CHIPS DE PROTEINAS

DE GENÓMICA A PROTEÓMICA

PROTEOMA es el conjunto de proteínas codificado por el genoma.

El estudio del proteoma es la PROTEÓMICA

• Proteínas de cualquier célula

• Isoformas

• Proteínas modificadas

• Interacciones entre proteínas

• Descripción estructural de las proteínas

• Descripción estructural de los complejos proteicos

• Por extensión: cualquier cosa post-genómica

High-throughput Biochemistry

Proteómica (en la actualidad): Bioquímica de proteínas a gran escala con gran precisión y rendimiento.

Objetivo: Descripción completa de la función celular

Plataformas para la proteómica y genómica funcional

Escalabilidad de la proteómica

Genómica: GRAN escalabilidad PCR, secuenciadores automáticos,etc.

Proteómica: POCA escalabilidad. Motivos:

• Material limitado y variable

• Degradación de la muestra

• Rango dinámico de abundancia muy grande (106)

• Modificaciones post-traduccionales abundantes

• Especificidad temporal y de desarrollo

• Perturbaciones patológicas

• Perturbaciones farmacológicas

Análisis de proteínas a escala proteómica

Si queremos definir la:

- Identidad

- Cantidad

- Estructura

- Función

De todas o un grupo de proteínas

(dentro de un contexto celular)

Debemos de poder:

Generar un conjunto de CLONES que expresen las proteínas individuales

de todo o parte un PROTEOMA

Seguido de:

ANÁLISIS Proteínas en un formato ÚTIL

TÉCNICAS NECESARIAS

• Genéticas

• Bioquímicas

• Biología celular

• Construcción de chips

• Identificación de interacciones

• Localización de proteínas en compartimentos celulares

1. Expresión y purificación de proteínas

2. Pruebas de actividad a escala proteómica

a) Aproximación genómica bioquímica

b) Microarrays- Analíticos- Funcionales

1. Expresión y purificación de proteínas

Localización de los ORFs

(pautas abiertas de lectura)

Problemas:

- A veces difícil localización

- Señales de “splicing”

- Poliadenilación

Clonación de los ORFs

Problemas:

- Se trata de una simplificación

- Se elige un mRNA y se descartan las isoformas

- Las modificaciones posttraduccionales (fosforilación, glicosilación, metilación, acetilación) pueden no ser consideradas

- No vale para proteínas de membrana

Clonación de los ORFs

Requiere:

- Cebadores (“primers”) para la PCR

- Inserción en vectores

Métodos de síntesis de HT:

- Síntesis automática

- Precio razonable

- Rapidez y precisión

Inserción en vectores

A) Recombinación mediada por la reparación del hueco

B) Clonaje independiente de ligación (T4 polimerasa + dCTP o dGTP)

C) Sistema Gateway de Invitrogen (integración/excisión del fago )

Inserción en vectores

ExpresiónSistemas homólogos Es el mejor (modificaciones post traduccionales, interacciones con sus parejas proteicas, etc)

Sistemas heterólogos Son necesarios para muchos organismos. Una alternativa son las células de insecto (modificaciones similares a mamíferos)

Incorporación de marcadoresFusión de péptidos o proteínas a las proteínas de interés

Alta AFINIDAD y SELECTIVIDADConservación de la ACTIVIDAD

- Glutatión-S-transferasa / agarosa de glutatión- Marcador de Hisx6 / agarosa de Ni- Péptido de unión a calmodulina / agarosa de calmodulina- Proteína A / -inmunoglobulina- Combinación de anteriores con sitios de corte (trombina, TEV, etc)- Proteína de unión a maltosa- Epítopos: hemaglutinina, Myc y FLAG- Derivados de GFP. Detección mediante FRET

Detección GFP mediante FRET

PROBLEMAS GENERALES:- Cada proteína de fusión requiere un esquema y un protocolo diferente- Hay proteínas que no se dejan purificar- Hay proteínas que se inactivan al fusionarse

2. Actividad proteica a escala proteómicaa) Aproximación Bioquímica genómicab) Microarrays (Chips)

a) Aproximación bioquímica genómicaUso de análisis bioquímico en paralelo de grupos de proteínas provenientes de un proteoma. El objetivo es identificar a una

proteína como responsable de una función.

Clonación GST-ORF Expresión y purificación en grupos de 96

Ensayo bioquímico Grupos Positivos Subgrupos

Ensayo en los subgrupos Positivos (deconvolución)

Ventajas:- Rapidez de asignación de función a ORFs.- Válido para cualquier tipo de ensayo de actividad- Alta sensibilidad- Permite la detección de complejos proteicos

b) Microarrays

Objetivo: análisis de alto rendimiento, a gran escala de la función génica, de forma rápida y barata.

Metodología: las proteínas purificadas individuales se depositan en una superficie, generalmente una lámina de vidrio para analizar su actividad

Manufactura de chipsDeben retener la función de la proteínaSer compatibles con las tecnologías de fabricaciónDeben permanecer en un ambiente húmedo

Comparación con los chips de DNAChips de DNA:

- No dan información directa de la función génica- Sencillos de hacer

Chips de proteína:- información directa de función- Complejos de hacer, ya que la función proteica es dependiente de estado, como las modificaciones post-traduccionales, interacción con otras proteínas, localización subcelular, modificaciones covalentes reversibles, etc.

