BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Lê Mỹ Kim Vương

CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Nha Trang - 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Lê Mỹ Kim Vương

CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER

Chuyên ngành : Hoá phân tích

Mã số : 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Người hướng dẫn 1 Người hướng dẫn 2

TS. Hoàng Thị Huệ An TS. Trần Thị Phương Anh

Nha Trang - 2019

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Cải biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát quá trình xà phòng hoá lutein ester” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này.

Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn

Lê Mỹ Kim Vương

Lời cảm ơn

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè trong lớp.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Thị Huệ An và TS. Trần Thị Phương Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Khoa Hoá học và Phòng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô ở Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học, đồng thời giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các thầy cô tại Trung tâm Thí nghiệm Thực hành Trường Đại học Nha Trang đã hỗ trợ trang thiết bị thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn.

Đề tài này được thực hiện trong khuôn khổ dự án “Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ”, mã số CNHD.DASXTN.026/17-18 thuộc Chương trình nghiên cứu KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020. Xin trân trọng cảm ơn Bộ Công Thương và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ lọc, hóa dầu đã cấp kinh phí thực hiện dự án này.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Trân trọng! Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019

Tác giả luận văn

Lê Mỹ Kim Vương

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ANOVA analysis of variance Phân tích phương sai

AOAC Assosiation of Official Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức.

ASTM

American Society for Testing of Materials

Hiệp hội phép thử Mỹ.

DAD Diod array detector Detector mảng diod.

DMF Dimethyle formamide

DNA Acid Deoxyribonucleic ADN

EU Europe Union Liên minh châu Âu

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm

GC-MS Gas chromatography mass spectrometry

Sắc ký khí Khối phổ

HPLC High performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

ICH International Conference on Harmonization

Hội đồng hòa hợp quốc tế.

JECFA The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food)

Hội đồng các chuyên gia FAO/WHO về phụ gia

thực phẩm

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện.

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng.

MTBE Methyle tert-butyle ether

R2 Correlation coefficient Hệ số tương quan

RT Retention Time Thời gian lưu

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu.

THF Tetrahydrofurane

UV – Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến.

v/v Volume/volume Thể tích/thể tích.

v/w Volume/weight Thể tích/khối lượng.

w/w Weight/weight Khối lượng/khối lượng.

lmax

Wavelength of maximum absorption

Bước sóng hấp thụ cực đại.

Danh mục các bảng

Bảng 1.1.Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin………………. 12

Bảng 2.1.Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải isocratic...52

Bảng 3.1.Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ lutein và lutein ester………………………………………………………………….. 62

Bảng 3.2.Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa giải theo chương trình gradient dung môi đề nghị…………………………………….66

Bảng 3.3.Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích……………………………..67

Bảng 3.4.Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số đĩa lý thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích……………………70

Bảng 3.5.Kết quả xác định hàm lượng carotenoid tổng số và lutein có trong lutein đối chứng……………………………………………………………...74

Bảng 3.6.Kết quả dựng đường chuẩn lutein (lặp lại 3 lần song song)……... 75

Bảng 3.7.Khảo sát độ lặp lại khi tiêm cùng mẫu chuẩn trong ngày………... 78

Bảng 3.8.Khảo sát độ thu hồi khi thêm mẫu chuẩn ở các nồng độ 12; 15; 18ppm………………………………………………………………………..81

Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến hiệu suất xà phòng hoá…………………………………………………………………………...84

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester……………………………………………………………………. ……86

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa……...........88

Bảng 3.12.Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester………………………………………………………………………….92

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn.…......96

Bảng 3.14.Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn ………………………………………………………………………...97

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15] ................. 10

Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15] .................. 11

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15] .. 11

Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [16] ............. 17

Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [16] ................................................................ 18

Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16] .................................. 22

Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất .......... 23

Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của lutein và lutein ester ........................................................................................ 63

Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải .... 65

Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung môi ................................. 65

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến một số đại lượng sắc ký .............. 68

Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dòng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút ......................................................................................... 69

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình sắc ký ................. 71

Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi thể tích bơm mẫu ................................................................................................................. 72

Hình 3.8. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 40 ppm ................. 75

Hình 3.9. Kết quả HPLC của các mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực và mẫu thêm ........................................................................................................ 76

Hình 3.10. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm ............... 79

Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin không xà phòng hóa (lutein ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ...................................................... 82

Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin sau khi xà phòng hóa (lutein tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ..................................................... 82

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 0,89 phút ................................................................................................................. 83

Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min); b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min) .................................................................. 83

Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ...................................... 85

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml ............................................ 87

Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml .......................................................... 87

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 88

Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau ....... 91

Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 92

Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời gian khác nhau ................................................................................................ 95

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 6

1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 6

2. Mục đích của đề tài ..................................................................................... 8

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 8

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................. 9

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 10

1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN .................................................................... 10

1.1.1. Cấu trúc phân tử ................................................................................ 10

1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein ............................................... 11

1.1.2.1. Tính chất vật lý ............................................................................ 11

1.1.2.2. Tính chất hóa học ........................................................................ 13

1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein ........................................ 13

1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein ...................................................... 13

1.1.3.2. Ứng dụng của lutein .................................................................... 14

1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên ...................................... 16

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ........................................... 16

1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký .................................................... 16

1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC .......................... 18

1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động .................................................... 18

1.2.2.2. Bộ phận khử khí ........................................................................... 19

1.2.2.3. Bơm cao áp .................................................................................. 19

1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu ........................................................................ 19

1.2.2.5. Cột sắc ký .................................................................................... 19

1.2.2.6. Đầu dò ......................................................................................... 20

2

1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu .................................................................... 21

1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu ........................................................................ 21

1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC .................................... 21

1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực .............................................. 21

1.2.3.2. Hệ số dung lượng ........................................................................ 22

1.2.3.3. Độ chọn lọc ................................................................................. 23

1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết ............................................................................ 23

1.2.3.5. Độ phân giải ................................................................................ 24

1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC ................................. 25

1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký .......................................................................... 26

1.2.4.2. Chọn cột sắc ký ............................................................................ 26

1.2.4.3. Chọn pha động ............................................................................ 27

1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải ................................................................... 28

1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC ..................................................................................................................... 28

1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký ............................................. 29

1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity) ........................................................... 29

1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy) .................................................................... 30

1.2.5.4. Độ chính xác (Precision) ............................................................. 30

1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range) ............................................ 31

1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit) ................................ 32

1.2.5.7. Độ thô (Robustness) .................................................................... 33

1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope) ............................. 33

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CARATENOID .............................................................................................. 33

3

1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis ........... 33

1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế .................................. 33

1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học .......................... 34

1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC ............................. 34

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ..................... 38

1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester ................................ 38

1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng phương pháp HPLC ........................................................................................................... 41

1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................. 41

1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................ 45

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 48

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 48

2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 48

2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 48

2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ........................................................................... 49

2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................. 49

2.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 49

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 50

2.3.1. Cải biến phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp với lutein ester ................................................................................................... 50

2.3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch khảo sát điều kiện chạy HPLC ............. 50

2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải ........................... 51

2.3.1.3. Chọn tốc độ dòng ........................................................................ 53

2.3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu ................................................................ 53

2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein ............................................................ 54

4

2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein .............................................. 56

2.3.2.1. Tính đặc hiệu ............................................................................... 56

2.3.2.2. Độ chụm (precision) .................................................................... 56

2.3.2.3. Độ tuyến tính của đường chuẩn – Khoảng nồng độ tuyến tính ... 57

2.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [41] .. 57

2.3.2.5. Độ đúng. ...................................................................................... 57

2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích hợp xà phòng hóa lutein ester .................................................................................. 58

2.3.3.1. Phương pháp tổng quát xà phòng hóa lutein ester ..................... 58

2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phòng hóa lutein ester ....... 58

2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa lutein ester đến đến hiệu suất xà phòng ............................................................................. 59

2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phòng hóa lutein ester ......................... 60

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................. 61

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 62

3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER ............................................................. 62

3.1.1. Chọn thành phần pha động ................................................................ 62

3.1.2. Chọn tốc độ dòng ............................................................................... 66

3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu ..................................................................... 70

3.1.4. Kết luận về điều kiện phân tích hỗn hợp lutein và lutein ester ......... 73

3.2. DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN .................. 74

3.2.1. Xác định độ tinh khiết của mẩu lutein đối chứng .............................. 74

3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn lutein ..................................................... 74

3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY DỰNG ............................................................................................................ 76

5

3.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích ......................................... 76

3.3.2. Độ lặp lại trong ngày (intra-day injection repeatability) ................... 78

3.3.3. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn ................................................. 78

3.3.4. Xác định LOD và LOQ ..................................................................... 80

3.3.5. Xác định độ thu hồi ........................................................................... 80

3.3.6. Kết luận về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng .......... 81

3.4. NHẬN BIẾT PEAK LUTEIN VÀ LUTEIN ESTER ............................. 82

3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ ....................................... 84

3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ..................................................... 84

3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa .............. 85

3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa .......... 88

3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa ......... 92

3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá .................................... 96

3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ .................................. 96

3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn .................................................................. 96

3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn ..................................................... 97

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 98

4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 98

4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 100

6

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Lutein là một sắc tố carotenoid có màu vàng cam, là dẫn xuất 3,3’-diol của b,e-caroten. Lutein có trong nhiều loài thực vật (cải bó xôi, bông cải xanh, rau ngót, hoa, quả, rong, tảo…) và trong mô của một số loài động vật (lòng đỏ trứng và da của gia cầm, da cá cảnh…) [1]. Lutein - cùng với đồng phân của nó là zeaxanthin - là các sắc tố tập trung ở hoàng điểm của mắt người với hàm lượng cao, có vai trò quan trọng trong việc xử lý hình ảnh, phát triển của thần kinh thị giác và não bộ [2]. Nhiều nghiên cứu dịch tể học gần đây đã chứng minh rằng lutein có khả năng bắt giữ oxy đơn và các gốc tự do, hấp thụ mạnh tia tử ngoại. Nhờ đó, lutein có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi một số bệnh ung thư, bệnh tim mạch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa và các bệnh về mắt ở người cao tuổi (bệnh đục thủy tinh thể, thoái hóa hoàng điểm) [3]. Do vậy, lutein đang được quan tâm nghiên cứu khai thác từ các nguồn tự nhiên nhằm ứng dụng trong trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm (làm thuốc bổ mắt, vi chất dinh dưỡng, kem chống nắng, son dưỡng môi, chất màu thực phẩm...) [4]

Hiện nay, nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lutein nhất là hoa cúc vạn thọ châu Mỹ (Tagetes erecta L.). Lutein tồn tại trong hoa cúc vạn thọ dưới dạng monoester hay diester của các acid béo (acid myristic, palmitic…). Hàm lượng carotenoid tổng số trong cánh hoa chiếm khoảng 0,1 – 0,2% (tính theo trọng lượng khô), trong đó lutein chiếm trên 80% [5]. Theo các quy trình truyền thống, lutein ester từ hoa cúc vạn thọ thường được chiết bằng hexan; dịch chiết được cô đặc dưới áp suất thấp để thu được một dạng dầu sệt (gọi là oleoresin), sau đó được xà phòng hóa bằng KOH trong alcol để chuyển thành dạng lutein tự do – là dạng cơ thể người có thể hấp thụ. Một số quy trình xà phòng hóa lutein ester đã được đề nghị như các quy trình của Ausich (1997) [6], Kumar (2004) [7], Swaminathan (2009) [8], Sankar (2012) [9] … Các quy trình trên chưa có sự nhất quán về điều kiện phản ứng (nồng độ oleoresin, nồng độ KOH, nhiệt độ, thời gian) cũng như chưa có đầy đủ thông tin về hiệu suất xà phòng hóa. Hơn nữa, công đoạn xà phòng hóa thường được tiến hành

7

ở nhiệt độ cao (50 – 600C hoặc 70 – 800C) và trong thời gian khá dài (3 giờ – 10 giờ); điều này có thể gây ra sự phân hủy đáng kể lutein do lutein là một hợp chất kém bền nhiệt. Nguyên nhân là do các tác giả trên đã sử dụng các phương pháp khác nhau (sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao) để theo dõi tiến trình phản ứng hoặc định lượng lutein trong hỗn hợp xà phòng hóa. Thực tế này dẫn đến sự bối rối đối với người nghiên cứu trong việc chọn lựa quy trình xà phòng hóa lutein ester ứng dụng cho các mục đích phân tích lutein ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc nhằm thu nhận lutein tự do từ cao chiết lutein ester ở quy mô công nghiệp. Để làm sáng tỏ vấn đề trên, cần khảo sát đầy đủ và hệ thống hơn về ảnh hưởng của các yếu tố phản ứng đến hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do, từ đó đưa ra quy trình thích hợp cho phép xà phòng hóa lutein ester với hiệu suất cao và sản phẩm chất lượng cao. Muốn vậy, cần sử dụng một phương pháp phân tích đáng tin cậy cho phép định lượng lutein tự do trong hỗn hợp xà phòng hóa lutein ester chiết tách từ hoa cúc vạn thọ.

Cho đến nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn được xem là một phương pháp hiệu quả để phân tích hỗn hợp carotenoid [10]. Nhiều quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC đã được xây dựng để phân tích hỗn hợp carotenoid trên các đối tượng khác nhau, trong đó có thể sử dụng cột sắc ký pha thường (cột silica, cột cyanopropyl...) hay pha đảo (cột C18, C30) với đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò dãy diode quang (PDA), đầu dò khối phổ (MS), hoặc đầu dò cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [10]. Trong số đó, phương pháp HPLC sử dụng cột silica là phương pháp đã được JECFA sử dụng như là phương pháp tiêu chuẩn để định lượng lutein và zeaxanthin trong các sản phẩm lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ [11][12]. Tuy nhiên, ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động chạy sắc ký, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại [13]. Đối với các cột pha đảo, cột C30 có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp carotenoid phức tạp nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường được ưu tiên lựa chọn khi phân tích hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu xây dựng phương pháp

8

HPLC định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau sử dụng cột C18 [14] nhưng các phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng thí nghiệm của chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành phần pha động, …). Tại Việt Nam, rất ít nghiên cứu về định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC. TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) đã sử dụng cột C18 (150 x 4,6 cm; 5 µm) với đầu dò PDA để xây dựng phương pháp RP-HPLC khá hiệu quả và thuận tiện cho phép định lượng astaxanthin và hỗn hợp carotenoid đi kèm (lutein, zeaxanthin, b-caroten, lycopen, astaxanthin ester) trong đối tượng giáp xác thủy sản [13]. Trong nghiên cứu của Trương Ngọc Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ đã xây dựng phương pháp phân tích b-carotene trong một số loại ngũ cốc có màu bằng cách sử dụng cột C18 (150 x 4,6 cm, 5µm). Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của chúng tôi hiện chỉ có cột pha đảo C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm) và đối tượng nghiên cứu trong luận văn hướng tới không phù hợp với các nghiên cứu trên. Do đó, việc cải biến phương pháp HPLC định lượng carotenoid sẵn có sao cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và đối tượng phân tích cụ thể là vấn đề đặt ra đối với người làm công tác phân tích. Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi sẽ nghiên cứu cải biến phương pháp HPLC nói trên để định lượng lutein và theo dõi quá trình xà phòng hóa lutein ester.

2. Mục đích của đề tài

- Cải biến phương pháp RP-HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5µm) phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, cho phép định lượng lutein trong sự có mặt của hỗn hợp lutein ester.

- Xác định điều kiện thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester chiết tách từ hoa cúc vạn thọ dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC đã cải biến thông qua việc xác định hiệu suất xà phòng hoá và độ tinh khiết của sản phẩm lutein tự do thu được.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. được trồng trong dự án đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng Thị Huệ An.

9

Phạm vi nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa một số kết quả nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] và xây dựng phương pháp HPLC phù hợp để định lượng lutein, từ đó ứng dụng kiểm soát quá trình xà phòng hoá lutein ester.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện sắc ký đến khả năng định lượng lutein khi có mặt hỗn hợp lutein ester bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm).

- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa (nồng độ tác chất, nhiệt độ, thời gian) đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Cho phép định lượng lutein trong các mẫu thực tế có chứa lutein và lutein ester bằng phương pháp HPLC với cột pha đảo C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm).

- Góp phần hoàn thiện quy trình xà phòng hóa lutein ester ở quy mô phòng thí nghiệm và ở quy mô công nghiệp.

10

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN

1.1.1. Cấu trúc phân tử

Lutein là một sắc tố xanthophyll (tức oxycarotenoid) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp chất màu thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm nhờ có màu vàng cam rất đẹp và tác dụng chống oxy hóa khá mạnh.

Lutein có công thức phân tử C40H56O2 (phân tử lượng 568,9), là dẫn xuất 3,3’- diol của b,e-caroten và là một dạng tiền vitamin A [15]. Phân tử lutein chứa bộ khung cấu trúc isoprenoid C40 điển hình của các carotenoid và có 2 vòng 6 cạnh ở hai đầu mạch carbon. Chuỗi liên kết đôi liên hợp trong lutein có thể tồn tại ở cấu hình cis hoặc trans, do đó tạo ra số lượng lớn đồng phân mono-cis và poly-cis của lutein.

Trong tự nhiên lutein thường tồn tại ở dạng đồng phân hình học bền nhất là dạng all-trans (hình 1.1) [15], [16].

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15]

Tuy nhiên, dưới tác dụng của bức xạ nhiệt hay ánh sáng, dạng all-trans có thể bị chuyển hóa thành các dạng đồng phân cis, trong đó bền hơn cả là các dạng 9-cis, 13-cis và 15-cis hay 9’-cis, 13’-cis, 15’-cis…(Hình 1.2.).

11

a) Đồng phân 9-cis- lutein

b) Đồng phân 13-cis- lutein

c) Đồng phân 15-cis- lutein

Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15]

Ngoài ra, trong tự nhiên cũng tồn tại một dạng đồng phân vị trí khác của lutein là zeaxanthin (Hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15]

1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein

1.1.2.1. Tính chất vật lý

Lutein có thể tồn tại ở dạng bột chảy vô định hình hoặc kết tinh dạng tinh thể hình kim, khối lăng trụ, đa diện hoặc dạng lá hình thoi [17]. Nhiệt độ nóng chảy 1900C.

