kDa, as expected for the large subunit of

[NiFe]-hydrogenase.

1

INTRODUCCIÓN

El uso generalizado de combustibles fósiles ha derivado en numerosos beneficios a

las sociedades industrializadas, en consecuencia las necesidades energéticas

mundiales han crecido exponencialmente en los últimos años. Esto ha propiciado que

las reservas actuales de combustibles fósiles se agoten vertiginosamente, lo cual ha

conducido a la búsqueda de nuevas fuentes energéticas renovables.

El uso excesivo de combustibles fósiles es una de las principales causas del

calentamiento global y la lluvia ácida, que afectan el clima del planeta, la vegetación y

los ecosistemas acuáticos. En este contexto el uso de energías limpias están en

proceso de investigación y desarrollo en diversos países generando importantes

avances en los procesos por los cuales se obtienen [1].

Los sistemas que utilizan energías producidas a partir de biomasa son ejemplos

típicos de sistemas de energía renovable. La biomasa, en los países en desarrollo,

proviene de la leña, residuos animales, residuos agrícolas y se usa principalmente

para actividades que son esenciales para la supervivencia [2].

Uno de los pocos combustibles limpios que se pueden obtener de la biomasa es el

hidrogeno (H2), debido a que su único subproducto de combustión es el agua.

Además, puede ser producido a partir de materias primas renovables tales como

residuos orgánicos de desechos industriales, entre otros. Cuando éste se genera a

partir de un sistema biológico se denomina biohidrogeno. Por lo tanto, áreas dentro de

la biotecnología se encuentran orientadas a los bioenergéticos.

Las enzimas hidrogenasas (H2asa) se han identificado en diferentes Phylum tales

como Arqueas y bacterias como Escherichia coli, por mencionar algunos. Esta

proteína tiene un papel muy importante en el metabolismo energético, ya que cataliza

la reacción reversible entre el hidrogeno (H2) y el protón. Teniendo como paso

limitante para la reacción su inactivación en presencia de oxigeno en sistemas

aerobios [3].

En los últimos años, se han desarrollado investigaciones para producir análogos

sintéticos de estas enzimas H2asa. Una de las razones principales es que las H2asas

2

pueden catalizar la reducción de electrones del H2, lo cual conduce a la generación de

energía limpia.

Las hidrogenasas son principalmente metaloenzimas que están divididas en tres

clases dependiendo del metal que contienen en su sitio catalitico, [FeFe]-hidrogenasa,

[NiFe]-hidrogenasa e [Fe]-hidrogenasa libre de metales [4].

[FeFe] y [NiFe]-hidrogenasas son las enzimas mas estudiadas a la fecha, ya que la

mayoría de las hidrogenasas en microorganismos pertenecen a una de estas dos

clases de enzimas, excepto las hidrogenasas libres de metales que fueron

descubiertas en algunos metanógenos. La mayoría de las [FeFe]-hidrogenasas

monoméricas están más involucrados en la evolución de H2, y tienen alta sensibilidad

al oxígeno (O2) y monóxido de carbono (CO) irreversiblemente inactivadas después

de la exposición al O2 [4,5].

La enzima [NiFe]-hidrogenasa está compuesta por dos subunidades y está

involucrada en la oxidación de H2, también cataliza reacciones reversibles [6,7]. Estas

enzimas son menos activas que las [FeFe]-hidrogenasas entre 10 ~ 100 veces, pero

mucho más tolerantes al O2 y CO además de ser reversible. Esta propiedad es una

ventaja significativa para la aplicación biotecnológica de hidrogenasas en la

producción de biohidrógeno, ya que no es necesario proteger el proceso de la

producción de O2 [5]

Considerando la complejidad de las hidrogenasas en cuanto a su función,

localización, estructura y sitios activos, es de esperarse que sean necesarios muchos

genes para la biosíntesis de estas enzimas. En el caso de la [Fe]-hidrogenasa no se

han identificados genes putativos. Al contrario, la frecuente agrupación genómica de

los genes implicados en síntesis y maduración de [NiFe]-hidrogenasa ha facilitado su

identificación [4].

El uso de técnicas de ingeniería genética permitirán que se sobreexprese la [NiFe]-

hidrogenasa en una cepa de E. coli top ten el cual ha sido reportado un rendimiento

de 2.014 mol de H2/mol de glucosa [8].

3

La sobreexpresión de esta enzima en un sistema biológico para aplicaciones

biotecnológicas es un paso importante para diseñar un sistema continuo de obtención

de hidrogeno.

Dado que la subunidad grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa participa en la

incorporación del níquel a la molécula de esta enzimas, el presente trabajo se enfocó

en el estudio del gen hycE que codifica para esta proteína, así como en el estudio de

la estructura de la enzima [NiFe]-hidrogenasa. Se analizó in sílico la secuencia de

aminoácidos de la enzima y se identificaron dominios estructurales que podrían

permitir futuros estudios de mutagénesis de este gen con el fin de ampliar sus

aplicaciones biotecnológicas para la producción de hidrógeno a gran escala en E. coli.

Además, se clonó un fragmento de 1700 pb usando oligos específicos para la

amplificación de este gen, el cual se clonó en un vector de expresión para la

transformación de E. coli BL21. Se analizaron la proteínas de las clonas

transformadas y se observó una banda de masa molecular aparente de 55 kDa, como

la esperada para nuestra proteína de interés.

4

1 CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES

1.1 El hidrógeno como vector energético

El hidrógeno (H2) es el biocombustible más prometedor debido a que su uso deriva en

varios beneficios tanto socio-económicos como ambientales. Contiene la mayor

cantidad de energía por unidad de peso que cualquier otro combustible conocido (142

KJ / g, o 61.000 Kcal / Kg) y se puede transportar para uso doméstico o consumo

industrial a través de medios convencionales aunque también el almacenamiento y

transporte es un tema de interés por los diversos materiales propuestos

recientemente para brindar seguridad.

El H2 es ahora universalmente aceptado como energía ambientalmente segura,

renovable y una alternativa ideal para sustituir los combustibles fósiles, ya que no

contribuye al efecto invernadero. Puede ser utilizado para combustión directa en un

motor de combustión interna o como combustible para una celda de combustible [9].

La demanda de hidrógeno no es exclusiva como fuente de energía ya que es

ampliamente utilizado en la industria química, de alimentos y en la producción de

derivados electrónicos, entre otros. Esto genera una creciente necesidad de producir

hidrógeno de una manera sostenible y económicamente viable. Se ha reportado una

demanda de más de 50 millones de toneladas anuales, con un crecimiento de más del

10 % anual [9].

La industria de los fertilizantes y el petróleo son los principales usuarios de H2 con el

50% y 37% respectivamente. Las ventas de H2 han aumentado en un 6% anualmente

en los últimos cinco años ya que está estrechamente relacionado con el aumento del

uso de H2 en las refinerías [9].

5

1.2 Métodos de producción de hidrógeno

Los métodos que se usan actualmente no son lo suficientemente eficientes y

económicamente viables para suplir las necesidades mundiales de hidrógeno. La

obtención convencional se caracteriza por altos costos energéticos del proceso; entre

estos métodos están: la oxidación parcial no catalítica de combustibles, vapor

reformante de metano, procesos de membrana, oxidación selectiva de metano,

deshidrogenación oxidativa, procesos electroquímicos y petroquímicos [10].

Sin embargo, los métodos antes mencionados no son los únicos; en los últimos años

se ha planteado una novedosa forma de obtener hidrógeno, la cual es conocida como

“tecnología verde” y no es más que su producción a partir de sistemas biológicos.

Esto se realiza a partir de la conversión de compuestos por diversas especies

celulares. Esta biotecnología incluye: biofotólisis directa, biofotólisis indirecta, reacción

de intercambio gaseoso (water-shift-reaction), fermentación oscura y foto-

fermentación [11, 12].

En la actualidad el hidrógeno se produce en un 40% del gas natural, el 30% de los

aceites pesados y nafta, un 18% de carbón, y el 4% por electrólisis (Figura 1) [13].

Figura 1. Métodos de producción de hidrogeno para la industria [13].

Producción de Hidrogeno

Gas natural

Aceites pesados y nafta

Carbón

Electrólisis

Otros

6

1.3 Producción biológica de hidrogeno

La producción de biohidrógeno se lleva a cabo a partir de biomasa y ha sido

ampliamente estudiada en años recientes puesto que ha generado gran atención

debido a sus características como fuente de energía limpia y sustentable para el

futuro [14].

Los microorganismos producen hidrógeno principalmente por dos rutas: fotosíntesis y

fermentación. La fotosíntesis es un proceso dependiente de la luz, incluyendo

biofotólisis directa, biofotólisis indirecta y fotofermentación. Mientras que la

fermentación anaerobia es un proceso que no depende de la luz por lo que también

se le conoce como fermentación oscura. La fermentación anaerobia consiste en la

descomposición de compuestos orgánicos bajo condiciones anóxicas (el oxígeno no

se utiliza como aceptor de electrones). Los sustratos son degradados por oxidación

que provee la energía necesaria para el crecimiento de la biomasa [15, 16].

Los carbohidratos son las fuentes de carbono preferidas para los procesos de

fermentación. Las ecuaciones que representan este método se muestran a

continuación [17]:

C6H12O6 + 2H2O 2CH3COOH + 2CO2 + 4H2

C6H12O6 CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2

La producción fermentativa de hidrógeno es realizada por microorganismos

fermentativos como: los anaerobios estrictos; cepas de Clostridium [18]; termófilos

[19], anaerobios facultativos; cepas de Enterobacterias [20, 21], Escherichia coli [22] y

especies de Citrobacterias [23] o cultivos mixtos [24].

Los procesos dependientes de la luz o bien métodos fotosintéticos son aquellos que

involucran la transformación de la energía solar en hidrógeno debido a la actividad

metabólica de la bacteria fotosintética o microalgas, pero en la práctica son difíciles de

aplicar debido a la baja eficiencia de utilización de la luz y las dificultades en el diseño

de los reactores para producción de hidrógeno [25].

La fermentación anaerobia utiliza una variedad de fuentes de carbono como

compuestos orgánicos, desperdicios de bajo costo o sustratos celulósicos o

7

celobiosos [26, 27, 28, 29, 30, 31]. Los rendimientos de producción de hidrógeno son

usualmente más altos en procesos fotosintéticos sin embargo el oxígeno que

evoluciona durante la fotosíntesis inhibe la enzima hidrogenasa responsable de la

producción de hidrógeno [32]. Los microorganismos fermentativos en cambio, no

presentan problemas con el oxígeno ya que la mayoría de los procesos son

anaerobios (cualquier oxígeno residual es consumido al inicio).