Sustratos blandosSe usan superficies de poliestireno, nitrocelulosa o PVDF.No permiten alta densidad de empaquetamientoLos puntos de aplicación difunden en la superficieRelación señal ruido muy bajosOrientación al azar

- Se hace una capa fina de polia-crilamida o agarosa sobre el vidrio- Se depositan las proteínas con fotolitografía- Se entrecruzan para inmovilizarlas

Estructuras de superficie 3D

VentajasAlta capacidad de inmovilizaciónAmbiente acuosoProteínas activas

DesventajasDifícil cambiar tamponesDifícil recuperar las moléculasOrientación al azar

Vidrio recubierto de PDMSSe hacen nanopocillos en los cuales se depositan las proteínasLas proteínas se inmovilizan por entrecruzamiento

Nanopocillos

Ventajas- Alta capacidad de inmovilización- Reducen la evaporación- Minimizan las contaminación cruzada- Minimizan ruido de fondo-Son abiertos, con lo que se pueden tratar secuencialmente con tampones, lavados , etc.- Recuperación de las muestras fácil

DesventajasRequiere equipo especializado, sofisticado y caroOrientación al azar

Vidrio

Unión de la proteína directamente en la superficie del vidrio o bien después de aplicar recubrimientos de diferentes tipos: - Poli-L-Lisina (adsorción)- Activación con aldehido (covalente)- Activación con epoxy (covalente)- Recubrimiento de oro (covalente)O bien - Biotina (afinidad)- Hisx6 (afinidad)

Ventajas-Enlace covalente disminuye probabilidad de alteración de la conformación nativa- Afinidad: orientación correcta

DesventajasGrupos –NH2 de cadenas laterales pueden modificar actividad.Afinidad: hay que biotinilar o marcar con Hisx6 todas las proteínas

Tipos de chipsSuperficie Ventajas Desventajas

Sustratosblandos 2D

PoliestirenoMembranas de nitrocelulosaPVDF (fluoruro depolivinilideno)(Adsorción y absorción)

No requiere modificar la proteina. Alta capacidad de retención de proteína

Unión no especifica de la proteína. Orientación al azar.Ruido de fondo. Chips de baja densidad

Estructurassuperficiales

3D

Poliacrilamida yagarosa(difusión)

No requiere modificar la proteina. Alta capacidad de retención de proteína

No disponibles comercialmente

Nano-pocillos

Vidrio recubierto de PDMS(polidimetilsilosano)(entrecruzamiento)

Unión fuerte y alta densidad de empaquetamiento

Oreintación al azar de las proteínas

Vidrio Vidrio soloCubierta de poli-L-LysActivación con aldehido Activación con epoxyCubierta de oroUnión por afinidad:Avidina o resina de Ni2+(adsorción, absorción, entrecruzamiento o unión por afinidad)

Idem a 2DIdem a 2DChips de alta densidadAlta densidad y resoluciónAcoplado a SPR y MSUnión fuerte, especifca y de alta densidad

Idem a 2DIdem a 2DOrientación al azarOrientación al azarOrientación al azarProteinas deben ser biotiniladas o Hisx6

Sistemas de depósito de proteínasBaja densidad: Sistemas de DOT-BLOT de 96 pocillos

Alta densidad: Robots capaces de depositar >30000 proteínas

- Contacto directo con la superficie

- Tecnología de chorro de tinta (ink-jet). No toca superficie

- Electrospray. Disminuye mancha de 150 a 30 µm.

Sistemas de detección de proteínas

Fluorescencia (preferido porque)- Sencillo- Seguro- Muy sensible- Puede tener muy alta resolución

ELISAMarcaje radioisotópico

La detección por fluorescencia:- 1 paso: molécula fluorescente- 2 pasos: usando un marcador de afinidad (p.e. biotina + estreptavidina fluorescente)- RCA (rolling circle amplification)

Estudio de interacción proteína con proteína, DNA o fármaco

Sistemas de detección de proteínas (2)

SELDI-MS: espectroscopia de masas con desorción ionización láser incrementado en superficie

- No necesita marcaje de ningún tipo: detección directa

- Se utiliza en chips recubiertos de capa metálicas, donde el láser vaporiza las proteínas y la MS revela la identidad de la proteína

AFM: microscopia de fuerza atómica

- Aprovecha cambios en al topológicos en la superficie para identificar las proteínas capturadas

SPR: resonancia de plasma en superficie

- Permite detección en tiempo real

- Seguimiento cinética de interacción (p.e.) antígeno-anticuerpo

- Amplio rango de pesos moleculares, afinidad y velocidad de unión

Chips analíticosSe unen diferentes tipos de ligandos, como anticuerpos, antígenos, aptámeros de DNA o RNA, carbohidratos pequeñas moléculas

Determinar niveles de expresión de proteínas.