Lutein là chất ít phân cực nên không tan trong nước, kém tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (như methanol, ethanol…), nhưng tan tốt hơn

9

OH

OH

OH

13

OH

OH

OH

15

HO

OH

12

trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình (acetone, ethyl acetate, dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran...) [17][18].

Phân tử lutein có 10 nối đôi liên hợp nên hấp thụ mạnh tia tử ngoại và ánh sáng xanh (400 - 490 nm), do đó lutein ở dạng bột có màu đỏ cam và ở dạng dung dịch có màu vàng cam rất đẹp. So với zeaxanthin (có 11 nối đôi liên hợp), các cực đại hấp thụ (λmax) của lutein thấp hơn khoảng 4 - 6 nm. Nhờ đó, có thể phân biệt khá dễ dàng lutein và zeaxanthin dựa vào phổ hấp thụ UV-Vis của chúng (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin

Carotenoid Dung môi Cực đại hấp thụ

(λmax, nm)

Hệ số hấp thụ

( )

Lutein

Chloroform 435 458 485 -

Ethanol 422 445 474 2550

Hexane 421 445 474 2480

Zeaxanthin

Acetone 430 452 479 2340

Chloroform 433 462 493 -

Ethanol 428 450 478 2480 (2540)

Hexane 424 449 476 2348

Nguồn: “Britton (1995) and Davies (1976)” [19]

Sự chuyển hóa lutein từ dạng trans thành dạng đồng phân mono-cis dẫn đến sự giảm cường độ hấp thụ và giảm λmax khoảng 2 - 6 nm, đồng thời làm xuất hiện đám hấp thụ cis (gọi tắt là peak cis) ở vùng UV gần 320 - 380 nm. Cường độ hấp thụ của peak cis càng lớn khi liên kết đôi có cấu hình cis càng gần tâm phân tử. Do vậy, cường độ hấp thụ của peak cis- ở đồng phân 15-cis mạnh nhất. Nhờ đó, có thể nhận biết các đồng phân cis- bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA [20][21].

%11cmA

13

1.1.2.2. Tính chất hóa học Lutein thuộc họ carotenoid, trong phân tử có chuỗi polyen liên hợp nên

rất nhạy cảm đối với acid, các ion kim loại, chất oxy hoá, ánh sáng, nhiệt… Nhóm hydroxyl ở hai đầu phân tử làm cho lutein dễ dàng tham gia vào các phản ứng oxy hóa. Nhờ đó, nó có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn một số carotenoid khác (như lycopen, b-caroten…). Vì vậy, lutein dễ bị oxi hóa bởi oxy không khí, hấp thụ mạnh các gốc tự do hoặc bị đồng phân hóa bởi nhiệt và ánh sáng, dẫn đến sự nhạt màu hay mất màu. Do đó, lutein cần được bảo quản trong môi trường khí trơ hay chân không dưới nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng mặt trời.

Lutein khá bền trong môi trường kiềm [22]. Trong môi trường kiềm, lutein ester bị xà phòng hóa tạo thành lutein tự do. Để tránh sự oxy hóa lutein bởi oxy không khí nên thực hiện phản ứng xà phòng hóa lutein ester dưới khí trơ N2.

Trong các mô động - thực vật lutein có khả năng liên kết với các acid béo, lipid, lipoprotein tạo thành các cấu trúc bền vững hơn so với dạng lutein tự do [23].

1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein

1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein

Phần lớn chức năng sinh học của chất màu lutein đều dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng, khả năng dễ bị oxy hóa và khả năng bắt giữ các gốc tự do của phân tử lutein.

Lutein có khả năng hấp thụ tia tử ngoại và ánh sáng xanh trong dải bức xạ khả kiến, do đó có khả năng bảo vệ da, mắt khỏi tác hại của các bức xạ này, ngăn ngừa ung thư da, thoái hóa điểm vàng [3], [24].

Người ta cho rằng các gốc tự do sinh ra trong tế bào và mô trong hoạt động sống của con người có thể gây tác hại đến DNA, protein, carbohydrate và lipid . Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng lutein có tác động loại trừ sự xâm nhập của chất oxy hóa và gốc tự do qua màng tế bào, giúp ngăn chặn sự oxy hóa lipid, hạn chế sự suy giảm khả năng miễn dịch đối với cơ thể, ngăn

14

ngừa những chứng bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim mạch, một số bệnh về mắt (thoái hóa võng mạc do tuổi già, đục thủy tinh thể viêm màng bồ đào…) [19]. Tác dụng này của lutein nhờ vào khả năng bắt giữ các chất oxy hóa và các gốc tự do sinh ra trong tế bào [26]. Khả năng chống oxy hóa của lutein có thể được giải thích bởi cấu trúc hóa học đặc biệt của nó với chuỗi polyen rất dễ bị oxy hóa. Ngoài ra, hai nhóm hydroxyl ở 2 vòng sáu đầu mạch trong phân tử lutein làm cho hoạt tính chống oxy hóa của lutein trở nên mạnh hơn so với các carotenoid khác (như lycopene, b-carotene, …) [27].

1.1.3.2. Ứng dụng của lutein Ø Trong công nghiệp thực phẩm

Nhờ có màu vàng rất đẹp lutein được phép sử dụng làm chất màu trong chế biến thực phẩm (mã số E161b). Lutein ở dạng chế phẩm hòa tan trong nước được sử dụng để nhuộm vỏ ngoài cho giò chả, các bán thành phẩm từ thịt gà, sữa chua, bánh nướng, kẹo, nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc điểm tâm, các sản phẩm từ sữa, trứng, thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới biết đi, chất béo, dầu, nước thịt, nước sốt và súp hỗn hợp [28].Theo quy định của EU, Canada, Úc, New Zealand … lutein có thể được sử dụng với mức 0,5 - 2 mg/ngày [29].

Ø Trong công nghiệp dược phẩm

Ngoài khả năng tạo màu, lutein còn có tác dụng chống oxy hóa, hấp thụ gốc tự do và tia tử ngoại, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giúp duy trì sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư [24]. Lutein là carotenoid chủ yếu có ở điểm vàng, giúp cải thiện khả năng truyền tin qua khe kết nối trong võng mạc, rất cần thiết cho quá trình xử lý hình ảnh và sự phát triển của thần kinh thị giác [31]. Đặc biệt, những nghiên cứu gần đây của tập đoàn dinh dưỡng hàng đầu thế giới là DSM (Thụy Sĩ) đã phát hiện lutein chiếm đến 66 - 77% lượng carotenoid hình thành não bộ của người, có chức năng quan trọng trong việc phát triển và kích thích khả năng học hỏi, sự hình thành cảm xúc và ghi nhớ của trẻ em, cải thiện tình trạng suy giảm chức năng nhận thức ở người cao tuổi [32]. Do vậy, lutein cũng đã được đưa vào trong thành phần của một

15

số thuốc bổ (liều dùng 2 - 330 mg/kg), trong sữa cho bé, trong thuốc bổ cho người cao tuổi.

- Lutein là chất ức chế khối u: Lutein cũng đã được cho là có tác dụng làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và ngăn ngừa một số dạng ung thư (như ung thư vú, cổ tử cung) do khả năng chống oxy hoá khá tốt. Một nghiên cứu của Đại học Tufts (Boston, Massachusetts) và các nhà điều tra Hàn Quốc cho thấy, phụ nữ có nồng độ lutein trong máu ở mức cao nhất thì khả năng ung thư vú giảm 88% [8].

– Lutein là chất ức chế sự tắc nghẽn mạch máu, viêm khớp, thậm chí có thể giúp giảm đau viêm xương khớp và tàn tật ở 16 triệu người Mỹ. Các nhà nghiên cứu tại Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ gần đây đã phát hiện ra rằng những người có nồng độ lutein cao trong máu (khoảng 70%) ít có khả năng bị viêm khớp đầu gối và các mô liên kết khác [33].

– Lutein làm giảm các rối loạn mắt như thoái hóa điểm vàng, đục thủy tinh thể. Ở người, lutein và zeaxanthin tập trung ở điểm vàng của mắt cũng như ở da, vú và mô cổ tử cung. Lutein được coi là một vi chất dinh dưỡng cần thiết cho thị lực bình thường [30][34]. Được sử dụng chủ yếu trong các sản phẩm chăm sóc mắt để làm giảm mệt mỏi thị giác, giảm tỷ lệ mắc chứng thoái hóa điểm vàng do tuổi già (AMD: Age-related macular degeneration), đục thủy tinh thể, bệnh võng mạc…

Ø Trong công nghiệp mỹ phẩm

Lutein chủ yếu được sử dụng để chống nếp nhăn và bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím. Lutein và lutein ester có thể dễ dàng thâm nhập vào da và cho hiệu quả chống nắng tốt [35]. Một số chế phẩm kem chống nắng công thức thảo dược chứa lutein ester chiết suất từ Tagetes erecta L. đã được sản xuất. [36].

Ø Trong chăn nuôi

Lutein được dùng để làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi cá cảnh, thức ăn cho gia súc và gia cầm để tạo màu vàng cho da gà và lòng đỏ trứng…

16

1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên

Lutein là carotenoid rất phổ biến trong nhiều loài động – thực vật. Các loại thực phẩm chứa nhiều lutein như cải spina, súp lơ xanh, cải xoăn, bắp, trái kiwi, lòng đỏ trứng gà, trong một số loài rong, tảo... Đặc biệt, hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) có khả năng tích lũy lutein với hàm lượng rất cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy cánh hoa cúc vạn thọ chứa khoảng 1,0 – 1,6% carotenoid tổng số (tính theo trọng lượng khô), trong đó khoảng 90% lượng carotenoid này là lutein ester (dưới dạng monoester và diester của các acid béo C12 - C18 như acid lauric, myristic, oleic, linoleic, palmitic, stearic) và chỉ có khoảng 5% là zeaxanthin ester (Kumar, 2004) [7]. Lutein dưới dạng ester rất bền nhưng khi vào cơ thể con người chỉ bị thủy phân một phần thành dạng tự do rồi mới được hấp thụ vào huyết thanh. Vì vậy, để tạo ra những chế phẩm lutein bổ sung cho con người, lutein ester cần phải được thuỷ phân về dạng lutein tự do [37].

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký

Sắc ký là kỹ thuật tách hỗn hợp phân tích thành các cấu tử riêng rẽ dựa trên ái lực khác nhau của các cấu tử này giữa 2 pha không trộn lẫn, trong đó một pha đứng yên (được gọi là pha tĩnh) và một pha còn lại là pha động.

Pha tĩnh có thể là các hạt rắn xốp, mịn hay cũng có thể là pha lỏng được gắn kết trên bề mặt của các hạt giá thể rắn nào đó. Pha tĩnh có thể được nhồi vào một cột bằng thủy tinh hay inox (sắc ký cột) hoặc tráng trên bản mỏng (bằng nhựa hay nhôm). Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ, là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion, là chất lỏng ta có sắc ký phân bố, là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử.

Để rửa giải chất phân tích ra khỏi pha tĩnh cần có một pha động. Pha động ở trạng thái lỏng (gọi là sắc ký lỏng), trạng thái khí (sắc ký khí) hay trạng thái siêu tới hạn (sắc ký siêu tới hạn).

17

Trong quá trình sắc ký, mẫu phân tích được nạp lên đầu cột pha tĩnh, sau đó cho pha động dịch chuyển liên tục qua pha tĩnh. Trong quá trình này, cấu tử nào có ái lực với pha tĩnh càng mạnh sẽ bị lưu giữ càng chặt trên pha tĩnh, do đó tốc độ di chuyển càng chậm. Ngược lại, cấu tử có ái lực yếu với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn. Nếu chiều dài pha tĩnh đủ lớn thì sau một thời gian các cấu tử phân tích sẽ được tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột. Quá trình tách hỗn hợp phân tích được lưu giữ trên pha tĩnh bằng cách cho một pha động di chuyển liên tục qua pha tĩnh như trên được gọi là sự rửa giải. Nếu đầu ra của cột sắc ký được ghép nối với một detector có khả năng ghi nhận một tín hiệu vật lý đặc trưng nào đó của các cấu tử phân tích (ví dụ: độ hấp thụ ánh sáng, chiết suất, độ dẫn điện, cường độ phát huỳnh quang, ...) và biểu diễn sự thay đổi của nồng độ chất phân tích (Cx) theo thời gian rửa giải (t), ta sẽ thu một sắc ký đồ chứa các peak sắc ký (Hình 1.4).

Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [38]

Trong sắc ký cột cổ điển sử dụng pha động là pha lỏng (sắc ký lỏng), kích thước các hạt pha tĩnh vào khoảng 50 – 230 µm. Thực tế cho thấy với kích thước hạt pha tĩnh như vậy hiệu quả tách không cao, thường chỉ cho phép tách những hỗn hợp chứa ít cấu tử và có ái lực với pha tĩnh khác nhau khá nhiều. Để tách những hỗn hợp cấu tử phức tạp (chứa nhiều cấu tử hoặc ái lực với pha tĩnh khác nhau không nhiều) cần tăng chiều dài đường đi của các cấu tử trên pha tĩnh bằng cách giảm kích thước các hạt pha tĩnh xuống khoảng 3 - 5 μm. Tuy nhiên, khi đó pha tĩnh được nén rất chặt nên phải hệ thống bơm

18

cao áp để đẩy pha động đi qua cột pha tĩnh. Kết quả là hình thành một kỹ thuật sắc ký mới là sắc ký lỏng cao áp (High pressure liquid chromatography) hay chính xác hơn là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography), viết tắt là HPLC.

1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC

Thiết bị HPLC gồm những bộ phận quan trọng sau (Hình 1.5):

Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [38]

1- Bình chứa dung môi pha động 2- Bộ phận khử khí 3- Bơm cao áp 4- Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler) 5- Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều

nhiệt 6- Đầu dò detector (nhận tín hiệu) 7- Hệ thống máy điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số

liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống 8- Thiết bị in dữ liệu

1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động

Thiết bị HPLC thường có 4 kênh dung môi đi vào đầu bơm cao áp, cho phép tạo ra các hệ pha động có thể chứa từ 1 – 4 dung môi để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn.

19

Tất cả dung môi, hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm phải là hóa chất tinh khiết cho sắc ký lỏng (HPLC grade).

Mẫu trước khi bơm vào thiết bị phân tích phải được lọc qua màng lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích [39]

1.2.2.2. Bộ phận khử khí

Bộ phận khử khí nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu trong quá trình phân tích pha động còn bọt khí thì bơm sẽ hút các dung môi trong pha động không đúng tỷ lệ, do đó sẽ làm thay đổi thời gian lưu của các peak. Nếu bọt khí còn quá nhiều và bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi, áp suất sẽ không lên và thiết bị sắc ký sẽ ngừng hoạt động [39].

1.2.2.3. Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình tách sắc ký. Tốc độ bơm thường được cài đặt hằng định theo thông số đã lựa chọn. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000 – 6000 psi hoặc 250 – 500 atm và bơm phải tạo dòng dung môi liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 – 9,999 ml/phút. Hiện nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Các máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar [39].

1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích với dung tích từ 5 – 100 µl. Có 2 cách tiêm mẫu vào cột: tiêm bằng tay (dùng syringe) và tiêm tự động (dùng autosampler).

1.2.2.5. Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thường được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1 – 10 mm, hạt chất nhồi cột cỡ 5 – 10 µm. Với chất nhồi cột cỡ 1,8 – 5 µm có thể dùng cột ngắn 3 – 10 cm và nhỏ

20

(đường kính trong 1 – 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Ngoài ra, còn có một số cột dùng kích thước và kích cỡ hạt đặc biệt.

Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu sắc ký. Chất nhồi cột có thể là silicagel (cột pha thường) hoặc silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hợp chất hữu cơ (cột pha đảo). Ngoài ra, người ta còn dùng các loại pha tĩnh khác như nhôm oxid, polymer xốp, chất trao đổi ion [39].

1.2.2.6. Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện cường độ tín hiệu phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.

A = k.C

trong đó:

A: là tín hiệu đo được;

C: nồng độ chất cần phân tích

k: hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất... Trên cơ sở đó, người ta đã chế tạo ra detector tử ngoại - khả kiến UV-Vis (bước sóng từ 190 đến 900 nm) hay detector dãy quang diod (DAD: Diod Array Detector), detector huỳnh quang (FlD: Fluorescence Detector; để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên hay dẫn chất có huỳnh quang), detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD: Evaporative Light Scatterring detector), detector điện hóa (đo dòng, độ dẫn, điện lượng...), detector chiết suất (RID: Refractive Index Detector), detector điện hóa (đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt….). Hiện đại hơn cả là detetor khối phổ (MSD: Mass Spectrometer), detector NMR.

21

1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu

Là bộ phận ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các máy HPLC thế hệ cũ thì sử dụng máy in đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích peak, chiều cao peak... Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính, nó có thể lưu tất cả các thông số của mẫu, phổ đồ và các thông số của peak (như tính đối xứng, hệ số phân giải...) trong quá trình phân tích, đồng thời xử lý và tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như nồng độ, % độ lệch chuẩn... [39]

1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu, phần mềm sẽ tự động tính toán và ta sẽ in kết quả ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.

1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC

1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực

Thời gian lưu của một chất (ký hiệu tr) là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất phân tử của chất tan. - Điều kiện chạy sắc ký: bản chất pha tĩnh; bản chất, thành phần,

pH và tốc độ của pha động; nhiệt độ cột.

Để đánh giá thời gian lưu thực của một cấu tử trong pha tĩnh cần phải dùng thời gian lưu thực (ký hiệu: tr’):

tr’ = tr – t0

trong đó:

t0: là thời gian cần thiết để pha động (hay một cấu từ hoàn toàn không bị lưu giữ) đi từ đầu cột đến detector

Trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn thì thời gian lưu thực của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau sẽ có thời gian lưu khác nhau. Vì vậy, dựa vào thời gian lưu để nhận biết sự có mặt của các chất.

22

Trong một phép phân tích nếu t’r nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu t’r quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hóa chất, độ chính xác của phép phân tích kém.

Hình 1.6 là sắc ký đồ khi rửa giải của 2 chất A và chất B. Chất A được rửa giải ra trước với thời gian lưu trA ; chất B được rửa giải ra sau với thời gian trB.

Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16]

Trong đó:

t0: thời gian lưu chết

trA: thời gian lưu chất A t’rA : thời gian lưu thực chất A

trB: thời gian lưu chất B t’rB: thời gian lưu thực chất B

1.2.3.2. Hệ số dung lượng

Hệ số dung lượng (ký hiệu: k’) của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó giữa pha tĩnh và pha động và được tính bằng tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.

