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Diplomarbeit
Charakterisierung der Rolle des Enzyms
Dimethylglycindehydrogenase im Sarkosinmetabolismus
von humanen Prostatakarzinomzellen
eingereicht von
Michael Haider
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der gesamten Heilkunde
(Dr. med. univ.)
an der
Medizinischen Universität Graz
ausgeführt am
Institut für Pathophysiologie und Immunologie
unter der Anleitung von
Univ.-Ass. Mag. Dr.scient.med. Robert Fuchs Univ.-Prof.Dr.phil. Anton Sadjak
Graz, am 02.11.2017
i
Eidesstattliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne fremde
Hilfe verfasst habe, andere als die angegebenen Quellen nicht verwendet habe und die den
benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich
gemacht habe.
Graz, am 02.11.2017 Michael Haider, eh
ii
Danksagungen
Ich möchte mich bei meinen beiden Betreuern Prof. Anton Sadjak und Dr. Robert Fuchs
recht herzlich bedanken. Besonders Dr. Robert Fuchs stand mir immer mit guten Tipps zur
Seite und zeigte außerordentliche Geduld mit mir. Außerdem ist er während des Verfassens
dieser Arbeit Vater geworden, weshalb ich Ihm und seiner Familie auch auf diesem Wege
alles Gute für die Zukunft wünschen möchte!
Auch bei Peter Augustin möchte ich mich für seine außerordentliche Hilfe bedanken.
Weiters möchte ich mich herzlich bei all jenen, die mich bei dieser Arbeit unterstützt haben,
für die Geduld und die Hilfestellung bedanken. Dazu zählen Anika Stracke, Nathalie Allard
und Andreas Meinitzer. Außerdem gebührt mein Dank auch Peter Macheroux und Beate
Rinner.
Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir dieses Studium ermöglicht, und mich bei allen
Unternehmungen unterstützt haben.
Auch meinen Großeltern möchte ich auf diesem Weg meinen Dank aussprechen, da sie mich
stets unterstützt und gefördert haben.
Bei meiner Freundin Stephanie möchte ich mich ebenfalls für die aufgebrachte Geduld
bedanken.
Zuletzt sei noch meinen Studienkollegen und Freunden gedankt, die mir während des
Studiums viele unvergessliche Momente schenkten.
Diese Diplomarbeit wurde durch eine Forschungssubvention der Stadt Graz unterstützt.
iii
Zusammenfassung
Hintergrund: Im Jahr 2009 wurde Sarkosin als potenziell neuer Tumormarker für
Prostatakrebs entdeckt. Sarkosin wurde mit der Aggressivität von Prostatakarzinomen (PCa)
in Verbindung gebracht. Weiters scheint Sarkosin im Tumormetabolismus bzw. in der
Kanzerogenese involviert zu sein. Das Enzym Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH)
spielt eine entscheidende Rolle im Cholin-Metabolismus durch die Demethylierung von
Dimethylglycin zu Sarkosin. Dennoch ist bislang nur sehr wenig über eine Rolle des Enzyms
im Zusammenhang mit dem PCa bekannt. Ziel dieser in vitro Studie ist es deshalb, den
Einfluss der DMGDH auf die Sarkosinsynthese, Zellmigration und Zellproliferation der
PCa-Zelllinien DU-145, PC-3 und LNCaP zu evaluieren.
Methoden: Die Expression der DMGDH in humanen PCa Zelllinien mit und ohne
Androgenstimulation wurde auf mRNA und Proteinebene mittels qPCR (Taqman® qPCR)
bzw. mit Immunfluoreszenz und Western Blotting analysiert. Um den Einfluss der DMGDH
auf Sarkosinsynthese, Zellmigration und Zellproliferation analysieren zu können, wurde ein
Silencing des Enzyms mittels ShRNA System mit lentiviralem Vektor durchgeführt. Die
Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration wurde mittels HPLC realisiert. Um das
Proliferations- bzw. Migrationsverhalten beurteilen zu können wurden WST-1®
Proliferationsassays bzw. Wound healing Assays verwendet.
Ergebnisse: Auf mRNA-Ebene konnte sehr schwache Expression der DMGDH in allen drei
getesteten PCa-Zelllinien nachgewiesen werden ohne Sensitivität auf Androgenstimulation.
Die mRNA-Expression der DMGDH konnte durch das sHRNA-Silencing erfolgreich
verringert werden. Der Proteinnachweis des Enzyms in den PCa-Zelllinien lieferte jedoch
ein inkonklusives Ergebnis, da die Immunfluoreszenz-Assays zwar Expression der DMGDH
suggerierten, jedoch die Western Blotting Experimente keine spezifischen DMGDH-Signale
erbrachten. Weiters konnte kein Effekt durch das Silencing der DMGDH hinsichtlich
Zellproliferation, Zellmigration und intrazellulärer Sarkosinkonzentration in DU-145 Zellen
beobachtet werden.
Schlußfolgerung: Unsere Daten legen nahe, dass das Enzym DMGDH nur eine
untergeordnete Rolle im Sarkosinmetabolismus in humanen PCa-Zellen zu spielen scheint.
iv
Abstract
Background: In 2009 sarcosine was identified as a new potential biomarker for prostate
cancer (PCa) and found to be associated with its aggressiveness. Since then the metabolism
of sarcosine was investigated in the light of cancerogenesis of PCa. Even though the enzyme
dimethylglycine dehydrogenase (DMGDH) plays a major role in the choline degradation
pathway its possible role in the genesis of PCa which is sparsely defined as yet. Therefore,
the aim of our study is to assess the impact of DMGDH on sarcosine synthesis and in-vitro
growth and migration behavior of human PCa-cell lines DU-145, PC-3 and LNCaP.
Methods: First of all, the expression of DMGDH was assessed at mRNA and protein level
by means of qPCR, respectively immunofluorescence assays and western blotting. In order
to assess the role of DMGDH on sarcosine metabolism in human PCa-cell lines, expression
of the enzyme was silenced using a ShRNA approach by means of a lentiviral system.
Measurement of intracellular sarcosine concentration was done by means of HPLC.
Proliferation of DMGDHSh-clones was analyzed by means of the proliferation dye WST-
1®. The migration behavior of DMGDHSh-clones was tested in wound healing assays.
Results: qPCR experiments showed weak expression of DMGDH at mRNA level in all three
tested cell linesthat was not influenced by androgens. Immunofluorescence assays further
suggested expression of the enzyme. However, in western blotting assays we were not able
to confirm expression of the enzyme at protein level. Furthermore, we successfully
established stable DMGDH knockdown-clones. Silencing of DMGDH did not affect
intracellular sarcosine concentration, cell proliferation and cell migration in DU-145 cells.
Conclusion: Our results suggest that the enzyme DMGDH only plays a minor role in
sarcosine metabolism of human PCa-cell lines.
v
Inhaltsverzeichnis
Danksagungen ----------------------------------------------------------------------------------------------- ii
Zusammenfassung ----------------------------------------------------------------------------------------- iii
Abstract ------------------------------------------------------------------------------------------------------ iv
Inhaltsverzeichnis ------------------------------------------------------------------------------------------- v
Abbildungsverzeichnis------------------------------------------------------------------------------------- vii
Tabellenverzeichnis --------------------------------------------------------------------------------------- viii
1 Einleitung ---------------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1 Prostatakarzinom --------------------------------------------------------------------------------------------- 1
1.1.1 Epidemiologie ---------------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1.2 Molekularpathologie ------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1.3 Klinik --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 1.1.4 Diagnostik -------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.5 Therapie ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 4 1.1.6 Sarkosin – ein neuer Marker für die Diagnose von Prostatakrebs? ---------------------------- 6
1.2 Dimethylglycindehydrogenase und andere Enzyme im Sarkosinmetabolismus --------------- 8 1.3 Hypothese ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 10 1.4 Ziele ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 10
1.4.1 PC-3 -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11 1.4.2 DU-145 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 11 1.4.3 LNCaP ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 11
2 Material und Methoden --------------------------------------------------------------------------- 12 2.1 Kultivierung der humanen Prostatakrebszellen ----------------------------------------------------- 12 2.2 Transfektion der PCa-Zellen mittels lentiviralem Vektor ------------------------------------------ 12 2.3 Immunfluoreszenznachweis von DMGDH ------------------------------------------------------------ 13
2.3.1 Herstellung der Slides und Färbung ----------------------------------------------------------------- 13 2.4 Western Blot ------------------------------------------------------------------------------------------------- 14
2.4.1 Probenvorbereitung ------------------------------------------------------------------------------------ 14 2.4.2 SDS-PAGE und Blotting-Prozedur -------------------------------------------------------------------- 15
2.5 qPCR ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 16 2.5.1 RNA – Isolierung ----------------------------------------------------------------------------------------- 16 2.5.2 Umschreiben der mRNA in cDNA -------------------------------------------------------------------- 17 2.5.3 Quantifizierung der Expression Sarkosin-metabolisierender Enzyme mittels qPCR. ----- 18
2.6 Analyse der Expression Sarkosin metabolisierender Enzyme in Abhängigkeit von Androgenstimulation ------------------------------------------------------------------------------------------------- 19 2.7 Mitochondrienfärbung mittels MitoRed® ------------------------------------------------------------ 20 2.8 Messung der Zellproliferation mit WST-1-Assay ---------------------------------------------------- 20 2.9 Messung der Zellmigration mit Wound-healing Assay --------------------------------------------- 21 2.10 Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration mit HPLC ---------------------------------- 23 2.11 Statistische Verfahren ------------------------------------------------------------------------------------- 23
3 Ergebnisse ------------------------------------------------------------------------------------------- 24 3.1 DMGDH wird in den Zelllinien LNCaP, PC-3 und DU-145 exprimiert --------------------------- 24 3.2 Erfolgreiches Silencing der DMGDH-Expression in PCa-Zellen ----------------------------------- 26 3.3 Ergebnisse der Messung der Expression von SARDH und GNMT nach Silencing der DMGDH------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29 3.4 Ergebnisse der Messung der Expression Sarkosin metabolisierender Enzyme nach Androgenstimulation ------------------------------------------------------------------------------------------------- 30
vi
3.5 Visualisierung der Mitochondrien mittels MitoRed® in DU-145 DMGDHsH-Klonen -------- 31 3.6 Das Silencing der DMGDH hat keinen Einfluss auf die Zellproliferation ----------------------- 32 3.7 Das Silencing der DMGDH beeinflusst das Migrationsverhalten der PCa-Zellen nicht ----- 33 3.8 Messung der Sarkosinkonzentration nach DMGDH Knockdown -------------------------------- 35
4 Diskussion -------------------------------------------------------------------------------------------- 37
5 Literaturverzeichnis -------------------------------------------------------------------------------- 42
Anhang - Lösungen --------------------------------------------------------------------------------------- 48
Anhang – ISC Poster -------------------------------------------------------------------------------------- 50
vii
Abbildungsverzeichnis ABBILDUNG 1: ENZYME IM CHOLINSTOFFWECHSEL ...................................................................................... 8 ABBILDUNG 2: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES IBIDI®-SYSTEMS ........................................................... 22 ABBILDUNG 3: QUANTIFIZIERUNG DER DMGDH-EXPRESSION IN PCA-ZELLLINIEN ....................................... 24 ABBILDUNG 4: NACHWEIS DER DMGDH-EXPRESSION IN HUMANEN PCA-ZELLLINIEN MITTELS INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ ........................................................................................................................ 25 ABBILDUNG 5: VERSUCH DES NACHWEISES DER DMGDH IN DU-145 UND LNCAP WILDTYPZELLEN MITTELS
WESTERN-BLOTTING ASSAY ............................................................................................................... 26 ABBILDUNG 6: NACHWEIS DES SILENCINGS DER DMGDH IN HUMANEN PCA-ZELLLINIEN AUF PROTEINEBENE
........................................................................................................................................................... 28 ABBILDUNG 7: QUANTIFIZIERUNG DER DMGDH-EXPRESSION IN DU-145 ZELLEN MITTELS QPCR NACH
SILENCING MIT SHRNA ....................................................................................................................... 29 ABBILDUNG 8: RELATIVE EXPRESSION VON GNMT UND SARDH NACH SILENCING DER DMGDH.................. 30 ABBILDUNG 9: ANDROGENABHÄNGIGKEIT DER EXPRESSION SARKOSIN-METABOLISIERENDER ENZYME IN
HUMANEN PCA-ZELLEN ...................................................................................................................... 31 ABBILDUNG 10: VERGLEICH DER MITOCHONDRIENLOKALISATION ZWISCHEN DU-145 WILDTYPZELLEN UND
DMGDHSH-KLONEN ........................................................................................................................... 32 ABBILDUNG 11: ERGEBNISSE DES WST-1-PROLIFERATIONS-ASSAYS VON DU-145 ZELLEN MIT SILENCING DER
DMGDH .............................................................................................................................................. 33 ABBILDUNG 12: WOUND-HEALING ASSAY MIT DU-145 ZELLEN ................................................................... 34 ABBILDUNG 13: ERGEBNISSE DES WOUND-HEALING ASSAYS MIT DU-145 ZELLEN VERSUS DU-145 DMGDH-
SH-KLONE ........................................................................................................................................... 34 ABBILDUNG 14: MESSUNG DER INTRAZELLULÄREN SARKOSINKONZENTRATION IN DU-145 DMGDHSH-
KLONEN .............................................................................................................................................. 36
viii
Tabellenverzeichnis TABELLE 1: ZUSAMMENSETZUNG DER REAKTIONSLÖSUNG FÜR DIE CDNA SYNTHESE................................. 17 TABELLE 2: TEMPERATURPROGRAMM VERWENDET IN DER CDNA-SYNTHESE............................................. 18 TABELLE 3: ZUSAMMENSETZUNG DER PCR-REAKTIONSLÖSUNG ................................................................. 18 TABELLE 4: TEMPERATURPROGRAMM QPCR............................................................................................... 19 TABELLE 5: BERECHNUNG VON ∆CQ, RELATIVER EXPRESSION, ∆∆CQ UND DES RELATIVEN
EXPRESSIONSUNTERSCHIEDS.............................................................................................................. 19
1
1 Einleitung
1.1 Prostatakarzinom
1.1.1 Epidemiologie
Laut WHO Cancer Report machten Tumoren der Prostata beim Mann 2012 15% aller
bösartigen Tumoren aus, das sind in Krankheitsfällen gerechnet weltweit 1.111.689 Fälle,
wovon 307.471 Patienten an Prostatakrebs verstarben [1]. Im Alter über 70 ist das
Prostatakarzinom (PCa) sogar der häufigste bösartige Tumor beim Mann [2].