Tabla 1. Ventajas y desventajas de los principales métodos de producción de hidrogeno por

procesos biológicos [32].

Proceso Microorganismo Ventajas Desventajas

Biofotólisis directa Alga verde Producción de H2

directo de agua y luz solar.

Requiere grandes cantidades de luz.

El oxigeno puede ser peligroso para el sistema.

Baja eficiencia fotoquímica.

Biofotólisis indirecta

Cianobacterias Producción de H2 a partir de agua.

Habilidad de fijar nitrógeno atmosférico.

Las hidrogenasas consumidoras de H2 deben ser removidas para detener la degradación.

El O2 tiene un efecto inhibitorio en la nitrogenasa.

Fotofermentación Bacteria fotosintética Puede utilizar diferentes materiales de desecho.

La eficiencia de conversión es baja 1-5 %

El O2 es un fuerte inhibidor de la nitrogenasa.

Fermentación anaerobia

Bacteria fermentativa Una gran variedad de fuentes de carbono pueden ser el sustrato.

Produce metabolitos como ácido butírico, láctico y acético como subproductos.

Es un proceso anaerobio no tiene limitaciones por O2.

Bajos rendimientos en la producción.

A mayor rendimiento la fermentación de hidrogeno es termodinámicamente desfavorable.

La mezcla de gases contiene CO2 que debe separarse.

8

Por lo tanto, la producción de hidrógeno fermentativo tiene más ventajas desde la

aplicación o uso de la actividad de la enzima hidrogenasas que la producción de

hidrógeno fotosintético y tiene un mayor potencial para aplicaciones prácticas [33]. La

Tabla 1 presenta las principales ventajas y desventajas de los métodos biológicos de

producción de hidrógeno.

1.4 Las enzimas hidrogenasas

Las hidrogenasas fueron descritas por Stephenson y Stickland en 1931 como enzimas

bacterianas que catalizan la oxidación reversible del hidrógeno según la siguiente

reacción: 2H + 2e- → H2 [34].

Son metaloenzimas que se clasifican según el metal que contenga en su sitio activo,

[NiFe]-hidrogenasa, [FeFe]- hidroegnasa y [Fe]-hidroegnasa [35].

El anaerobio facultativo Escherichia coli posee tres isoenzimas [NiFe]-hidrogenasas.

Dos de estas isoenzimas (hidrogenasas 1 y 2) están unidos a la membrana. La

hidrogenasa 1 es sintetizada bajo condiciones fermentativas, cataliza la oxidación de

hidrógeno y se ha sugerido que está involucrada en el reciclaje de hidrogeno. La

hidrogenasa 2 se sintetiza en altos niveles cuando las células crecen en glicerol y

fumarato y es responsable de generar energía. La hidrogenasa 3 es parte del

complejo formato hidrogenilasa que cataliza la conversión de formato en dióxido de

carbono e hidrogeno. Los genes que codifican a la hidrogenasa 3 forman parte del

operón hyc ubicado en la región del cromosoma 58/59-min de E. coli. La

secuenciación de este operón reveló que el gen hycE codifica a la subunidad grande

de la hidrogenasa 3 [36, 37].

La actividad de la hidrogenasa se encontró posteriormente en numerosos procariotas

aerobios y anaerobios. La función fisiológica de la hidrogenasa en la mayoría de los

procariotas es la oxidación del gas hidrógeno y reducción de aceptores de electrones

[38, 39].

9

Otra función es producir hidrógeno que permita mantener el pH intracelular y el

potencial redox en los niveles adecuados. Aunque las hidrogenasas catalizan una

reacción simple, lo hacen en muchos contextos metabólicos y por lo tanto asumen

diversas funciones [38].

En las bacterias fermentativas del tipo Clostridium, la reducción de protones en

dihidrógeno por hidrogenasas es un medio para la eliminación del exceso de

equivalentes reductores. Varios microorganismos pueden utilizar H2 como una fuente

de electrones ya sea aeróbico o anaeróbicamente (por ejemplo, los metanógenos, los

reductores de sulfato y las bacterias fotosintéticas).

Los fijadores de nitrógeno por lo general contienen hidrogenasas que reciclan el H2

producido por la nitrogenasa. Estas funciones son a menudo asociadas con diferentes

localizaciones celulares como el desprendimiento de hidrógeno principalmente en el

citosol, mientras que la absorción es generalmente periplásmatica o localizada en

membrana. Sin embargo, la hidrogenasa citoplasmática bidireccional también media

la captación de H2. Algunas bacterias contienen dos o más diferentes hidrogenasas,

localizadas en diferentes compartimentos celulares.

La multiplicidad de H2asas en tales organismos refleja la importancia de H2 en su

metabolismo y también asegura una rápida y eficiente respuesta a variaciones en las

necesidades energéticas de acuerdo a las cambiantes condiciones de crecimiento. El

hidrógeno transmembranal de ciclo redox conduce a la formación de gradientes de

protones transmembranales que se han sugerido como reductores de sulfato por

redundancia de hidrogenasas en algunos casos. [4]

En Proteobacteria, los genes de la hidrogenasa que codifican para la captación H2

están agrupados, ya sea en el cromosoma o en un megaplásmido. Los genes por lo

general son denominados alfabéticamente de acuerdo a su orden en el grupo (Tabla

2).

10

Tabla 2. Grupos homólogos del gen hidrogenasa que codifica para [NiFe]-hidrogenasas en

Proteobacteria [4]

B.

japonicum

R.

eutropha

E. coli

H2asa

1 2 3

T.roseopersicina

H2asa H2asa

1 2

Pseudomonas

hydrogenovora

Características o

función

hupS hoxK hyaA hybO hyaG hupS hydS hupS Subunidad pequeña

hupL hoxG hyaB hybC hycE hupL hydL hupL Subunidad grande

hupC hoxZ hyaC hybB hupC hupC Citocromo b

hypA hypA1 hybF hypA Inserción Ni,

maduración de

GTPasa, donador Ni

hypF hypF1 hypF Síntesis de CO y

CN

El gen estructural que codifica para la subunidad pequeña (28-35 kDa) ha sido

nombrado S o K (pequeño o klein) (por ejemplo, hupS, hoxK, hydS), mientras que la

subunidad grande (45-70 kDa), ha sido designado L o G (Grande o gross), por

ejemplo, hupL hoxG hydL,). Los genes estructurales (hup o hox), están involucrados

en la maduración de la enzima heterodimérica.

En la Figura 2 se describen los cuatro paso de la síntesis del sitio activo de la

hidrogensa 3 en E. coli, en el paso I el grupo preformado Fe(CN)2CO es transferido a

HypC. En el paso II, HypC libera el grupo Fe(CN)2CO al precursor de la subunidad

grande de hidrogenasa pre-HycE. En el paso III, el complejo HypA-HypB-SlyD libera

el niquel al precursor que contiene Fe. En el paso IV, la proteasa especifica HycI

romperá el C-terminal para completar el cierre del sitio activo [37].

11

Figura 2. Modelo propuesto de la síntesis del sitio activo de la [NiFe]-hidrogenasa 3 en E. coli.

En el paso tres se sugiere la incorporación de níquel al sitio activo [37].

Otro conjunto de proteínas, codificados por los genes hyp (“p” por pleiotrópicos), está

involucrado en la inserción de Ni, Fe, CO y CN en el sitio activo. Por último, estos

grupos de genes de la hidrogenasa también comprenden genes regulatorios que

controlan la expresión de los genes estructurales.

La secuenciación de la región 58-59 minutos de mutantes de E. coli reveló la

presencia de un operón con cinco genes llamados hypABCDE (para los genes de

hidrogenasas pleiotropicamente) Un sexto gen hyp, hypF fue encontrado en otro sitio

cromosomico [40].

La maduración de la [NiFe] hidrogenasa 3 de E. coli se inicia con la unión del sitio

activo de hierro y sus ligandos diatómicos. El procesamiento proteolítico (división

endoproteolítica del C-terminal) de la subunidad grande se logra sólo después de la

correcta incorporación de Fe (CO) (CN) 2 y Ni. Se ha demostrado que tal

Paso I Paso II Paso VI

Paso III

12

procesamiento proteolítico no ocurren en un mutante de E. coli que tiene una deleción

en el hypF gen [41]. A partir de la observación de que la proteína HypF contiene una

secuencia característica motivo de la o-carbamoiltransferasas. El grupo de Böck ha

demostrado recientemente que el carbanil fosfato se requiere para la síntesis de la

centro activo de [NiFe]-hidrogenasas y sugirió que es el fuente de los ligandos CO y

CN al átomo de Fe. No se conoce si la inserción de los ligandos diatómicos tiene lugar

en la subunidad grande o primero en alguna proteína y posteriormente a la subunidad

grande [42].

1.5 El biohidrógeno

La producción biológica de hidrógeno utiliza microorganismos para convertir la

biomasa o la energía solar en hidrógeno bajo condiciones suaves de presión y

temperatura [4].

La producción de hidrógeno por microalgas verdes es un proceso dependiente de luz

[5] en el que las hidrogenasas, que son las enzimas que catalizan la reacción de

reducción de protones (H+) a H2 [6], están acopladas vía ferredoxina a la cadena de

transporte de electrones fotosintética. Las cianobacterias también son capaces de

producir hidrógeno por acción de enzimas hidrogenasas, pero en un proceso

acoplado a la fijación de nitrógeno [7]. Otras bacterias liberan hidrógeno durante

procesos fermentativos de desechos orgánicos. Finalmente, basados en los

complejos procesos metabólicos mencionados anteriormente, se han desarrollado

rutas sintéticas in vitro para la producción de H2. En estos sistemas multienzimáticos,

la hidrogenasa tiene una función primordial en el proceso. Esta propuesta resulta

prometedora en términos de control y eficiencia sobre los sistemas microbiológicos,

pero rescatando las ventajas de la biocatálisis [8]

1.6 Distribución de las hidrogenasas

La disponibilidad de numerosas secuencias de hidrogenasas de una amplia gama de

organismos genera nuevas oportunidades para el análisis de la distribución de estas

enzimas en todos los ámbitos de la vida. Es de particular interés la presentación de un

13

creciente número de secuencias completo de genomas, que permiten un inventario

completo de genes de codificación de H2asa en un número considerable de los

organismos [4].