0

'

0

0'

tt

tttk rri

i =-

=

23

Nếu k’ nhỏ thì tr cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu k’ lớn thì peak bị doãng. Trong thực tế thì k’ = 1 – 5 là tối ưu.

1.2.3.3. Độ chọn lọc

Độ chọn lọc (ký hiệu: α) cho biết hiệu quả tách hai chất A và B bởi hệ thống sắc ký.

α càng khác 1 thì khả năng tách càng tốt.

Hình 1.7 mô tả ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất A và B; với a = 1.02 các peak bị dính lại nên hiệu quả tách không cao, với a = 1,2 thì các peak tách rời nhau cho thấy hiệu quả tách cao hơn.

Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất A và B [38]

1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết (ký hiệu: N) là đại lượng biểu thị hiệu năng tách của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Theo lý thuyết đĩa, cột sắc ký có thể xem gồm nhiều đĩa lý thuyết có chiều cao là H, tại mỗi đĩa ứng một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động:

(L: chiều dài của pha tĩnh nhồi trong cột sắc ký)

Đối với peak có dạng phân bố chuẩn Gauss thì:

'

'

',

',

A

B

AR

BR

kk

tt

==a

NLH =

24

trong đó: W1/2 là độ rộng tại ½ chiều cao của peak

Theo Van Deemter:

trong đó:

dP: kích thước hạt pha tĩnh

df: độ dày lớp phủ lỏng trên pha tĩnh

dC: đường kính cột

λ: thông số phụ thuộc kích thước hạt và độ đồng nhất của pha tĩnh

g: thông số phụ thuộc khoảng cách giữa các hạt

k: hằng số đặc trưng cho quá trình chuyển khối

DM: hệ số khuếch tán trong pha động

DS: hệ số khuếch tán của cấu tử phân tích trong pha tĩnh

: tốc độ trung bình của pha động

Như vậy, H phụ thuộc vào đường kính và khả năng hấp phụ của hạt pha tĩnh, tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động; hệ số khuếch tán của các chất trong cột.

1.2.3.5. Độ phân giải

Độ phân giải (ký hiệu: R) là đại lượng biểu thị độ tách của các peak A, B ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho [39].

2

2/1

54,5 ÷÷ø

öççè

æ=

WtN r

uDddf

Dd

kuDdH

M

CP

S

fMP

úúû

ù

êêë

é+++=

),(.22222g

l

u

÷÷ø

öççè

æ

+÷øö

çèæ -

=+-

='1'1

41)(2 ,,

kkN

WWtt

RAB

ArBr

aa

25

trong đó: là thừa số dung lượng trung bình của 2 cấu tử A và B cạnh nhau cần phân tách.

Trong thực tế, nếu các peak đối xứng thì để định tính (hai peak tách nhau) thì độ phân giải tối thiểu là R = 1,0; còn để định lượng R = 1,5 là phù hợp.

Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:

• Tăng thừa số dung lượng bằng cách giảm lực rửa giải của pha động (giảm nhiệt độ cột, thay đổi thành phần pha động, thay đổi pha tĩnh sao cho tăng khả năng lưu giữ chất)

• Tăng số đĩa lý thuyết N của cột bằng cách dùng cột dài hơn • Giảm chiều cao đĩa lý thuyết H bằng cách điều chỉnh tốc độ pha

động để H cực tiểu; dùng cột có kích thước hạt pha tĩnh nhỏ hơn hoặc cột có đường kính nhỏ hơn

• Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác có pha tĩnh tương tác chọn lọc hơn với các cấu tử cần tách.

Tuy nhiên, nếu R quá lớn thì thời gian phân tích sẽ dài, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình gradient dung môi. Tuy nhiên, nếu dùng gradient dung môi thì trong quá trình chạy sắc ký sự thay đổi thành phần pha động sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và diện tích các peak phân tích. Do vậy, nên hạn chế sử dụng chương trình gradient dung môi [39].

1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC

Để xây dựng một quy trình phân tích HPLC cần xác lập các điều kiện sắc ký sao cho tối ưu hóa độ phân giải đối với các chất cần phân tích trong một thời gian ngắn nhất có thể được. Muốn vậy, cần thực hiện các bước khảo sát sau:

'k

'k

26

1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký

Tùy thuộc vào loại và tính chất chất phân tích (độ tan, phân tử lượng), nền mẫu và điều kiện phòng thí nghiệm (có sẵn loại cột sắc ký gì) mà chọn kiểu sắc ký phù hợp.

- Chất phân tích có phân tử lượng <2000:

* Chất phân tích tan tốt trong nước: nếu là hợp chất ion thì dùng sắc ký trao đổi ion hay sắc ký cặp ion; nếu là hợp chất phân cực và không điện ly thì dùng sắc ký pha đảo.

* Chất phân tích tan tốt trong dung môi hữu cơ kém phân cực (như hexan) thì dùng sắc ký pha thường; nếu tan trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình (như methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran…) thì dùng sắc ký pha đảo.

- Chất phân tích có phân tử lượng >2000: nếu tan tốt trong nước thì dùng sắc ký lọc gel theo cơ chế trao đổi ion; nếu tan tốt trong dung môi hữu cơ thì dùng sắc ký thấm qua gel [40].

1.2.4.2. Chọn cột sắc ký

a) Chọn pha tĩnh: dựa vào thành phần và tính chất của các cấu tử có trong mẫu phân tích để lựa chọn. Pha tĩnh cần có tương tác vừa phải và chọn lọc hỗn hợp chất cần phân tích.

- Để tách các chất không phân cực hay ít phân cực: dùng cột pha thường (NP: normal phase) tức cột có pha tĩnh phân cực (ví dụ: cột silica trung tính có chứa các nhóm –OH phân cực trên bề mặt; cột silica được ghép dây nhánh chứa nhóm chức phân cực như cyanopropyl, aminopropyl, diol...)

- Để tách các chất không phân cực, ít phân cực hay các chất phân cực có thể tạo cặp ion: dùng cột pha đảo (RP: reversed phase) tức là cột kém phân cực, trong đó pha tĩnh là silica được ghép dây nhánh Ankyl mạch hở (C3; C8; C18; C30) hay alkyl chứa vòng thơm (cột phenyl). Trong số đó, cột C18 được sử dụng nhiều nhất do nó có khả năng tách hiệu quả những nhóm hợp chất có

27

phân tử lượng nhỏ từ không phân cực, phân cực trung bình và cả những hợp chất ion.

b) Chọn kích thước cột và cỡ hạt pha tĩnh:

Nếu muốn phân tích nhanh và hiệu quả tách tốt thì dùng cột ngắn và có kích thước hạt nhỏ (<2 µm).

Nếu cần phân tích hỗn hợp phức tạp nhiều cấu tử thì dùng cột dài hơn.

1.2.4.3. Chọn pha động

Để luận chọn pha động phù hợp cần thỏa mãn các yêu cầu sau:

- Hòa tan được hỗn hợp chất phân tích để có thể rửa giải được chúng.

- Trơ với pha tĩnh, tức không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học.

- Bền theo thời gian, ít nhất trong suốt thời gian phân tích mẫu. - Có độ tinh khiết cao (dung môi cho HPLC, hóa chất tinh khiết phân

tích) - Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. - Phải không cho tín hiệu với loại detector sử dụng. Ví dụ: Dùng

detector UV/Vis thì dung môi không được hấp thụ trong vùng bước sóng phân tích; dùng detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang...

- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Thông thường, pha động thường có độ phân cực ngược với pha tĩnh: - Với hệ sắc ký pha đảo (RP – HPLC) pha động thường có là tổ hợp

một số dung môi phân cực (ví dụ: nước- methanol, nước- acetonitrile...). Ngoài ra, có thể bổ sung một số dung môi phân cực trung bình (tetrahydrofuran, dichloromethane, isopropanol...), hoặc thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH, thêm chất tạo phức, tạo cặp ion... để tạo ra sự rửa giải tốt nhất

- Với hệ sắc ký pha thường (NP-HPLC) thì dùng pha động kém phân cực (ví dụ: hexan; hỗn hợp hexan – ethyl acetate...) [39].

28

1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải

Để chọn chế độ rửa giải phù hợp, cần thử nghiệm nhiều lần để chọn thành phần pha động (chứa tổ hợp các dung môi nào), tốc độ dòng, nhiệt độ cột... để đạt độ phân giải tốt và peak có độ nhạy cao.

Ngoài ra, cần chọn chế độ rửa giải sao cho hiệu quả tách tốt nhưng với thời gian ngắn nhất.

- Nếu hỗn hợp phân tích gồm các cấu tử có độ phân cực không khác nhau nhiều thì nên rửa giải isocratic.

- Nếu hỗn hợp phân tích chứa các cấu tử có độ phân cực khác nhau nhiều (ví dụ: gồm hợp chất phân cực trung bình và kém phân cực) thì phải rửa giải gradient.

Việc xây dựng quy trình phân tích HPLC là công việc hết sức cần thiết, tuy nhiên, để có một quy trình phân tích tốt đòi hỏi mất nhiều thời gian khảo sát [39]. Trong thực tế, chúng ta thường áp dụng một số quy trình phân tích của một nhóm hợp chất nào đó đã được phát triển bởi các chuyên gia phân tích. Thế nhưng, việc áp dụng những quy trình này có thể cho kết quả không mong muốn. Do đó, để đỡ mất thời gian xây dựng một quy trình phân tích mới, chúng ta có thể cải biến (modification) quy trình có sẵn sao cho đạt hiệu quả mong muốn. Tuy vây, các quy trình này đều cần được thẩm định trước khi áp dụng trên đối tượng phân tích.

1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC

Việc thẩm định quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích ứng dụng không. Theo các hướng dẫn của ICH 1994 và 1996 [Q2A: Thẩm định phương pháp phân tích: Định nghĩa và thuật ngữ, ngày 27 tháng 10 năm 1994”; “Q2B: Thẩm định quy trình phân tích: Phương pháp luận, ngày 6 tháng 11 năm 1996”] để thẩm định một quy trình phân tích định lượng bằng phương pháp HPLC cần tiến hành đánh giá những tiêu chí tiêu sau:

29

1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Đánh giá sự phù hợp của thiết bị đối với việc thực hiện phương pháp HPLC đã cho để đạt độ đúng và độ tin cậy tối thiểu.

Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu tự tạo hay mẫu thử (ít nhất 6 lần tiêm).

Yêu cầu cần đạt: Độ phân giải giữa peak liền kề với peak của chất cần phân tích phải ≥ 1,5. Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (nếu RSD >2% phải có sự giải thích phù hợp) [41].

1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity)

Là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Trong phân tích định lượng, tính đặc hiệu đánh giá khả năng đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử.

- Cách khảo sát:

Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau: (1) mẫu trắng (dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu); (2) mẫu nền (mẫu không có chất cần phân tích); (3) mẫu chuẩn; (4) mẫu tự tạo (mẫu không có chất cần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và (5) mẫu thử chứa chất cần phân tích được chuẩn bị theo quy trình.

Yêu cầu cần đạt:

- Trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo cho peak của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các peak khác (nếu có trong nền mẫu).

- Sắc ký đồ của mẫu trắng hay dung dịch nền mẫu không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng peak phải ≤ 1,0% so với đáp ứng peak của mẫu chuẩn.

- Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết, nghĩa là hệ số chồng phổ UV-Vis của peak hoạt chất cần phân tích thu

30

được trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử/mẫu tự tạo với peak tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn ≥ 0,99 [41].

1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy)

Là biểu diễn sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy với giá trị thực (hoặc giá trị trung bình) với giá trị đúng (hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận).

Cách khảo sát:

- Cách 1 (tiến hành trên mẫu tự tạo): Chuẩn bị 03 mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất cần phân tích (Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ phân tích). Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính.

- Cách 2 (thực hiện trên mẫu phân tích) : Chuẩn bị 06 mẫu thử độc lập với lượng chất chuẩn thêm vào ứng với mức nồng độ 100% của chất cần phân tích.

Tính độ thu hồi (% Recovery) theo công thức:

Độ thu hồi (%) = (Lượng chất phân tích tìm lại x 100)/Lượng chất chuẩn thêm vào

Yêu cầu đối với phép thử định lượng: Độ thu hồi (%) = 98,0 - 102,0% [40]

1.2.5.4. Độ chính xác (Precision)

Diễn tả sự trùng hợp (hay mức độ phân tán) của các kết quả đo được từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả.

Độ chính xác thường được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn (SD: standard deviation) hoặc hệ số dao động (RSD: relative standard deviation) của một loạt phép đo.

31

trong đó:

Độ chính xác nên được thử trên một mẫu thử thực, đồng nhất (nếu không có mẫu đồng nhất thì có thể dùng mẫu tự tạo hoặc một dung dịch mẫu thử).

Độ chính xác có thể chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp.

a) Độ lặp lại (Repeatability): diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn.

Cách khảo sát: Định lượng 06 mẫu thử độc lập trong cùng ngày.

b) Độ chính xác trung gian (Intermediate precision): diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, bởi các kiểm nghiệm viên khác nhau và thiết bị khác nhau.

Cách khảo sát: Tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày/khác kiểm nghiệm viên/khác hệ thống HPLC.

Theo hướng dẫn của AOAC, giới hạn chấp nhận phù hợp cho mẫu phân tích ở nồng độ nhỏ (<100 ppm) là giá trị RSD kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên/mỗi ngày (n = 6) ≤ 3,0% và của cả hai kiểm nghiệm viên/khác ngày (n = 12) phải ≤ 5,0%.

c) Độ tái lặp (Reproducibility): diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm phối hợp nhau để tiêu chuẩn hoá phương pháp [40].

1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range)

Là khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử trong đó quy trình phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính.

1

)(1

2

-

-=å=

n

XXSD

n

ini

%100.%n

n

XS

RSD =

32

Cách khảo sát: Tiến hành sắc ký 5 - 8 dung dịch chuẩn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng peak thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.

Yêu cầu cần đạt: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995).

(Nếu r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp)

1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit)

Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà một quá trình phân tích có thể phân biệt một cách đáng tin cậy với nhiễu nền.

LOD thường được xác định bằng nồng độ chất phân tích ứng với peak có diện tích gấp 3 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.

Giới hạn định lượng (LOQ: Quantitation Limit): là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp. LOQ thường được tính bằng nồng độ chất phân tích ứng với peak có diện tích gấp 10 lần độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng [41].

LOD và LOQ có thể xác định theo 1 trong 2 cách:

- Cách 1: Pha loãng dung dịch chuẩn đến lúc diện tích peak của chất phân tích gấp 3 lần (nếu tính LOD) hay gấp 10 lần (đối với LOQ) độ lệch chuẩn của nền khi phân tích mẫu trắng.

- Cách 2: Dựa vào đường chuẩn tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng.

LOD = (3,3 x s)/a; LOQ = 3,3 x LOD

trong đó:

s: độ lệch chuẩn của tín hiệu ứng với mẫu nền .

a: hệ góc của đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và đáp ứng (thường là diện tích peak) của chất cần phân tích [40].

33

1.2.5.7. Độ thô (Robustness)

Đánh giá khả năng duy trì của quy trình phân tích không bị ảnh hưởng bởi những biến đổi nhỏ nhưng có tính chủ định trong các thông số của phương pháp và chỉ ra mức tin cậy của quy trình trong điều kiện sử dụng bình thường.

1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope)

Cho biết quy trình phân tích đã cho có thể áp dụng được trên các loại nền mẫu nào.

Như vậy, việc xây dựng một quy trình HPLC đã khó khăn thì việc tiến hành thẩm định quy trình càng phức tạp do rất tốn kém. Do vậy, trong thực tế chỉ có thể đánh giá trên một số tiêu chí thực tiễn nào đó sao cho có sự cân đối giữa yêu cầu về tính chính xác, tính khoa học của phương pháp với phí tổn, thời gian và việc huấn luyện đội ngũ các nhà phân tích.

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CARATENOID

Cũng như các carotenoid khác, dung dịch lutein hấp thụ mạnh trong vùng khả kiến trong khoảng 400 – 500 nm. Sự hấp thụ này tuân theo định luật Lambert-Beer trong một khoảng tương đối rộng (có thể dưới 1 ppm đến vài chục ppm). Như vậy, về nguyên tắc, có thể định lượng các carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis. Việc định lượng này đặc biệt nhạy nếu sử dụng phương pháp HPLC với detector UV-Vis [42].

1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis

1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế

Nguyên tắc:

Hoà tan lượng carotenoid với dung môi thích hợp. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng ứng với cực đại hấp thụ của carotenoid trong dung môi đã pha với cuvet 1cm.

Hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu (Y%) được tính theo công thức:

34

trong đó:

A: độ hấp thụ của dung dịch đo được; D: hệ số pha loãng.

: độ hấp thụ cực đại của dung dịch chứa 1% w/v carotenoid với

cuvette 1cm trong dung môi nghiên cứu.

G: số gam carotenoid đã cân (G lấy sao cho A đo được từ 0,3 – 0,7).

1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học

Các mẫu sinh học chứa lutein thường chứa hỗn hợp nhiều carotenoid khác nhau, chúng có phổ hấp thụ khả kiến chồng lấn lên nhau, gây khó khăn cho việc định lượng riêng rẽ một carotenoid nào đó. Bên cạnh đó, mẫu còn có thể chứa một số hợp chất có màu không phải carotenoid nhưng cũng hấp thụ bức xạ khả kiến do đó sẽ cản trở việc định lượng lutein bằng phương pháp trắc quang - so màu. Khi đó, cần loại bỏ những hợp chất cản trở trước khi định lượng carotenoid tổng số. Chẳng hạn, các mẫu dịch chiết thực vật (lá cây, một số loài rong, tảo có màu lục) thường chứa chlorophyll. Ngoài khả năng hấp thụ ở vùng 650 – 700 nm chlorophyll còn hấp thụ mạnh ở 430 nm (chlorophyll a) và 450 – 460 nm (chlorophyll b). Do đó cần phải xà phòng hoá mẫu carotenoid trước khi phân tích để loại bỏ các tạp chất béo khỏi dịch chiết [43].