Altersstandardisierte Statistiken zeigen eine Inzidenz von 31,1 Fällen pro 100 000
Einwohner. Somit befinden sich bösartige Neoplasien der Prostata auf Platz 2 der
Krebsinzidenzen bei Männern hinter bösartigen Lungentumoren mit einer Inzidenz von 34,2
[1]. Geographisch zeigen sich höhere Inzidenzen in den Vereinigten Staaten und im
nördlichen Europa, niedrigere Inzidenzen hingegen in Süd-Ost-Asien [3]. 2012 betrug die
Mortalität bei Prostatakrebs 6,8%, was 307 471 Todesfällen weltweit entspricht [1]. Als
anerkannte Risikofaktoren gelten hohes Lebensalter, familiäre Vorbelastung sowie
ethnische Zugehörigkeit, jedoch scheinen auch Umwelteinflüsse eine Rolle zu spielen, da
Auswanderer aus dem asiatischen Raum in Amerika gleiche Inzidenzen wie die
einheimische Bevölkerung aufweisen [3]. Aufgrund der immer höher werdenden
Lebenserwartung bei Männern, wird Prostatakrebs auch sozioökonomisch eine immer
wichtiger werdende Erkrankung. So werden in Zukunft durch den Umstand der steigenden
Lebenserwartung und Inzidenz die verursachten Kosten dieser Erkrankung in Europa auf
über 8,43 Mrd. € geschätzt [3, 4].
1.1.2 Molekularpathologie
Generell scheint der Androgenrezeptor (AR) eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von
Prostatakarzinomen einzunehmen. Etwa 60% der Patienten mit Prostatakarzinom zeigen
eine Alteration des AR [5, 6]. So können die Eigenschaften des AR durch den Austausch
von nur einer Aminosäure gravierend verändert sein. Eine Aktivierung des AR durch
Androgene, Östrogene und sogar Antiandrogene wird möglich [7-13]. Durch den Austausch
von Threonin durch Alanin an Position 878 lässt sich ein solcher AR (in diesem Fall der AR-
Mutant „AR T878A“) durch Androgene, Östrogene und Antiandrogene aktivieren [10]. Eine
solche Mutation spricht somit wenig bis gar nicht auf eine Hormontherapie an.
2
Neben dem AR ist auch eine Rolle von weiteren Proteinen in der Pathogenese des
Prostatakarzinoms dokumentiert. So zeigen neben diesem vor allem das Tumor Protein 53
(Tp53), der E-twenty-six Transkriptionsfaktor (ETS) und das Tumorsuppressorgen PTEN
Mutationen in PCa-Zellen [5, 6].
Der Verlust des Tumorsuppressors PTEN führt zur Stimulation der Proliferation der PCa-
Zellen durch den PI3K-AKT Signalweg und genomischer Instabilität. Es wurde spekuliert,
dass dieser Umstand eine Fusion des ETS-related-gene (ERG) und des androgenabhängigen
Transmembrane-protease-serine (TMPRSS) Promoters begünstigt. Daraus ergibt sich eine
durch Androgen gesteuerte Expression von ERG, welche Proliferation, Invasion und
Aggressivität des PCa beeinflusst [14, 15]. Wie ERG kann auch ETS mit TMPRSS
fusionieren und die Expression dadurch über Androgene gesteuert werden, was ebenfalls ein
wichtiger Mechanismus in PCa ist [16].
Auch der Verlust von Tumorsuppressorgenen ist relativ häufig in PCa-Zellen. Besonders
hervorzuheben sind neben PTEN und p53 das Retinoblastoma Tumor-Suppressor-Gen und
das NKX3-1 Gen [17-19].
Interessanterweise zeigten Prostatakarzinome nach längerer Behandlung mit
Androgenantagonisten eine Verminderung der AR Expression. Als Kompensation wird
jedoch der Epidermal-Growth-Factor Receptor (EGFR) hinaufreguliert und ermöglicht dem
Tumor auf diesem Weg wieder Proliferation [20]. Festuccia et al. schlossen aus dieser
Erkenntnis, dass eine kombinierte Therapie mit Antiandrogenen und EGFR Inhibitoren
sinnvoll wäre und der bisher verwendeten Monotherapie überlegen sein könnte [20].
Weiters konnten Varambally et al. zeigen, dass das Protein Histon – Lysin N –
Methyltransferase EZH2 bei PCa hinaufreguliert ist [21]. Diese Überexpression führt zu
erhöhter Invasivität und Progression. Außerdem zeigte sich, dass Überexpression von EZH2
zu erhöhter Sarkosinproduktion führte [21]. Sarkosin wiederum scheint die Expression des
EGF – Rezeptors HER2 zu induzieren was Proliferation und Androgenunabhängigkeit der
PCa Zellen zur Folge hat [22].
1.1.3 Klinik
Prostatakarzinome breiten sich zunächst lokal entlang der Nerven aus und infiltrieren im
späteren Verlauf das umliegende Gewebe und Organe. Die Metastasierung erfolgt
hämatogen und lymphogen. Von der Metastasierung ist bevorzugt das Skelett betroffen,
wobei sich häufig Metastasen in Wirbelsäule, Femur und Beckenknochen finden [2].
3
Neben der allgemeinen B-Symptomatik von Tumoren wie Gewichtsverlust und
Nachtschweiß ergeben sich aufgrund der anatomischen Lage auch viele andere Symptome
des PCa. Trotzdem bleiben gerade am Anfang Patienten oft symptomlos. Mit zunehmender
Tumorgröße kann es dann aber zum Beispiel zu Störungen beim Wasserlassen bis hin zur
Stauungsniere durch Obstruktion der Harnröhre kommen. Auch Schmerzen im
Bewegungsapparat bis hin zu pathologischen Frakturen sind je nach Lokalisation und
Ausdehnung der Knochenmetastasen möglich.
1.1.4 Diagnostik
1.1.4.1 Etablierte Verfahren
Ein Durchbruch in der Labordiagnostik des PCa gelang 1970 mit dem Nachweis des
Prostataspezifischen Antigens (PSA) [23].
Bei PSA handelt es sich um ein Glykoprotein welches prinzipiell von Männern und Frauen
synthetisiert wird. PSA konnte bei Männern im Prostataepithel, aber auch bei Frauen im
Brustgewebe nachgewiesen werden. PSA zählt zur Proteinfamilie der Kallikreine und
fungiert als Serinprotease [24]. Man unterscheidet freies und gebundenes PSA wobei beim
gebundenen Protein je nach Carrier-Protein 5 Subtypen unterschieden werden können [25-
27].
Beim Mann wird PSA vom Epithel der Prostata produziert und der Samenflüssigkeit
beigemengt. Dort bewirkt es durch Aufspaltung von Semenogelin eine Verflüssigung des
Ejakulates [28]. Eine Erhöhung von PSA im Serum lässt auf einen möglichen pathologischen
Prozess in der Prostata schließen, da durch Zelluntergang, Biopsie oder Malignom PSA ins
Blut diffundieren kann. So kommen erhöhte PSA-Werte zum Beispiel bei Entzündung in
Form einer Prostatitis, bei Zunahme der Zellmasse der Prostata in Form einer benignen
Prostatahyperplasie (BPH) oder aber auch bei neoplastischen Geschehnissen – einem
Prostatakarzinom – vor. Neben der PSA-Analytik hat sich auch die digital rektale
Untersuchung (DRU) etabliert. Dabei wird die Prostata über das Rektum ertastet um
Größenzunahme und/oder Formveränderungen zu erkennen.
Ein Screening sollte allen Männern mit erhöhtem Risikoprofil bezüglich PCa angeboten
werden. Das betrifft über 50 Jahre alte Männer, 45jährige Männer mit positiver PCa-
Familienanamnese, Afroamerikaner, 40 Jahre alte Männer mit einem PSA-Wert von
>1ng/ml und 60jährige Männer mit einem PSA-Wert von >2ng/ml. PSA und DRU Befund
bestimmen auch ob biospiert werden soll oder nicht. Jedoch sollte immer das individuelle
4
Risikoprofil evaluiert werden und nicht nur aufgrund einer reinen PSA-Erhöhung eine
Biospie durchgeführt werden, da diese auch mit Komplikationen verbunden sein kann. Die
Biopsie selbst erfolgt unter Zuhilfenahme von Ultraschall. Als die drei häufigsten
Komplikationen der Biopsie kommen Hämatospermie (37,4% der Patienten betroffen),
Hämaturie > 24h (14,5% der Patienten betroffen) und rektale Blutungen < 48h (2,2% der
Patienten betroffen) vor [3].
Zur Abschätzung der Prognose des PCa hat sich das System nach Gleason durchgesetzt.
Dieses nach Donald F. Gleason benannte und 1966 publizierte Gradingsystem berücksichtigt
die Drüsenarchitektur des Tumorgewebes [29]. Je nach histologischem Erscheinungsbild des
Tumorgewebes wird von Gleason 1 bis Gleason 5 unterschieden, wobei Gleason 1
hochdifferenzierte und Gleason 5 keine ersichtliche Differenzierung bedeutet. Der Gleason
Score errechnet sich durch Summation des häufigsten und zweithäufigsten Gleason –
Musters, bei Vorliegen nur eines Musters durch Verdoppelung von diesem [2].
Für die weiterführende Diagnostik und Staging stehen Magnetresonanztomographie (MRT),
Computertomographie, Szintigraphie und Ultraschall zur Verfügung [3].
1.1.5 Therapie
Es stehen verschiedene Therapieprotokolle zur Verfügung. Entscheidend sind der Wunsch
des Patienten und eine Nutzen-Risiko Abwägung. So macht es wenig Sinn bei Patienten mit
Komorbiditäten und einer eingeschränkten Lebenserwartung eine aggressive PCa-Therapie
durchzuführen, mit der Gefahr die Lebensqualität des Patienten zu vermindern.
Für ein konservatives Vorgehen stehen zwei Strategien zur Verfügung, nämlich watchful
waiting und active surveillance. Bei beiden Strategien wird eine sofortige und unnötige
Therapie vermieden, stattdessen wird beobachtet um bei Voranschreiten der Erkrankung
rechtzeitig intervenieren zu können. Besteht ein kurativer Ansatz, und wird eine
Lebenserwartung >10 Jahren erwartet entscheidet man sich für active surveillance. Zur
Verlaufskontrolle stehen dabei PSA-Bluttests, DRUs und regelmäßige Biopsien nach
definierten Protokollen zur Verfügung. Handelt es sich hingegen um einen palliativen
Therapieansatz, ist watchful waiting die Strategie der Wahl. Bei watchful waiting richtet sich
die Verlaufskontrolle nach dem Patienten und der Fokus liegt eher auf den Symptomen und
deren zeitlicher Veränderung [3]. Ziel beider Strategien (watchful waiting und active
surveillance) ist die Minimierung der toxischen Nebenwirkungen der Therapie [30-32].
Als operativen Therapieansatz steht die radikale Prostatektomie zur Verfügung. Dabei wird
die gesamte Prostata zwischen Blase und Harnröhre entfernt. Zusätzlich werden auch beide
5
Samenbläschen und umgebendes Gewebe reserziert. Ziel ist eine komplette Entfernung von
Tumorgewebe. Dies kann auch die Resektion der pelvinen Lymphknoten beinhalten. Da
auch diese Operation ein gewisses Risiko birgt, sollte vor allem bei Patienten mit
Komorbiditäten abgewogen werden ob eine Prostatektomie sinnvoll ist. Patienten mit einer
geschätzten Lebenserwartung von >10 Jahren profitieren eher von dieser Methode.
Operationstechnisch stehen neben radikaler retropubischer und perinealer Prostatektomie
auch minimal invasive Techniken wie laparoskopische und Roboter-assisitierte-
laparoskopische Operationsmethoden zur Verfügung, wobei Roboter-assistierte minimal
invasive Techniken in den USA bereits als Goldstandard gelten [3].
Neben konservativen und operativen Methoden gibt es auch noch die Möglichkeit mit
Strahlung auf den Tumor zu wirken. Mehrere Techniken stehen zur Verfügung. Als
Goldstandard gilt dabei die Intensity Modulated Radiation Therapy (IMRT). Die Intensität
der Strahlung kann während der Behandlung verändert werden und erlaubt somit höhere
Intensitäten als bei konventionellen Methoden. Durch Bildgebung vermessen, kann der
Tumor im dreidimensionalen Raum gezielt bestrahlt und umliegendes Gewebe geschont
werden [33].
Eine weitere Säule der Therapie von PCa ist die Hormon-Therapie (Androgen Deprivation
Therapy) die einer chemischen Kastration entspricht. Es handelt sich um eine Anti-
Hormontherapie. Ziel ist es die Wirkung der Androgene auf den Tumor zu hemmen. Eine
Verminderung der Androgenwirkung kann über verschieden Mechanismen erreicht werden.
So kann zum Beispiel die Sekretion von Androgen durch operative Entfernung des
Syntheseortes (operative Kastration) vermindert, oder durch die Gabe von Antiandrogenen
die Wirkung direkt am Rezeptor gehemmt werden. Goldstandard ist nach wie vor die
operative Kastration [3].
Für die medikamentöse Kastration stehen Luteinisierendes-Hormon-releasing-Hormon
(LHRH) Agonisten und Antagonisten, Östrogene und Antiandrogene zur Verfügung.