Los organismos caracterizados incluyen: las algas verdes siendo los únicos

organismos eucariotas para el cual la actividad de la hidrogenasa ha sido bien

establecida. Esta hidrogenasa puede considerarse una enzima reversible o de doble

uso in vivo, ya que las algas verdes pueden producir o consumir hidrógeno después

de su adaptación anaeróbica. Dos hidrogenasas de algas verdes han sido purificadas

a homogeneidad. La hidrogenasa de Chlamydomonas reinhardtii parece consistir en

una subunidad individual con un peso molecular de 48 kDa, cuya secuencia N-

terminal no muestra homología significante a cualquier otra hidrogenasa [43]; La

hidrogenasa de Scenedesmus obliquus consta de dos subunidades con peso

molecular de 55 kDa y 36 kDa respectivamente [44]. Esta enzima es extremadamente

sensible al oxígeno. Chlorococcum littorale es una nueva especie de alga verde

marina unicelular que pueden crecer rápidamente a muy altas concentraciones de

dióxido de carbono [45, 46]. La producción de hidrógeno por esta alga se ha

observado asociada con el fotosistema II [47] y la descomposición de carbohidratos

endógenos bajo condiciones anaeróbicas en oscuridad [48].

Algunos microorganismos, como la β-proteobacteria Ralstonia eutropha, que crecen

en ambientes aerobios poseen [NiFe]-hidrogenasas tolerantes al oxígeno que son

capaces de metabolizar hidrógeno en condiciones aerobias. Las hidrogenasas

insensibles a oxígeno son de interés para fines biotecnológicos, por ejemplo, como

catalizadores en celdas de combustible o en la producción biológica de hidrógeno [49,

50].

La - proteobacterium Ralstonia eutropha alberga tres diferentes [NiFe] hidrogenasas

tolerantes a oxígeno que permiten al organismo el uso de hidrógeno como la única

fuente de energía en presencia de oxígeno. La hidrogenasa unida a membrana (MBH)

orientada periplasmáticamente está conectada a la cadena respiratoria vía citocromo

tipo-. La hidrogenasa soluble (SH) es una enzima citoplasmática que reduce

directamente NAD+ a expensas del hidrógeno. La tercera deshidrogenasa

(hidrogenasa regulatoria sensible a H2 [RH]) de R. eutropha no está involucrada en la

conservación de energía, sino que actúa como un sensor de hidrógeno en una H2-

14

cascada de señales dependiente de activación de transcripción de genes hidrogenasa

[51].

La expresión en bacterias recombinantes BL21 de la [Ni Fe] hidrogenasa 1 produce

12.5 ml H2/(h. L) en 400 ml de glucosa contenido en un medio de cultivo en

condiciones microaerobias, agregando formato para activar el complejo FHL [62].

También la enzima [Fe Fe] hidrogenasa se ha investigado debido a sus altos niveles

en la producción de hidrógeno, con la desventaja que es en procesos anaerobios,

como catalizador para aplicaciones sintéticas por expresión heteróloga y su

inmovilización sobre electrodos en celdas electroquímicas [63].

1.7 Biocatálisis de las hidrogenasas

Como se ha mencionado antes las enzimas hidrogenasas se clasifican de acuerdo a

la composición del sitio activo como [NiFe], [FeFe], y [Fe] ahora denominada libre de

metales. [35].

Las estructuras disponibles para [FeFe] y [NiFe]- hidrogenasa, (Figura 3) han

mostrado una compleja arquitectura del sitio activo del hidrógeno, además de los

metales, unidos a la cisteína los ligandos diatómicos tales como el CO y CN- [3].

Figura 3. Estructuras de los sitios activos, (a) [NiFe] hidrogenasa, (b)[FeFe] hidrogenasa. X:

ligando indeterminado productor de oxigeno, Y: CH2 o NH [3]

15

Las hidrogenasas suelen ser sensibles a la inhibición por oxígeno. Particularmente la

[FeFe]-hidrogenasa es irreversiblemente inactivada por éste, mientras que no afecta

la integridad estructural de la [NiFe]-hidrogenasa, sin embargo de forma reversible

inactiva su función catalítica. Se ha demostrado por diferentes técnicas

espectroscópicas que el oxígeno se une entre el níquel y el hierro [52]. En la Figura 4

se muestra la estructura tridimensional de los metales presentes en la enzima.

Figura 4. Estructura atómica de los sitios catalíticos de [FeFe]-hidrogenasa y [NiFe]-

hidrogenasa. (A) representación del átomo de la [FeFe]-hidrogenasa H-cluster, 2Fe-centro y

(B) [NiFe]-hidrogenasa. Colores para identificar posiciones: Fe (marrón), Ni (verde), C (azul), S

(amarillo), N (azul), O (rojo) y H (blanco) [53].

De acuerdo con el modelo actual propuesto por Fritsch et al. [54] (Figura 5) estos

cofactores funcionan como un interruptor electrónico, según la naturaleza de la

molécula de gas que se acerca al sitio activo (Figura 6).

16

Figura 5. Estructura de la hidrogenasa unida a membrana de R. eutropha. La cinta azul

muestra la subunidad grande y la verde la subunidad pequeña. Las estructuras de esferas y

barras de abajo representan el arreglo espacial de los cofactores [54].

Sirven como aceptor de electrones en la oxidación H2 y como un donador de

electrones en el ataque del O2 en el sitio activo. Esta doble función es apoyada por la

capacidad de un nuevo grupo de hierro-sulfuro para adoptar de tres estados redox a

potenciales redox fisiológicos.

17

Figura 6. Cofactores metálicos unidos a membrana. La malla azul representa la densidad de

electrones en estudios de cristalografía de rayos X. a) densidad de electrones en el centro

activo. B) cluster proximal coordinado por 6 cisteinas. C) cluster medio coordinado por tres

residuos de cisteína. D) cluster distal coordinado por tres cisteínas y una histidina [54].

18

Figura 7. Arquitectura del grupo proximal [4Fe-3S]. a) Modelo esquemático y estructural del

grupo y sus ligandos en la subunidad pequeña de hidrogenasa unida a membrana. B) grupo

proximal de [Ni Fe] hidroegenasa de D. vulgaris sensible a oxigeno [54].

La segunda función estructural es una amplia red de cavidades de agua que pueden

actuar como canales para facilitar la extracción de agua producida en el sitio activo

[NiFe]. Estos descubrimientos tienen un impacto en el diseño de catalizadores

biológicos y químicos de conversión H2 que son capaces de producir H2 en presencia

de aire, Figura 7.

19

JUSTIFICACIÓN

Debido a la crisis energética de los hidrocarburos y los problemas que estos

ocasionan al medio ambiente, se requieren formas de energía cada vez más limpias y

que sean de fuentes renovables. El hidrógeno se ha propuesto como una fuente

viable y sostenible de energía que requiere ser estudiada. La actividad de enzimas

tales como la [FeFe] y [NiFe]-hidrogenasas presente en numerosos microorganismos,

permite que se empleen manipulaciones genéticas para estudiar la función de genes

involucrados en la producción de hidrógeno, como el gen hycE, el cual está

involucrado en la inserción del níquel en la enzima [NiFe]-hidrogenasa. El estudio de

este gen proporcionará información importante que pudiera utilizarse posteriomente

para incrementar la producción de biohidrógeno en microorganismos como E. coli.

20

OBJETIVO GENERAL

Estudiar al gen hycE y la estructura de la enzima que codifica a la enzima [NiFe]-

hidrogenasa en Escherichia coli.

OBJETIVOS PARTICULARES

Realizar el análisis in silico de secuencias de la enzima [NiFe]-hidrogenasa en

diferentes especies bacterianas.

Analizar in silico la estructura tridimensional de la enzima [NiFe]-hidrogenasa

de Escherichia coli.

Clonar el gen hycE de la [NiFe]-hidrogenasa en un plásmido de expresión con

etiqueta de histidina.

Evaluar el perfil de proteínas totales y extracto purificado de E. coli cepa BL21

conteniendo el gen hycE.

21

HIPÓTESIS

El gen de la enzima hidrogenasa hycE se encuentra presente en las bacterias

productoras de hidrógeno reportadas hasta la fecha. Dado que se ha reportado que la

bacteria Escherichia coli es capaz de producir hidrógeno, debe ser posible el estudio

in silico de estos genes, así como el estudio estructural de la proteína correspondiente

a la hidrogenasa en la cepa BL21 de E. coli.

22

2 CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Diseño experimental

Para el desarrollo experimental del trabajo se diseñó el siguiente diagrama general.

23

En la primera parte del trabajo se realizó el análisis in silico de las secuencias de

nucleótidos que codifican para la [NiFe]-hidrogenasa en microorganismos en

microorganismos reportados como productores de hidrógeno, tanto de bacterias

metanogénicas, acetogénicas y reductoras de nitrato y sulfato, arqueas anaerobias,

protozoarios, hongos y algunas algas verdes que contienen a la enzima hidrogenasa.

Por otra parte, se realizó un análisis in silico de la estructura de la proteína

correspondiente a la [NiFe]-hidrogenasa con base en la estructura tridimensional de la

proteína obtenida por cristalografía de rayos X reportados por Fritsch et al [54].

Con base al alineamiento de las secuencias de nucleótidos de genes que codifican

para la [NiFe]-hidrogenasa en bacterias se diseñaron oligonucleótidos para amplificar

un fragmento de ADN que corresponde al gen hycE de la enzima [NiFe]-

hidrogenasa.

Se utilizaron los oligonucleótidos antes mencionados y ADN genómico como plantilla

para las reacciones de PCR y se obtuvo un amplicón de aproximadamente 1700 pb.

Este se clonó primero en un vector de clonación TOPO y posteriormente fue

subclonado en un plásmido de expresión con etiqueta de histidina pET 15b para

obtener el plásmido pET15b-hidrogenasa:6 his-tag.

Se utilizó el plásmido antes mencionado para la transformación de células bacterianas

de E. coli cepa BL21 y se seleccionaron clonas que crecieron en medio de selección

con antibiótico.

Se realizó una extracción de proteínas totales y se observó su perfil mediante una

electroforesis y tinción con azul de Coomasie. Finalmente, el extracto proteico se pasó

a través de una columna de Ni-agarosa y se observó el perfil de proteínas eluidas

mediante una electroforesis y una tinción con plata.