1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC

So với phương pháp sắc ký cột cổ điển, phương pháp HPLC có những ưu điểm sau: 1) Hiệu quả tách tốt nhờ sử dụng pha tĩnh có kích thước hạt nhỏ; 2) Giảm đáng kể nguy cơ phân hủy carotenoid do pha tĩnh được chứa trong một cột kín bằng thép inox không tiếp xúc với ánh sáng và không khí; 3) Độ lặp lại cao do cột sắc ký được nhồi sẵn, có thể dùng lại nhiều lần; 4) Phân tích nhanh do hệ thống HPLC được điều khiển tự động; 5) Cho phép thu nhận các thông tin về cấu trúc phân tử carotenoid nhờ sử dụng các detector PDA, MS hay NMR. Vì vậy, phương pháp thông dụng nhất để định lượng carotenoid

GADAYcm .10..(%) %1

1

4

=

%11cmA

35

hiện nay chính là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tuy nhiên, do sự phức tạp về thành phần carotenoid trong mẫu sinh học cũng như sự đa dạng của đối tượng phân tích nên cho tới nay không có quy trình tiêu chuẩn nào cho phép định lượng carotenoid trong tất cả loại mẫu phân tích.

Đa số trường hợp định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC đều dùng cột pha ngược trong đó phổ biến nhất là cột C18 do có ưu điểm là tương thích với hầu hết dung môi hòa tan carotenoid và phù hợp với độ phân cực của các carotenoid. Trong một số trường hợp cột pha thường với pha tĩnh là silicagel được sử dụng để tách các xanthophyll (Ví dụ: dùng cột silica (250 mm x 4,6 mm; 3 µm) để định lượng lutein và zeaxanthin trong sản phẩm lutein tinh chiết tách từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. theo quy trình của JECFA [11]; định lượng astaxanthin trong thức ăn nuôi cá bằng cột Lichrosorb Si60 (5 µm) được phủ một lớp acid phosphoric 1 (Sự acid hóa pha tĩnh bằng các acid yếu như trên có tác dụng ngăn ngừa sự lưu giữ quá mạnh của các xanthophyll phân cực trên cột). Tuy nhiên, cột silica thường phân giải kém đối với các carotene.

Nhiều hệ dung môi đã được đề nghị dùng làm pha động trong phân tích carotenoid, trong đó thông dụng nhất là acetonitrile và methanol. Hầu hết các hệ pha động đều dựa trên sự tổ hợp hai dung môi cơ bản trên nhưng có sự thay đổi đôi chút về thành phần [44]. Acetonitrile được dùng rất phổ biến do nó có độ nhớt thấp và độ chọn lọc tốt hơn khi tách các xanthophyll trên cột C18 [45]. Trong khi đó pha động với thành phần cơ bản là methanol có ưu điểm là cho độ thu hồi cao hơn, ngoài ra methanol rẻ và ít độc hơn acetonitrile [46]. Trên cơ sở acetonitrile hay methanol, một vài dung môi khác (dichloromethane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, hexane, acetone, nước ...) có thể được thêm vào pha động để đạt được sự lưu giữ mong muốn, cải thiện độ phân giải và làm tăng độ tan của carotenoid. Ví dụ: thêm dịch loromethane tăng tính chọn lọc của quá trình tách và tăng độ tan của carotenoid. Một số nhà phân tích có khuynh hướng sử dụng pha động chứa 3 - 4 dung môi

1 bằng cách bơm dung dịch H3PO4 1% (1g dung dịch H3PO4 85% hòa tan trong 100 ml metanol) qua cột với tốc độ 1 ml/min trong 1 h

36

nhưng theo Craft (1992) [19], điều này có thể làm phức tạp hóa phương pháp phân tích do tăng tính không trộn lẫn của chúng và tốc độ bay hơi khác nhau của các dung môi sẽ làm thay đổi thành phần pha động trong quá trình phân tích, do đó làm thay đổi thời gian lưu của carotenoid trong ngày. Neils và Leenheer (1983) [47] cho rằng việc dùng pha động không chứa nước khi tách hỗn hợp carotenoid phức tạp sẽ giúp làm tăng độ tan của carotenoid và giảm khả năng kết tủa carotenoid trên cột. Tuy nhiên, một số nhà phân tích vẫn thường thêm một lượng nước rất nhỏ vào pha động để hạn chế sự rửa giải quá sớm của các xanthophyll tự do. Đôi khi acetat amoni (0,05 M trong methanol) hay triethylamine (0,05 hay 0,1% v/v) có thể được thêm vào pha động để hạn chế ảnh hưởng của tính acid gây ra bởi các nhóm silanol tự do trên pha tĩnh silicagel, do vậy giảm hiện tượng kéo đuôi, cải thiện độ thu hồi các carotenoid.

Nếu có thể, nên dùng chế độ rửa giải isocratic (thành phần pha động không đổi) do nó có những ưu điểm sau: 1) đơn giản (chỉ cần dùng một bơm cao áp); 2) nhanh; 3) cho đường nền ổn định; 4) thời gian lưu lặp lại tốt. Chế độ rửa giải này nói chung có khả năng tách được các tiền vitamin A và carotenoid chính trong các mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, khi tách hỗn hợp gồm nhiều carotenoid có độ phân cực rất khác nhau thì nên dùng chế độ rửa giải gradient để cải thiện độ chọn lọc và tăng khả năng rửa giải các hợp chất lưu giữ mạnh trên pha tĩnh.

Dung môi hòa tan mẫu phải tương thích với pha động HPLC. Nếu độ tan của các carotenoid trong dung môi hòa tan mẫu tốt hơn nhiều so với trong pha động và nhất là khi tiêm dung dịch mẫu gần như bão hòa vào cột thì sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa carotenoid trong buồng tiêm mẫu, dẫn đến hiện tượng kéo đuôi, giãn peak, chẽ peak hay tạo thành các peak ma (ghost peak)… Để tránh sự không tương thích này, nên dùng pha động làm dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu bằng pha động trước khi tiêm vào cột sắc ký. Theo Kimura et al. (1995) [47], acetone là dung môi hòa tan mẫu rất tốt khi pha động chứa hỗn hợp acetonitrile – methanol – dichlorometane – hexane do nó có độ phân cực và tính tan gần giống như pha động.

37

Khi phân tích carotenoid, nếu nồng độ carotenoid trong dung dịch khá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng biến dạng peak. Theo Khachik et al. (1988) [47], có thể loại trừ hiện tượng này nếu thể tích tiêm mẫu giảm xuống còn 5 hay 10 µl.

Nhiệt độ cột cũng cần được ổn định để duy trì độ lặp lại về thời gian lưu của các carotenoid cũng như độ chọn lọc và độ thu hồi của phương pháp phân tích. Chẳng hạn, ở 300C khi dùng cột C18 và pha động gồm acetonitrile-dichloromethane-methanol 70:20:10 thì không thể tách lutein với zeaxanthin, tách trans-β-carotene với đồng phân 9-cis nhưng ở 130C thì có thể tách tốt chúng (Sander và Craft, 1990) [47].

Như đã biết, các carotenoid hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại - khả kiến nên để định lượng carotenoid thường dùng detector UV-Vis. Hơn nữa, loại detector này khá rẻ tiền và dễ vận hành nhưng có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính khá rộng, ít chịu ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ. Nhược điểm của chúng là không cho phép nhận biết được các carotenoid có thời gian lưu gần giống nhau. Để khắc phục hạn chế này có thể dùng detector DAD: loại detector đắt tiền hơn nhưng cho phép ghi phổ hấp thụ UV-Vis của các carotenoid ứng với các peak tách ra trên sắc ký đồ, do đó cho phép khẳng định phần nào cấu trúc của carotenoid, đồng thời kiểm tra độ tinh khiết của peak. Tuy nhiên, các carotenoid chứa các đồng phân hình học hay đồng phân quang học có phổ hấp thụ UV-Vis rất gần giống nhau. Trong trường hợp này, không thể sử dụng detector DAD để nhận biết chúng mà phải dùng detector MS hay NMR để khẳng định chính xác hơn cấu trúc phân tử carotenoid. Nói chung, độ nhạy của detector MS cao hơn so với detector UV-Vis.

Để định lượng một carotenoid X nào đó bằng phương pháp HPLC thường dùng phương pháp đường chuẩn. Lưu ý rằng các carotenoid đa số kém bền nên hàm lượng carotenoid trong “mẫu chuẩn” thường bị suy giảm trong quá trình bảo quản. Do vậy, cần kiểm tra lại hàm lượng carotenoid tổng số có trong mẫu chuẩn bằng phương pháp đo quang UV-Vis (xem 1.3.1), sau đó chạy HPLC để xác định % carotenoid X có trong tổng số carotenoid còn lại.

38

Hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn được tính theo công thức:

% CARX = % CAR TS* (SX/STS)*100%

trong đó:

%CARX: hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn.

%CARTS: hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu chuẩn xác định bằng phương pháp đo quang UV-Vis.

SX: diện tích peak ứng với carotenoid X trên sắc ký đồ.

STS: tổng diện tích các peak xuất hiện trên sắc ký đồ.

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester

Hiện nay, hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) được xem là nguồn nguyên liệu tự nhiên tốt nhất dùng cho sản xuất lutein thương mại do nó có khả năng tích lũy lutein với hàm lượng khá cao và gần như nguyên chất. Thật vậy, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng xanthophyll tổng số trong cánh hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. vào khoảng 1,0 – 1,6% (tính theo trọng lượng khô), trong đó khoảng 90% lượng carotenoid này là lutein ester (dưới dạng monoester và diester của các acid béo C12 - C18 như acid lauric, myristic, oleic, linoleic, palmitic, stearic) và chỉ có khoảng 5% là zeaxanthin ester (Kumar, 2004). Lutein dưới dạng ester rất bền nhưng khi vào cơ thể con người chỉ bị thủy phân một phần thành dạng tự do rồi mới được hấp thụ vào huyết thanh. Vì vậy, để tạo ra những chế phẩm lutein bổ sung cho con người, sau khi thu được oleoresin cần thủy phân lutein ester về dạng tự do [9].

Quá trình thủy phân lutein ester từ hoa cúc vạn thọ có thể thực hiện bằng phương pháp hóa học hay sinh học. Phương pháp hóa học (còn gọi là phương pháp xà phòng hóa) sử dụng tác nhân kiềm mạnh (thường là KOH) trong alcohol hữu cơ (propylen glycol, ethanol) để cắt đứt liên kết ester giữa các nhóm –OH trong phân tử lutein với các acid béo. Phương pháp xà phòng hóa tuy ít tốn kém nhưng thường phải tiến hành ở nhiệt độ cao nên có thể gây ra sự phân hủy lutein tự do. Do đó, một số tác giả khác nghiên cứu sử dụng

39

phương pháp sinh học trong đó sử dụng enzyme lipase để thủy phân lutein ester ở nhiệt độ phòng nhằm hạn chế sự phân hủy hoạt chất. Tuy nhiên, phương pháp này hiện nay ít được áp dụng rộng rãi do enzyme đắt tiền, hiệu quả kinh tế không cao khi ứng dụng trong công nghiệp [48].

Trên thế giới đã có khá nhiều sáng chế về quá trình tách chiết và tinh chế lutein từ hoa cúc vạn thọ, trong đó có đề cập đến phương pháp xà phòng hóa lutein ester.

Sau đây là một số phương pháp xà phòng hóa lutein ester tiêu biểu:

Ausich và cs. (1997) [43] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách hòa tan oleoresin trong propylen glycol theo tỷ lệ 41:41 (w/w) rồi đun ở 50 - 600C cho tan ra, sau đó thêm từ từ 18 phần khối lượng dung dịch nước của KOH 45% w/w rồi đun nóng đến 65-800C (tốt nhất là ở 700C) trong 10 giờ. Như vậy, tỷ lệ oleoresin: propylen glycol: KOH: H2O trong hỗn hợp xà phòng hóa ban đầu xấp xỉ 4:4:1:1 (w/w/w/w). Nhược điểm của quy trình này là oleoresin khó tan trong propylen glycol (có độ nhớt cao) nên quá trình xà phòng hóa cần tiến hành ở nhiệt độ khá cao trong thời gian dài, dẫn đến khả năng phân hủy lutein, zeaxanthin thành các sản phẩm không mong muốn

Khachik, F. (2001) [49] đề nghị quá trình chiết lutein ester từ bột hoa cúc vạn thọ khô (thu được bằng cách ủ xi-lô rồi sấy khô) bằng tetrahydrofuran (THF) và đồng thời xà phòng hóa bằng cách phối trộn với dung dịch KOH 10% trong ethanol (EtOH) để đưa hỗn hợp về pH 12. Tỷ lệ các thành phần trong hỗn hợp phản ứng như sau: 100 g bột hoa cúc: 1000 ml THF: 250 ml KOH 10% w/v trong EtOH. Tiến hành chiết và xà phòng hóa lutein ester bằng cách khuấy trộn hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng trong 2 h Tiến trình thủy phân được giám sát bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). Quy trình này mặc dù cho hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm lutein cao nhưng có nhược điềm là không có giai đoạn cô đặc lutein ester trước khi xà phòng hóa nên tiêu tốn nhiều dung môi và KOH. Ngoài ra, THF dễ tạo thành các peroxid do đó có thể phân hủy xanthophyll.

Madhavi (2002) [50] đưa ra quy trình xà phòng hóa oleoresin trong dung dịch isopropanol-nước như sau: Hòa tan 1 kg oleoresin trong 3 L

40

isopropanol rồi khuấy và đun nóng đến 600C đến khi chảy lỏng thành dung dịch. Sau đó, thêm 0,44 L dung dịch nước chứa 50% KOH (tức nồng độ oleoresin và KOH trong hỗn hợp xà phòng hóa là 0,3 g/ml và nồng độ KOH là 6,4% w/v). Xà phòng hóa bằng cách khuấy và duy trì hỗn hợp ở 60-650C trong 90 phút. Sản phẩm thu được chứa 95% carotenoid tổng số (với 90% all-trans lutein, 4% all-trans zeaxanthin, còn lại là các vết carotenoid khác). Nhược điểm của quy trình này sinh ra nhiều nước thải do sử dụng lượng nước lớn gấp 30 lần lượng oleoresin.

Kumar, S.T.K và cs. (2004) [7] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách thêm dung dịch KOH 8 – 13% w/v trong isopropanol vào oleoresin sao cho oleoresin với nồng độ oleoresin trong hỗn hợp là 0,33 g/ml. Hỗn hợp được đun nóng 65-800C trong 3 giờ. Tiến trình xà phòng hóa được giám sát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nhược điểm của quy trình này phản ứng phải thực hiện ở nhiệt độ khá cao (70 - 800C) nên có khả năng dẫn đến sự chuyển hóa trans-lutein thành đồng phân cis- làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm.

Swaminathan (2009) [8] xà phòng hóa oleoresin bằng cách đun oleoresin đến dưới 450C, khuấy đều cho chảy lỏng ra, thêm 1,2 - 2,0 phần thể tích dung dịch KOH 13 - 15% trong EtOH tuyệt đối rồi đun ở 70 - 800C trong 40 phút. Hiệu suất xà phòng hóa thay đổi từ 55% - 80% tùy điều kiện phản ứng cụ thể. Ưu điểm của quy trình này là ít sử dụng dung môi độc hại, rút ngắn thời gian xà phòng hóa.

Gần đây, Joseph và cs. (2013) [51] đã cải tiến quy trình xà phòng hóa lutein oleoresin bằng dung dịch KOH trong nước với sự có mặt của hỗn hợp alcohol béo (lauryl alcohol) và acid béo (caprylic capric acid) để bảo vệ lutein khỏi bị oxy hóa ở nhiệt độ cao như sau: 10 kg oleoresin được đun nóng và khuấy ở 450C trong 5-10 phút cho đồng nhất. Thêm từ từ 1,95 kg KOH 95% trong 3 kg nước rồi 0,86 kg caprylic capric acid và 4,3 kg of lauryl alcohol, khuấy đều và gia nhiệt ở 800C trong 3h (theo dõi quá trình xà phòng hóa bằng sắc ký bản mỏng). Hiệu suất phản ứng khoảng 80,15%. Phương pháp này tuy không dùng dung môi EtOH và sản phẩm carotenoid thu được có độ tinh

41

khiết cao (khoảng 91,75% carotenoid tổng số) nhưng phải dùng hỗn hợp caprylic capric acid-lauryl alcohol và lượng nước khá lớn khó có khả năng thu hồi, yêu cầu thiết bị phức tạp (ly tâm tốc độ cao).

Từ việc tổng quan tài liệu có thể thấy rằng đa số phương pháp xà phòng hóa đều sử dụng dung dịch KOH trong alcohol (methanol, ethanol, isopropanol, propylen glycol…). Tuy nhiên, không có sự tương đồng về điều kiện xà phòng hóa lutein ester. Nguyên nhân có lẽ là do các tác giả đã sử dụng các dung môi khác nhau (hexane, ether dầu mỏ, ethyl acetate…) để chiết lutein tự do từ hỗn hợp xà phòng hóa cũng như dùng các phương pháp và kỹ thuật khác nhau (TLC, đo quang UV-Vis, HPLC) để đánh giá hiệu suất xà phòng hóa. Thực tế trên dẫn đến sự băn khoăn trong việc lựa chọn phương pháp xà phòng hóa để ứng dụng trong nghiên cứu và sản xuất.

Nhằm góp phần hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ, việc đánh giá lại ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa đến hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do, từ đó chọn lựa phương pháp thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester là vấn đề cần quan tâm.

1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng phương pháp HPLC

1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Lutein là carotenoid có trong nhiều loài động - thực vật, có vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh mù lòa ở người cao tuổi (thoái hóa hoàng điểm, đục thủy tinh thể,...). Do đó, có nhiều công trình nghiên cứu định lượng lutein và các carotenoid đi kèm trong các nguồn nguyên liệu tự nhiên, các mẫu sinh học, thực phẩm, dược phẩm.