Beim Einsatz von LHRH Agonisten wird die Synthese des Luteinisiernden Hormons (LH)
und des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) hinaufreguliert, was zu einer Down-
Regulation des LHRH Rezeptors führt und letztendlich eine Verminderung von LH und FSH
bewirkt. Es kann jedoch durch die anfangs überschießende FSH und LH Stimulation zu
einem sogenannten flare-up Phänomen kommen, welches bei den LHRH Antagonisten nicht
vorkommt [3]. LHRH Antagonisten binden kompetitiv an den LHRH Rezeptor und
bewirken eine sofortige Verminderung von FSH, LH und Testosteron. Nachteil bei diesen
Substanzen ist die Formulierung der Medikamente. Im Gegensatz zu LHRH Agonisten gibt
6
es für LHRH Antagonisten keine langwirkenden Depot-Formulierungen. Eingesetzte
Pharmaka sind Abarelix (LHRH Agonist) und Degarelix (LHRH Antagonist) [3].
Neben Östrogenen und LHRH Antagonisten/Agonisten, kommen wie schon erwähnt auch
Antiandrogene zum Einsatz. Unterschieden werden steroidale und nicht-steroidale
Antiandrogene. Bei ersteren handelt es sich um synthetische Derivate von
Hydroxyprogesteron. Als steroidale Antiandrogene kommen Cyproteronacetat,
Megestrolacetat und Medroxyprogesteronacetat zum Einsatz. Nilutamid, Flutamid und
Bicaltumid werden als nicht-steroidale Antiandrogene eingesetzt. Als neue Substanzen
stehen Abirateron und Enzalutamid zur Verfügung. Abirateron vermindert über Hemmung
von CYP17 die intrazelluläre Testosteronkonzentration, Enzalutamid wirkt als nicht-
steroidales Antiandrogen und blockiert zusätzlich noch den Transport des AR zum Zellkern,
was eine agonistische Wirkung ebenfalls unterbindet [3].
1.1.6 Sarkosin – ein neuer Marker für die Diagnose von Prostatakrebs?
Ein großes Problem bei den bisherigen PCa Screeningmethoden ist, dass keine
Unterscheidung zwischen harmlosen und aggressiven Tumoren möglich ist. Dieser Umstand
führt zu Überdiagnosen, was Patienten einer Therapie zuführt (mit möglichen
Nebenwirkungen), obwohl die Behandlung gar nicht oder noch nicht nötig gewesen wäre.
Es zeigte sich, dass der Einfluss der Behandlung auf das Überleben nur minimal ist, da
Übertherapie und Überdiagnose die Fälle überdecken, welche von einer Behandlung
wirklich profitieren würden [34].
2009 untersuchten Sreekumar et al. [35] 262 klinische Proben auf Tumormetabolite und
konnten das Glycinderivat Sarkosin (N-Methylglycin) als möglichen PCa Marker
identifizieren [36].
Es wurden in dieser Studie 42 Gewebeproben (16 benigne, 12 klinisch lokale PCas und 14
metastatische PCas) und jeweils 110 Urin- und Plasmaproben untersucht. Insgesamt wurden
in der Analyse 1126 Metabolite gefunden wovon allerdings nur 176 in allen drei getesteten
Tumortypen vorkamen. Die gemessenen Metabolit-Konzentrationen zeigten eine sehr gute
Korrelation mit der Aggressivität der Tumoren. Es stellte sich heraus, dass Gewebeproben
den Urin- bzw. Plasmaproben überlegen waren, da hier eine bessere Differenzierung der
Probenkategorien möglich war. So wurden Metabolite in Gewebeproben von benignen,
klinisch lokalen, und metastasierenden PCas untersucht. Von 547 in den Gewebeproben
gefundenen Substanzen wurden 37 identifiziert, die eine Unterscheidung zwischen benignen
und lokalen PCa zulassen. 91 von insgesamt 533 erlaubten die Unterscheidung zwischen
7
lokalen und bereits metastasierenden PCa. Nur sechs Metabolite, darunter Sarkosin,
erlaubten eine Unterscheidung zwischen benignem Geschehen, lokalem PCa und
metastatischem PCa. Sarkosin wurde daher als Tumormarker diskutiert, da es in benignen
Gewebeproben nicht nachweisbar war und somit eine mögliche Früherkennung zulassen
würde [36].
Außerdem konnte gezeigt werden, dass Sarkosin verglichen zu Biopsie-negativen Proben in
Biopsie-positiven signifikant erhöht im Urinsediment nachweisbar war. Somit könnte eine
invasive Biopsie durch eine einfache Sarkosin-Urinuntersuchung umgangen werden.
Weitere Stärken von Sarkosin als diagnostischer Marker zeigten sich bei Fällen bei denen
ein Ergebnis von 2-10ng/ml PSA vorlag. In diesem Bereich ist der PSA-Test inkonklusiv in
Bezug auf die Diagnose PCa. Bei Untersuchung von Patienten mit PSA-Werten in diesem
Konzentrationsbereich zeigte sich eine erhöhte Sakosinkonzentration als verlässlicher
Indikator eines PCas [36].
Varambally et al. [21] konnten zeigen, dass Überexpression von EZH2 in benignen Zellen
zu Zellinvasion und neoplastischer Progression führt. Da die Sarkosinkonzentration in
malignen Zellen mit hohem Invasionspotential ebenfalls erhöht waren, untersuchten
Sreekumar et al. [35] den Zusammenhang zwischen Sarkosin und EZH2. Es zeigte sich, dass
Überexpression von EZH2 in benignen Zellen zu einer Erhöhung, Knockdown von EZH2
zu einer Verminderung der Sarkosinkonzentration führte. Weiters führte die Zugabe von
Sarkosin zu benignen Epithelzellen der Prostata zur Ausprägung eines invasiven Phänotyps.
Die Autoren schlossen daraus, dass Sarkosin direkt mit der Invasionsfähigkeit in PCa
assoziiert verbunden sein könnte.
Enzyme, welche im Sarkosinmetabolismus involviert sind, könnten somit potentielle
therapeutische Targets von PCa darstellen so die Autoren weiter.
Die Autoren eines Reviews aus dem Jahr 2013 sahen in Sarkosin und dem Schlüsselenzym
im Sarkosinmetabolismus - Glycin N-Methyltransferase (GNMT) - vielversprechende
Kandidaten als nicht-invasive Marker für PCa [37].
Generell geht der Trend in der PCa Diagnostik Richtung Multiplextestung von mehreren
zuverlässigen Tumormarkern wie zum Beispiel EZH2, Glutathion-S-Transferase P-1
(GSTP-1) und des TMPRSS-ETS Fusions-Gen. Genauere Untersuchungen und gezielte
Therapien könnten so ermöglicht und Überdiagnose und Übertherapie verhindert werden.
Weiters spielt die Probengewinnung eine wichtige Rolle, da so Biopsien vermieden und ein
Screening erleichtert werden könnte [23].
8
1.2 Dimethylglycindehydrogenase und andere Enzyme im
Sarkosinmetabolismus
Das Enzym Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH) ist ein mitochondriales Flavoprotein,
welches die Reaktion von Dimethylglycin unter Abspaltung einer Methylgruppe zu Sarkosin
katalysiert (Abb.1) [38, 39]. Im Körper wird DMGDH hauptsächlich in Hepatozyten und
Tubuluszellen der Niere gebildet [40-42]. DMGDH ist als Enzym des Cholinstoffwechsels
für einen Demethylierungsschritt hin zu Glycin verantwortlich [39, 43]. Chemisch gesehen
spielt Cholin als Baustein für Biomoleküle eine wichtige Rolle. Gebunden an Acetat
ermöglicht Cholin in Form des Neurotransmitters Acetylcholin im Zentralnervensystem die
Übertragung von Nervenimpulsen an der Synapse. In Kombination mit Phospholipiden trägt
Cholin als Phosphatidylcholin maßgeblich zur Zellintegrität bei [44].
DMGDH katalysiert die Umwandlung von Dimethylglycin zu N-Methylglycin (=Sarkosin).
Sarkosin wiederum kann als Substrat für weitere Enzyme dienen und weiter zu Glycin weiter
abgebaut werden [39, 43].
Abbildung 1: Enzyme im Cholinstoffwechsel. Dargestellt ist der stufenweise Abbau von Cholin bis hin zu Glycin. Cholin wird durch die Enzyme Cholindehydrogenase (CHD), Betainaldehyd-Dehydrogenase (BAD) und Betain-Homocystein-S-Methyltransferase (BHMT) zu Dimethylglycin umgewandet. Dimethylglycin wiederum kann durch das Enzym Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH) zu Sarkosin umgewandelt werden. Dabei wird die Methylgruppe auf den Kofaktor Tetrahydrofolsäure (THF) übertragen. Dabei reagiert THF zu N-5,10-methyl-THF. Die so übertragene Methylgruppe kann wiederum für andere Synthesen verwendet werden. Die freiwerdenden Elektronen werden auf Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD+) übertragen und FAD+ wird zu Dihydro-Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2) reduziert. Diese in Form von FADH2 gespeicherten Elektronen können über Umwege in die Atmungskette eingeschleust und zur Energieumwandlung verwendet werden. Das Produkt der von der DMGDH katalysierten Reaktion – Sarkosin – kann durch die Enzyme Sarkosindehydrogenase (SARDH) und Pipecolinsäure- und Sarkosinoxidase (PIPOX) weiter zu Glycin demethyliert werden. Auch DMGDH kann die Demethylierung von Sakosin katalysieren. Umgekehrt kann Sarkosin durch Mehtylierung auch aus Glycin synthetisiert werden. Diese Reaktion katalysiert das Enzym Glycin-N-methyltransferase (GNMT). Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Peter Augustin aus [39] entnommen.
Wie in Abb. 1 ersichtlich, sind viele Enzyme an der Metabolisierung von Cholin hin zu
Glycin beteiligt. Cholin wird zuerst durch das Enzym Cholindehydrogenase zu
Betainaldehyd umgewandelt, welches dann erneut durch Cholindehydrogenase mit dem
Kofaktor Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) zu Betain und Dihydro-Flavin-Adenin-
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Dinukleotid (FADH2) metabolisiert wird. In Folge katalysiert das Enzym Betain-
Homocystein-S-Methyltransferase die Umwandlung von Betain zu Dimethylglycin. Als
Methylgruppenakzeptor dient L-Homocystein welches zu L-Methionin methyliert wird.
Dimethylglycin dient wie schon erwähnt nun als Substrat für DMGDH. Mit den Kofaktoren
Tetrahydrofolsäure (THF) und FAD+ katalysiert die DMGDH die Demethylierung von
Dimethylglycin zu Sarkosin [39, 43]. THF nimmt dabei die freiwerdende Methylgruppe auf
und reagiert zu N-5,10-Methyl-THF; FAD wird zu FADH2 reduziert. FADH2 kann die
aufgenommenen Elektronen über Umwege dann in die Atmungskette einschleusen, Methyl-
THF hingegen kann die Methylgruppe als Methyldonator auf andere Biomoleküle
übertragen [39].
Für die weitere Umwandlung von Sarkosin zu Glycin steht dem Körper das Enzym
Sarkosindehydrogenase (SARDH) zur Verfügung. Unter anaeroben Bedingungen und
Abwesenheit von THF entsteht bei der Demethylierung von Dimethylglycin oder Sarkosin
aus dem Methylrest Formaldehyd, bei aeroben Verhältnissen und Anwesenheit von THF
wird die Methylgruppe auf THF übertragen; N-5,10-methyl-THF entsteht und kann wie
schon oben beschrieben weiter reagieren [45].
Glycin kann jedoch auch methyliert und dadurch zu Sarkosin umgewandelt werden. Dabei
erfolgt die von der SARDH-katalysierte Reaktion in umgekehrter Richtung. Verantwortlich
als Katalysator für diese Reaktion ist die Glycin-N-Methyltransferase (GNMT). GNMT
methyliert mit Hilfe von S-Adenosylmethionin (SAM) Glycin am Stickstoffatom zu
Sarkosin, wobei S-Adenosylmethionin seine Methylgruppe abgibt und zu S-
Adenosylhomocystein reagiert [46]. GNMT gilt als der wichtigste Regulator der SAM-
Konzentration in den Mitochondrien [39].
GNMT und SARDH sind wichtige Enzyme des Sarkosinmetabolismus in PCa-Zellen.
Interessanterweise konnte beim PCa eine Hochregulation von GNMT beobachtet werden
[47-49]. Zudem führte ein Silencing der Expression vonSARDH zum gleichen Effekt wie
eine Überexpression von GNMT. Resultat waren erhöhte Sarkosinkonzentrationen und
verstärktes Tumorwachstum. Ausknocken von GNMT führte zu einer Verminderung der
GNMT-Expression um 70% was letztendlich zu einer Verminderung der Zellproliferation
und der Induktion von Zelltod führte [47]. Wie erwartet führte auch die Überexpression von
SARDH zu vergleichbaren Effekten. In einem Mausmodell führte eine Überexpression von
SARDH und gleichzeitiges Knockdown von GNMT zu einer Verminderung des
Tumorwachstums um 75% [47]. Ottaviani et al. konnten weiters zeigen, dass das GNMT-
10
Gen eine androgenabhängige Promoterregion besitzt [49]. Dies wurde zwar auch schon von
Sreekumar et al. vermutet jedoch fehlten genauere Untersuchungen. Im Gegensatz zu
GNMT und SARDH wurde die DMGDH im Lichte des PCas noch kaum untersucht.
Binzak et al. konnten 2001 zeigen wie sich ein Fehlen von DMGDH auf den menschlichen
Phänotyp auswirkt. In der Studie wird der Fall eines 38-jährigen Afroamerikaners mit
homozygoter DMGDH Mutation resultierend in einer Inaktivität von DMGDH beschrieben.
Auffällig war ein starker Körpergeruch des Patienten nach Fisch, Muskelschwund und
erhöhte Dimethylglycin Konzentrationen in Serum und Urin [50].
In Anbetracht der potentiellen Konsequenzen durch das Fehlen von DMGDH sind die
Symptome allerdings überraschend mild [50].