24

2.2 Alineamiento de secuencias de aminoácidos.

Las secuencias de aminoácidos de las enzimas [NiFe]-hidrogenasa reportadas en

diversos microorganismos fueron obtenidos de la base de batos Genbank. En la Tabla

3 se enlistan los microorganismos de los cuales fueron obtenidas estas secuencias

asi como sus números de accesión correspondientes. Estas fueron alineadas usando

el programa ClustalW2 (www.ebi.ac.uk). Se seleccionaron aquellas secuencias

reportadas en la literatura [60].

Tabla 3. Números de accesión de las secuencias de aminoácidos de las enzimas [NiFe]-

hidrogenasa seleccionadas para este estudio.

Microorganismo No. Accesión [NiFe]-hidrogenasa

Salmonella enterica NP461770

Citrobacter rodentium YP003366594

Escherichia coli K12 CAA35550

Klebsiella pneumoniae YP002920914

Enterobacter radicincitans CBB97125

2.3 Análisis de estructura de la enzima [NiFe]-hidrogenasa

Para realizar este análisis se utilizó el programa Cn3D-4.1, el cual es una

herramienta para visualizar la secuencia y estructura de una proteína determinada

[61]. Este programa también nos da las opciones de resaltar con color las regiones

25

de interés proporcionando mayor información de la enzima reportada de [NiFe]-

hidrogenasa por la técnica de cristalografía de rayos X. Se utilizó la secuencia de

aminoácidos de la subunidad grande hycE de la enzima y se visualizó en la estructura

de la enzima de E. coli No. Accesión CAA35550.1 de la secuencia de aminoácidos:

MSEEKLGQHYLAALNEAFPGVVLDHAWQTKDQLTVTVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVLFG

NDERKLNGHYAVYYVLSMEKGTKCWITVRVEVDANKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRDMYG

LIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNNVVPIGPL

HVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRVCGICGFAHST

AYTTSVENAMGIQVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSGFMQFFRVRETSMK

MAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKDDMIQTRQLAQQMRREVQELVDVLLSTPNMEQRTVGIG

RLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVHSEQGCDVISRLKVRINEVYT

ALNMIDYGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGDDIHWSMTGDNQKLYRWRCRAAT

YANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTVVDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKN

S PLK

2.4 Diseño de oligonucleótidos

Con base a los datos analizados en cuanto a la secuencia y estructura de la enzima

se decidió diseñar oligonucleótidos para amplificar el fragmento que corresponde al

gen hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa, ya que se observó que

presenta varias ventajas para posteriores experimentos en las cuales se podrían

mutar aminoácidos específicos que están relacionados a la incorporación de Ni o Fe a

la enzima, y por su posición en la parte externa de la molécula es más probable que

sean llevados a cabo. Para esto se sintetizaron tres pares de oligonucleótidos de

acuerdo a la secuencia con número de accesión X17506 reportado para E. coli K12

como se ve en la Figura 8, con las letras marcadas con color rojo se indican la región

que se tomó de la parte inicial y la final para hacer la secuencia sentido (Forward) y

antisentido (Reverse).

26

Figura 8. Secuencia de nucleótidos del ge hycE de la enzima [NiFe] hidrogenasa E. coli K12.

En color rojo se indican las secuencias de los oligonucleotidos Forward (1- 20) y Reverse

(1661-1681).

Se seleccionó la secuencia que corresponde al gen hycE del operón hyc

A,B,C,D,E,FG,H,I, de 1700 pb aproximadamente, se sintetizaron los oligonucleótidos

5´-3´ y 3´-5´(IDT, Integrated DNA technologies) que corresponden a la subunidad

grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa como se muestran en la Tabla 4. En color

rojo se marcan las secuencias de las enzimas de restricción Nde I (CATATG) y Bam

HI (GGATCC) mas dos aminoácidos que se agregaron a la secuencia del gen en

H1°. En el oligo H2° son solo la secuencia del gen. En el oligo H3° se muestra en

color verde estas mismas secuencias más las que corresponden a las enzimas de

restricción pero sin el par de aminoácidos.

27

Tabla 4. Secuencias de oligonucleótidos sintetizados

Nombre Secuencia de nucleótidos

Forward H1o 5´-AACATATG TCTGAAG AAAAATTAGG-3´

Reverse H1o 3´-TTATTTCAGCGGCGAGTTT GGATCCAA-5´

Forward H2o 5´-ATGTCTGAAG AAAAATTAGG-3´

Reverse H2o 3´-TTATTTCAGC GGCGAGTTT-5´

Forward H3o 5´-CATATG ATGTCTGAAG AAAAATTAGG-3´

Reverse H3o 3´-TTATTTCAGC GGCGAGTTT GGATCC-5´

2.5 Material biológico

2.5.1 Cepas de Escherichia coli.

La bacteria seleccionada para la amplificación del gen de la enzima [NiFe]-

hidrogenasa fue E. coli debido a su fácil manipulación en el laboratorio. En la Tabla 5

se describen las cepas de que se utilizaron en los experimentos de PCR.

28

Tabla 5. Genotipos de cepas de E. coli utilizadas en este estudio.

Cepa Genotipo

BL21 E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(λS)

DH5α endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG

Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK

+), λ

JM109 endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14-

[F' traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] hsdR17(rK-mK

+)

XL1-Blue endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+

lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK

+)

TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG

recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ

2.6 Extracción de ADN genómico.

Se obtuvo ADN genómico de E. coli de cinco diferentes cepas comerciales: top 10, JM

109, BL21, DH5, Xl-blue, mediante el método CTAB/ fenol /cloroformo [55]. Este

método consistió en resuspender un asa de colonias de una placa de agar en 500 µl

de agua hasta una perfecta homogeneización, se agregaron 30 µl de SDS al 10 %,

se mezcló bien y se adicionaron 3 µl de proteinasa K (20 mg/ml) se incubó 60 minutos

a 37 ºC, se añadieron 100 µl de NaCl 5 M, se mezcló y se añadieron 80 µl de

CTAB/NaCl, se mezcló volteando el tubo e incubó durante 10 minutos a 65 ºC. Se

añadió un volumen de la solución fenol/cloroformo: alcohol isoamilico (25/24:1), se

mezcló volteando el tubo y se centrifugó 5 minutos a 8,000 rpm. Se extrajo la fase

superior procurando no tocar la interfase. Se añadió RNAsa a una concentración final

de 50 µg/ml y se incubó durante 30minutos a 37 ºC. Se extrajo con igual volumen de

cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Se centrifugó y se extrajo la fase superior.

29

Tomando en cuenta el volumen que se recuperó, se precipitó con 0.1 volumen de

acetato de sodio y 2 volúmenes de etanol frío, a -20º C toda la noche ó a -80º C por 1

hora. Se centrifugó a 12,000 rpm durante 20 minutos. Se retiró el etanol y se secó la

pastilla a 37 ºC. Se resuspendió en 50 µl de agua y se almacenó a -20 ºC.

2.7 Reacción de PCR con oligos diseñados para amplificar al gen que codifica

para la [NiFe]-hidrogenasa.

Para obtener el fragmento de las secuencias sintetizadas se utilizó la técnica de PCR

(reacción en cadena de la polimerasa) con la cual se amplificaron las secuencias de

ADN del gen hycE de [NiFe]-hidrogenasa. La cual se basa en hibridar los oligos

diseñados a partir mediante la actividad de la enzima Taq polimerasa. Para amplificar

un fragmento del gen de esta enzima se utilizaron los pares de oligos denominados

hidrogenasa H1º, H2º y H3º (Tabla 4). De estos oligos el primer par contiene

nucleótidos adicionales al inicio de la secuencia que codifican para un sitio de

restricción. También se realizaron amplificaciones con gradiente de temperatura para

buscar las condiciones ideales de hibridación de ADN.

Se hicieron mezclas de reacción para PCR de 25 µl conteniendo 2.5 ml de buffer 10X

para PCR (Invitrogen), 2 µl MgCl2 (50 mM), 1 µl de dNTPs (10 mM), 1 µl de cada uno

de los oligos Forward H y Reverse H (20 pm/l), 15.5 µl de agua destilada

desionizada esteril y 1 µl de la enzima Taq polimerasa (1U/pmol).

Se usó el siguiente programa de PCR : desnaturalización 95 oC por 30 s, seguido de

30 ciclos a 95 oC por 30 s, 55 oC por 30 s y 72 oC por 2 min; y una extensión final de

72 oC durante 15 min.

Los productos de PCR se verificaron en un gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro

de etidio.

.

30

Figura 9. Vector de clonación pCR 2.1 TOPO (Invitrogen).

2.8 Clonación del fragmento amplificado.

Los fragmentos amplificados fueron ligados mediante una reacción al vector TOPO

TA (Cloning kit for sequencing, Invitrogen) como se describe a continuación: 3 l

producto de PCR, 1 l del vector TOPO, 1 l solución de sales (1.2 M NaCl; 0.06 M

MgCl2), 1 l agua estéril, 6 l volumen final, 15 min a temperatura ambiente. El

fragmento ligado se almacenó a -20 oC hasta su uso.

En la Figura 9 se muestra el mapa del plásmido TOPO (Invitrogen) de 3,900 pb, el

cual se utilizó para clonar el fragmento generado con la PCR, en negrillas se observa

el sitio de inserción para el producto de PCR.

31

Se obtuvieron células químicamente competentes de las cepas comerciales Top ten y

DH5 por el método de cloruro de calcio. El cual consistió en crecer toda la noche

hasta saturación el cultivo bacteriano a 37 oC a 200 rpm. Se tomó un inoculo de 1ml y

se creció en 100 ml de medio LB por 2.5 horas a 37 oC a 200 rpm hasta alcanzar una

OD600 0.5 se centrifugó y se resuspendió la pastilla en CaCl2 100 mM, se centrifugó

nuevamente y se resuspendió en un volumen de 860 l de Cacl2 100 mM y 140 l de

glicerol, se hicieron alícuotas se congelaron en nitrógeno liquido y se guardaron a -

80oC hasta su uso.

La transformación se realizó por choque térmico utilizando células competentes Top

ten (Invitrogen) en un tubo conteniendo las células top ten se adicionó 3 µl de la

reacción de ligación la cual consiste en 3 µl de producto de PCR, 1 µl de sales (NaCl

1.2 M, MgCl2 0.06 M ), 1 µl vector TOPO (Invitrogen). Esta reacción se mantuvo 30

min en hielo, posteriormente se incubó a 42 oC durante 90 segundos en un baño

seco, inmediatamente se puso en hielo y se agregó 1 ml de medio LB. Enseguida se

incubó una hora a 37 oC en agitación a180 rpm. Por último, se sembraron en cajas

petri con medio de selección LB con ampicilina (100µg/ml) y se incubaron toda la

noche en una estufa a 37 oC.