Một trong những công trình nghiên cứu lâu đời nhất định lượng carotenoid trong thực vật bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha ngược được thực hiện bởi Tee E. Siong và Lim Chin Lam (1992) [47]. Dịch chiết carotenoid thu nhận từ 8 loài thực vật trước hết được tách sơ bộ bằng sắc ký cột hở chứa hỗn hợp MgO2-diatomite (phương pháp AOAC, Deutsch, M.J,

42

1984 [28]), rửa giải bằng hỗn hợp acetone: hexane với tỷ lệ acetone tăng dần. Các phân đoạn carotenoid tách ra được đo quang UV-Vis ở 450 nm để xác định carotenoid tổng số, sau đó tiêm vào thiết bị HPLC sử dụng cột C18 (300 x 3,9 mm; 10 µm) với thể tích tiêm mẫu 50 - 100 µL; pha động là hỗn acetonitrile-methanol-ethyl acetate, 88:10:2, v/v, tốc độ dòng 2,0 mL/min. Sử dụng phương pháp này cho phép phân tách được a- và b- carotene, lutein, lycopene trong một số rau quả, nhưng không phân giải được một số carotenoid khác (lutein và zeaxanthin…). Kết quả cũng cho thấy việc xà phòng hóa giúp loại bỏ chlorophyll, do đó cho phép định lượng carotenoid dễ dàng hơn. Phương pháp này khá phức tạp, cần lượng mẫu nhiều, độ phân giải không cao (do dùng pha tĩnh có kích thước hạt lớn), độ chính xác không cao, mất nhiều thời gian nên hiện nay ít được sử dụng.

Sau đó, những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực chế tạo thiết bị HPLC đã cho phép các nhà phân tích sử dụng pha tĩnh C18 với kích thước hạt nhỏ hơn và cột ngắn hơn, nhờ đó giảm lượng mẫu và thời gian phân tích nhưng hiệu quả tách tốt hơn. Chẳng hạn, Maria V. Chandra-Hioe và cs. (2017) [47] đã xây dựng quy trình định lượng lutein và β-carotene trong một số loài rau có lá ở châu Á (rau muống, rau dền, su lơ trắng, su lơ xanh, mù tạc, rau mùi). Các carotenoid được chiết từ các mẫu rau bằng acetone chứa 5% (w/v) CaCO3. Dịch chiết được cô đặc ở 4°C, sau đó lọc và bơm vào thiết bị HPLC với cột C18 (150 x 3,9 mm; 5 μm). Pha động gồm 2 hệ dung môi: A = acetonitrile: methanol: đệm Tris 0,1 M pH 8 (84: 2:14) và B = methanol: ethyl acetate (68:32). Rửa giải gradient trong 25 phút với tốc độ dòng 1,2 mL/phút (100% A đến 100% B trong 12 phút, giữ trong 6 phút; về 100% A trong 1 phút và cân bằng cột trong 6 phút). Ghi nhận tín hiệu bằng detector DAD ở 450 nm. Các dung dịch chuẩn gốc β-carotene, lycopene and lutein được bảo quản ở -800C dưới khí quyển N2 và pha loãng thành dung dịch chuẩn làm việc bằng pha động ngay trước khi dùng. Các đường chuẩn có R2 > 0,99. Phương pháp có độ thu hồi tốt đối với β-carotene và lutein (lần lượt là 132% và 100%); độ chính xác khá cao (độ lặp lại trong ngày < 3,8%; độ lặp lại giữa các ngày < 11%).

43

Tuy vậy, đối với những hỗn hợp carotenoid phức tạp, cột C18 thường không cho phép tách tốt, không thể định lượng chính xác. Vì vậy, những năm gần đây các nhà sản xuất đã cho ra đời cột pha đảo C30. Kết quả nghiên cứu trên nhiều đối tượng phân tích khác nhau cho thấy loại cột này có khả năng phân giải rất tốt hỗn hợp carotenoid, đặc biệt cho phép tách rất hiệu quả các đồng phân vị trí hay đồng phân quang học. Do đó, loại cột này hiện được sử dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới để phân tích carotenoid. Sau đây là một số ví dụ:

- Rebecca Yuhas và cs. (2011) [47] đã sử dụng cột C30 (250 x 4,6 mm; 5μm) để định lượng lutein trong sữa bột trẻ em: rửa giải gradient kiểu bậc thang (85% A đến 70% A từ 0 – 18 phút; giảm xuống 10% A trong 1 phút và giữ trong 4 phút; sau đó tăng lên đến 85% A trong 1 phút; cân bằng cột ở 85% A trong 6 phút; trong đó A = MeOH; B = MTBE (Methyl – tert – butyl ether); tốc độ dòng 1 mL/phút; ghi nhận tín hiệu bằng detector UV-Vis ở 445 nm. Đường chuẩn có độ tuyến tính tốt (R2 = 0,997). Phương pháp có độ lặp lại tốt (% RSD < 4%), độ chính xác trung gian cao (% RSD < 20% và < 12% khi nồng độ lutein lần lượt dưới 25 µg/L và 200 µg/L). Độ thu hồi chung của toàn bộ quá trình từ 88% đến 106%.

- Domenico Montesano và cs. (2012) [47] đã nghiên cứu chiết và định lượng lutein từ phế liệu cà chua (vỏ và hạt) bằng phương pháp HPLC-DAD. Mẫu được đun sôi trong nước, lọc lấy bã đem chiết bằng acetone/ethanol 2:1 (v/v). Dịch chiết được cô quay rồi hòa tan trong hexane/ethyl acetate 96:4 (v/v) để làm sạch (loại các carotenoid kém phân cực như β-carotene, lycopene) trên cột SPE Florisil. Dịch ra khỏi cột SPE được cô quay, rồi hòa tan trong pha động sắc ký và bơm vào thiết bị HPLC trên cột C30 (250 × 4,6 mm; 5 µm), detector PDA ở bước sóng 450 nm, rửa giải isocratic bằng pha động gồm MBTE:MeOH 30:70 v/v, tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Đường chuẩn có độ tuyến tính và độ lặp lại tốt (R2 = 0,9999; %RSD = 1,7%), khoảng tuyến tính rộng (0,01 – 100 μg/mL), LOD và LOQ rất thấp (lần lượt là 0,02 và 0,07 μg/mL).

44

- Jing Tan và cs. (2017) [52] đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng all-trans lutein, zeaxanthin, b-cryptoxanthin, a-carotene, và b-carotene trong các mẫu sinh học như huyết thanh và sữa người sử dụng cột C30 (150 x 2,1 mm, 3 µm) ở 300C. Buồng tiêm mẫu được giữ ở 80C trong 48 giờ. Pha động gồm 2 hệ dung môi: A = MeOH : dung dịch ammonium acetate 1,5% (98:2, v/v) và B = MTBE : MeOH : dung dịch ammonium acetate 1,5% (90:8:2, v/v/v). Rửa giải gradient như sau: 100% A giữ trong 1,5 phút; giảm xuống 55% A ở 9,4 phút rồi xuống 5% A sau 2,0 phút và giữ trong 2,0 phút; cuối cùng về 100% A sau 0,1 phút và giữ trong 3,0 phút. Tốc độ dòng cố định 0,5 mL/phút. Các carotenoid được phát hiện ở 445 nm, quét phổ UV-Vis 380 – 640 nm. Echinenone được sử dụng làm chất nội chuẩn. Các dung dịch chuẩn gốc carotenoid được chuẩn hóa trước mỗi lần phân tích. Kết quả cho thấy các peak lutein (ở 5,649 min) và peak của zeaxanthin (6,397 min) phân giải rất tốt và quá trình sắc ký hoàn tất chỉ trong 18 phút, tức ngắn hơn 30 – 40 phút so với các phương pháp khác. Nguyên nhân là do sử dụng cột có kích thước hạt và đường kính nhỏ. Độ tuyến tính tốt đạt được đối với các carotenoid (R2 > 0,9999). Giới hạn định lượng của phương pháp (MLOQ) đối với mẫu huyết thanh và sữa mẹ lần lượt là 10 ng/mL và 5 ng/mL. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ đúng tốt (độ thu hồi từ 85 –105%), độ lặp lại khá cao (%RSD trên mẫu chuẩn lutein khoảng từ 3,3 – 4,2%; %RSD đối với độ thu hồi lutein trên mẫu thực từ 2,2- 7,5%).

Bên cạnh đó, cũng có những phương pháp định lượng carotenoid sử dụng cột pha thuận. Chẳng hạn:

- JECFA (2004) [12] đã phê chuẩn phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm lutein tinh chế thu nhận từ hoa cúc vạn thọ như sau: Mẫu lutein (cân chính xác) được hòa tan trong EtOH tuyệt đối và độ hấp thụ ở 446 nm để xác định hàm lượng carotenoid tổng số. Sau đó, xác định % lutein và % zeaxanthin trong tổng số carotenoid bằng phương pháp HPLC sử dụng cột silica (250 x 4,6 mm; 3 μm); rửa giải isocratic trong 40 phút (pha động là hỗn hợp hexane/ethyl acetate 70:30 v/v; tốc độ 1,5 ml/phút); thể tích bơm mẫu 10 μl; detector UV-Vis ghi nhận tín hiệu ở 446 nm.

45

- Miroslav ŠIVEL và cs. (2014) [1] đã định lượng lutein trong các dịch chiết cô đặc thu nhận từ hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) Mẫu được hòa tan trong dung môi acetone-methanol (1:1 v/v) và bơm vào thiết bị HPLC-DAD ở 300C dùng cột pha thuận ZORBAX SB CN (75 mm × 4,6 mm; 3,5 μm), rửa giải gradient tuyến tính (0 phút 30% A; 10 phút 0% A và 15 phút 30% A; trong đó A = dung dịch nước chứa 3,153 g/L ammonium formate và B = MeOH) với tốc độ dòng 0,7 mL/phút. Tín hiệu được ghi ở 446 nm. Phương pháp có LOD = 0,22 μg/g; LOQ = 0,7 μg/g. Đường chuẩn tuyến tính tốt (R2 = 0,9982); độ lặp lại và độ thu hồi cao (đối với các dung dịch chuẩn RSD = 1,4% và độ thu hồi từ 99,0 – 101%).

Khó khăn lớn nhất trong việc định lượng các mẫu sinh học là việc xử lý mẫu khá phức tạp, độ chính xác và độ lặp lại thường không cao do carotenoid dễ phân hủy trong quá trình phân tích, độ phân giải của một số peak chưa tốt, thời gian phân tích khá dài.

1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại. Đối với các cột pha đảo thì cột C30 tuy có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp carotenoid khác nhau (đặc biệt là hỗn hợp carotenoid ở các dạng đồng phân khác nhau) nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường được ưu tiên lựa chọn trong phân tích các hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp. Cho tới nay số công trình nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng các hợp chất nhóm carotenoid rất ít.

Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] đã xây dựng phương pháp HPLC định lượng astaxanthin và các carotenoid đi kèm có trong một số loài giáp xác thủy sản. Mẫu được xay nhỏ, trộn đều với Na2SO4 khan rồi đồng hóa trong dung môi acetone. Dịch chiết acetone được chiết sang hỗn hợp ether ethylic - ether dầu mỏ (1:1, v/v), làm khan, cô quay, hòa tan trong methanol-dichloromethane (3:1, v/v) và xà phòng hóa ở 50C trong 18 giờ (phương pháp Yuan & Chen (2000) [47]). Hỗn hợp sau khi xà phòng hóa được chiết sang

46

ethyl axetat, cô quay. Hòa tan cặn thu được acetone, giữ qua đêm ở -200C để kết tủa tạp chất lipid, rồi lọc dung dịch qua màng lọc PTFE 0,22 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC (Agilent 1100 Series, USA). Điều kiện sắc ký như sau: cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm); nhiệt độ cột 300C; thể tích bơm mẫu: 5 µl; tốc độ dòng: 1 ml/min; detector PDA ghi tín hiệu ở 480 nm và quét phổ từ 350 – 600 nm. Rửa giải gradient (100% A: 8 phút; 100% A đến 100% B: 5 phút; 100% B 15 phút; cân bằng cột: 15 phút; trong đó A = acetonitrile-methanol-dichloromethane-H2O 85:5:5:5 v/v/v/v và B= acetonitrile-methanol-dichloromethane-H2O 60:8:30:2 v/v/v/v). Phương pháp cho phép tách tốt hỗn hợp astaxanthin, lutein/zeaxanthin, lycopene, b-carotene nhưng không phân tách được cặp đồng phân lutein/zeaxanthin. Kết quả cho thấy các đường chuẩn tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ carotenoid từ 1,5 - 10 µg/ml (R2 > 0,99); độ lặp lại cao (%RSD = 0,30 – 1,50% đối với mẫu chuẩn (n = 6) đo trong ngày có n = 6 và từ 1,13 - 2,93% đối với mẫu chuẩn (n = 3) trong 2 tháng. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi thấp (astaxanthin: 83%; lutein: 65,4%; lycopene: 52,4%; b-carotene: 66,4%) do carotenoid bị mất mát trong quá trình xà phòng hóa và kết tủa tạp chất lipid bằng acetone.

Trương Ngọc Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ (2017) [14] đã xây dựng phương pháp phân tích β – carotene trong một số loại ngũ cốc có màu bằng phương pháp HPLC với detector PDA sử dụng cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) ở nhiệt độ phòng. Pha động là MeOH:H2O 50:50 v/v, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μL. Kết quả nghiên cứu cho thấy : phương pháp có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt (RSD% < 3,5%, n = 6); LOD thấp (0,2 ppm); đường chuẩn β – carotene tuyến tính tốt trong khoảng 0,5 ÷ 10 ppm (R2 = 0,9999); độ đúng tốt (độ thu hồi trên mẫu thực tế từ 91 ÷ 101%).

Tuy đã có nhiều phương pháp định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18 nhưng các phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng thí nghiệm của chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành phần pha động, hoặc về phạm vi ứng dụng…). Do đó, việc cải biến phương pháp HPLC sẵn

47

có để phù hợp hơn với điều kiện phòng thí nghiệm và mục đích phân tích cụ thể là điều cần thiết.

Trong đề tài này sẽ sử dụng thiết bị HPLC-DAD và cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) - là cột pha đảo C18 duy nhất có tại phòng thí nghiệm của chúng tôi - để nghiên cứu định lượng lutein trong sự có mặt của một số carotenoid khác (astaxanthin, zeaxanthin; b-caroten; các lutein ester) từ đó ứng dụng xác định điều kiện thích hợp cho phản ứng xà phòng hóa lutein ester tách chiết từ hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagteges erecta L.).

48

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu

Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. từ đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng Thị Huệ An. Hoa sau khi thu hoạch được cắt lấy cánh, loại bỏ tạp chất, sấy ở 600C đến độ ẩm <10% rồi nghiền thành bột mịn, cân thành những lượng chính xác, đóng gói chân không, bảo quản ở -200C đến khi sử dụng.

2.1.2. Hóa chất

- Các hóa chất sử dụng trong quá trình chiết tách và xử lý mẫu (hexane, ethanol, ethyl acetate, KOH, Na2SO4, NaCl) thuộc loại tinh khiết phân tích của hãng Xilong (Trung Quốc).

- BHT (2,6-di-tert-butyl-4-metylphenol) thuộc loại tinh khiết phân tích (Merck, Đức).

- Các carotenoid đối chứng gồm: lutein tinh thể (tinh khiết >90%) của Công ty Biopurify (Trung Quốc); astaxanthin và b-carotene tinh thể (tinh khiết > 95%) của Sigma-Aldrich (USA).

Các mẫu đối chứng được bảo quản trong lọ kín, ở -200C đến khi dùng.

- Nước cất 2 lần: thu nhận ngay trước khi dùng từ thiết bị cất nước siêu sạch Milli Q Direct 8 (Millipore, USA).

- Dung môi hòa tan chuẩn bị mẫu phân tích và dung môi pha động chạy sắc ký (acetone, methanol, dichloromethane, ethyl acetate) thuộc loại dùng cho HPLC (Merck, Đức).

Các dung môi dùng làm pha động được lọc qua màng lọc 0,45µm và siêu âm khử bọt khí trước khi cho vào bình đựng dung môi của thiết bị HPLC.

Tất cả dung môi hòa tan mẫu và sử dụng trong quá trình chiết tách, chuẩn bị mẫu đều có thêm 0,1% BHT để chống oxy hóa.

49

2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ

2.2.1. Dụng cụ

- Micropipet các cỡ 100; 200; 1000; 5000 µL (Eppendorf, Đức).

- Bình định mức 5; 10; 25; 50; 100 mL (Schotte Duran, Đức).

- Bình lắng gạn 100; 250; 500 mL (Isolab, Đức).

- Bình cầu đáy bằng, đáy tròn các cỡ (Isolab, Đức).

- Phễu lọc thủy tinh.

- Bộ dụng cụ xà phòng hóa gồm: bình cầu đáy bằng (50; 500; 2000 mL), sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế.

2.2.2. Thiết bị

- Cân kỹ thuật ± 10-3 g (OHAUS, Trung Quốc).

- Cân phân tích điện tử ± 10-4g (SATORIUS, Nhật).

- Máy đồng hóa Ultra Turax Basic T18 (IKA, Đức).

- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA, Đức).

- Máy lắc ổn nhiệt KS 4000 i Control (IKA, Đức).

- Quang phổ kế tử ngoại – khả kiến CARY 50 (Varian, Úc).

- Thiết bị cô chân không RV 10 Control V (IKA, Đức).

- Thiết bị chiết hồi lưu gia nhiệt có khuấy trộn (Công ty Pháp Việt Food, Việt Nam).

- Tủ đông -200C (SANAKY, Việt Nam).

- Tủ sấy UNB 400 (Memmert, Đức).

- Máy sấy đối lưu dung tích 100 L (Công ty MACTECH, Việt Nam).

- Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Chromaster của hãng HITACHI (Nhật Bản) gồm có bơm cao áp 5110 với bộ trộn dung môi 4 kênh; bộ bơm mẫu tự động (autosampler) 5210; cột phân tích C18 (250 x 4,6; 5 µm); lò điều

50

nhiệt cột 5310; đầu dò 5430 Diode Array (DAD), phần mềm xử lý Agilent OpenLAB CDS version A.02.02.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Cải biến phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp với lutein ester

Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa một số kết quả nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13], đó là:

- Chọn thành phần pha động để rửa giải hỗn hợp carotenoid là tổ hợp của các dung môi methanol, acetonitrile, dichloromethane và nước.

- Dung môi hòa tan mẫu là acetone (thực nghiệm cho thấy dung môi này có khả năng hòa tan tốt hầu hết carotenoid và tương thích tốt với hệ pha động nói trên).