Perfiles de expresión

Diagnóstico clínico

Muestras de proteína de dos estados biológicos se marcan separadamente con agentes fluorescentes rojos y verdes, se mezclan, e incuban en el chip. Las manchas indican sobreexpresión

Chips analíticos: anticuerpos- Es el más usual- Se depositan los anticuerpos a alta densidad en el chip- Se pasa un extracto celular, suero o incluso células vivas sobre el chip- El antígeno se une- Detección con antígeno (extracto) marcado o con un segundo anticuerpo

Desventajas:- Tener agentes que reconozcan la proteína de interés: anticuerpos- Anticuerpos policlonales poco específicos y caros- Anticuerpos monoclonales mucho mas caros, más difíciles de producir y tardan más tiempo

Alternativa a producción de anticuerpos o sucedáneos

- Presentación de Ab en fagos- Presentación de ribosomas- SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial)- Presentación de mRNA- Affibody display

Construcción de un amplio repertorio de regiones con actividad de unión “potencial”

Chips analíticos: alergenos o antígenos

- Inverso al anterior- Se depositan los antígenos a alta densidad en el chip- Se detectan los anticuerpos (normalmente suero) sobre el chip- Detección de los anticuerpos

Ejemplo 1: Hiller et al.94 alergenos purificados unidos a vidrioPerfiles de reactividad frente a las IgE de pacientes alérgicosPequeñas cantidades de sueroTest de alergia alternativo al de piel

Ejemplo2: Robinson et al.>300 autoantígenos de 8 enfermedades autoinmunes, sobre vidrioPequeñas cantidades de suero

Chips analíticos: péptidos

Objetivo: Detección de epitopos en las proteínas que definan su “actividad básica”

Ejemplo 1: Houseman et al- Inmovilización en vidrio recubierto de oro de >3000 péptidos de 9 aminoácidos de longitud- Localización de sustratos de la c-Src tirosina quinasa- Detección con SPR, fluorescencia e imagen de fósforo

Ventajas:

- Péptidos más cortos- Péptidos más estables que las proteínas- Permiten fabricación de chips de alta densidad- Síntesis del péptido in situ mediante fotolitografía o síntesis dirigida por luz (ahorro económico ya que se necesita muy poco material)

Chips analíticos: carbohidratos

Chips funcionalesLas proteínas o los péptidos provenientes del proteoma de un organismo se purifican o se sintetizan individualmente usando métodos de alto rendimiento o capacidad de ejecución (HT)

Permite analizar:

- Actividad de proteínas- Propiedades de unión a ligando- Modificaciones post-traduccionales- Identificación dianas farmacológicas- Construcción de redes biológicas

Muestras de proteína de dos estados biológicos se marcan separadamente con agentes fluorescentes rojos y verdes, se mezclan, e incuban en el chip. Las manchas indican sobreexpresión

Chips funcionales: ejemplos

Ejemplo 1: Zhu et al

Análisis de interacción de familias de proteínas-119 proteinas quinasas y 17 sustratos-Los sustratos son inmovilizados en nanopocillos-Las quinasas se incuban con los sustratos en presencia de ATP*-Se detectan los sustratos marcados con imagen de fósforo

Ejemplo 2: Zhu et al

Análisis de un proteoma completo

- 5800 de 6200 ORFs de levaduras.- Las proteínas se marcaron con GST y con Hisx6 (ambos). Se obtuvo -un rendimiento del 80% de proteínas funcionales - Se unen al chip recubierto de Ni-NTA con la His x6- Chequeo de calmodulina y fosfoinosítidos (PIs)- Se obtuvieron 6 interacciones conocidas junto con 33 nuevas de calmodulina y mas de 150 proteínas que interaccionaban con los PIs

Aplicaciones generales de los chips

Genómica Bioquímica vs ChipsGenómica bioquímica:- Requiere 64 ensayos para cubrir el genoma de levadura (grupos de 96 proteínas)- Es muy flexible para muchos tipos de ensayos bioquímicos- Particularmente útil para ensayos de actividad enzimática

Desventajas:El uso de los grupos de proteínas (o pools) no asegura la calidad de las proteínasLas otras 95 proteínas pueden interferir con la medidaNo permite medidas fiables de unión con fluorescenciaNo puede maneja múltiples positivos al mismo tiempo

Chips de proteína:Permite chequear la calidad individual de cada proteínaIdentificación inmediata de ORFs responsables de una actividad específicaIdentificación de positivos múltiples en una sola vueltaAnálisis de alto rendimiento de actividades proteicasAutomatización de la construcción, ensayo y lectura de resultados

Desventajas:Se necesitan cultivar 6000 cepas (levadura) y 6000 purificaciones de proteínasSe necesita inmovilizar los sustratos para los ensayos de unión fluorescentes

Conclusiones

• Los chips pueden ser una herramienta poderosísima en la biología a gran escala

• La metodología de fabricación sobre vidrio está validada para análisis de proteína a partir de un proteoma completo

• La metodología de fabricación esta robotizada, así como la de ensayo y lectura de resultados

• La mejora de la producción de anticuerpos como reactivos influirá en la mejora de los chips como herramientas en el análisis del proteoma