2.9 Extracción de ADN plasmídico.

Se tomaron pequeñas muestras de las colonias de E. coli top ten transformadas que

crecieron en el medio con antibiótico, se inocularon en 3 ml de medio liquido LB con

ampicilina (100µg/ml) toda la noche a 37 oC a 180 rpm. Posteriormente se tomaron

1.5 ml de este cultivo en tubos ependorff de 1.5 ml y se centrifugaron a 4000 rpm

durante 10 min, se descartó el sobrenadante y la pastilla fue resuspendida en 100μl

del buffer 1(Tris HCl 50 mM pH 8.0; EDTA 10 mM; sacarosa 50 mM). Se añadió 100μl

del buffer 2 (NaOH 0.2N; SDS 1%), se mezcló por inversión e incubó a temperatura

ambiente durante 5 min.

Seguidamente se añadió 300μl del buffer 3 (Acetato de potasio 3.5 M, pH 5.5), se

mezcló por inversión e incubó en hielo durante 15 min. Luego se centrifugó a 10,000

rpm, durante 10 min. El sobrenadante que contiene el DNA plasmídico se transfirió a

un nuevo tubo para agregar 100 ml de fenol:cloroformo (1:1) y se mezcló por

32

inversión. Se centrifugó a 10,000 rpm por 5 min. La fase acousa se transfirió a un

nuevo tubo y se agregó 0.7 volumen de isopropanol e incubó a -20 oC 30 min

Posteriormente se centrifugar a 14 000 por 10 min, se eliminó el sobrenadante y se

procedió a lavar el precipitado con 1000 l de etanol al 70 %, se centrifugó y eliminó el

sobrenadante para posteriormente secar y resuspender la pastilla de ADN en agua

estéril. Para verificar la integridad del ADN plasmídico se realizó una electroforesis en

un gel de agarosa al 1%, a 70 volts durante 30 min.

2.10 Digestión de plásmidos

Para verificar la presencia del inserto en el plásmido, se realizó una reacción de

restricción enzimática utilizando 2 µl de ADN plasmídico de cada clona con el inserto

de hidrogenasa, 1 µl de la enzima Eco RI (Invitrogen), 3 l de buffer React 3 (10X)

(Invitrogen) y 24 µl de agua para un volumen final de 30 µl. Se incubó a 37 oC durante

2 horas.

2.11 Subclonación en un plásmido de expresión con una etiqueta de histidina

Se obtuvo un plásmido pET15b-hidrogenasa:6 his-tag, mediante la subclonación del

fragmento amplificado con los oligonucleótidos específicos para el gen hycE en un

vector de expresión que contiene una etiqueta de 6 histidinas llamado pET15b el cual

mide 5,708 pb.

La reacción de ligación consistió de: 4 l de buffer de ligación 5X, 1 l de enzima T4

ligasa 5 U/l (Invitrogen), 5 l de pET-15b, 5 l del inserto, 5 l agua, a temperatura

ambiente toda la noche.

La etiqueta de histidinas del vector pET 15b le confiere la ventaja de permitir la

purificación de la proteína por columna de afinidad en un solo paso, lo que permite

obtener la proteína de manera más rápida y más pura. El vector pET-15b contiene

un extremo N-terminal His • Tag ® secuencia seguida por un sitio de trombina y tres

sitios de clonación. Los sitios únicos se muestran en el mapa (Figura 9). La secuencia

33

está numerada por convención pBR322, por lo que la región de expresión T7 se

invierte en el mapa circular. La región de clonación/expresión de la cadena codificante

es transcrito por la T7 RNA polimerasa. Este plásmido contenido en la bacteria E. coli,

se purificó antes de su uso en la ligación de una maxi preparación para obtener el

ADN plasmídico por columna de intercambio aniónico y se hizo una reacción de

digestión con las enzimas NdeI y Bam HI a 37oC durante 4 horas. Para verificar la

ligación del inserto se realizaron reacciones de digestión y de PCR.

Figura 10. Mapa del vector de expresión pET-15b.

34

2.12 Análisis del perfil de expresión de proteínas totales y extracto purificado

de una clona de E. coli BL21 putativamente transformada con pET 15b-

hidrogenasa:6 his-tag.

El patrón de expresión de las proteínas se realizó con la extracción de proteínas

totales de las clonas que se seleccionaron como positivas las cuales fueron inducidas

con IPTG 0.5 mM durante 1 hora a temperatura ambiente, se tomaron 2 ml de un

cultivo bacteriano crecido a 37 oC toda la noche en medio de cultivo LB. La pastilla

obtenida se resuspendió en buffer de extracción (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl; 1 mM

EDTA; 10% glicerol; 1 mM mercaptoetanol; 200 mM fenilmetil sulfonil (PMSF) 1%

PVP) disuelta con el uso de un homogenizador durante 30 segundos en hielo tres

veces. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford. Las

proteínas totales fueron separadas en un gel desnaturalizante al 10% por

electroforesis. La electroforesis se realizó con base en el sistema discontinuo

propuesto por Laemmli. Se ensambló el equipo de electroforesis (ProteanR plus

Dodecell, de Bio-rad) según las instrucciones del fabricante. Previamente los cristales

se limpiaron con etanol al 70% (v/v) ya que se encuentran en contacto directo con el

gel y evitar manchas. Se preparó la solución para los geles de poliacrilamida SDS-

PAGE (10% con 0.75 mm de espesor), se vertió en los cristales, se agregó

isopropanol y se dejó polimerizar por 30 min. Se preparó en gel concentrador y se

corrió a 100 voltios durante 2 horas.

Posteriormente se realizó la tinción con solución de Coomasie 15 min en agitación

suave, se lava con agua el exceso de colorante y se destiñe con una solución de

acido acético 10% y metanol 45% en agitación suave y realizando cambios de

solución cada15 min. 2 o 3 veces. Por último se digitalizó el gel en un escáner.

La purificación de las proteínas de realizó por medio de una columna de níquel. Se

crecieron las clonas seleccionadas toda la noche en 3 ml de medio de cultivo LB mas

ampicilina (100 g/ml). Se inocularon 2 ml de este cultivo en 200 ml de medio LB mas

ampicilina hasta alcanzar una D.O. 0.6, se adicionó IPTG 0.5 mM durante 1 hora a 37

oC. Se centrifugó 5000 rpm 5 min, se descartó el medio y se resuspendió la pastilla

en 50 ml de buffer (100 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, EDTA 1

mM) y Lisozima 100 l (0.1g/ml) se sonicó 3 veces en un politrón 30 segundos cada

vez, se centrifugó nuevamente a 5000 rpm 5 min y se apartó 1 ml del sobrenadante

35

que son las proteínas totales (Input) y el resto se incubó con la suspensión agar-

níquel durante 1 hora a 4 oC, posteriormente se centrifugó a 1000 rpm 5 min, se

eliminó el sobrenadante (se apartó para correr como proteínas no incorporadas FT) se

lavó la pastilla con el buffer dos veces y se eluyeron las proteínas de las esferas de

níquel con 500 l del mismo buffer mas 250 mM de Imidazol por centrifugación a 1000

rpm durante 5 min 3 veces.

Posteriormente se cargaron las fracciones proteicas en un gel de poliacrilamida al

10% y por electroforesis se separaron las proteínas, por último se realizó una tinción

con nitrato de plata.

Se lavó el gel con agua y se hidrató durante 20 min con etanol al 30% (v/v)

Posteriormente los geles se pre-trataron con una solución al 0.02% (p/v) de tiosulfato

de sodio por 1.5 min, en oscuridad, inmediatamente los geles fueron lavados con

agua por un minuto con tres cambios cada 20 s. Luego los geles se incubaron en una

solución de nitrato de plata al 0.2% (p/v) y formaldehido al 0.03% (v/v) por 20 min en

oscuridad. Después del periodo de incubación, la solución de plata fue eliminada y se

lavó con agua dos veces por 20 s. Después se llevó a cabo el revelado con una

solución de carbonato de sodio al 6% (p/v), formaldehido al 0.019% (p/v) y 0.4 mM de

tiosulfato de sodio. Después de adquirir la intensidad de tinción deseada se eliminó la

solución reveladora y la reacción fue detenida con una solución de EDTA al 1.5%.

36

3 CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Análisis in silico de secuencias de [NiFe]-hidrogenasas

Las secuencias de aminoácidos correspondientes a la subunidad grande de la enzima

[Ni Fe] hidrogenas, fueron obtenidas del Genbank y se ha identificado secuencias

similares para diferentes especies las cuales se ha reportado que producen

hidrógeno. Se realizó una alineación de estas secuencias en el programa CLUSTAL

W 1.83 [56]. En la Figura 10, se puede observar que estas secuencias comparten

sitios catalíticos y dominios conservados, lo que sugiere que pueden ser los sitios

probables para hacer mutaciones e incrementar la eficiencia de esta enzima en la

producción de hidrógeno Maeda et al [57] demostraron un incremento en la

producción de hidrógeno al realizar mutaciones en cuatro cisteínas de E. coli (Cys241,

Cys244, Cys531 y Cys534) marcadas en rojo en las secuencias de la Figura 10. En los

rectángulos verdes se señalan los dominios conservados correspondientes al

complejo 1 de la NADH deshidrogenasa y la superfamilia NiFeSe hidrogenasa [54].