1.3 Hypothese
Bisherige Studien haben eine eindeutige Assoziation der Enzyme GNMT und SARDH mit
dem Sarkosin-Metabolismus und der Aggressivität von PCas festgestellt. Eine mögliche
Rolle der DMGDH in der Progression des PCas wurde bislang jedoch nur spärlich
untersucht. Die vorliegende Arbeit soll in Form einer Pilotstudie den Nachweis der
Expression der DMGDH in drei klassischen PCa-Zelllinien (LNCaP, DU-145, PC-3)
erbringen und die Rolle der DMGDH in zellulären Prozessen wie Survival, Proliferation und
Migrationsverhalten erörtern.
1.4 Ziele
Es konnte bisher gezeigt werden, dass Sarkosin eine Rolle im PCa-Tumormetabolismus
spielt und als potentieller Marker für PCa in Betracht kommt. Da Sarkosin durch mehrere
Enzyme synthetisiert bzw. wieder degradiert, wird liegt der Fokus auf genau diesen
Enzymen. Eines davon ist DMGDH und wurde im Gegensatz zu GNMT und SARDH noch
nicht so intensiv untersucht. Daher liegt das Ziel dieser Arbeit darin zu untersuchen, wie
wichtig DMGDH für die Sarkosinsynthese in PCa-Zellinien ist. Dies geschieht auf
Proteinebene mittels Immunfluoreszenz und Western Blotting und auf mRNA Ebene mittels
qPCR. Anschließend erfolgt ein Silencing der DMGDH-Expression mit Hilfe eines sHRNA-
Konstrukts unter Verwendung eines lentiviralen Vektors. In generierten stabilen Klonen mit
Silencing der DMGDH sollen die intrazelluläre Sarkosinkonzentration sowie etwaige
Alterationen in der Genexpression von SARDH und GNMT bestimmt werden. Zusätzlich
werden mit den Zellen noch funktionelle Versuche durchgeführt um die Auswirkungen des
11
DMGDH-Silencings auf die Proliferation und Zellmigration zu untersuchen. Dazu werden
der WST-1 Assay und der Wound-healing Assay verwendet. Außerdem wird untersucht, ob
die Expression von DMGDH durch Androgene (Testosteron, Dihydrotestosteron)
beeinflusst wird, was für die GNMT bereits demonstriert werden konnte. Die drei gut
etablierten PCa-Zelllinien PC-3, DU-145 und LNCaP wurden in dieser Studie als in vitro
Modelle für PCa herangezogen.
1.4.1 PC-3
Die PC-3 Zelllinie wurde aus einer Knochenmetastase eines 62 Jahre alten Kaukasiers mit
einem niedrig differenzierten Adenokarzinom (G4) generiert. Die PC-3 Zelllinie erwies sich
als Androgen-unabhängig. Bei den Zellen handelt es sich um epithelähnliche adhärent
wachsende Zellen, welche als Mono- oder Multilayer wachsen können. Die
Verdoppelungszeit der PC-3 Zellen beträgt ca 50h [51].
1.4.2 DU-145
Die DU-145 Zellen wurden aus der Tumormasse einer metastatischen Läsion im zentralen
Nervensystem eines 69 Jahre alten Patienten im Jahr 1975 gewonnen. Zellen dieses Typs
wachsen adhärent als Monolayer und sind epithelähnlich. Die Verdoppelungszeit von DU-
145 Zellen beträgt in etwa 30-40h. Neben PC-3 Zellen sind auch Zellen der DU-145 Linie
Androgen unabhängig [52, 53].
1.4.3 LNCaP
LNCaP Zellen wurden 1977 aus einer metastatischen Läsion im linken supraklavikulären
Lymphknoten eines 50 Jahre alten Mannes mit PCa gewonnen. Die Zellen sind adhärent und
wachsen einzeln oder in Form von Zellaggregaten [54]. Außerdem sind LNCaP Zellen im
Gegensatz zu den beiden anderen verwendeten Linien androgensensitiv [55]. Die
Verdoppelungszeit beträgt um die 60h [54].
12
2 Material und Methoden
2.1 Kultivierung der humanen Prostatakrebszellen
Für die Studie wurden die drei Zelllinien PC-3, DU-145 und LNCaP verwendet. Die
Zelllinien wurden vom Zentrum für Biomedizinische Forschung der Medizinischen
Universität Graz (Ass.Prof.in Priv.Doz.in Mag.a Dr.in Beate Rinner) bezogen. Als
Kulturgefäße dienten 25ml Zellkultur-Flasks (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland). Die
Zellen (LNCaP und DU-145) wurden in RPMI-1640-Medium (Sigma-Aldrich, Darmstadt,
Deutschland) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS-Superior, Biochrom, Berlin,
Deutschland) und mit Zusatz von 2mM Glutamin (Sigma Aldrich) und Penicillin-
Streptomycin Lösung (Penstrep®, Sigma Aldrich) mit einer Endkonzentration von 100 U/L
Penicillin und 100µg/ml Streptomycin im fertigen Medium kultiviert. Die Kultivierung der
PC-3 Zellen erfolgte in einem Misch-Medium bestehend aus 45% Ham´s F12 + 45% RPMI
1640 + 10% FBS mit Zugabe von Penstrep® und Glutamin (2mM). Die Kultivierung der
Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von
90%. Bei allen Zellen handelt es sich um adhärent wachsende Zellen. Zur Passagierung der
Zellen wurde das RPMI Medium abgehoben, die Zellen einmal mit Calcium/Magnesium
freiem Phosphatpuffer (CMF-PBS) gewaschen und anschließend mit 1ml Trypsin/EDTA-
Lösung (Sigma-Aldrich) gespült, wobei final 0,3ml der Trypsinlösung im Flask
zurückgelassen wurde. Danach wurden die Zellen im Brutschrank inkubiert (typischerweise
rund fünf Minuten) bis sich die Zellen abgerundet und vollständig von der Oberfläche der
Kulturflasche abgelöst haben. Nach diesem Schritt wurden 4,7ml Zellkulturmedium
zugesetzt und die Zellen darin resuspendiert. Abhängig von der Konfluenz der Zellen wurde
im Flask ein Aliquot der Zellsuspension zur weiteren Kultivierung zurückgelassen und mit
Zellkulturmedium auf 5ml aufgefüllt. Die restliche Zellsuspension wurde für Experimente
verwendet bzw. verworfen.
2.2 Transfektion der PCa-Zellen mittels lentiviralem Vektor
Für das Silencing der DMGDH in den PCa-Zelllinien wurde ein lentivirales Small hairpin
RNA (ShRNA) System von Santa Cruz Biotechnologies (Dallas, Texas, USA.) verwendet.
24h vor Transfektion der Zellen mit den Lentivirus-Partikeln wurden pro Well einer 24-Well
Platte 1ml Medium vorgelegt mit 1x105 Zellen ausgelegt und bis zur Transfektion über
Nacht im Brutschrank inkubiert um für den Zeitpunkt der Transfektion 50% Konfluenz zu
erreichen. Die Inkubation erfolgte in RPMI Medium mit Penstrep.
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Für die Transfektion wurde eine Lösung bestehend aus Zellkulturmedium und Polybrene®
(Santa Cruz Biotechnologies) hergestellt (finale Konzentration 5µg/µl). Das vorhandene
Medium wurde abgehoben und durch 1ml des mit Polybrene® versetzten Mediums ersetzt
(dazu wurden pro Well 0,5µl Polybrene®-Lösung zum Medium gegeben). Die zuvor bei
Raumtemperatur aufgetauten und vorsichtig resuspendierten Viruspartikel wurden nun zu
den Zellen hinzugegeben (pro Well 20µl Virussuspension) und die Zellen über Nacht
inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Polybrene® hältige Medium entfernt, durch
Polybrene® freies ersetzt und die Zellen wieder über Nacht in diesem Medium inkubiert.
Für die anschließende Selektion von stabilen Klonen mit Silencing der DMGDH wurden die
Zellen entsprechend der Herstellerangaben gesplittet und weiter in Polybrene® freiem
Medium 24h inkubiert und für die Selektion vorbereitet. Die Selektion der erfolgreich
transfizierten Zellen erfolgte durch Zugabe von Puromycin Dihydrochlorid (sc – 108071,
Santa Cruz Biotechnologies) in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration (10µg/ml).
Das Puromycin-hältige Medium wurde alle 4 Tage durch frisches Medium ersetzt.
Zur Kontrolle wurde ebenfalls eine Transfektion mit Kontroll ShRNA Virus Partikeln
(Control shRNA lentiviral Particles, sc – 108080, Santa Cruz Biotechnologies) durchgeführt.
2.3 Immunfluoreszenznachweis von DMGDH
Um das DMGDH Protein in den Zellen nachweisen und lokalisieren zu können wurde ein
monoklonaler IgG Maus-Antikörper (Klon E-6, Santa Cruz Biotechnologies) in einer
Verdünnung von 1/50 in CMF-PBS Puffer (mit 0,3% Igepal CA-630 /Sigma-Aldrich und
5% Goat-Serum/PAA, Pasching, Österreich) gegen DMGDH eingesetzt. Die eigentliche
Visualisierung erfolgte durch Bindung eines fluoreszierenden Sekundärantikörpers an den
primären Maus-Antikörper. Als Sekundärantikörper wurde ein polyklonaler IgG Ziegen
Anti-Maus Antikörper (Alexa Fluor® 555 Goat anti-mouse IgG Antibody, Biolegend®, San
Diego, CA, USA) in einer Verdünnung von 1/200 in CMF-PBS mit 0,3% Igepal verwendet.
2.3.1 Herstellung der Slides und Färbung
Für die Analyse der DMGDH-Expression wurden die Zellen geerntet und direkt auf sterilen
Objektträgern kultiviert. Die Fixation der Zellen erfolgte mit 4% Paraformaldehyd für
15min. Danach wurden die Zellen dreimal mit CMF-PBS gewaschen, luftgetrocknet und bis
zur Immunfluoreszenzfärbung bei -20°C gelagert.
Die vollständig mit Zellen bewachsenen Slides wurden aus dem Gefrierschrank (-20°C)
entnommen, aufgetaut und 30min im Abzug getrocknet. Auf den Slides wurden durch
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einfaches Wegwischen des Zellrasens jeweils zwei Zellfelder geschaffen und mit einem
Fettstift umrandet. Eines der Felder wurde mit Primärantikörper-Lösung beschickt
(=Testansatz), das zweite nur mit dem Färbepuffer ohne Antikörper (=Negativkontrolle).
Die Permeabilisierung der Zellmembranen erfolgte durch Tris-Buffered-Saline-Tween 20®
Puffer (TBST) für 5min. Beide Felder wurden mit den jeweiligen Lösungen bedeckt. Dazu
wurden ca. 300µl pro Feld veranschlagt um die Zellen gut zu bedecken. In einer feuchten
Kammer und gekühlt bei 4°C wurden die Slides über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag
wurde die Flüssigkeit auf den Slides abgegossen, die Slides in CMF-Puffer getaucht und
anschließend dreimal mit TBST Puffer für jeweils 5min gewaschen. Nach diesem Schritt
wurden pro Feld ca. 300µl Sekundärantikörper-Lösung aufgetragen. Da der
fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper lichtsensitiv ist, musste ab diesem Schritt unter
Lichtschutz gearbeitet werden. Die Proben wurden unter Lichtschutz bei Raumtemperatur
30min in der feuchten Kammer inkubiert. Nach diesen 30min wurden die Slides wieder in
CMF-Puffer getaucht und zwei Mal in TBST-Puffer für jeweils 5min gewaschen. Neben der
DMGDH-Färbung wurde noch eine Kernfärbung mit 4´,6-Diamidino-2-Phenylindol-
dihydrochlorid (DAPI, Sigma, 1µg/ml in CMF-Puffer) durchgeführt. Hier wurde ebenfalls
unter Lichtschutz gearbeitet. Die Slides wurden nach dem zweimaligen Waschen mit TBST-
Puffer mit DAPI-Lösung überschichtet. Nach 20 min wurden die Slides aus der DAPI-
Lösung entnommen, einmal gespült mit CMF-PBS und erneut einmal mit TBST-Puffer 5
min gewaschen und final wieder in CMF-Puffer getaucht um Reste von TBST zu entfernen.
Anschließend wurden die gefärbten Zellen mit Roti®Mount FluorCare Mounting-Medium
(Roth, Karlsruhe, Deutschland) überschichtet und mit einem Deckglas bedeckt. Die
Versiegelung der Slides erfolgte mit farblosem Nagellack.
Die anschließende mikroskopische Auswertung erfolgte mit einem Leica DM 4000 B
Mikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland), ausgestattet mit einer PC gekoppelten Leica DFC
300 FX Kamera und dazugehöriger Software vom Hersteller.
2.4 Western Blot
2.4.1 Probenvorbereitung
Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und je zweimal in CMF-PBS-Puffer
gewaschen. Bis zur Proteinisolierung wurden die Zellpellets bei -20°C gelagert.
Zu den Zellpellets (2x106 Zellen) wurden jeweils 150µl Lysis-Puffer (siehe Anhang)
zugegeben. Der Aufschluss der Zellen erfolgte am Vortex-Mischer und im Anschluss durch
Ultraschall in einem mit Eis gekühlten Ultraschallbad (6min). Dann wurde 10min unter
15
Kühlung bei 12000rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgehoben und in ein
neues Eppendorf-Gefäß gegeben. Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte mittels
PierceTM BCA Protein Kit Assay (Thermo Fisher Scientific). Dafür wurden die Reagenzien
und die einzelnen Proteinlösungen in eine 96 Well Platte entsprechend den
Herstellerangaben vorgelegt und 30min bei 37°C inkubiert. Daneben wurden noch Protein-
Standards (Bovines Serum Albumin) mit den Konzentrationen von 0,5mg/ml, 1mg/ml,
1,5mg/ml und 2mg/ml und als Leerwert ohne Proteinzugabe hergestellt. Die
Proteinbestimmung erfolgte mittels Photometer (Tecan Sunrise absorbance reader, Tecan,
Männedorf, Schweiz) bei 562nm. In Microsoft Excel wurde mit Hilfe der Proteinstandards
eine Standardgerade generiert und anhand dieser Gerade die Konzentration der einzelnen
Proteinlösung auf Basis der jeweiligen gemessenen Absorption berechnet.