2.3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch khảo sát điều kiện chạy HPLC

a) Chuẩn bị dung dịch lutein đối chứng :

Cân khoảng 2 mg mẫu lutein đối chứng cho vào cốc 25 mL, thêm một vài giọt dichloromethane cho tan rồi thêm tiếp acetone HPLC và chuyển vào bình định mức 100 mL, định mức tới vạch bằng acetone, lắc đều. Bảo quản dung dịch trên trong tối ở -200C. Ngay trước khi dùng, đưa dung dịch về nhiệt độ phòng, pha loãng 10 lần bằng acetone HPLC, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC.

b) Chuẩn bị dung dịch lutein ester:

* Bước 1: Thu nhận lutein oleoresin từ bột hoa cúc vạn thọ khô:

Cân 1,0 kg bột hoa cúc vạn thọ khô cho vào nồi chiết của thiết bị chiết hồi lưu gia nhiệt có cánh khuấy. Thêm vào đó 15 L hexane, khuấy trộn và đun nóng ở trong 24 giờ để chiết carotenoid. Lọc lấy dịch chiết. Lặp lại quá trình chiết nói trên với bã chiết. Gộp dịch chiết hexane lại, cô dưới áp suất thấp (<400C), thu được một dạng dầu sệt màu nâu đỏ (còn gọi là lutein oleoresin, chứa các carotenoid - chủ yếu dưới dạng lutein ester). Bảo quản lutein oleoresin ở -200C cho đến khi nghiên cứu.

51

* Bước 2: Chuẩn bị dung dịch lutein ester:

Cân khoảng 0,05 gam lutein oleoresin hòa tan và định mức thành 100 ml bằng acetone HPLC. Bảo quản dung dịch trên trong tối ở -200C (thời gian bảo quản không quá 1 tháng). Ngay trước khi dùng, đưa dung dịch về nhiệt độ phòng, pha loãng 10 lần bằng acetone HPLC.

c) Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp lutein và lutein ester :

Ngay trước khi phân tích, hút 5mL dung dịch lutein đối chứng cho vào bình định mức 10 ml chứa sẵn 5 mL dung dịch lutein ester. Đậy nắp, lắc đều. Hút 1 ml dung dịch thu được, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC.

2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải

Thành phần pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Khi thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích, qua đó làm thay đổi thừa số lưu giữ k’ của các cấu tử trong hỗn hợp phân tích. Vì vậy, để có được thành phần pha động phù hợp cần tiến hành thử nghiệm sắc ký với tỷ lệ dung môi khác nhau.

Trong quá trình nghiên cứu, các điều kiện sau đây được giữ cố định trong suốt quá trình khảo sát (trường hợp có thay đổi sẽ được đề cập riêng):

- Cột phân tích TSKgel ODS-100V (250 mm x 4,6 mm; 5 μm);

- Nhiệt độ cột: 250C;

- Thể tích bơm mẫu: 20 µl;

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút;

- Detectơ PAD; bước sóng làm việc: 450 nm.

Các pha động được tổ hợp từ các dung môi acetonitrile (MeCN), methanol (MeOH), dichloromethane (DCM) và nước (H2O).

Trước hết, khảo sát 6 chế độ rửa giải isocratic với thành phần pha động thay đổi như sau (Bảng 2.1) :

52

Bảng 2.1. Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải isocratic

Ký hiệu Thành phần pha động (v/v/v/v)

MeCN MeOH DCM H2O

I1 70 15 10 5

I2 45 40 10 5

I3 70 9 20 1

I4 50 9 40 1

I5 45 12 42 1

I6 45 14 40 1

Dựa vào các kết quả thu được, để hiệu quả tách tốt cần lựa chọn thành phần pha động và điều chỉnh chế độ rửa giải sao cho :

- Các cấu tử khảo sát có thừa số lưu giữ k’» 2 – 5 (nếu hỗn hợp phức tạp thì k’ = 1 – 20).

- 2 peak kế cận nhau có độ chọn lọc a ³ 1.

- 2 peak kế cận nhau có độ phân giải Rs ³ 1,5.

trong đó:

; ;

t0: thời gian chết, là giá trị trung bình cộng của thời gian xuất hiện peak dung môi (thực nghiệm cho thấy hệ thống HPLC đang sử dụng có t0 » 3,1 phút).

tRi : thời gian lưu của cấu tử phân tích thứ i ;

1 và 2: hai cấu tử rửa giải kế cận nhau;

W1, W2: độ rộng chân peak của các cấu tử 1 và 2.

0

0'ttt

k Rii

-=

1

2

''kk

=a)()(2

21

12

WWttRs RR

+-

=

53

2.3.1.3. Chọn tốc độ dòng

Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng tới quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng dãn peak, thời gian rửa lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy, cần phải khảo sát để tìm được tốc độ dòng phù hợp với hệ thống sắc ký sử dụng.

Thử nghiệm bơm mẫu với các giá trị tốc độ dòng sau đây :

u1 = 0,8 ml/ phút; u2 = 1 ml/phút ; u3 = 1,2 ml/phút.

Dựa vào giá trị thời gian lưu (tR) và độ rộng peak (W) thu được trên sắc ký đồ (phần mềm của thiết bị HPLC tính sẵn), tính được số đĩa lý thuyết (N) của cột sắc ký đối với cấu tử phân tích ứng với tốc độ dòng khảo sát theo công thức :

So sánh kết quả thu được, từ đó chọn tốc độ dòng phù hợp.

2.3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu

Thể tích bơm mẫu quá nhỏ thì lượng chất đưa vào cột sắc ký quá ít, do đó khi rửa giải sẽ cho tín hiệu có cường độ thấp, chiều cao (hay diện tích peak) quá nhỏ sẽ phát hiện hay định lượng không chính xác. Ngược lại, nếu thể tích tiêm mẫu quá lớn thì lượng chất nạp vào cột quá nhiều, khi đó có thể xảy ra hiện tượng cột bị quá tải, dẫn đến peak bị dãn rộng và độ phân giải kém. Do vậy, cần khảo sát chọn thể tích bơm mẫu thích hợp.

Trong nghiên cứu này chúng tôi thay đổi thể tích bơm mẫu lần lượt là :

5; 10; 15 và 20 (µl).

Sau khi chạy HPLC, so sánh tính chất các peak (tính đối xứng, chiều cao, độ rộng, tỷ lệ S/N), từ đó chọn thể tích bơm mẫu thích hợp nhất.

2

016 ÷÷ø

öççè

æ -=

WttN R

54

2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein

a) Xác định độ tinh khiết của mẫu lutein đối chứng: lutein dễ phân hủy trong quá trình bảo quản nên trước khi dựng đường chuẩn cần xác định lại hàm lượng lutein trong mẫu đối chứng dựa vào phương pháp của JECFA (2004) [12]. Cụ thể như sau:

Bước 1: Xác định hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu lutein đối chứng:

Cân chính xác một lượng lutein đối chứng trên cân phân tích (khoảng 27 - 35 mg) cho vào bình định mức 100 ml. Thêm vào đó vài giọt dichloromethane và đảo đều đến khi thấy tinh thể vừa tan, rồi pha loãng và định mức đến vạch bằng ethanol tuyệt đối, lắc đều trong 10 phút.

Hút 1 mL dung dịch lutein thu được cho vào bình định mức 100 mL thứ hai, pha loãng đến vạch bằng ethanol tuyệt đối, lắc đều trong 20 giây. Đo độ hấp thụ của dung dịch vừa thu được ở 446 nm với cuvet 1cm (dùng ethanol tuyệt đối làm dung dịch so sánh).

Hàm lượng carotenoid tổng số (% CARTS) trong mẫu lutein đối chứng được tính theo công thức:

trong đó:

D = 100*100 = 104 là độ pha loãng dung dịch lutein trong ethanol

A446: độ hấp thụ của dung dịch lutein đo được

= 2550: độ hấp thụ của dung dịch lutein tinh khiết trong dung môi

ethanol ở 446 nm đo với cuvet 1 cm

G: lượng lutein đem phân tích (tính bằng g)

Bước 2: Xác định hàm lượng lutein có trong tổng carotenoid

GEDACAR

cmTS .

.% %11

446=

%11cmE

55

Hút 1 mL dung dịch lutein trong ethanol thu được ở trên cho vào bình định mức 50 ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng acetone HPLC, lắc đều. Hút 1 ml dung dịch thu được lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC đang sử dụng với cột phân tích C18 (250x 4,6; 5 µm), detector DAD (ghi tín hiệu ở 446 nm), pha động là hỗn hợp MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v), rửa giải isocratic trong 10 phút với tốc độ dòng 1 ml/phút.

Hàm lượng lutein trong tổng số carotenoid có trong mẫu lutein đối chứng được tính theo công thức:

trong đó:

SLutein và STS lần lượt là diện tích peak lutein và tổng diện tích tất cả các peak có trên sắc ký đồ

b) Dựng đường chuẩn lutein:

- Pha dung dịch chuẩn gốc lutein:

Cân 0,0276 gam lutein đối chứng (vừa xác định hàm lượng lutein như trên) hòa tan và định mức đến 250 mL bằng acetone.

- Pha dãy chuẩn lutein chạy HPLC:

Từ dung dịch chuẩn gốc lutein vừa pha, hút lần lượt 1,25; 2,50; 5,00; 7,50 và 10,00 (mL) cho vào 5 bình định mức 25 mL (ký hiệu lần lượt là S1, S2, S3, S4, S5), rồi pha loãng đến vạch mức bằng acetone HPLC (có chứa 0,1% BHT). Lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC. Tiến hành phân tích theo điều kiện HPLC thích hợp đã chọn ở phần 2.3.1.2. Dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak lutein (S) và nồng độ lutein (C) của dãy chuẩn:

S = aC + b

trong đó:

TS

LuteinTS SSCARLutein .%% =

56

a và b lần lượt là hệ số góc và tung độ gốc của đường chuẩn

Mỗi điểm chuẩn đo 3 lần để tính độ lệch chuẩn của a và b.

2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein

2.3.2.1. Tính đặc hiệu

Tiến hành chạy HPLC các loại mẫu sau:

- Mẫu trắng: dùng dung môi acetone HPLC

- Mẫu lutein đối chứng: chứa dung dịch lutein tan trong acetone HPLC (chuẩn bị như mục 2.3.1.1.a)

- Mẫu thực: chứa lutein oleoresin chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ hòa tan trong acetone HPLC (chuẩn bị như mục 2.3.1.1.b)

- Mẫu thêm: thêm dung dịch lutein đối chứng vào dung dịch lutein ester (chuẩn bị theo mục 2.3.1.1.c)

Để khẳng định tính đặc hiệu của phương pháp, cần chứng minh peak lutein không bị trùng với peak của các cấu tử khác có trong mẫu trắng và mẫu thực:

- Mẫu trắng phải không cho peak ứng với thời gian lưu của lutein

- Cường độ peak của lutein của mẫu thêm chuẩn lớn hơn so với mẫu thực.

Ngoài ra, kiểm tra giá trị độ tinh khiết của peak (% Peak purity) và so sánh phổ UV-Vis của peak lutein với phổ UV-Vis của các dữ liệu phổ lutein.

2.3.2.2. Độ chụm (precision)

Độ chụm được đánh giá qua các đại lượng sau:

a) Độ lặp lại của thiết bị HPLC (injection-repeatability): được đánh giá qua giá trị %RSD khi đo tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng giữa của đường chuẩn trong cùng một ngày.

%100.%

xSDRSD =

57

trong đó:

b) Độ lặp lại của các kết quả phân tích song song (intra-assay repeatability): xác định bằng cách phân tích lặp lại 3 lần mẫu lutein tinh thu nhận từ hoa cúc vạn thọ.

2.3.2.3. Độ tuyến tính của đường chuẩn – Khoảng nồng độ tuyến tính

Đánh giá dựa vào giá trị R2 của đường chuẩn trong khoảng nồng độ khảo sát

2.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [41]

LOD và LOQ được xác định theo các công thức sau:

và:

trong đó:

a: hệ số góc của đường chuẩn

SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu, được xác định bằng độ lệch chuẩn của tung độ gốc (b) của đường chuẩn khi lặp lại phép dựng đường chuẩn 3 lần

2.3.2.5. Độ đúng:

Được xác định bằng cách thêm vào xác định qua giá trị độ thu thu hồi (% R) khi phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu trắng (dung môi acetone HPLC) ở 3 mức nồng độ thêm lần lượt là 12; 15 và 18 ppm (lặp lại 3 lần).

Tính độ thu hồi (%R) theo công thức:

1

)( 2

1

-

-=å=

n

xxSD

n

ii

aSDLOD b´

=3,3

aSDLOQ b´

=10

100% ´=c

tt

CCR

58

trong đó:

Ctt: nồng độ lutein tìm thấy sau khi phân tích

Cc: Nồng độ lutein đã thêm vào mẫu trắng

So sánh giá trị độ thu hồi tính trung bình tính được với độ thu hồi yêu cầu cần đạt và kết luận.

2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích hợp xà phòng hóa lutein ester

2.3.3.1. Phương pháp tổng quát xà phòng hóa lutein ester

Cân chính xác G gam mẫu oleoresin (chứa hỗn hợp lutein ester thu nhận từ hoa cúc vạn thọ) cho vào bình cầu cổ nhám 50 ml. Thêm vào mẫu oloeoresin V ml dung dịch KOH trong EtOH 960 (ký hiệu nồng độ KOH là CKOH, g/ml). Lắp sinh hàn hồi lưu, đun nóng và khuấy đều hỗn hợp ở 700C trong 1 h (trong điều kiện tránh ánh sáng).

Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước cất vào hỗn hợp đến thể tích gấp đôi, lắc đều. Tiếp đó, chuyển hỗn hợp vào phễu chiết có chứa sẵn một thể tích tương đương ethyl acetate, khuấy đều, để yên cho hỗn hợp phân lớp hoàn toàn. Tách riêng pha nước bên dưới, đem chiết lặp lại như trên thêm 2 lần nữa. Pha ethyl acetate bên trên trong các lần chiết (chứa lutein tự do) được gộp lại, cho vào phễu chiết khác, rửa 3 lần bằng nước cất (thể tích tương đương với thể tích ethyl acetate) để loại bỏ các tạp chất tan trong nước. Lọc dịch chiết ethyl acetate qua một lớp Na2SO4 khan, cho vào bình định mức, định mức đến vạch bằng acetate ethyl. Bảo quản dịch chiết dung dịch ở - 200C cho đến khi phân tích.

2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phòng hóa lutein ester

Dịch chiết lutein tự do trong ethyl acetate thu được sau quá trình xà phòng hóa (xem mục 2.3.3.1) được pha loãng 100 lần bằng acetone HPLC rồi bơm vào thiết bị HPLC Chromaster của hãng HITACHI (Nhật Bản) đang nghiên cứu, trong đó điều kiện chạy HPLC dựa trên kết quả khảo sát “cải biến

59

phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp lutein ester” (xem mục 2.3.1)

Hiệu suất xà phòng hóa được tính theo công thức:

Hiệu suất xà phòng hóa (%) = SLutein*100/SLutein ester

Hiệu suất xà phòng hoá trans-lutein (%) = Strans-lutein*100/Slutein ester

Hiệu suất xà phòng hoá cis-lutein (%) = Scis-lutein*100/Slutein ester

với:

SLutein: là diện tích peak lutein tự do (dạng trans và dạng cis) trên sắc ký đồ của mẫu sau khi xà phòng hóa (nhận biết peak lutein nhờ mẫu lutein đối chứng; phân biệt các peak trans- và cis-lutein dựa vào sự khác biệt về phổ hấp thụ UV-Vis của chúng trong ở vùng phổ 300 - 350 nm)

Strans-lutein: là diện tích peak của trans- lutein trên sắc ký đồ của mẫu sau khi xà phòng hoá.

Scis-lutein: là diện tích peak của cis- lutein trên sắc ký đồ của mẫu sau khi xà phòng hoá.

Slutein ester: là tổng diện tích tất cả các peak thu được trên sắc ký đồ khi phân tích mẫu oleoresin (tức lutein ester) có cùng nồng độ không xà phòng hóa nhưng cũng được chiết và phân tích trong điều kiện giống hệt mẫu đem xà phòng hóa.

2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa lutein ester đến đến hiệu suất xà phòng

a) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin

Tiến hành xà phòng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như đã mô tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nồng độ KOH là CKOH = 0,15 g/ml và thay đổi nồng độ oleoresin trong hỗn hợp phản ứng lần lượt là:

Coleoresin = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 0,9 (g/ml).

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn nồng độ oleoresin thích hợp cho phản ứng.

60

b) Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ KOH

Tiến hành xà phòng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như đã mô tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nồng độ oleoresin là 0,3 g/ml và thay đổi nồng độ KOH lần lượt là:

CKOH = 0,00; 0,025; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30 (g/ml).

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn tỷ lệ KOH/oleoresin thích hợp cho phản ứng.

c) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa

Cân chính xác các lượng oleoresin (khoảng 3 gam) cho vào 5 bình cầu cổ nhám 50 ml khác nhau. Thêm vào đó một thể tích chính xác của dung dịch KOH 5% w/v trong EtOH 960 (có 0,1% BHT) sao cho nồng độ oleoresin trong hỗn hợp là 0,3 g/ml. Tiến hành xà phòng hóa các mẫu (bằng cách đun cách thủy và khuấy đều trong 1 giờ), trong đó nhiệt độ phản ứng ở các mẫu khảo sát thay đổi: 40; 50; 60; 70; 800C.

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn nhiệt độ xà phòng hóa thích hợp.

d) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xà phòng hóa

Tiến hành xà phòng hóa oleoresin và chiết lutein tự do hình thành như đã mô tả ở mục 2.3.3.1, trong đó cố định nhiệt độ xà phòng hóa (bằng nhiệt độ đã chọn từ kết quả thí nghiệm 2.3.3.1.c) nhưng thay đổi thời gian phản ứng lần lượt là:

20; 40; 60; 80; 100; 120; 180 phút.

Sau khi phản ứng hoàn tất, xác định hiệu suất xà phòng hóa của các mẫu khảo sát. Từ đó, chọn thời gian xà phòng hóa thích hợp.