37

Salmonella MSEEKLGQQYLAALHQAFPGVVLDEAWQTKDQLTITVKVNYLPEVVEFLYYQQGGWLSVL 60

Citrobacter MSEEKLGQQYLAALHQAFPGVVLDEAWQTKDQLTITVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVL 60

Escherichia MSEEKLGQHYLAALNEAFPGVVLDHAWQTKDQLTVTVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVL 60

Klebsiella MSEEKIGQHYLAALHQAFPGVVLDEAWQTKDQLTVTVKVNYLPEVVEFLYYKQGGWLSVL 60

Enterobacter MSEEKIGQHYLAALHEKFPGVVLDEAWQTKDQITLTVKVNYLPEVVEFLYYQQGGWLSVL 60

*****:**:*****:: *******.*******:*:****************:********

Salmonella FGNDERQLCGHYAVYYVLSMEQGTKCWITVRVEVDANKLEFPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120

Citrobacter FGNDERQLCGHYAVYYVMSMEQGTKCWITVRVEVDANKLEFPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120

Escherichia FGNDERKLNGHYAVYYVLSMEKGTKCWVTVRVEVDANKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120

Klebsiella FGNDERKLNGHYAVYYVLSMEQGTKCWITVRVEVDANKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120

Enterobacter FGNDERKLNGHFAVYYVLSMEQGVKCWITVRVEVDALKPEYPSVTPRVPAAVWGEREVRD 120

******:* **:*****:***:*.***:******** * *:*******************

Salmonella MYGLIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180

Citrobacter MYGLIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180

Escherichia MYGLIPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180

Klebsiella MYGLVPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGTKKNN 180

Enterobacter MYGLVPVGLPDERRLVLPDDWPDELYPLRKDSMDYRQRPAPTTDAETYEFINELGDKKNN 180

****:************************************************** ****

Salmonella VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240

Citrobacter VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240

Escherichia VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240

Klebsiella VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIIDADYRLFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240

Enterobacter VVPIGPLHVTSDEPGHFRLFVDGENIVDADYRMFYVHRGMEKLAETRMGYNEVTFLSDRV 240

**************************:*****:***************************

Salmonella CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIQVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300

Citrobacter CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIVVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300

Escherichia CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIQVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300

Klebsiella CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIVVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFTGFDSG 300

Enterobacter CGICGFAHSTAYTTSVENAMGIVVPERAQMIRAILLEVERLHSHLLNLGLACHFVGFDSG 300

********************** *******************************.*****

Salmonella FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKEDMIQTRQLAQQMRRDVQELV 360

Citrobacter FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKEDMIQTRQLAQQMRRDVQELV 360

Escherichia FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKDDMIQTRQLAQQMRREVQELV 360

Klebsiella FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDLLKEDMIQTRQLAQQMRRDVQELV 360

Enterobacter FMQFFRVRETSMKMAEILTGARKTYGLNLIGGIRRDMLKDDMVQTRALAQQMRRDVMELV 360

************************************:**:**:*** *******:* ***

Salmonella DMLLSTPNMEQRTVGIGRLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVH 420

Citrobacter DMLLSTPNMEQRTVGIGRLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVH 420

Escherichia DVLLSTPNMEQRTVGIGRLDPEIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMEVH 420

Klebsiella DMLLSTPNMEQRTVGIGRLDPQIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFVGYGLLPMTVH 420

Enterobacter DVLMSTPNIEQRTVGIGRLDPQIARDFSNVGPMVRASGHARDTRADHPFAGYGLLPMTVH 420

*:*:****:************:***************************.******* **

Salmonella SEQGCDVISRLKVRINEVYTSLNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480

Citrobacter SEQGCDVISRLKVRINEVYTALNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480

Escherichia SEQGCDVISRLKVRINEVYTALNMLDYGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480

Klebsiella SEQGCDVISRLKVRINEVYTALNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFSEAPRGD 480

Enterobacter SEQGCDVISRLKVRINEVLTALNMIDFGLDNLPGGPLMVEGFTYIPHRFALGFAEAPRGD 480

****************** *:***:*:**************************:******

Salmonella DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540

Citrobacter DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540

Escherichia DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540

Klebsiella DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540

Enterobacter DIHWSMTGDNQKLYRWRCRAATYANWPTLRYMLRGNTVSDAPLIIGSLDPCYSCTDRMTV 540

************************************************************

Salmonella VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569

Citrobacter VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569

Escherichia VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569

Klebsiella VDVRKKKSKVVPYKELERYSIERKNSPLK 569

Enterobacter VDVRKKRSKVVPYKELERYGIERKNSPLK 569

******:************.*********

38

Figura 11. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de microorganismos que contienen la

[NiFe]-hidrogenasa. Las letras marcadas con un asterisco representan aminoácidos idénticos;

las letras marcadas con puntos representan aminoácidos con propiedades similares. Los

dominios conservados están marcados en rectángulos verdes. Las flechas indican cisteínas

importantes.

3.2 Análisis de la estructura tridimensional de la subunidad grande de la

enzima [NiFe]- hidrogenasa

Para realizar este análisis se utilizó como modelo la estructura de la [NiFe]-

hidrogenasa de E. coli, obtenida por cristalografía de rayos X (Figura 11), que está

bastante conservada en diferentes especies, por lo que se usó como base para

analizar la estructura y sitios de unión a los metales que contiene esta proteína [58].

39

Figura 12. Modelo estructural molecular de la enzima [NiFe]-Hidrogenasa. La flecha amarilla

indica el sitio activo de la enzima [58].

En la Figura 12 se observa la imagen amplificada de los aminoácidos cercanos a los

sitios catalíticos o en los sitios de unión a los metales de las enzimas que podrían

mejorar la producción de hidrogeno. Fritsch et al. [54], propusieron la transferencia

de agua a la superficie cerrada por puentes de sal formada entre Arginina 88 y

residuos de glutamato, Glu 107 y Glu 308. También identificaron dos rotámeros de

glutamina 308 que indica una apertura transitoria, por lo tanto, los datos estructurales

son compatibles con una traslocación controlada de moléculas de agua

probablemente acompañado de protones, apoyando el modelo de que las

hidrogenasas tolerantes a O2 forman agua como un subproducto durante la

40

conversión catalítica de H2 en presencia de O2 . Estas modificaciones han generado

algunas mutantes que han elevado la producción de hidrogeno de 0.3 mol/mg

proteína/hora hasta 9 mol/mg proteína/hora.

Figura 13. Modelo propuesto para mutagénesis dirigida de la enzima [NiFe]-hidrogenasa de E.

coli. Las esferas representan al hierro, níquel y magnesio.

Se ha demostrado que la activación de hidrógeno está mediada por el centro de

níquel y que los grupos sulfuro-hierro probablemente están involucrados en la

transferencia de electrones entre el sitio activo, la superficie molecular y de los

interlocutores redox de la enzima, como los citocromos y ferredoxinas [59].

41

En la Figura 13 se señala en color amarillo claro (cinta) la subunidad grande de la [Ni

Fe] hidrogenasa de E. coli de nuestro interés y se puede observar que su posición

espacial en la molécula está en una región expuesta por lo que se podrían realizar

con mayor facilidad las modificaciones de algunos aminoácidos para mejorar su

actividad catalítica como han propuesto algunos autores [54].

Figura 14. Modelo estructural de la enzima [NiFe]- hidrogenasa. La cinta en color amarillo

claro representa la secuencia del gen hycE. A y B son la misma estructura rotando la

molécula.

A

B

42

Al ser esta proteína, importante para la incorporación del níquel a la molécula y estar

ubicada espacialmente en una región externa se puede sugerir que la mutación de los

aminoácidos cercanos a este sitio podría tener resultados positivos en la producción

de hidrógeno.

Si consideramos que la distancia entre los átomos del centro activo y los ligandos

metálicos unidos a ellos tienen una función clave en la actividad y tolerancia al

oxígeno en la mayoría de las hidrogenasas, entonces es posible proponer un modelo

para futuros estudios de mutagénesis dirigida.

Las comparaciones de secuencias, los datos estructurales y las propiedades

espectroscópicas indican que, aunque las hidrogenasas no están filogenéticamente

relacionadas, poseen algunas similitudes notables en la arquitectura molecular del

sitio activo, es decir, la presencia de cianuro y/o de carbono como ligandos de los

metales. Las enzimas [NiFe]-hidrogenasas son de gran interés biotecnológico en

relación a su uso potencial en celdas de combustible. Estudios realizados con [NiFe]-

hidrogenasa de la proteobacteria Ralstonia eutropha H16 se obtuvieron células

mutantes de hypX- y mostraron un retardamiento en su crecimiento en condiciones

normales aeróbicas, lo que demuestra que la tolerancia al oxígeno de la enzima

requiere la función de HypX. Por tanto, se sugiere que el ligando CN es importante

para la tolerancia al oxígeno [5].

3.3 Obtención de ADN genómico de E. coli.

El protocolo reportado para obtener ADN genómico se basa en el uso de CTAB y se

utilizó para las cinco cepas de E. coli, DH5, XL-Blue, BL21, JM109 y Top 10 que

posteriormente se usaron en los ensayos de PCR. El ADN se visualizó por medio de

electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. En la figura 15

se observa la integridad del ADN de alto peso molecular. Aunque debido a que todas

mostraron presencia de ARN se realizó una reacción de digestión con la enzima

RNAsa.

43

M 1 2 3 4 5 6

Figura 15. Electroforesis de ADN genómico de E. coli, M, marcador de peso molecular (1Kb)

cepas 1.DH5α, 2. BL 21, 3. Sin muestra, 4. JM 109, 5. XL-Blue, 6. Top ten.

Con base a los datos analizados en cuanto a la secuencia y estructura de la enzima

se decidió amplificar el fragmento que corresponde al gen hycE de la [NiFe]-

hidrogenasa, ya que se observó que presenta varias ventajas para posteriores

experimentos en las cuales se podrían mutar aminoácidos específicos que están

relacionados a la incorporación de Ni o Fe a la enzima y por su posición en la parte

externa de la molécula es más probable que sean llevados a cabo, para esto se

enviaron a sintetizar tres pares de oligonucleótidos de acuerdo a la secuencia con

número de accesión X17506 reportado para E. coli K12 como se ve en la Figura 12,

con las letras marcadas con color rojo se indican la región que se tomó de la parte

inicial y la final para hacer la secuencia sentido (Forward) y antisentido (Reverse).

El primer par de oligos corresponde a la secuencia del gen más la secuencia de las

enzimas de restricción Bam HI y Nde I y tres nucleótidos extra que se agregaron para

poder identificar el inserto. Al no obtener el fragmento esperado se decidió hacer un

segundo par de oligos sin las secuencias agregadas y posteriormente reamplificar con

el primer par que se tenía. Por último y al no obtener una banda del tamaño esperado

con los oligos anteriores se diseñó un tercer par de oligos sin nucleótidos extras

1018 pb

1636 pb

44

conteniendo solo las secuencias de las enzimas de restricción Nde I y Bam HI en los

extremos 3´ de cada uno.

3.4 Obtención de un amplicón con los oligos diseñados para amplificar al gen

hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa.