2.4.2 SDS-PAGE und Blotting-Prozedur
Für die Auftrennung der Proteine mittels Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde ein Biorad® Mini-Protean II System verwendet. Als
Gel wurde ein selbst gegossenes 10%iges SDS Polyacrylamidgel verwendet. Über dem
10%igen Trenngel wurde ein 5%iges Stacking-Gel (inklusive Kamm zur Bildung von
Probentaschen) aufgetragen. In jede Kammer wurden jeweils 25µg Probe versetzt mit
Loading Dye pipettiert. Als Molekulargewichtsstandard wurde eine Prestained
Proteinstandard (Thermo Scientific) aufgetragen. Als Positivprobe wurde aufgereinigte
heterolog in Komagataella phaffi exprimierte humane DMGDH verwendet [39]. Das Gel
wurde in die Bio-Rad® Apparatur eingespannt und in Tris-Glycin Puffer getaucht. Weiters
wurde das Gel mit den Proben beladen und anschließend wurde für die Auftrennung der
Proteine die Spannung für 10min auf 120V, dann für 60min auf 160V eingestellt. Danach
wurde das Gel entnommen und es wurde der Transfer der Proteine (=Blotting) auf eine
Nitrocellulosefolie vorbereitet. Dazu wurden Nitrocellulose und Gel
übereinandergeschichtet und in den Transferpuffer bestehend aus Tris-Glycin Puffer,
versetzt mit Ethanol und Methanol, getaucht. Während des Blottingvorganges (200mA für
2h) wurde mit Eis gekühlt. Um die Blotting-Effizienz zu überprüfen wurde die Membran
mit Ponceau S-Lösung gefärbt. Die Nitrocellulose wurde so lange mit TBST gewaschen bis
die Anfärbung der Banden nicht mehr sichtbar war. Anschließend wurde die Membran mit
2%igem Milchpulver (Roth®) gelöst in TBST-Puffer geblockt (1h bei 4°C). Danach erfolgte
die Inkubation mit dem DMGDH-Primärantikörper (Santa Cruz Maus Anti-DMGDH, Klon
E-6, IgG 1/200 Verdünnung in 0,5%iger Milchpulver-TBST-Lösung). Die Membran wurde
16
1h bei 4°C gekühlt mit dem Primärantikörper inkubiert. Nach der Inkubation wurde die
Nitrocellulosemembran 3x jeweils 5min mit TBST-Puffer gewaschen. Danach erfolgte die
Zugabe des Sekundärantikörpers (Goat Anti-Mouse IgG konjugiert mit Horseradish
Peroxidase, 1/5000 Verdünnung in 0,5%iger Milchpulver-TBST-Lösung). Die Inkubation
erfolgte wieder gekühlt bei 4°C für 2h. Die Visualisierung der Banden erfolgte mittels
Chemiluminiszenz in der G Box (Syngene, Cambridge, UK) unter Verwendung von
Luminol (Super Signal West Pico chemiluminescent substrate, Thermo Scientific).
2.5 qPCR
2.5.1 RNA – Isolierung
Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet, durch Zentrifugation pelletiert, der
Überstand abgehoben und die Zellpellets bis zur weiteren Verwendung bei -20°C
tiefgefroren.
Um eine Beschädigung der RNAs zu vermeiden, wurde bei den Isolationsschritten auf Eis
gearbeitet. Die Proben wurden aus dem Gefrierschrank entnommen und sofort wurde
TriReagent RT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) in die Gefäße
zugegeben. Die mit TriReagent RT versetzten Proben wurden anschließend in 1,5ml
Probengefäße überführt und mit 50µl 4 - Bromanisol (BAN, Sigma-Aldrich) versetzt. Nach
diesem Schritt wurden die Gefäße 20x durch Kippen gut gemischt, 5min bei
Raumtemperatur inkubiert und um eine beschleunigte Phasentrennung zu erreichen bei
12000x g und bei einer Temperatur von 4°C 15min lang zentrifugiert.
Anschließend wurden 500µl des Überstandes abgehoben und in ein neues Eppendorf-Gefäß
pipettiert. Das Ausfällen der RNA erfolgte durch Zugabe von 500µl 2 – Propanol. Wieder
wurde 20x durch Kippen gemischt, 10min bei Raumtemperatur inkubiert und bei 12000x g
8min bei 4°C zentrifugiert. War ein RNA Pellet vorhanden, wurde der Überstand abgehoben
und zum RNA Pellet 1ml Ethanol 96% zugegeben. Anschließend wurde zentrifugiert (bei
7500x g, 4°C, 5min) und der Überstand möglichst gründlich entfernt. Die RNA wurde dann
bei Raumtemperatur getrocknet und je nach Pelletgröße mit 50 – 100µl Aqua bidest im
Thermoschüttler (300rpm, 10min) gelöst. Es folgte die Lagerung der Proben auf Eis und die
anschließende Messung der RNA Konzentration am NanoDrop® - Photometer (Thermo-
Fisher).
Für die Qualitätskontrolle der isolierten RNAs wurden je Probe 300ng RNA mit Aqua bidest
auf ein Volumen von 10µl aufgefüllt und mit 2µl 6x Loading Dye versetzt. Die Auftrennung
der Proben erfolgte durch in einem Ethidiumbromid-haltigem Argarosegel (1x TAE Puffer,
17
1% Argarose, 0,4µg/ml Ethidiumbromid) bei 70 Volt für 40min. Die Visualisierung der
RNA-Banden erfolgte mittels einem CHEMI-DOC XRS® System (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA)
2.5.2 Umschreiben der mRNA in cDNA
Für das Umschreiben der zellulären RNAs in cDNA wurde der High Capacity cDNA Kit
von Thermo Fisher verwendet. Es wurden insgesamt 2000ng RNA pro Probe eingesetzt.
Dazu wurden entsprechend der gemessenen RNA Konzentration nach der Isolierung das
entsprechende Aliquot entnommen und mit RNAse freiem Aqua bidest auf ein
Gesamtvolumen von 10µl aufgefüllt. Somit ergibt sich eine RNA Konzentration von
200ng/µl. Zu diesen 10µl Probe wurden anschließend noch 10µl Reaktionslösung
zugegeben. Die genaue Zusammensetzung der Reaktionslösung ist in Tabelle 1 angeführt.
Daraus ergibt sich eine neue Konzentration von 100ng RNA/µl. Als Kontrolle wurde noch
ein Ansatz mit Wasser anstatt RNA angesetzt. Anschließend erfolgte das Umschreiben der
RNA Fragmente in cDNA in einem C 1000 Thermal Cycler der Firma Bio-Rad®. In Tabelle
2 ist das verwendete Temperaturprogramm angeführt. Die gewonnene cDNA wurde bis zur
weiteren Verwendung bei -20°C im Gefrierschrank gelagert.
Tabelle 1: Zusammensetzung der Reaktionslösung für die cDNA Synthese
Bezeichnung Volumen pro Ansatz in µl
10x RT Buffer 2,0
25x dNTP Mix (100mM) 0,8
10x RT Random Primers 2,0
MultiscribeTM Reverse Transcriptase 1,0
Nucleasefreies Wasser 4,2
Gesamtvolumen 10
18
Tabelle 2: Temperaturprogramm verwendet in der cDNA-Synthese
Zeit Temperatur [°C]
10min 25
120min 37
5sec 85
Bis zur Entnahme 4
2.5.3 Quantifizierung der Expression Sarkosin-metabolisierender
Enzyme mittels qPCR.
Die Quantifizierung von DMGDH, SARDH und GNMT erfolgte mittels qRT-PCR durch
Verwendung von predesigned Taqman Assays (DMGDH: Assay ID Hs00919744_m1,
SARDH: Assay ID Hs00990344_m1, GNMT: Assay ID Hs00219089_m1, Applied
Biosystems/Thermo Fisher). Dabei wurde die zuvor in cDNA umgeschriebene mRNA als
Probe verwendet. Diese wurde dazu 1/20 verdünnt und das entsprechende Aliquot (20ng) in
einer PCR-Platte vorgelegt. Zu dieser Menge cDNA wurden die in Tabelle 3 angeführten
Komponenten hinzugegeben um die Reaktion starten zu können. Als Bezugsgröße und
Vergleich diente die parallele Analyse von 18S-RNA. Nach Zugabe aller Komponenten
wurde die PCR-Platte mit PCR Plate Seal versiegelt und 1 min bei 1000x g zentrifugiert.
Anschließend erfolgte die Amplifikation mittels PCR in einem C 1000 Thermal Cycler mit
CFX 96 Real Time System der Firma Bio-Rad®. Bei der Kontrolle wurden alle Substanzen
bis auf das Enzym zugegeben. Das Temperaturprogramm der PCR ist Tabelle 4 zu
entnehmen.
Tabelle 3: Zusammensetzung der PCR-Reaktionslösung
Bezeichnung Volumen pro Ansatz in µl
20x Gene Expression Assay 0,5
2x TaqMan Mastermix 5
cDNA 20ng 4
Wasser 0,5
19
Tabelle 4: Temperaturprogramm qPCR
Zeit Temperatur [°C]
1. 10min 95
2. 15sec 95
3. 1min 60
Zyklen (2. – 3.) 45x
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte als Cq-, Cq und Cq Werte (Tabelle 5). Beim
Cq Wert wird vom Cq Wert des Zielgens der Cq Wert des Housekeeping Gens (in diesem
Fall 18S RNA) abgezogen (Formel 1). Je größer der erhaltene Cq Wert eines untersuchten
Gens ist, umso geringer ist die Expression dieses Gens. Die relative Expression lässt sich
nach Einsetzen in Formel 2 berechnen. Neben Cq und Cq lässt sich auch noch der relative
Expressionsunterschied mittels Cq berechnen (Formel 3). Durch Einsetzen in Formel 4
ergibt sich dann der relative Expressionsunterschied zwischen den Proben mit einer Probe
als Bezugsgröße.
Tabelle 5: Berechnung von ∆Cq, relativer Expression, ∆∆Cq und des relativen
Expressionsunterschieds
Nummer Formel
1 ∆𝑪𝒒 = 𝑪𝒒(𝒁𝒊𝒆𝒍𝒈𝒆𝒏) − 𝑪𝒒(𝟏𝟖𝑺)
2 𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒆 𝑬𝒙𝒑𝒓𝒆𝒔𝒔𝒊𝒐𝒏 = 𝟐−∆𝑪𝒒
3 ∆∆𝑪𝒒 = ∆𝑪𝒒(𝑷𝒓𝒐𝒃𝒆) − ∆𝑪𝒒(𝑩𝒆𝒛𝒖𝒈𝒔𝒑𝒓𝒐𝒃𝒆)
4 𝒓𝒆𝒍𝒂𝒕𝒊𝒗𝒆𝒓 𝑬𝒙𝒑𝒓𝒆𝒔𝒔𝒊𝒐𝒏𝒔𝒖𝒏𝒕𝒆𝒓𝒔𝒄𝒉𝒊𝒆𝒅 = 𝟐−∆∆𝑪𝒒
2.6 Analyse der Expression Sarkosin metabolisierender Enzyme
in Abhängigkeit von Androgenstimulation
Für diesen Versuch wurden Zellen des Typs DU-145 (Androgenrezeptor negativ) und
LNCaP (Androgenrezeptor positiv) verwendet. Dazu wurden 106 Zellen in 25cm2
Kulturflaschen ausgesät und über Nacht inkubiert um ein Anhaften der Zellen zu
gewährleisten. Am nächsten Tag erfolgte der Austausch des Mediums und die Stimulation
der Zellen mit Androgenen (100µM Testosteron bzw. 100µM Dihydrotestosteron/Sigma-
Aldrich) oder mit Epidermal Growth Factor (2µg/ml rekombinantes EGF, Biolegend). Da
20
die Androgene in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich) gelöst wurden, wurde als
Vektorkontrolle jeweils ein Flask nur mit DMSO behandelt. Als weitere Kontrolle dienten
Zellen ohne Zusatz von weiteren Substanzen. Die Androgen-Lösungen wurden vor dem
Zusatz zur Zellkultur sterilfiltriert (0,2µm Porengröße). Die Inkubation der Zellen nach
Zugabe der Androgene bzw. EGF erfolgte für 48h im Brutschrank. Nach 48h wurde das
Zellkulturmedium abgesaugt und die Zellen in den Flasks bei -20°C bis zur weiteren Analyse
gelagert. Die Analyse der mRNA-Expression von DMGDH, SARDH und GNMT nach
Androgen bzw. EGF Stimulation erfolgte auf Ebene der mRNA mittels qPCR.
2.7 Mitochondrienfärbung mittels MitoRed®
Es wurden die Mitochondrien der Zelllinie DU-145 analysiert. Diese wurden dazu in
schwarzen 24 Well Klarbodenplatten (Biozym, Wien, Österreich), optimiert für
Fluoreszenzfärbungen kultiviert. Die Färbung der Mitochondrien erfolgte mit MitoRed von
Sigma-Aldrich®, die Kernfärbung wurde mittels Höchstfärbung realisiert. Es wurden pro
Well 5x104 Zellen (DU-145 Wildtyp versus DU-145 DMGDHsH-Klone) in einem Volumen
von jeweils 500µl Medium ausgelegt. Als Verdampfungsfalle wurden jeweils 500µl Wasser
in die übrigen leeren Wells gegeben.
Entsprechend der Herstellerangaben wurde eine 1mM MitoRed Lösung in DMSO
hergestellt. Die Zielkonzentration im Medium betrug 100nM. Weiters wurden noch
0,5µl/Well Höchst 33342-Reagenz (Molecular Probes/Thermo Fisher) für die Anfärbung der
Zellkerne zugesetzt. Anschließend erfolgte die Inkubation der Zellen laut Herstellerangaben
und eine Auswertung der Fluoreszenz mit einem ZOE Fluoreszenzmikroskop von Bio-
Rad®.