2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phòng hóa lutein ester

a) Xà phòng hoá lutein ester lượng lớn

Cân 2 mẫu oleoresin (4 gam oleoresin/ mẫu) cho vào bình cầu 50ml. Thêm vào đó V ml dung dịch KOH trong EtOH 960C sao cho nồng độ

61

oleoresin và nồng độ KOH ứng với giá trị thích hợp được xác định từ các thí nghiệm 2.3.3.3a và b. Lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy đều, đun nóng hỗn hợp ở nhiệt độ và thời gian được xác định từ kết quả các thí nghiệm 2.3.3.3 c và 2.3.3.3d. Hỗn hợp sau khi xà phòng hóa được chiết bằng ethyl acetate, rửa bằng nước cất (3 lần), lọc qua Na2SO4 khan rồi định mức bằng acetone thành 100 ml. Hút dịch chiết ethyl acetate rồi pha loãng 100 lần bằng acetone HPLC, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC.

b) Xà phòng hoá lutein ester thêm chuẩn

Tiến hành tương tự như mục 2.3.3.4a nhưng thêm vào đó 0,6g lutein chuẩn.

Sau khi tiến hành xà phòng hoá và chạy HPLC, tính được hiệu suất thu hồi lutein và độ thu hồi %R của quá trình xà phòng hoá theo công thức:

H% = C

%Rxà phòng hoá = (Lượng lutein trong mẫu thêm tìm thấy (mthêm tìm thấy) – Lượng lutein trong mẫu không thêm (mkhông thêm))*100/ Lượng lutein đã thêm

(mthêm)

Từ đó tính được hiệu suất thu hồi lutein của toàn bộ quá trình phân tích (bao gồm hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá và hiệu suất thu hồi được phân tích trên thiết bị HPLC)

%Rtoàn bộ = %Rxà phòng hoá * %Rphân tích

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình.

Phân tích ANOVA với độ tin cậy P = 0,95 để đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình.

Dùng phần mềm EXCEL 2003 để vẽ đồ thị và xử lý số liệu.

62

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER

3.1.1. Chọn thành phần pha động

Kết quả thử nghiệm 6 chế độ rửa giải isocratic được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ lutein và lutein ester

Ký

hiệu

Thành phần pha động

MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O

(v/v/v/v)

Peak

Thời gian

lưu

(tR)

Thừa số

lưu giữ

(k’)

I1 70:15:10:5 Lu 9,293 1,966

LuE KRG -

I2 45:40:10:5 Lu 8,873 1,862

LuE KRG -

I3 70:9:20:1 Lu 5,493 0,772

LuE KRG -

I4 50:9:40:1 Lu - << 1

LuE 14,233 – 38,220 4,348 –11,329

I5 45:12:42:1 Lu - << 1

LuE 13,540 – 28,680 3,368 – 8,252

I6 45:14:40:1 Lu - << 1

LuE 12,039 – 24,433 2,591 – 5,757

Ghi chú : Lu: Lutein; LuE: Lutein ester; KRG: không rửa giải.

63

Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của

lutein và lutein ester

64

Từ bảng 3.1. cho thấy:

Nhìn chung, khi thay đổi từ chế độ rửa giải isocratic từ I1 đến I6 (ứng với tỷ lệ CH2Cl2 tăng dần từ 10% đến 40%) thì các carotenoid đều được rửa giải nhanh hơn, tức thừa số lưu giữ của lutein tự do và lutein ester đều giảm xuống. Nguyên nhân là do CH2Cl2 có khả năng hòa tan rất tốt các carotenoid, do đó tỷ lệ CH2Cl2 càng lớn sẽ càng thuận lợi cho sự rửa giải lutein và lutein ester ra khỏi pha tĩnh. Với tỷ lệ CH2Cl2 trong pha động là 10% thì thừa số lưu giữ của lutein là k’lutein » 2 (từ 1,862 – 1,998), tức thỏa mãn yêu cầu trong sắc ký (k’ = 2 – 5). Tuy nhiên, nếu tăng tỷ lệ CH2Cl2 trong pha động lên 20% thì thừa số lưu giữ k’lutein = 0,772 <1. Ngược lại, khi tỷ lệ CH2Cl2 không quá 20% thì lutein ester không rửa giải được (không thấy xuất hiện sau 120 phút). Khi tăng tỷ lệ CH2Cl2 lên 40% thì nhóm hợp chất này mới được rửa giải nhưng khi đó lutein lại rửa giải quá sớm (k’lutein<<1). Nghịch lý trên cho thấy không thể sử dụng chế độ rửa giải isocratic để phân tích hỗn hợp chứa đồng thời lutein và lutein ester mà cần phải dùng chế độ rửa giải gradient.

Dựa vào việc phân tích các kết quả trên chúng tôi đề xuất sử dụng hệ 2 pha động:

A = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v)

B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)

với chế độ rửa giải như sau:

0 – 10 phút: 0% B

10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (gradient tuyến tính)

25 – 60 phút: 100% B

60 – 70 phút: 100% B về 0% B

70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột)

Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Nhiệt độ cột: 250C

65

Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải

Áp dụng chế độ rửa giải nói trên cho hỗn hợp lutein và lutein ester chúng tôi ghi nhận được sắc ký đồ HPLC (Hình 3.3). Các thông số mô tả thời gian lưu (tR) và thừa số lưu giữ (k’) của các cấu tử trong mẫu được cho trong bảng 3.2.

Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung môi

t

%

BA

O 10 25

100

60 70 75

66

Bảng 3.2. Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa giải theo chương trình gradient dung môi đề nghị.

STT Cấu tử Thời gian lưu

tR (phút)

Thừa số lưu giữ

k’= (tR – t0)/t0

1 Dung môi (acetone) 3,100 0

2 Lutein tự do 8,847 1,854

3 Lutein ester-1 37,887 11,222

4 Lutein ester-2 40,433 12,043

5 Lutein ester-3 43,407 13,002

6 Lutein ester-4 46,940 14,142

7 Lutein ester-5 51,167 15,505

Với chương trình rửa giải gradient đã thử nghiệm thì các giá trị thừa số lưu giữ của các cấu tử trong mẫu rơi vào khoảng 1,854 – 15,505. Với hỗn hợp mẫu phức tạp gồm nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau nhiều (từ lutein tự do khá phân cực đến lutein ester kém phân cực) thì có thể chọn chế độ rửa giải sao cho k’ = 1 – 20. Do đó, chương trình rửa giải gradient nói trên được chúng tôi áp dụng cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.2. Chọn tốc độ dòng

Khi thay đổi tốc độ dòng lần lượt từ 0,8 đến 1,0 và 1,2 ml/phút thì các sắc ký đồ thu được đều cho các peak rõ đẹp, tách nhau hoàn toàn. Để chọn tốc độ dòng thích hợp, cần đánh giá ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu (tR), thừa số lưu giữ (k’), độ rộng peak (W) và số đĩa lý thuyết (N) đối với các cấu tử trong hỗn hợp lutein và các lutein ester (xem bảng 3.3 và các đồ thị 3.4.a, 3.4.b và 3.4.c).

Theo đó, khi tăng tốc độ dòng từ 0,8 lên 1,2 ml/phút thì:

- Thừa số lưu giữ (k’) của lutein gần như không đổi (» 1,85) nhưng của các lutein ester tăng lên gần như tuyến tính. Nguyên nhân là do khi tốc độ pha động tăng thì thời gian chết t0 giảm.

67

- Độ rộng chân peak (W) giảm đáng kể khi tốc độ dòng tăng từ 0,8-1,0 ml/phút nhưng sau đó giảm rất ít hay gần như không đổi (trên sắc ký đồ quan sát thấy các peak trở nên thon, nhọn hơn)

- Số đĩa lý thuyết của các cấu tử (N) tăng khi tốc độ dòng tăng từ 0,8 - 1,0 ml/phút nhưng sau đó lại giảm hoặc gần như không đổi khi tốc độ dòng tăng từ 1,0 đến 1,2 ml/phút.

Do vậy, để thu được sắc ký đồ với các peak thon gọn, hiệu quả tách của cột tốt hơn, thời gian phân tích không dài, tốc độ dòng u = 1,0 ml/phút được chọn để tiếp tục khảo sát.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích.

u (ml/ phút)

Đại lượng sắc

ký

Cấu tử phân tích Dung môi

Lu LuE- 1

LuE- 2

LuE- 3

LuE-4

LuE-5

0,8

tR (phút) 3,90 11,09 41,52 44,45 47,95 51,99 56,87 k’ 0 1,84 9,65 10,40 11,30 12,33 13,58

W (phút) 1,15 0,95 1,53 1,66 2,04 2,46 N (đĩa) 626 25091 11240 11268 8890 7419

1,0

tR (phút) 3,10 8,85 37,89 40,43 43,41 46,94 51,17 k’ 0 1,85 11,22 12,04 13,00 14,14 15,51

W (phút) 0,82 0,77 1,21 1,41 1,83 2,00 N (đĩa) 768 32657 15231 13075 9182 9242

1,2

tR (phút) 2,58 7,35 35,53 37,84 40,55 43,79 47,65 k’ 0 1,85 12,77 13,67 14,72 15,97 17,47

W (phút) 0,77 0,93 1,26 1,35 1,78 1,89 N (đĩa) 615 20081 12530 12655 8575 9100

68

a) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thừa số lưu giữ của lutein và lutein ester

b) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến độ rộng chân peak của lutein và lutein

ester

c) Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến số đĩa lý thuyết của lutein và lutein ester

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến một số đại lượng sắc ký

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0,6 0,8 1 1,2 1,4

u (mL/phút)

k'

LuLuE-1Lu-2LuE-3LuE-4LuE-5

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0,60 0,80 1,00 1,20 1,40

u (mL/phút)

W (m

in)

LuLuE-1Lu-2LuE-3LuE-4LuE-5

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

0,6 0,8 1 1,2 1,4

u (mL/phút)

N (đ

ĩa)

LuLuE-1LuE-2LuE-3LuE-4LuE-5

69

Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dòng từ

0,8 đến 1,2 ml/phút

70

3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu

Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu (Vinj) đến đặc tính sắc ký của các cấu tử được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.6

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số đĩa lý thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích.

Vinj (µl)

Đại lượng sắc ký

Cấu tử phân tích Lu LuE-1 LuE-2 LuE-3 LuE-4 LuE-5

5

tR (phút) 8,84 38,00 40,30 43,50 47,07 51,41 k’ 1,85 11,26 12,00 13,03 14,18 15,58 S 954584 610084 42156 795051 1005848 489592 W 0,70 1,66 0,87 1,39 1,29 1,62

N (đĩa) 1076 7072 29253 13516 18591 14230 H (mm/đĩa) 0,232 0,035 0,009 0,018 0,013 0,018

10

tR (phút) 8,88 37,94 40,49 43,51 47,07 51,37 k’ 1,86 11,24 12,06 13,04 14,18 15,57 S 1245693 103020 434141 1181692 2775514 964367 W 0,9 0,64 0,95 1,27 1,72 1,66

N (đĩa) 660 47415 24789 16201 10455 13527 H (mm/đĩa) 0,379 0,005 0,010 0,015 0,024 0,018

15

tR (phút) 8,86 37,92 40,48 43,48 47,047 51,313 k’ 1,85 11,23 12,06 13,03 14,178 15,55 S 2126024 197624 638967 1713045 4219258 1544386 W 0,95 0,830 1,08 1,35 1,97 1,79

N (đĩa) 588,19 28159,27

19166,86 14314,79 7962,44 11607,6

H (mm/đĩa) 0,425 0,009 0,013 0,017 0,031 0,022

20

tR (phút) 8,847 37,887 40,433 43,407 46,94 51,167 k’ 1,85 11,22 12,04 13,01 14,14 15,50 S 3391830 345782 974498 2462189 5660473 2104321 W 1,02 0,77 1,21 1,41 1,83 2

N (đĩa) 507,93 32656,7 15231,2 13075,03 9182,46 9241,75 H (mm/đĩa) 0,49 0,01 0,012 0,02 0,027 0,027

71

a) Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến diện tích peak của lutein và

lutein ester

b) Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến số đĩa lý thuyết của lutein và

lutein ester

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình sắc ký

Qua khảo sát các thể tích bơm mẫu khác nhau từ 5µl; 10µl; 15µl; 20µl thì hầu như các peak lutein và lutein ester đều rửa giải với thời gian lưu và hệ số lưu giữ gần như là như nhau. Tuy nhiên, để lựa chọn thể tích bơm mẫu phù hợp, chúng ta cần xét đến ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến diện tích peak và số đĩa lý thuyết cũng như chiều cao đĩa, cụ thể như sau:

-Khi thể tích bơm mẫu tăng thì chiều cao và diện tích peak của các lutein và lutein ester tăng đáng kể. Điều này cho thấy độ nhạy của phương pháp tăng khi tăng thể tích bơm mẫu.

-Tuy nhiên, số đĩa lý thuyết của các cấu tử (N) lại giảm khi thể tích bơm mẫu tăng. Điều này cho thấy, càng tăng thể tích bơm mẫu thì độ phân

0100000020000003000000400000050000006000000

5 10 15 20

Lu

LuE-1

LuE-2

LuE-3

LuE-4

LuE-5

S

v (µl)

05000

100001500020000250003000035000400004500050000

5 10 15 20

Số đ

ĩa lý

thuy

ết (N

, đĩa

)

V-inject (uL)

Lu LuE-1 LuE-2 LuE-3 LuE-4 LuE-5

72

giải của mẫu càng kém. Do đó, việc lựa chọn thể tích bơm mẫu vừa phải là điều cần thiết.

Kết hợp với sắc ký đồ ở hình 3.7, khi thể tích bơm mẫu tăng từ 5µl - 20µl thì sắc ký đồ của lutein và lutein ester có peak sắc, nhọn và rõ nét hơn. Do đó, thể tích bơm mẫu được chọn trong nghiên cứu này là 20µl.

Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi thể tích bơm

mẫu

73

3.1.4. Kết luận về điều kiện phân tích hỗn hợp lutein và lutein ester

Từ những kết quả khảo sát trên đây, có thể đi đến các kết luận sau:

Điều kiện thích hợp để tách hỗn hợp lutein và lutein ester bằng phương pháp HPLC sử dụng cột phân tích TSKgel ODS-100V (250 mm x 4,6 mm; 5 μm) ở nhiệt độ 250C:

- Pha động: gồm 2 hệ dung môi sau:

A = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v)

B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)

Rửa giải gradient theo chương trình như sau:

0 - 10 phút: 0% B

10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (gradient tuyến tính)

25 - 60 phút: 100% B

60 – 70 phút: 100% B về 0% B

70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột)

Tốc độ dòng: 1 ml/phút

Thể tích bơm mẫu: 20 µl

(Detector DAD quét phổ từ 190-840 nm và ghi nhận tín hiệu ở 450 nm)

Ghi chú:

Trong trường hợp mẫu phân tích chỉ chứa lutein thì chỉ cần chạy chế độ rửa giải isocratic trong 10 phút, trong đó pha động là hỗn hợp MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v) (phần 3.1.1).

74

3.2. DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN

3.2.1. Xác định độ tinh khiết của mẩu lutein đối chứng

Tiến hành định lượng theo phương pháp JECFA (2004) đã xác định được hàm lượng carotenoid tổng số (% CARTS) và hàm lượng lutein (% Lu) trong mẫu lutein đối chứng như sau:

%CARTS = 94,10 ± 4,30

và: % Lu = 90,24 ± 2,76

Bảng 3.5. Kết quả xác định hàm lượng carotenoid tổng số và lutein có trong lutein đối chứng

Lần đo

Khối lượng lutein G (g)

Độ hấp thụ

A %CARTS SLutein STS %SLu %Lu

1 0,0341 0,847 97,37 13740086 14441881 95,14 92,64 2 0,0336 0,820 95,69 21237152 22364853 94,96 90,87 3 0,0316 0,719 89,23 14302842 14631849 97,75 87,22

Trung bình

94,10 95,95 90,24

SD 4,30 1,56 2,76

3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn lutein

Từ kết quả định lượng lutein trong mẫu lutein đối chứng, tính được nồng độ dung dịch chuẩn gốc lutein (xem mục 2.3.1.5.b) đã pha chế như sau:

Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha chế các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ từ 5 – 40 ppm và chạy HPLC trên thiết bị đang khảo sát với điều kiện rửa giải đã chọn ở phần 3.1.4.

Dữ liệu thu được khi dựng đường chuẩn lutein được trình bày trong Bảng 3.6 và các Hình 3.8-1, 3.8-2; 3.8-3.

ppmppmxLVLuteinmgmppmC

pha

LuteinLutein

1006,9925,0.10024,906,27

)(.100).%()(0 »===

75

Bảng 3.6. Kết quả dựng đường chuẩn lutein (lặp lại 3 lần song song)

Dung dịch

chuẩn gốc

C0Lutein (ppm)

Vhút

(ml)

Vđịnh

mức (ml)

Dung dịch đo

CLutein (ppm)

SLu

Lần 1

SLu Lần 2

SLu

Lần 3 SLu

TB

100

0,5 10 5 385104 314880 301975 333986 1 10 10 653761 622050 542974 606262 2 10 20 1569806 1516295 1489448 1525183 3 10 30 2847378 2835697 2649827 2777634 4 10 40 4754935 4615401 4530198 4633511

Từ các dữ liệu trên, dựng được đường chuẩn mô tả mối quan hệ giữa diện tích peak lutein (S) với nồng độ (C) của lutein trong dung dịch phân tích (Hình 3.8) trong khoảng nồng độ 5 - 40 ppm.

a) Đường chuẩn lutein (lần 1)

b) Đường chuẩn lutein (lần 2)

c) Đường chuẩn lutein (lần 3)

d) Đường chuẩn lutein trung bình

Hình 3.8. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 40 ppm

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 1)

S = 123228C - 545601R2 = 0,965

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 10 20 30 40 50

C-Lutein (ppm)

S

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 2)

S = 113248C - 331121R2 = 0,9652

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 10 20 30 40 50

C-Lutein (ppm)

S

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 3)

S = 110256C - 343742R2 = 0,9585

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 10 20 30 40 50C-Lutein (ppm)

S

Đường chuẩn HPLC trung bình của lutein (n = 3)

S = 121339C - 572793R2 = 0,9673

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 10 20 30 40 50

C-Lutein (ppm)

S

76

3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY DỰNG

3.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích

Để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp HPLC, kết quả thể hiện ở hình 3.9.

a) Kết quả chạy HPLC mẫu trắng

b) Kết quả chạy HPC mẫu đối

chứng

c) Kết quả HPLC của mẫu thực (lutein ester)

d) Kết quả HPLC mẫu thêm

Hình 3.9. Kết quả HPLC của các mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực và mẫu thêm

77

Qua đó ta có thể thấy được rằng:

- Ở mẫu trắng (chỉ dùng dung môi acetone HPLC) thì chỉ có 1 peak của dung môi ở thời gian lưu 3 phút

- Đối với mẫu lutein đối chứng (chứa dung dịch lutein tan trong acetone HPLC) xuất hiện peak ở thời gian lưu ~8,9 phút. Điều này cũng thể hiện rõ trong nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (phụ lục.......)