Para la obtención del amplicón, se llevaron a cabo reacciones de PCR tomando en

cuenta la temperatura de fusión (Tm) de los oligos sintetizados. Se utilizó el primer

par de oligos (H1o) que contiene las secuencias de las enzimas de restricción pero no

se observó el fragmento esperado de 1700 pb aproximadamente. Por lo que se

realizó otro ensayo a la temperatura (Tm) que arroja el programa gratuito de internet

Appliedbiosystems.com sin resultados positivos y posteriormente un PCR con

gradiente de temperatura sin los resultados esperados. Al no observar ninguna banda

se enviaron a sintetizar los siguientes pares de oligonucleótidos (H2o) pero sin la

secuencia de las enzimas de restricción. Se realizó una PCR con un segundo par de

oligonucleótidos de la hidrogenasa y se observó un barrido de ADN por lo que se

procedió a realizar un gradiente de temperatura para tener una mejor reacción de

amplificación del fragmento.

Se realizó un ensayo de PCR usando un gradiente de temperatura de alineamiento de

60 a 50º C analizando tres puntos solamente (60°C, 56.5°C y 50.7°C) utilizando como

plantilla el ADN genómico de las cinco cepas de E. coli (Tabla 5). En la Figura 16 se

observó la amplificación del fragmento esperado de aproximadamente 1700 pb de

las cinco cepas de E. coli. La línea 1 es top ten; línea 2 es DH5; línea 3 es BL21;

línea 4 es JM109 y línea 5 es BL21. Sin embargo, también se observó amplificación

inespecífica lo cual se presenta como otras bandas de diferentes tamaños. Aunque en

todas las cepas y prácticamente en todas las temperaturas probadas se observa la

banda de interés, se puede observar una mayor intensidad a 56 °C y en las cepas

DH5 y BL21. Debido a la amplificación inespecífica obtenida, se realizó una

reamplificación con el producto de PCR correspondiente a BL21 a 56º C ya que a

esta temperatura hubo una mejor amplificación. En la Figura 17 se observa el

amplicón esperado de 1700 pb. También se puede corroborar que al modificar la

45

temperatura el amplicón fue más específico, pues solo se observa una banda del

tamaño esperado.

Figura 16. Electroforesis del producto de PCR gradiente de temperatura con oligos

hidrogenasa 2o. M Marcador 1 Kb, 1 top 1.0, 2.DH5α, 3.BL21, 4. JM 109, 5.XL-Blue.

M 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

10

M 1 2 3 4 5

60 o C 56.5 o C

50.7 oC

1636 pb

1018 pb

1636 pb

1018 pb

46

Figura 17. Electroforesis del producto de PCR con los oligos H2° diseñados para amplificar al

gen hycE de la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa.

El producto de PCR se clonó en el vector TOPO (Invitrogen) se transformaron células

competentes top ten contenidos en el kit de clonación por choque térmico y se

seleccionaron las colonias en medio de cultivo con ampicilina posteriormente se

realizó la obtención de ADN plasmídico como se muestra en la Figura 18. Se observó

el marcador de 1 kb (M) y el peso aproximado del plásmido más el inserto de la

hidrogenasa de 5700 pb aproximadamente marcado con la flecha.

Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa 1% de la minipreparación de clonas positivas con

ADN plasmídico de hidrogenasa.

1636 pb

M H2°

1636 pb

1018 pb

1018 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

14 15 16 17 18 19 20

47

Se seleccionaron las clonas de tamaño cercano al esperado y posteriormente se hizo

una digestión con la enzima Eco RI para liberar el fragmento. Dato no mostrado.

Con el ADN plasmídico obtenido de las minipreparaciones se amplificó por PCR

utilizando el tercer par de oligonucleótidos (H3o) los cuales tienen las secuencias de

las enzimas de restricción como se observa en la Figura 19 el fragmento esperado es

de 1700 pb aproximadamente. M es el marcador de peso de 1Kb.

Figura 19. Electroforesis en gel de agarosa 1% del producto de PCR de hidrogenasa con los

oligos H3o,

M marcador 1 Kb, línea 1 producto de PCR.

El producto de PCR se clonó nuevamente en el vector TOPO (Invitrogen), se

transformaron células competentes top ten y se realizó la extracción de ADN

plasmídico, se enviaron a secuenciar cinco clonas a la universidad de Clemson y no

se obtuvieron resultados positivos de la secuencia debido a la calidad del ADN. Dados

estos resultados se hizo un análisis de restricción utilizando las enzimas Nde I y Bam

48

HI para poder ver el fragmento correspondiente a la hidroegensa pero por la poca

cantidad de ADN no se aprecia bien en la foto del gel la banda correspondiente por lo

tanto no se muestra este dato. Se cortó la banda y se eluyó del gel de agarosa, se

precipitó con glucógeno para obtener el ADN del gen de la hidrogenasa y

posteriormente se hizo la ligación al vector de expresión pET15-b.

3.5 Obtención del plásmido de expresión pET 15b-hidrogenasa y

transformación de E. coli cepa BL21.

El vector o plásmido de expresión pET-15b se purificó y se digirió con las enzimas

Nde I y Bam HI, para linealizar el plásmido posteriormente se utilizó para ligar con el

fragmento obtenido del gen hidrogenasa mediante la T4 ligas. Esta reacción se utilizó

para transformar por choque térmico las bacterias. A las colonias que crecieron en el

medio selectivo con ampicilina se les extrajo el ADN plasmídico (Figura 20) y se pudo

observar una banda de aproximadamente 7400 pb que corresponde al tamaño de

pET-15b-hidrogenasa:6his-tag de 5700 pb más 1700 pb del inserto.

49

Figura 20. Electroforesis de la minipreparación de clonas del vector de expresión pET 15b-

hidrogenasa:6 his-tag. M: Marcador de peso molecular de 1 Kb.

En 2010, Kim et al [62] citó que la cepa de E. coli BL21 recombinante que

sobreexpresa al gen de la [NiFe]-hidrogenasa 1 produce 12.5 ml H2/(h-L) en

condiciones de micro-anaerobiosis, mientras que la cepa silvestre no genera gas H2.

Es necesario comprobar si las clonas obtenidas en este trabajo efectivamente

contienen al gen recombinante hycE y si éste está siendo sobreexpesado. De ser así,

estas clonas podrían usarse en ensayos de hidrógeno similares a los antes descritos.

3.6 Patrón de expresión de proteínas totales y de extracto purificado de las

clonas obtenidas de E. coli.

Como resultado del experimento de transformación de E. coli cepa Bl21 con pET-15-

hidrogenasa:6 his-tag, se obtuvieron varias colonias que fueron resistentes al medio

M clona 1 clona 2

1018 pb

1636 pb

50

de selección, por lo que se sugirió que deberían contener el mencionado plásmido. De

estas se seleccionaron dos clonas. Se eligieron las clonas 1 y 2, se obtuvo el extracto

de proteínas totales de cada una. Se obtuvo el perfil de expresión de proteínas totales

en un gel de poliacrilamida al 10% teñido con azul de Coomasie. Se sabe que la

proteína correspondiente a la hidrogenasa es de aproximadamente 55 kDa que

corresponde a la subunidad grande de la [NiFe]-hidrogenasa [58].

51

Figura 21. Patrón de proteínas de dos clonas de pET 15b: hidrogenasa. Los productos fueron

separados en un gel de poliacrilamida al 10 %, por electroforesis con dodecilsulfato de sodio

(PAGE-SDS) y teñido con azul de Coomassie. La flecha indica la proteína de 55 kDa.

Se puede observar en la figura 21 las proteínas de células BL21 sin transformar, las

clonas positivas y estas mismas proteínas inducidas con IPTG y el marcador de masa

molecular (Fermentas). Como control de carga de las proteínas en el gel se utilizó

tinción con el reactivo de Bradford (dato no mostrado). Se observa un cambio en la

intensidad de la banda que corresponde a la proteína de 55 kDa. Cuando añadimos

el IPTG, se induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que transcribe a gran nivel

el gen que hemos clonado.

Posteriormente se utilizó un protocolo de purificación de proteínas para la clona 1

teniendo en cuenta que la secuencia clonada en el vector pET-15b se encuentra en el

Clona 2 Clona 1 Clona 1 Clona 2 Clona 1 BL21 M

+ IP

IPTG

55 kDa

+ IPTG

72 kDa

52

mismo marco de lectura que las 6 histidinas del vector. Esta purificación se realizó a

partir de un cultivo bacteriano utilizando una columna de afinidad de Níquel-agarosa.

Figura 22. Purificación de proteínas por columna de níquel de la clona 1 de E. coli BL21.

Marcador de proteínas, línea 1 proteínas totales, línea 2 proteínas no incorporadas, línea 3

proteínas eluidas de la columna. Electroforesis PAGE-SDS gel de poliacrilamida 10 % teñido

con nitrato de plata.

En la figura 22 se observa una banda de una masa molecular aparente de 55 kDa.

Esta línea corresponde a la clona 1 que fue pasado por una columna de níquel-

agarosa. Posteriormente se eluyeron de la columna con imidazol (linea 3) se observa

una banda mas separada que puede ser la subunidad grande del gen hycE de la

M 1 2 3

55 kDa

72 kDa

53

hidrogenasa de E. coli por su masa molecular de tamaño similar al reportado. El gel

de acrilamida al 10 % se tiñó con nitrato de plata.

Rossmann [36] purificó la subunidad grande HYCE de E. coli demostrando que es un

polipéptido que contiene níquel, el cual está sujeto al procesamiento proteolítico C-

terminal. También, observaron que la formación de sitios activos en [NiFe]

hidrogenasas de bacteria requiere, además de los productos de los genes

estructurales, proteínas auxiliares que son codificadas por los llamados genes hyp. En

E. coli, la función pleiotrópica del gen hyp es particularmente evidente ya que las

mutaciones en la mayoría de los genes de hyp afectan la de actividad de las tres

isoenzimas hidrogenasas de este organismo. Aunque las formas de la subunidad

grande de la hidrogenasa 3 en los mutantes hyp presentan una apariencia idéntica en

la migración en geles de SDS, difieren en dos importantes aspectos. (a) La forma

presente en los mutantes hyp parece estar libre de níquel, mientras que la preforma

de la subunidad grande en el mutante hycH se asocia con el níquel. Esto indica que la

incorporación de níquel en la subunidad grande es un requisito previo para el

procesamiento C-terminal.

54

CONCLUSIONES

Al analizar las secuencias de genes de hidrogenasas de diferentes microorganismos

complementado con el análisis de estructura, se eligió la secuencia del gen hycE

correspondiente a la subunidad grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa 3 de E. coli,

involucrada en la maduración de la enzima y también debido a su tolerancia al

oxígeno lo cual representa una ventaja importante.