2.8 Messung der Zellproliferation mit WST-1-Assay
Die aus der Zellernte gewonnene Zellsuspension wurde am CASY Zellzähler vermessen und
so verdünnt, dass eine Suspension mit 3x104 Zellen/ml erhalten wurde. Daraus wurden in
jedes Well einer 96 Well-Platte jeweils 100µl dieser Lösung pipettiert was einer
Konzentration von 3x103 Zellen/Well entspricht. In den Wells an den Rändern der Platte
wurde keine Zellsuspension, sondern jeweils 100µl Wasser als Verdampfungsfalle
eingefüllt. Die Auswertung erfolgte nach 24h, 48h und 72h. Nach Inkubation der Zellen
entsprechend den angegebenen Zeitspannen wurden pro Well 10µl WST-1-Reagens (Roche,
Mannheim, Deutschland) zugegeben und die jeweilige Platte für 60min im Brutschrank
inkubiert. Die Messung erfolgte danach photometrisch bei 450nm mit dem Tecan Sunrise
21
Photometer. Die Messungen pro Versuch erfolgten in Triplikaten. Um die Ergebnisse der
einzelnen Experimente besser vergleichen zu können, wurden die erzielten Messwerte auf
den Zeitpunkt 24h (=100%) bezogen.
2.9 Messung der Zellmigration mit Wound-healing Assay
Um die Zellmigration der DU-145 DMGDHsH-Klone beurteilen zu können, wurde auf die
Methode Wound-Healing Assay zurückgegriffen. Im klassischen Wound-Healing Assay
wird in einem Zellrasen mit einer Pipettenspitze eine „Wunde“ (wound) erzeugt. Über einen
gewissen Zeitraum wird nun das Schließen der Wunde beobachtet, was in erster Linie vom
Migrationsverhalten der Zellen abhängt. In unserem Setting wurde jedoch keine „Wunde“
erzeugt, sondern ein System von IBIDI® (Martinsried, Deutschland) verwendet. Es handelt
sich dabei um eine Zweikammer-Silikon Form welche in ein Well eingesetzt wird und
danach mit Zellsuspension befüllt wird. Die Zellen haften sich an den Boden der Platte,
jedoch trennt eine Wand die beiden Kammern voneinander und verhindert so die
Ansiedelung der Zellen in diesem Bereich. Es entsteht ein zellfreier Streifen der nach
Entfernung des Inserts von Zellen besiedelt werden kann. Wie schnell die Zellen diese
Fläche bedecken hängt von der Zellmigration ab. Je mehr Fläche pro Zeiteinheit abgedeckt
wird, desto höher die Zellmigration.
22
Abbildung 2: Schematische Darstellung des IBIDI®-Systems. Zunächst wird die IBIDI® Silikonform mit einer Pinzette in ein Well eingesetzt (1). Anschließend erfolgt die Befüllung der beiden Kammern mit jeweils 70µl Zellsuspension (2). Nach Inkubation über Nacht haften sich die Zellen am Boden der Zellkulturplatte an und die IBIDI®-Form kann entfernt werden (3). Nach Auffüllen des Wells mit Medium können die Zellen den freien Raum zwischen den beiden Feldern besiedeln (4). Wie schnell diese Besiedelung erfolgt hängt in erster Linie von der Zellmigration ab.
Die IBIDI® Silikonkammern wurden in einer 24 Wellplatte platziert. Dabei war darauf zu
achten, dass guter Kontakt zwischen dem Boden der Silikonform und dem Boden der Platte
gewährleistet war um ein Auslaufen der Zellsuspension in den zellfreien Bereich zu
verhindern. Die durch Trypsinierung gewonnene Zellsupension wurde am CASY gemessen
und derart verdünnt, dass eine Suspension mit einer Konzentration von 4,71x105 Zellen/ml
erhalten wurde. Jeweils 70µl dieser Zellsuspension wurden in die beiden Kammern der
Inserts pipettiert. Anschließend wurde die Platte über Nacht im Brutschrank inkubiert um
die Adhäsion der Zellen zu ermöglichen. Danach wurden die Inserts entfernt und die Wells
mit 1ml Medium gespült. Anschließend wurde pro Well 1ml Medium mit 1% FBS zugesetzt.
Bei manchen Proben wurde als Kontrolle 10ng/ml EGF zugesetzt um die Migration der
Zellen zu stimulieren. Die Auswertung der Migration erfolgte mittels ZOE
Fluoreszenzmikroskop zum Zeitpunkt t=0 (Wegnahme der Inserts), t=6h, t=12h und t=18h.
Um zu gewährleisten, dass immer dieselbe Stelle fotografiert wurde, erfolgte eine
Markierung an der Unterseite der 24 Well Platte. Die Auswertung der Bilder und die
Quantifizierung der Migration der Flächen erfolgte mit Paint und ImageJ. Dazu wurde der
Prozentsatz der zellfreien Oberfläche gegen die Zeit aufgetragen. Pro DMGDHSh-Klon
wurden jeweils drei unabhängige Versuche durchgeführt.
23
2.10 Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration mit
HPLC
Die Messung von Sarkosin in der Zellsuspension erfolgte mit einem stable-isotope-dilution-
assay und high performance liquid chromatography (HPLC) in Kombination mit einem
Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometer auf einem Voyager TSQ Quantum triple
Quadrupol, ausgerüstet mit einem Ultimate 3000 chromatography System (Thermo
Instruments, San Jose, Californien). Sarkosin wurde nach der Derivatisierung mit
Phenylisothiocyanat (PITC) mit einer Phenomenex Zorbax Eclipse XDB-C18 (100 x 3mm,
3,5µm) Säule mit einem linearen Gradienten (mobile Phase A: 0,2% Ameisensäure, v/v und
B: 0,2% Ameisensäure in Acetonitril, v/v) bei einem flow von 0,5ml/min bei einer
Temperatur von 30°C getrennt. Sarkosin und der interne Standard (Sarkosin-d3
hydrochlorid, Toronto Research Chemicals, Canada) wurden durch ein multiple reaction
monitoring (MRM) quantifiziert. Das Sarkosin-Isomer Alanin konnte chromatographisch
gut abgetrennt werden.
2.11 Statistische Verfahren
Die Daten wurden als Mittelwerte plus/minus Standardabweichung dargestellt.
Signifikanztestung erfolgte mittels ANOVA. Ein p-Wert von p<0,05 wurde dabei als
signifikant eingestuft. Für graphische Darstellungen von Kurven und Diagrammen wurde
Microsoft Excel 2016, für Signifikanztestung das Programm SigmaPlot 11.0 verwendet.
24
3 Ergebnisse
3.1 DMGDH wird in den Zelllinien LNCaP, PC-3 und DU-145
exprimiert
Zunächst galt es zu bestimmen ob und wie viel DMGDH in den PCa Zellen exprimiert wird.
Der Nachweis der DMGDH-Expression wurde mittels qPCR, indirekter Immunfluoreszenz
und Western-Blotting realisiert. Es konnte gezeigt werden, dass DMGDH in den
verwendeten PCa-Zelllinien zumindest schwach exprimiert wird. Die qPCR-Experimente
zeigten in den PCa-Zellen Cq-Werte für die DMGDH von ≥35 und daraus sehr hohe
resultierende ∆Cq-Werte bezogen auf die Expression der 18sRNA (Abb. 3).
Die Immunfluoreszfärbung (Abb. 4) wies auf Expression der DMGDH in allen drei
getesteten Zelllinien hin, da in allen Zelllinien ein Fluoreszenzsignal detektiert werden
konnte. Der versuchte Nachweis der Expression der DMGDH mittels Western-Blotting
zeigte jedoch kein spezifisches Ergebnis (Abb. 5). Nach Inkubation mit dem Anti-DMGDH
Primärantikörper und anschließender Visualisierung mit Peroxidase-markiertem
Sekundärantikörper und Chemilimineszenz konnte kein Signal auf der Laufhöhe von
100kDa (Molekulargewicht der DMGDH: 97kDa) beobachtet werden. Als Positivkontrolle
wurde im Western-Blotting Assay aufgereinigte humane DMGDH mitgeführt, die ein
spezifisches Signal auf der Höhe von 100kDa zeigte.
Abbildung 3: Quantifizierung der DMGDH-Expression in PCa-Zelllinien. Dargestellt sind die ∆Cq-Werte inklusive Standardabweichung (resultierend aus jeweils drei technischen Replikaten) aller drei analysierten Zelllinien. Als Referenz diente 18sRNA. Je höher die ∆Cq-Werte, desto geringer die Enzymexpression. In diesem Fall sind die ∆Cq-Werte alle >24 (PC-3: ∆Cq= 26,31±0,30, LNCaP: ∆Cq= 25,58±0,51, DU-145: ∆Cq= 24,05±0,77), was für eine geringe Expression der DMGDH in den analysierten Zelllinien spricht.
25
Abbildung 4: Nachweis der DMGDH-Expression in humanen PCa-Zelllinien mittels indirekter Immunfluoreszenz. Blau: DAPI Kernfärbung, Orange: indirekte DMGDH Färbung. Originale Vergrößerung 630x. Links ist der jeweilige Testansatz, rechts die jeweilige dazugehörige Negativkontrolle (Ansatz ohne Primärantikörper) dargestellt. Da die Zellen eine unterschiedliche Zellmorphologie (DU-145: flach ausgebreitet versus LNCaP: spindelförmig, PC-3: teils spindelförmig teils ausgebreitet) aufweisen und die Belichtungszeit bei der mikroskopischen Analyse unterschiedlich eingestellt wurde, ist eine Aussage zur etwaigen Expressionsunterschieden nicht
26
möglich. Wie in der Negativkontrolle erkennbar, konnte kein unspezifisches Signal des Sekundärantikörpers beobachtet werden.
Abbildung 5: Versuch des Nachweises der DMGDH in DU-145 und LNCaP Wildtypzellen mittels Western-Blotting Assay. A: Als Proben wurden LNCaP Wildtypzellen (Position 1) und DU-145 Wildtypzellen (Position 2) analysiert. Weiters wurden Klone mit stabilem Silencing der DMGDH (DMGDHsH) DU-145 Klon 3 (Position 3), DU-145 Klon 5 (Position 4), DU-145 Klon 6 (Position 5) und DU-145 Klon 10 (Position 6) aufgetragen. Die Probe DU-145 ShControl ist auf Position 8 aufgetragen. Als Referenz diente reine DMGDH (Position 10) und ein Lysat der Leberzelllinie HepG2 (Position 9). Der Nachweis von reiner DMGDH zeigt eine Bande bei 100kDa. Die Zellproben hingegen zeigen ein Signal bei etwa 40kDa. B: Als Loading-Kontrolle wurde α/β-Tubulin verwendet. Die Reihenfolge der Proben ist ident mit jener von A. Es zeigen sich Banden bei 55kDa, was dem Molekulargewicht von α-Tubulin entspricht. Der Molekulargewichtsstandard mit dessen Hilfe das Molekulargewicht der Banden bestimmt wurde, wurde auf Position 7 aufgetragen, ist jedoch am Blot nicht sichtbar.
3.2 Erfolgreiches Silencing der DMGDH-Expression in PCa-Zellen
Insgesamt konnten in der DU-145-Zelllinie 12 Klone, in der PC-3-Zelllinie 14 Klone und in
der LNCaP-Zelllinie 6 Klone mit Resistenz gegenüber dem Selektionsantibiotikum
Puromycin gewonnen werden. Um zu verifizieren, ob in diesen stabilen Klonen auch ein
Silencing der DMGDH vorlag, wurde die DMGDH-Immunfluoreszenzfärbung als
Screeningmethode (Abb. 6) gewählt. DMGDH-qPCR wurde als Bestätigungs-Assay
eingesetzt. In der Immunfluoreszenzfärbung wurde eine Intensitätsminderung des DMGDH-
Signals als Verminderung der Expression gedeutet. Alle generierten Zellklone wurden dabei
jeweils einer Doppeluntersuchung unterzogen. Bei zweimaliger beobachteter
Intensitätsminderung wurden die Klone für eine PCR Untersuchung selektioniert. In den
Zelllinien DU-145 und PC-3 konnten jeweils 5 Klone mit offensichtlicher Downregulation
der DMGDH-Expression identifiziert werden (Abb. 6). In der LNCaP-Zelllinie konnte
jedoch kein einziger Klon mit verminderter DMGDH-Expression gefunden werden (Abb.
6). Schon das Anzüchten von LNCaP-Zellklonen gestaltete sich nach Transfektion bzw.
27
Selektion schwierig, da sich LNCaP-Einzelzellen in Zellkulturplatten nur sehr schlecht
vermehren lassen.
Der Nachweis des Silencings der DMGDH in der DU-145-Zelllinie mittels Western-Blotting
zeigte dieselben Ergebnisse wie schon beim Nachweis von DMGDH in den Wildtyp-Zellen.
Bei den Wildtyp-Zellen trat wiederum eine Bande bei etwa 40kDa auf, bei den getesteten
DMGDHsH-Klonen – jedoch auch bei der sH-Kontrollzelllinie-nicht (Abb. 6)
Die qPCR-Untersuchung der DU-145 Klone mit dem offensichtlich effektivsten Silencing
(Abb. 7) zeigte eine teils sehr starke Verminderung der DMGDH-Expression (obwohl
ohnehin schon sehr schwach exprimiert) im Vergleich zum Wildtyp. Interessanterweise
zeigte der DU-145 DMGDHSh-Klon 2 keine Verminderung der DMGDH mRNA-
Expression. Es muss jedoch erwähnt werden, dass jeweils nur eine PCR-Untersuchung
durchgeführt wurde.
28
Abbildung 6: Nachweis des Silencings der DMGDH in humanen PCa-Zelllinien auf Proteinebene. A: DMGDH-Immunfluoreszenzfärbung von PCa Zellen nach DMGDH-Silencing mittels sHRNA. Als repräsentative Beispiele sind einzelne DMGDHsH Zellklone der Zelllinien PC-3, DU-145 und LNCaP im direkten Vergleich zu den jeweiligen Wildtyp-Zellen gezeigt. Im Gegensatz zu den DU-145 und PC-3-Zellen konnten keine LNCaP-Klone mit verminderter Fluoreszenzintensität in der DMGDH-Färbung identifiziert werden. Alle mikroskopischen Fotos wurden jeweils mit derselben Belichtungszeit aufgenommen. Blau: DAPI Kernfärbung, Orange: indirekte DMGDH-Färbung. DU-145/PC-3: Originale Vergrößerung: 400x, LNCaP: 200x. B: Western-Blotting nach Silencing der DMGDH mit DU-145-Zelllysaten. I: Aufgetragen sind Lysate von DMGDHsH Klon 3 (Pos. 1), Klon 5 (Pos. 2), Klon 6 (Pos. 3) und Klon 10 (Pos. 4) im Vergleich zu den Wildtyp Zellen (Pos. 5) und der ShControl (Pos. 7). Weiters wurde ein Proteinstandard zur Größenbestimmung (Pos. 6) und reine
29
DMGDH (Pos. 8) als Positivkontrolle verwendet. Da der Größenstandard durch keine Immunfärbung sichtbar gemacht wurde, wurden die Standardbanden aus der Ponceau S Färbung nachträglich in die Abb. eingefügt. DMGDH besitzt ein Molekulargewicht von 97kDa. Bei den Klonen ist auf der Höhe von 100kDa keine Bande erkennbar, beim Wildtyp hingegen zeigt sich eine Bande bei etwa 40kDa. II: Nachweis von α/β-Tubulin als Loading Control. Die Reihenfolge der Proben entspricht jener in A. Zu erkennen sind Banden bei 55kDa, was dem Molekulargewicht von α/β-Tubulin entspricht. III: Färbung der Membran mit Ponceau S. Zu erkennen ist auf Position 6 der Größenstandard.
Abbildung 7: Quantifizierung der DMGDH-Expression in DU-145 Zellen mittels qPCR nach Silencing mit sHRNA. Dargestellt ist die relative Expression der DMGDH bezogen auf 18sRNA der DU-145 DMGDHsH-Klone. Die DMGDH-Expression der Klone wurde in Verhältnis zum Wildtyp gesetzt. Es zeigt sich eine deutliche Verminderung der DMGDH-Expression nach Knockdown bei den DMGDHsH-Klonen 3, 5, 6 und 10 (DMGDHsH-Klon 3: 0,056±0,042, DMGDHsH-Klon 5: 0,0019±0,00074, DMGDHsH-Klon 6: 0,057±0,030, DMGDHsH-Klon 10: 0,022±0,0087). Beim DMGDHsH-Klon 2 konnte keine Verminderung der DMGDH-Expression gemessen werden (DMGDHsH-Klon 2: 1,1±0,41,). Die eingezeichnete Standardabweichung resultiert aus jeweils drei technischen Replikaten eines Versuchsansatzes.
3.3 Ergebnisse der Messung der Expression von SARDH und
GNMT nach Silencing der DMGDH
Ziel dieses Versuches war es zu beobachten, ob sich durch das Silencing der DMGDH auch
die Expression der GNMT und SARDH verändert, was auf ein eventuelles
Kompensationsverhalten in Bezug auf den Sarkosin-Metabolismus von PCa-Zellen
schließen lassen würde. Abb. 8 zeigt die SARDH und GNMT-Expression nach Silencing
der DMGDH. Entsprechend den Erwartungen führt eine Verminderung der DMGDH-
Expression zu einer Downregulation der SARDH-Expression. Interessanterweise führt das
Silencing der DMGDH jedoch auch zu einer Verminderung der GNMT Expression.
30
Abbildung 8: Relative Expression von GNMT und SARDH nach Silencing der DMGDH. Dargestellt ist die relative Expression von GNMT und SARDH nach Silencing der DMGDH in DU-145 DMGDHsH-Zellen. Als Bezugsgröße diente der Wildtyp. Die eingezeichnete Standardabweichung resultiert aus jeweils drei technischen Replikaten eines Versuchsansatzes.
3.4 Ergebnisse der Messung der Expression Sarkosin
metabolisierender Enzyme nach Androgenstimulation
Wie aus der Literatur bekannt [49], kann die Expression der GNMT durch Androgene
induziert werden. Da jedoch bezüglich Androgenstimulation von PCa-Zellen und DMGDH
noch keinerlei Informationen vorhanden waren, wurde ein Versuch durchgeführt um den
Einfluss von Androgenen auf die DMGDH-Expression in LNCaP-Zellen die den
Androgenrezeptor exprimieren zu erörtern. Um einen möglichen Link von EGF-Signaling
mit dem Sarkosin-Haushalt der PCa-Zellen zu überprüfen, wurden die PCa-Zellen auch mit
EGF stimuliert. Um unspezifische Reaktionen ausschließen zu können, wurde als Referenz
eine Androgen-unabhängige Zelllinie (in diesem Fall DU-145) verwendet. Es zeigte sich,
dass durch Stimulation der LNCaP-Zellen mit Testosteron bzw. Dihydrotestosteron die
Expression der GNMT um das Zehnfache anstieg, während es bei den DU-145-Zellen zu
keiner Änderung der GNMT-Expression kam (Abb. 9). EGF hatte in beiden Zelllinien
keinen offensichtlichen Einfluss auf die Expression der GNMT.
Im Gegensatz zur GNMT konnte bei der DMGDH keine spezifische Regulation der mRNA-
Expression durch Androgene (und EGF) nachgewiesen werden. Es kam zwar zu einer
scheinbaren Up-Regulation der Expression der DMGDH durch Androgene; jedoch sowohl
in Anwesenheit (LNCaP), als auch in Abwesenheit (DU-145) des Androgenrezeptors, was
einer Androgenrezeptor-abhängigen Regulation der DMGDH-Expression widerspricht.
Eine Induktion/Repression der SARDH-Expression durch Androgene oder EGF konnte
ebenfalls nicht nachgewiesen werden.
31
Abbildung 9: Androgenabhängigkeit der Expression Sarkosin-metabolisierender Enzyme in humanen PCa-Zellen. LNCaP (A, Androgenrezeptor positiv) und DU-145 (B, Androgenrezeptor negativ) wurden 24h mit Testosteron (T, 100µM), Dihydrotestosteron (DT, 100µM) oder Epidermal Growth Factor (EGF, 2µg/ml) behandelt. Die mRNA-Expression der Sarkosin-metabolisierenden Enzyme Glycin-N-methyltransferase (GNMT), Dimethylglycindehydrogenase (DMGDH) und Sarkosindehydrogenase (SARDH) wurde mittels qPCR bestimmt. Der Balken der DMGDH-Expression in LNCaP-Zellen (A) nach Dihydrotestosteron-Behandlung wurde abgeschnitten, da der gemessene Wert mehr als 10mal so hoch ist (240,5±137,2).
3.5 Visualisierung der Mitochondrien mittels MitoRed® in DU-145
DMGDHsH-Klonen
Da es sich bei der DMGDH um ein mitochondriales Enzym handelt, wurde analysiert, ob
sich durch das Silencing der DMGDH die Morphologie der Mitochondrien, die
mitochondriale Masse bzw. die Distribution der Mitochondrien in den DU-145-Zellen
ändert. Für diesen Zweck wurden die Zellen mit MitoRed® gefärbt und mit dem ZOE-
Fluoreszenzmikroskop analysiert (Abb. 10). Es zeigte sich hier das typische Bild der
Mitochondrien – teils vesikuläre und vorwiegend tubuläre Strukturen im Cytosol der Zellen.
Im Vergleich zwischen den Wildtyp-Zellen und einzelnen DMGDHsH-Klonen sah man im
32
Fluoreszenzmuster keine erkennbaren Unterschiede, die auf Alterationen in Bezug auf
Morphologie bzw. Distribution der Mitochondrien in Folge des Silencings der DMGDH
hinweisen würden.
Abbildung 10: Vergleich der Mitochondrienlokalisation zwischen DU-145 Wildtypzellen und DMGDHsH-Klonen. Blau: Höchst Kernfärbung, Rot: Mitochondrienfärbung mittels MitoRed®. Gezeigt sind Zellen des DU-145 Wildtyps und des DMGDHsH-Zellklons 5. Dieser Zellklon wies im in der qPCR-Analyse den höchsten Silencingeffekt der DMGDH auf. Zu erkennen sind die teils vesikulären, vorwiegend jedoch tubulären Strukturen der Mitochondrien – sowohl beim Wildtyp als auch beim DMGDHsH-Zellklon. Es konnten keine Alterationen der Zellmorphologie oder der Mitochondrienverteilung beobachtet werden.
3.6 Das Silencing der DMGDH hat keinen Einfluss auf die
Zellproliferation
Ziel dieses Versuchs war es zu evaluieren, ob das Silencing der DMGDH Einfluss auf die
Proliferation der DU-145-Zellen hat.
Abb 11 zeigt das Ergebnis dieser Versuchsserie. Die Proliferationsrate der DMGDHsH-
Klone – indirekt gemessen durch Analyse der Stoffwechselaktivität über einen Zeitraum von
72 Stunden – unterschied sich nicht signifikant von jener des Wildtyps. Es konnte daher
weder eine Proliferationssteigerung noch eine Inhibition des Wachstums durch das
DMGDH-Silencing beobachtet werden.
33
Abbildung 11: Ergebnisse des WST-1-Proliferations-Assays von DU-145 Zellen mit Silencing der DMGDH. Dargestellt ist die relative Signalzunahme (Absorption bei 450nm) der einzelnen Zellproben. Neben dem Wildtyp (WT) wurde zum Vergleich auch die DU-145 sHControl (Sh) analysiert. Gemessen wurde jeweils nach 24h (blau), 48h (orange) und 72h (grau). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bezogen auf die Referenzen (Wildtyp bzw. sHControl). n=3
3.7 Das Silencing der DMGDH beeinflusst das
Migrationsverhalten der PCa-Zellen nicht
Neben dem Einfluss auf die Zellproliferation wurde ebenfalls ein Einfluss auf die
Zellmigration der PCa-Zellen durch das Silencing der DMGDH erwartet. Deshalb wurde das
Migrationsverhalten der DU-145 DMGDHsH-Klone mittels Scratch/Wound-Healing Assay
getestet (Abb. 12). Als Kontrolle wurden Wildtyp-Zellen bzw. Wildtyp-Zellen behandelt mit
EGF eingesetzt.
Abb. 13 zeigt das Migrationsverhalten der verschiedenen DU-145 Zellklone. Die Klone
zeigen keine Alterationen bezüglich des Migrationsverhaltens durch das Silencing der
DMGDH. Interessanterweise konnte eine (jedoch nicht signifikante) Steigerung der
Zellmigration nach EGF-Behandlung beobachtet werden.
34
Abbildung 12: Wound-Healing Assay mit DU-145 Zellen. Gezeigt sind Bilder der DU-145 sHControl beim Start des Experimentes (0h), 6h und 12h. Durch die Migration der Zellen wird die zellfreie Fläche (als Wound oder Scratch bezeichnet) immer kleiner und kann gegen die Zeit aufgetragen werden. In der oberen Reihe sind die unbearbeiteten Bilder ersichtlich, darunter werden jeweils dieselben Bilder mit den markierten Grenzen des Zelllayers gezeigt. Die markierte zellfreie Fläche wurde mittels ImageJ ausgewertet.
Abbildung 13: Ergebnisse des Wound-healing Assays mit DU-145 Zellen versus DU-145 DMGDH-sH-Klone. Dargestellt ist die zeitabhängige prozentuale Flächenabnahme der „Wunde“. Dazu wurde die Fläche zum Zeitpunkt 0 (blauer Balken), nach 6h (oranger Balken), nach 12h (grauer Balken) und nach 18h (gelber Balken) gemessen. Bei diesem Versuch wurde zur Kultur der Wildtyp-Zellen (WT) auch noch Epidermal Growth Factor (EGF) zugesetzt. Außerdem diente als zusätzliche Referenz noch die DU-145 sHControl-Zelllinie (Sh). Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Migrationsverhaltens der getesteten DMGDHsH-Klone (Klone 2, 3, 5, 6, 10) bezogen auf den WT. Jedoch ist der Trend erkennbar, dass mit EGF behandelte Zellen die freie Oberfläche schneller bedecken und somit eine beschleunigte Zellmigration aufweisen könnten. n=3
35
3.8 Messung der Sarkosinkonzentration nach DMGDH
Knockdown
Sreekumar et al. konnten zeigen, dass Veränderungen der GNMT-, bzw. der SARDH-
Expression Einfluss auf die Sarkosinkonzentration in PCa-Zellen haben [47]. Inwieweit die
DMGDH in PCa-Zellen an der Sarkosinsynthese beteiligt ist, wurde hingegen noch nicht
gezeigt. Bei diesem Versuch wurde daher der Sarkosin-Gehalt von DU-145 Wildtyp-Zellen
mit jenen der Puromycin-resistenten Zellklone verglichen und in Korrelation gesetzt mit der
Effizienz des Silencings der DMGDH. Außerdem wurden Wildtyp-Zellen aller drei
eingesetzten Zelllinien analysiert und die jeweiligen intrazellulären
Sarkosinkonzentrationen mit den anderen verwendeten Zelllinien verglichen.
In Abb. 14 sind die Ergebnisse der Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration der
einzelnen DMGDHsH-Klone dargestellt. Es zeigen sich keine Unterschiede bezüglich der
intrazellulären Sarkosinkonzentration in den Klonen im Vergleich zum Wildtyp in
Abhängigkeit von der Effizienz des Silencings. Die DU-145 Klone 1 und 3-12 zeigen eine
ähnliche intrazelluläre Sarkosinkonzentration im Vergleich zum Wildtyp. Nur der DU-145
DMGDHsH-Klon 2 zeigt eine deutlich erhöhte Sarkosinkonzentration im Vergleich zum
Wildtyp. Am wahrscheinlichsten lässt sich dieses Resultat dadurch erklären, da die Zellen
des DU-145 DMGDHsH-Klons 2 im Vergleich zum Wildtyp (WT) und anderen Zellklonen
ein deutlich größeres Zellvolumen bzw. Zelldurchmesser aufweisen (Durchmesser WT-
Zellen: etwa 30µm, Klon 2: etwa 50µm) und daher in Folge pro Zelle mehr Sarkosin
speichern können als kleinere Zellen.