Se identificaron dominios estructurales de la enzima [NiFe]-hidrogenasa que podrían

permitir futuros estudios de mutagénesis de este gen con el fin de ampliar sus

aplicaciones biotecnológicas para la producción de hidrógeno a gran escala en E. coli.

Se obtuvo por PCR el fragmento de aproximadamente 1700 pb correspondiente a la

enzima [NiFe]-hidrogenasa.

Se obtuvieron clonas de la construcción pET15b-hidrogenasa:6 hist-tag.

Se obtuvo el patrón de expresión de las proteínas de las clonas obtenidas con el

inserto y se purificaron por afinidad en columna de níquel-agarosa. Se observó la

proteína de 55 kDa de la subunidad grande de la enzima [NiFe]-hidrogenasa.

55

PERSPECTIVAS

La combinación de técnicas como la cristalografía de rayos X, biología molecular y

espectroscópica ha marcado el ritmo acelerado de estudio de las enzimas

hidrogenasas. La comprensión de cómo funcionan estas enzimas es un punto clave

para la creación de dispositivos biomiméticos y biotecnológicos para la producción de

energía. Más de un centenar de hidrogenasas se han caracterizado genética y/o

bioquímicamente. También mediante la comparación de sus secuencias de

aminoácidos, se ha podido identificar subgrupos de clases de las enzimas, para

comparar y correlacionar información bioquímica, genética y fisiológica en relación

con los miembros de los subgrupos, independientemente de su origen y sus diversas

funciones en el metabolismo energético.

Con los resultados obtenidos en el presente estudio es posible sugerir mutaciones en

los sitios catalíticos de la enzima [NiFe]-hidrogenasa 3 de E. coli y se podría utilizar la

generación de mutantes para verificar los cambios en la producción de hidrogeno.

Por otro lado se utilizarán las bacterias que sobreexpresen el gen hycE en celdas de

combustible microbianas para la producción de hidrogeno o el dispositivo biológico

para generar hidrogeno llamado Celda de Electrolisis Microbiana (CEM), el cual es

capaz de electrolizar cualquier sustrato biodegradable, como por ejemplo la materia

orgánica presente en aguas residuales, y convertirla directamente a hidrogeno y CO2

que tiene como principal objetivo convertir la energía química en eléctrica.

Es importante mencionar que se realizará la secuenciación nuevamente de las clonas

que hemos analizado por otros métodos. Para verificar que tenemos clonados el gen

hycE.

56

Anexo 1. Articulo de divulgación aceptado en la revista Ciencia de la

Academia Mexicana de Ciencias.

“El biohidrógeno: la fuente de energía del futuro”

Ángela Ku González y Enrique Castaño de la Serna

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C.

Calle 43 No. 130 Col. Chuburná de Hidalgo., Mérida, Yuc, Méx.

CP 97200. Tel: (52) 999 942 83 30; enriquec@cicy.mx.

Palabras clave: biohidrogeno, enzimas, hidrogeno.

57

En la actualidad, la población ve como se acaban lentamente las fuentes de

petróleo, el mayor generador de energía, y también puede palpar el declive

ecológico que ha ocasionado. Generando temor y conciencia ecológica. ¿Cuál

será el futuro? La búsqueda de fuentes alternas de energía volvió a tomar vigor

en los últimos años. Algunas fuentes ya olvidadas como el bioetanol o el biodiesel

después de cien años de abandono empezaron a tomar fuerza. Sin embargo,

nuestra demanda energética exige fuentes de energía alternas. Pero sobre todo

que no compitan con la demanda alimenticia y que no utilicen extensiones

territoriales destinadas a la agricultura. Así mismo, la reciente conciencia

ecológica requiere de fuentes de energía que no causen estragos ecológicos en el

futuro, como la emisión de gases de efecto invernadero. Una solución en un

futuro cercano es el hidrogeno, este gas cuando es producido a partir de un

sistema biológico se le denomina biohidrógeno.

58

El Hidrogeno es el compuesto más abundante en el universo y cuando interactúa

con el oxígeno para formar agua libera una gran cantidad de energía. Siendo el

producto resultante agua pura que puede ser reutilizada para volver a producir

hidrogeno y oxígeno. Para lograr esto, se requiere de un sistema que permita

romper la molécula de agua para obtener hidrogeno y oxigeno. Al igual que un

sistema que permita utilizar los iones de hidrogeno (H+) para producir gas H2.

Existen diversos métodos para lograrlo incluyendo procesos de alta presión con

electrólisis de agua, fotoelectroquímicos y termoquímicos. Los cuales se asocian

bastante con el enfriamiento de reactores nucleares. Pero uno de los más

interesantes es el uso de organismos que realicen el proceso de forma natural.

La realidad es que este proceso lo realizan diariamente las plantas y algas

utilizando la energía solar y sistemas enzimáticos para la producción de azucares

donde el agua junto con el bióxido de carbono y energía se combinan para

producir azucares. En los sistemas de bioetanol se utilizan estos azucares para

producción de alcoholes y en los sistemas de biodiesel requiere de un mayor

proceso bioquímico para que las plantas generen aceites que puedan utilizarse

59

posteriormente para la producción de diesel. Es claro que cada proceso involucra

una pérdida de energía. Por lo cual la eficiencia resultante del proceso decae con

el número de conversiones moleculares. La mayor eficiencia claramente recae

sobre el proceso primario. Algunas algas como las cianobacterias, se han

utilizado durante los últimos años para lograr la producción de hidrógeno. Las

cianobacterias son un grupo grande y diverso de organismos procariotas oxigeno

fototropicos. Es decir, muchos de ellos tienen la habilidad de producir hidrogeno.

Por lo menos 14 géneros de cyanobacteria producen hidrogeno bajo diversas

condiciones de cultivo. Entre estas destacan Cianobacteria Gloeocapsa alpicola

que bajo deficiencias de sulfuro muestran un incremento en la producción de

hidrogeno. Arthrospira (Spirulina platensis) puede producir hidrogeno en

obscuridad y condiciones anaeróbicas. Mientras que la cianobacteria Anabaena

cylindrica, produce hidrogeno y oxígeno simultáneamente en una atmosfera de

argón por 30 días con luz limitada. Las cianobacterias simbióticas con las raíces

de cada una (Cycas revolute) y Zamia furfuracea muestran una gran cantidad de

producción de hidrogeno. Entre ellas destaca Anabaena cylindrica que produce la

mayor cantidad de hidrogeno (30 ml of H2/lit de cultivo /h).

La conversión de agua en hidrogeno y oxigeno requiere de enzimas, en particular

nitrogenasas o hidrogenesas.

Las nitrogenesas se encuentran en los quistes filamentosos de las cianobacterias

cuando crecen en condiciones limitantes de nitrógeno. El hidrogeno es producido

como un subproducto en la fijación de nitrógeno a amoniaco. La reacción

consume ATP (trifosfato de adenosina), que son unidades de energía, y en forma

general sigue esta ecuación.

16 ATP + 16 H2O + N2 + 10H+ + 8e- →Nitrogenasa→ 16 ADP +16 Pi + 2NH4+ +

H2

60

Mientras que las hidrogenasas existen en dos tipos diferentes de cianobacterias.

Una de ellas tiene la habilidad de oxidar el hidrogeno (codificada por el gen

hupSL) y la otra de ser una hidrogenasa bidirecional (codificada por el gen

hoxFUYH) que puede consumir o producir hidrogeno. Las hidrogenasas que

consumen hidrogeno se encuentran en los tilacoides membranales, sacos

aplanados o vesículas, de los quistes de las cianobacterias filamentosas. Es ahí

donde se transfieren los electrones procedentes del hidrogeno para la reducción

del oxigeno por la vía respiratoria y la reacción es conocida como

oxihidrogenación o reacción de Knallgas.

H2 → Hidrogenasa → 2H+ +2e-

El papel de las hidrogenasas bidireccionales es poco claro y se cree que

mantiene el nivel iónico del organismo. Por lo general se asocian a la membrana

del citoplasma y es posible que tengan funciones similares a las de aceptores de

electrones tanto de NADH como H2. Son enzimas que constan de cuatro o cinco

subunidades proteicas, dependiendo de la especie. Donde el gen hoxYH es el

principal y se requiere de proteínas auxiliares conocidas con el término hyp

producto de los genes: hypA-F. Este tipo de hidrogenasas puede ser de utilidad

para la producción futura de hidrogeno.

Uno de los problemas principales es que la producción de hidrogeno mediante

nitrogenasas o hidrogenasas puede ser tan solo en condiciones anaeróbicas

debido a que son altamente sensibles al oxigeno. Puesto que el oxigeno es uno

de los productos de la fotosíntesis los organismos han desarrollado un sistema

espacial y temporal estratégico para proteger las enzimas de ser inactivadas por

oxígeno. Esto incluye: a) Quistes que contienen cámaras separadas que evitan

que el oxigeno producido afecte la actividad de las nitrogenasas utilizando

61

membranas permeables al oxigeno y b) la realización del proceso en periodos

diferentes de luz y obscuridad.

En la actualidad, se han tratado de reproducir celdas que mimeticen los procesos

fotosintéticos para la producción de hidrogeno a partir de agua. El prototipo

existente fue construido por Thomas Mallouk de la universidad de Pensilvania.

Denominado como celda Grätzel utiliza la luz para liberar los electrones de una

molécula de tinción (pigmentos naturales) pero en lugar de ser utilizado para

generar corriente, la celda Grätzel lleva los electrones para la catálisis de la

reacción que a partir del agua produce oxígeno e hidrogeno en una reacción

similar a la de la fotosíntesis. Sin embargo, el proceso para reproducirlo

eficientemente es difícil, ya que muchos de los compuestos de tinción probados

reaccionan fácilmente con sus moléculas antes de llevar a cabo la catálisis. Una

vez generados los compuestos se tendrá que generar módulos a nivel de

nanotecnología para acomodar de manera eficiente las moléculas de tinción y

evitar cortos circuitos. Otro problema a solucionar es la composición química de la

molécula de tinción, que por lo general está basada en Ruthenio u óxido de Iridio,

lo cual puede ser base del problema. Se tendrá que probar si se puede recapitular

el proceso utilizando compuestos de mayor abundancia como lo hacen los

sistemas biológicos. Sin embargo estos sistemas ya tienen una eficiencia del 1%

de conversión energética. Es posible que con la optimización geométrica de las

moléculas de Iridio se pueda lograr un 10% de eficiencia. De ser así se podrían

utilizar estas celdas para la producción masiva del hidrogeno usando luz solar,

convirtiéndolo en atractiva y no contaminante fuente de energía.

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