36
Abbildung 14: Messung der intrazellulären Sarkosinkonzentration in DU-145 DMGDHsH-Klonen. Als Referenz dienten der Wildtyp (WT) und die ShControl (Sh). K1-K12 sind die jeweiligen DMGDHsH-Zellklone nach Selektion (Klon 1-Klon 12). Bei K3, K5, K6 und K10 konnte eine Verminderung der DMGDH-Expression mittels qPCR und Immuncytochemie bestätigt werden.
37
4 Diskussion
Ziel dieser Pilotstudie war es, die Rolle des Enzyms Dimethylglycindehydrogenase im
Sarkosinmetabolismus von Prostatakrebszellen zu charakterisieren, da rezente Studien
gezeigt hatten, dass das Metabolit Sarkosin mit der Aggressivität von Prostatakrebs
korreliert [47]. Wir konnten zeigen, dass in den humanen Prostatakrebszelllinien PC-3, DU-
145 und LNCaP DMGDH-Expression auf mRNA-Ebene vorhanden ist. Die Expression des
Enzyms war jedoch äußerst schwach ausgeprägt. Für den Nachweis der DMGDH auf
mRNA-Ebene wurde jedoch ein TaqMan®-basierendes Detektionssystem verwendet,
welches (im Gegensatz zu SYBR Green basierenden Systemen) eine sehr hohe Sensitivität
und Spezifität aufweist [56].
Der Nachweis der DMGDH in PCa-Zellen auf Proteinebene war jedoch inkonklusiv, da die
Immunfluoreszenz-Assays Expression der DMGDH in allen drei getesteten Zelllinien
suggerierten, jedoch ebenfalls durchgeführte Western Blotting-Experimente keinen
spezifischen Nachweis der DMGDH in den PCa-Zellen erbrachte. Es wurden in den PCa-
Proteinlysaten Banden bei 40kDa beobachtet, obwohl das DMGDH-Signal bei 100kDa zu
erwarten wäre. Als Positivkontrolle für den DMGDH Western-Blotting-Assay wurde
aufgereinigte humane DMGDH verwendet, die wie erwartet ein Signal bei 100kDa zeigte.
Dies legt nahe, dass die Western-Blotting-Methodik per se funktioniert hat. Eine
unspezifische Bindung des Antikörpers im Western Blotting Assay und wahrscheinlich auch
im Immunfluoreszenz-Assaykann daher nicht ausgeschlossen werden. Der verwendete
DMGDH-Antikörper kann laut Herstellerangaben sowohl für Immunfluoreszenz als auch
für Western-Blotting verwendet werden, was eine applikationsabhängige Limitation des
Antikörpers in Abhängigkeit der Konformation des Epitops ausschließt [57].
Interessanterweise konnte durch die Anwendung eines lentiviralen Systems zum Silencing
der DMGDH eine weitere Verringerung der Expression des Enzyms (obwohl schon in den
Wildtyp-Zellen sehr niedrig) - nachgewiesen werden. Bei 4 von 5 getesteten DU-145
DMGDHsH Klonen konnte bestätigt werden, dass die Expression der DMGDH sowohl auf
Protein- (Immunfluoreszenz) als auch auf mRNA-Ebene (qPCR) im Vergleich zum
jeweiligen Wildtyp erniedrigt war. Trotz des negativen gebliebenen Western-Blotting
Nachweises des Enzyms in den PCa-Zellen erhärtet dies die Spezifität des Versuchsansatzes.
Ottaviani et al. hatten bereits 2013 gezeigt, dass die Expression des Enzyms GNMT durch
Androgene reguliert wird [49]. Eine Regulation der Expression der DMGDH in PCa-Zellen
durch Androgene ist bislang in der Literatur noch nicht dokumentiert. Um die mögliche
38
Induzierbarkeit der DMGDH-Expression durch Androgene zu überprüfen wurden PCa-
Zellen (LNCaP und DU145-Zellen) mit Testosteron oder mit Dihydrotestosteron behandelt.
Es zeigte sich wie erwartet, dass die LNCaP-Zellen die den Androgenrezeptor exprimieren
mit einer Upregulation der DMGDH-Expression (mRNA-Level) reagieren, die
Androgenrezeptor-negativen DU145-Zellen jedoch nicht. Bei der DMGDH fand man keine
Androgen/Androgenrezeptor-abhängige Regulation, was nicht darauf schließen lässt, dass
die DMGDH-Expression abhängig von Androgenen ist.
Das Silencing der DMGDH führte weder zu einer Verminderung noch zu einer Erhöhung
der intrazellulären Sarkosinmenge. Nach Khan et al. führte die Überexpression des Sarkosin-
degradierenden Enzyms SARDH in PCa-Zellen in Bezug auf die intrazelluläre
Sarkosinkonzentration zum gleichen Effekt wie das Silencing des Sarkosin-produzierenden
Enzyms GNMT, nämlich zu einer Verringerung der Sarkosinkonzentration. Die
Überexpression von GNMT hingegen führt zu einer Erhöhung des intrazellulären
Sarkosinlevels [47]. Die DMGDH scheint demnach nur eine untergeordnete Rolle in Bezug
auf die Sarkosinsynthese in PCa-Zellen, zumindest in den analysierten PCa-Zellinien zu
spielen. Um zu testen, ob es durch das Silencing der DMGDH zu einer Änderung der
Expression der GNMT bzw. SARDH in den PCa-Zellen kommt, wurde die Expression
dieser Enzyme in den DMGDHsH-PCa-Klonen überprüft. Interessanterweise wurde durch
das Silencing der DMGDH in mehreren DMGDHsH-Klonen auch die Expression von
GNMT und SARDH vermindert. Damit konnte auch die Hypothese eines
Kompensationsmechanismus nach Silencing der DMGDH über eine mögliche Upregulation
der Sarkosin-produzierenden GNMT nicht bestätigt werden.
Weiters führte das Silencing der DMGDH hinsichtlich des Proliferations- und
Migrationsverhaltens der PCa-Zellen zu keinen Alterationen. Nach Khan et al. beeinflussen
GNMT und SARDH diese Parameter indirekt durch Erhöhung bzw. Verminderung der
intrazellulären Sarkosinkonzentration [47]. Aufgrund der Beobachtungen in unserer Studie,
dass die DMGDH keinen Einfluss auf die intrazelluläre Sarkosinkonzentration hat, erscheint
eine fehlende Alteration von Proliferation bzw. Migration als sehr wahrscheinlich, da diese
Parameter laut Khan et al. maßgeblich von der Sarkosinkonzentration abhängen.
Eine beschleunigte Zellmigration nach EGF-Stimulation konnte bislang nur bei Zellen der
PC-3 Zelllinie beobachtet werden [58]. Wie auch PC-3 Zellen exprimieren jedoch auch
39
Zellen der DU-145 Linie keinen Androgenrezeptor [53]. Auch wenn bei unseren Messungen
kein signifikantes Ergebnis vorlag, konnte dennoch ein Trend hinsichtlich beschleunigter
Zellmigration nach EGF Zugabe in DU-145 Zellen beobachtet werden. Mehr Experimente
müssen in Zukunft noch durchgeführt werden um die stimulierende Rolle von EGF auf das
Migrationsverhalten der DU145-Zellen weiter zu überprüfen, jedoch erscheinen die bis jetzt
gewonnen Resultate diesbezüglich durchaus plausibel. Bei PCas konnte nach antiandrogener
Therapie eine Überexpression des EGF-Rezeptors HER-2/neu in PCa-Zellen beobachtet
werden [20, 59]. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein direkt proportionaler
Zusammenhang zwischen Sarkosinkonzentration und EGFR-Expression besteht [22]. So
kann durch Erhöhen der intrazellulären Sarkosinmenge eine Expressionssteigerung von Her-
2/neu erreicht werden [22]. Die von uns gemessenen sehr hohen Sarkosinkonzentrationen in
Zellen der DU-145 Linie im Vergleich zu LNCaP Zellen wären demnach mit diesem
Umstand vereinbar. Die Frage ob die Androgen-Unabhängigkeit (inklusive Steigerung der
EGFR-Expression) als Folge der hohen Sarkosinkonzentration anzusehen ist oder ob die
hohe Sarkosinkonzentration die Folge der Androgen-Unabhängigkeit ist konnte diese Studie
nicht beantworten.
Um einen eventuellen Zusammenhang zwischen dem EGF-Signalling und dem Sarkosin-
Metabolismus zu finden, wurde überprüft, ob sich die Expression Sarkosin-
metabolisierender Enzyme in Antwort auf EGF in DU-145 Zellen ändert. Dies war nicht der
Fall, was auf keine transkriptionelle Kontrolle durch EGF auf Sarkosin-metabolisierende
Enzyme hindeutet. Zukünftige Versuche müssen noch klären ob EGF einen Einfluss auf den
intrazellulären Sarkosingehalt hat.
Weiters gilt es zu klären, welche Auswirkungen der Entzug von Nährstoffen auf den
Sarkosinmetabolismus im Allgemeinen und speziell auf die Enzymexpression der DMGDH,
SARDH und GNMT hat, da bei den in dieser Studie verwendeten Nährmedien ein
Nährstoffüberangebot vorhanden war. PCa-Zellen könnten Sarkosin in Zeiten mit
vermindertem Nährstoffangebot als Methylquelle bzw. Aminosäurequelle verstoffwechseln.
Dazu könnte die Expression der im Sarkosinmetabolismus beteiligten Enzyme beeinflusst
werden. Zukünftige Versuche könnten diesen Aspekt genauer untersuchen.
Aufgrund der Forschungsergebnisse von Khan et al. und Sreekumar et al. wurde Sarkosin
bereits als neuer PCa-Tumormarker vorgeschlagen. Allerdings lieferten weiterführende
Studien widersprüchliche Ergbnisse [35, 37, 47, 60, 61] und Sarkosin ist nach wie vor kein
klinisch genutzer Parameter für die Diagnosestellung eines PCa. Obwohl die bisherigen
Ergebnisse einen Zusammenhang zwischen Sarkosin und PCa nahelegen, konnten die
40
Details der Rolle von Sarkosin im Tumormetabolismus noch nicht endgültig geklärt werden.
Außerdem konnte, wie schon bei einer früheren Studie gezeigt wurde [36], durch die
Analyse der Sarkosinkonzentration in Urin und/oder Serum nur unter bestimmten
Voraussetzungen ein Vorteil in der Diagnostik gegenüber der bisherigen PSA Bestimmung
erreicht werden. Ankerst et al. untersuchten die Datenlage erneut und kamen zu
widersprüchlichen Ergebnissen. In ihrer Studie aus dem Jahr 2015 kamen sie
zusammenfassend zum Schluss, dass die Serumbestimmung von Sarkosin nicht als
Screeningmethode zur PCa-Früherkennung verwendet werden sollte. Zusätzlich raten die
Autoren Sarkosin trotz der Datenlage aus früheren Studien nicht weiter als Tumormarker zu
verfolgen [60]. Lima et al. verwiesen in ihrer Studie auf die Schwierigkeiten der Auswertung
der gewonnenen Daten beiMetabolomics-Studien. Problematisch wären die enormen
Datenmengen und die statistische Aufbereitung bzw. Auswertung dieser. Weitere
Fehlerquellen würden Probenvorbereitung und analytische Methoden betreffen. In Summe
betrachtet würden diese Umstände die Inhomogenität der erzielten Studienergebnisse
unterschiedlicher Arbeitsgruppen erklären so die Autoren [62].
Letztlich stellt sich die Frage wie wichtig die DMGDH für den Sarkosinmetabolsimus von
PCa Zellen wirklich ist. Aufgrund der von uns gewonnenen Daten scheint die DMGDH eine
eher untergeordnete bis gar keine Rolle im Sarkosinmetabolismus in den von uns
verwendeten PCa-Zelllinien zu spielen. Trotzdem muss auf den Umstand hingewiesen
werden, dass es sich bei dem von uns verwendeten Modell um ein in vitro Modell handelt.
Die Daten können demnach nicht einfach auf solide Tumoren im menschlichen Organismus
übertragen werden. Die DMGDH ist zwar in den von uns verwendeten PCa-Zellen
vorhanden jedoch hat ein Wegfall dieses Enzyms keine Auswirkungen auf Survival,
Migration, Proliferation, intrazelluläre Sarkosinkonzentration und Zellmorphologie. Ob ein
solches Verhalten auch im in vivo Modell beobachtet werden kann müssen künftige Studien
klären.
41
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47
48
Anhang - Lösungen
Calcium- und Magnesiumfreier Phosphatpuffer
(CMF-PBS)
8g NaCl
0,3g KCl
2g Glukose-Monohydrat
91,4g Dinatriumdihydrogenphosphat Dihydrat
0,02g Kaliumdihydrogenphosphat
Ad H2O auf 1L
pH-Wert 7,4
Tris-buffered saline Konzentrat (TBS 10x)
24g Tris-HCl
5,6g Tris-Base
88g NaCl
Ad H2O auf 1L
pH-Wert 7,6
Tris-buffered saline, Tween 20 (TBST-Puffer)
100ml TBS 10x
900ml H2O
500µl Tween 20
RIPA Puffer
50mM Tris-HCl, pH 8
150mM NaCl
1% NP-40
0,5% Natriumdeoxycholat
0,1% SDS
NP-40 Puffer
20mM Tris-HCl, pH 8
137mM NaCl
10% Glycerol
1% NP-40
2mM EDTA
Western Blotting Running buffer (5x)
15g Tris
71g Glycin
2g Glukose-Monohydrat
1,68g EDTA Dihydrat
6,25ml SDS
Ad H2O auf 1L
49
Western Blotting Transfer buffer (10x)
30g Tris
140g Glycin
Ad H2O auf 1L
Western Blotting Transfer buffer (1x)
100ml 10x Transfer buffer
100ml Ethanol 96%
100ml Methanol
Ad H2O auf 1L
Ponceau S Lösung
0,2% Ponceau S
3% TCA
50
Anhang – ISC Poster
Ergebnisse der Studie wurden am Internationalen Student Congress (ISC) 2016 in Graz in
Form eines Posters präsentiert. Das Poster wurde außerdem als beste Posterpräsentation
ausgezeichnet.