- Mẫu thực chứa lutein ester gồm 5 peak với thời gian lưu tương ứng là 15,6; 18,0; 21,0; 24,5; 28,68 phút với hệ pha động là MeCN/MeH/CH2Cl2/H2O là 45/14/40/1 v/v/v/v.

- Mẫu thêm chứa dung dịch lutein đối chứng (peak ở thời gian lưu 8.967 phút) và dung dịch asaxanthin (xuất hiện peak ở thời gian lưu 6.9 phút) đồng thời 5 peak lutein ester ứng với thời gian lưu 34.4; 37.02; 40.098; 43.71; 48.12 phút. Ở đây hệ pha động được chạy như mục 3.1.4.

Từ kết quả trên cho thấy phương pháp HPLC đã chọn có tính chọn lọc

cao.

78

3.3.2. Độ lặp lại trong ngày (intra-day injection repeatability)

Kết quả chạy HPLC 6 mẫu chuẩn lutein (nồng độ 20 ppm) trong cùng một ngày trên thiết bị và điều kiện phân tích như sau:

Bảng 3.7. Khảo sát độ lặp lại khi tiêm cùng mẫu chuẩn trong ngày.

Lần

chạy

Thời gian

lưu

tR (phút)

Diện tích

peak

S

Chiều cao

peak

H

1 9,100 2170432 120175

2 9,013 1930235 107780

3 9,000 1853365 105839

4 8,953 1793871 100445

5 8,940 1839218 106353

6 8,833 1958927 110278

Trung bình 8,973 1924341,33 108478,33

% RSD 0,991 7,01 6,09

% RSD yêu cầu

[41] 7,3 7,3 7,3

Từ kết quả bảng 3.7 cho thấy, với %RSD của diện tích peak là 7,01% và của chiều cao là 6,09% gần như đạt yêu cầu. Điều này cho thấy độ lặp lại là đáng tin cậy.

3.3.3. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn

Kết quả dựng đường chuẩn lutein ở phần 3.2.2 cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ lutein trong khoảng 5 – 40 ppm chưa cao (0,958 < R2 < 0,965) do có điểm chuẩn ở mức nồng độ 40 ppm lệch khá nhiều so với các đường hồi quy. Để đường chuẩn đạt mức độ tuyến tính tốt hơn, chúng tôi thu hẹp khoảng giá trị nồng độ định lượng từ 5 – 30 ppm

79

Khi đó, tính tuyến tính của đường chuẩn được cải thiện hơn trước (0,9814 < R2 < 0,986). Khi đó, đường chuẩn trung bình của lutein có dạng như sau:

S = 144861C – 148404 ; (R2 = 0,9791)

So với yêu cầu chung về giá trị R2 của các đường chuẩn theo quy định của ICH (R2 > 0,99) [41] thì giá trị R2 đối với đường chuẩn lutein xây dựng được chưa đạt yêu cầu. Nguyên nhân là do dung dịch lutein kém bền và dêx bị phân huỷ nên giá trị R2 thường không cao như đối với các hợp chất thông thường.

a) Đường chuẩn lutein (lần 1)

b) Đường chuẩn lutein (lần 2)

c) Đường chuẩn lutein (lần 3)

d) Đường chuẩn lutein trung bình

Hình 3.10. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 1)

S = 99308C - 249741R2 = 0,9814

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 10 20 30 40 50

C-Lutein (ppm)

S

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 2)

S = 101008C - 319151R2 = 0,9815

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 10 20 30 40 50

C-Lutein (ppm)

S

Đường chuẩn HPLC của lutein (lần 3)

S = 95538C - 306441R2 = 0,9855

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

0 10 20 30 40 50C-Lutein (ppm)

S

Đường chuẩn HPLC trung bình của lutein (n = 3)

S = 144861C - 148404R2 = 0,9791

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 5 10 15 20 25 30 35

C-Lutein (ppm)

S

80

3.3.4. Xác định LOD và LOQ

Dựa vào phương trình đường chuẩn đã được xây dựng ở mục 3.3.3. Ta có thể tính được giới hạn định phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) như sau:

Lần Giá trị b

1 249741

2 319151

3 306441

Trung bình 148404

SD 36955

= 0.84ppm

= 2.55ppm

Dựa vào kết quả tính toán LOD và LOQ ở trên, cho thấy giới hạn định tính và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích đều thấp và đạt yêu cầu.

3.3.5. Xác định độ thu hồi

Mẫu trắng thêm chuẩn

Dựa vào kết quả phân tích mẫu trắng (dung môi acetone) được bổ sung với nồng độ 12; 15 và 18ppm được trình bày trong bảng 3.8. Cụ thể:

aSDLOD b´

=3,3

aSDLOQ b´

=10

81

Bảng 3.8. Khảo sát độ thu hồi khi thêm mẫu chuẩn

ở các nồng độ 12; 15; 18ppm.

Nồng độ thêm Cthêm (ppm)

Lần đo thời gian S H Ctt %R

12ppm

Lần 1 8,9 1532411 89662 11,60295 96,69 Lần 2 8,9 1335173 78759 10,24138 85,34 Lần 3 8,88 1241841 73715 9,597097 79,98

Trung bình 87,34 %RSD 9,77

15ppm

Lần 1 8,9 1631568 96680 12,28745 81,92 Lần 2 8.,887 1497958 88576 11,36512 75,77 Lần 3 8,887 1448906 86468 11,0265 73,51

Trung bình 77,06 %RSD 5,65

18ppm

Lần 1 8.,873 2034872 122750 15,07152 83,73 Lần 2 8,86 1836693 108442 13,70346 76,1 Lần 3 8,873 1929788 117403 14,34611 79,7

Trung bình 79,85 %RSD 4,76

Nhận xét: Kết quả trong bảng 3.8, gía trị độ thu hồi %R ở mỗi nồng độ đều đạt yêu cầu (từ 80 – 110%) [41]. Ở nồng độ thêm 12ppm, giá trị độ lệch chuẩn %RSD đạt 9,77% cao hơn so với %RSD yêu cầu (7,3%) [41]. Do đó, phương pháp HPLC đã xây dựng có độ thu hồi đạt yêu cầu.

3.3.6. Kết luận về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng

Qua khảo sát về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng, ta có thể rút ra kết luận sau:

- Phương pháp có tính đặc hiệu cao, phân biệt được rõ các peak lutein và lutein ester.

- Độ lặp lại của phương pháp tốt với %RSD là 7.01% đạt yêu cầu so với %RSD yêu cầu (7,3%).

82

- Độ tuyến tính của đường chuẩn nằm trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm với độ lệch chuẩn R2 là 0,9791.

- Giới hạn phát hiện LOD = 0,84ppm và giới hạn định lượng LOQ = 2,55ppm.

- Độ thu hồi đạt yêu cầu với %R trung bình là 81,52% tương ứng với các nồng độ 12ppm; 15ppm; 18ppm lần lượt là 87,34%; 77,36%; 79,85% (%R yêu cầu trong khoảng 80 – 110%).

3.4. NHẬN BIẾT PEAK LUTEIN VÀ LUTEIN ESTER

Kết quả HPLC cho thấy oleoresin chiết từ mẫu hoa cúc vạn thọ nghiên cứu là hỗn hợp chứa chủ yếu các dạng ester khác nhau của lutein, trong đó hàm lượng lutein tự do trong mẫu oleorsin không phát hiện được (Hình 3.11). Sau quá trình xà phòng hóa ở điều kiện khảo sát (700C; 3 h), sắc ký đồ HPLC (Hình 3.12; Hình 3.13) và phổ hấp thụ UV-Vis của các peak trên sắc ký đồ (Hình 3.44) cho thấy ngoài sự hình thành lutein tự do ở dạng trans có RT ~ 8,9 phút luôn luôn tạo thành đồng phân cis-lutein (RT ~ 10,3 min).

Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin không xà phòng hóa (lutein

ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml

Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin sau khi xà phòng hóa (lutein

tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml

83

Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 8,9

phút

a) trans-lutein:

lmax = 424; 446; 474 (nm)

b) cis-lutein:

lmax = 328; 418; 442; 468 nm

Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min); b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min)

Các sắc ký đồ HPLC thu được (Hình 3.12) cho thấy với cột HPLC đang sử dụng (cột C18 kích thước 250 mm x 4,6 mm; cỡ hạt 5µm) không phát hiện được peak của zeaxanthin. Kết quả nghiên cứu của Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] cũng chứng tỏ cột C18 cỡ hạt 5 µm không có khả năng phân giải cặp đồng phân lutein/zeaxanthin. Để phân giải cặp đồng phân này cần dùng các cột C18 có cỡ hạt nhỏ hơn (cỡ 3 µm), hoặc dùng cột có pha tĩnh tương tác với lutein và zeaxanthin chọn lọc hơn (như cột C30 hoặc cột silica). Do các cột HPLC nói trên không được sử dụng phổ biến ở nước ta nên trong nghiên cứu này chỉ đánh giá hàm lượng zeaxanthin qua hàm lượng lutein tổng cộng.

84

3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ

Để khảo sát điều kiện thích hợp nhất khi tiến hành xà phòng hoá lutein ester được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ, ta cần đi khảo sát các điều kiện về ảnh hưởng của nồng độ lutein ester (oleoresin), nồng độ KOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất xà phòng hoá.

3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin

Từ kết quả bảng 3.9 và hình 3.15, ta thấy rằng nồng độ oleoresin ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu suất xà phòng hoá lutein ester.

Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến

hiệu suất xà phòng hoá.

Coleoresin

(g/ml)

KOH/Oleoresin

(w/w)

Hiệu suất thu

nhận trans-

lutein (%)

Hiệu suất thu

nhận cis-

lutein (%)

Hiệu suất xà

phòng hóa

tổng cộng

(%)

0,1 1,50 15,10 2,98 18,08

0,2 0,75 16,78 4,75 21,53

0,3 0,50 17,41 4,97 22,38

0,4 0,38 15,82 6,14 21,96

0,5 0,30 20,10 5,54 25,64

0,6 0,25 50,68 12,40 63,08

0,8 0,19 77,32 15,49 92,81

0,9 0,17 32,15 9,60 41,75

85

Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin

Nhận xét:

- Với nồng độ oleoresin thấp (với 0,1 – 0,5g/ml) tương ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin lớn (1,5 – 0,3 lần) ta nhận thấy rằng hiệu suất chuyển hoá của lutein ester thành lutein tự do (dạng trans, cis – hay tổng số) đều rất thấp. Điều này cho thấy lutein tự do bị phân huỷ khi có mặt của lượng kiềm dư khá lớn.

- Khi nồng độ oleoresin tăng lên thì hiệu suất xà phòng hoá cũng tăng lên đáng kể, ở nồng độ oleoresin 0,8g/ml (tương ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin là 0,19) thì đạt cực đại nhưng sau đó lại giảm mạnh ở nồng độ 0,9g/ml. Thực nghiệm cho thấy rằng, khi tăng nồng độ oleoresin lên (>0,8g/ml) thì hỗn hợp rất đặc do đó việc khuấy trộn rất khó ngay cả khi nó được đun nóng đến 700C. Nguyên nhân của việc giảm hiệu suất xà phòng hoá khi tăng nồng độ oleoresin là do sự giảm khả năng tiếp xúc các tác chất trong hỗn hợp phản ứng. Vì vậy, để hiệu suất xà phòng hoá lutein ester cao nhất nên chọn nồng độ oleoresin là 0,8g/ml.

3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa

Kết quả thực nghiệm từ bảng 3.10 cho thấy, nồng độ KOH ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester. Khi cố định nồng độ oleoresin là 0,3g/ml thì hiệu suất phản ứng tăng mạnh khi nồng độ KOH tăng từ 0,00 – 0,05g/ml và sau đó giảm dần khi tiếp tục tăng nồng độ KOH .

0

20

40

60

80

100

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

C-Oleoresin (g/ml)

Hiệu

suất

xà ph

òng h

óa (%

)

Trans-LuteinCis-Lutein Tổng lutein

86

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.

CKOH

(g/ml)

KOH/Oleoresin

(w/w)

Hiệu suất thu

nhận trans-

lutein (%)

Hiệu suất

thu nhận cis-

lutein (%)

Hiệu suất xà

phòng hóa

tổng cộng

(%)

0,000 0,00 0,00 0,00 0,00

0,025 0,08 18,95 5,21 24,15

0,050 0,17 56,88 9,22 66,10

0,100 0,33 53,35 5,21 58,56

0,150 0,50 16,74 4,53 21,27

0,200 0,67 11,20 2,52 13,72

0,250 0,83 8,90 2,74 11,63

0,300 1,00 4,12 1,34 5,45

Điều này được giải thích bởi sự phân huỷ lutein trong môi trường kiềm dư. Chitta Ranjan Sarkar và cs. (2012) cũng đã đưa ra kết luận về sự suy giảm hiệu suất xà phòng hoá lutein ester trong môi trường kiềm khi xà phòng hoá lutein ester bằng KOH trong methanol.

Theo kết quả nghiên cứu trên (bảng 3.10), nhận thấy rằng để xà phòng hoá lutein ester với nồng độ oleoresin được cố định là 0,3g/ml thì cần dùng nồng độ KOH trong ethanol là 0,05g/ml (tức 5% w/v hay 0,89M) tương ứng tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,17 w/w.

Trong khi đó, theo Swaminathan, điều kiện tối ưu để xà phòng hoá lutein ester là nồng độ oleoresin 0,8g/ml với nồng độ KOH là 15% w/v (tức là 0,15g/ml hay 2,5M) ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin là 0,1875 w/w) [8] . Mặc dù, giá trị KOH tối ưu để xà phòng hoá khác nhau nhiều nhưng giá trị tỷ lệ KOH/oleoresin tối ưu theo nghiên cứu của chúng tôi và Swaminathan lại khá gần nhau. Một điều thú vị nữa là nếu chúng ta biểu diễn kết quả nghiên cứu ở bảng 3.9 và 3.10 qua các đồ thị hình 3.16 và 3.17 thì đều cho kết quả tỷ lệ

87

KOH/oleoresin tối ưu vào khoảng 0,17 – 0,19, điều này trùng hợp với kết quả nghiên cứu của Swaminathan. Vì vậy, với tỷ lệ KOH/oleoresin tối ưu này thì tùy theo nồng độ oleoresin trong hỗn hợp mà phải dùng nồng độ KOH khác nhau. Điều đó giải thích tại sao nồng độ KOH tối ưu trong kết quả nghiên cứu của các tác giả khác nhau thường không giống nhau.

Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin

khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml

Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin

khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml

Như vậy, để hiệu suất xà phòng hóa lutein ester cao nhất nên tiến hành phản ứng với tỷ lệ KOH/oleoresin khoảng 0,18 w/w. Khi đó, ứng với nồng độ

1,500,750,500,38

0,30

0,25

0,19

0,17

0

20

40

60

80

100

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60

KOH/Oleoresin (w/w)

Hiệu

suất

xà ph

òng h

óa (%

)

Trans-LuteinCis-LuteinTổng lutein

0,00

0,08

0,170,33

0,500,67 0,83

1,000

20

40

60

80

100

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20

KOH/Oleoresin (w/w)

Hiệu

suất

xà p

hòng

hóa

(%)

Trans-LuteinCis-LuteinTổng Lutein

88

oleoresin tối ưu 0,8 g/ml thì nồng độ KOH cần dùng là: CKOH = 0,8 x 0,18 = 0,144 g/ml = 14,4% w/v = 2,58 M. Kết quả này khá tương đồng với điều kiện xà phòng hóa đề nghị bởi Swaminathan (2010).

3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa

Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hoá thể hiện qua bảng 3.11 và hình 3.18.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa.

Nhiệt độ

(0C)

Hiệu suất thu

nhận trans-lutein

(%)

Hiệu suất thu

nhận

cis-lutein (%)

Hiệu suất xà phòng

hóa

tổng cộng (%)

40 2,24 0,00 2,24

50 6,51 0,00 6,51

60 8,60 0,00 8,60

70 56,90 9,22 66,12

80 59,25 15,39 74,64

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester

2,246,51 8,60

56,90 59,25

0,00 0,00 0,00

9,22

15,39

2,246,51 8,60

66,12

74,64

0

20

40

60

80

100

30 40 50 60 70 80 90

Nhiệt độ (độ C)

Hiệu

suất

xà ph

òng h

óa (%

)

Trans-LuteinCis-LuteinTổng Lutein

89

Từ kết quả trên cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester và chất lượng sản phẩm lutein tự do hình thành.

- Ở nhiệt độ 400C hiệu suất xà phòng hóa rất thấp (chỉ khoảng 2,24%) tại đó lượng lutein ester còn lại rất lớn trong khi đó lượng lutein tự do hình thành không đáng kể. Điều đó thể hiện rõ ở sắc ký đồ hình 3.19.a). Thực nghiệm cho thấy ở 400C oleoresin chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ là một khối lỏng đặc sệt, rất khó khuấy trộn. Khi được gia nhiệt, oleoresin dần dần chảy lỏng ra, dễ khuấy hơn.

- Khi tăng nhiệt độ từ 40 – 600C thì hiệu suất xà phòng hóa tăng lên nhưng chậm (từ 2,24% – 8,60%). Nếu tiếp tục tang nhiệt độ từ 60-700C thì hiệu suất phản ứng tăng rất mạnh (từ 8,6% – 66,12%) nhưng sau đó lại tăng chậm dần. Như vậy, khi tăng nhiệt độ xà phòng hoá thì hiệu suất tăng có thể được giải thích bởi sự gia tăng khả năng tiếp xúc các tác chất (oleoresin và KOH) với nhau, nhờ đó tốc độ phản ứng tăng lên.

Các sắc ký đồ HPLC (Hình 3.19) cũng cho thấy ở nhiệt độ dưới 600C thì sản phẩm lutein tự do hình thành chỉ có đồng phân trans chứ không có đồng phân cis. Tuy nhiên, trên 600C thì đồng phân cis xuất hiện và tỷ lệ đồng phân cis/trans càng tăng khi nhiệt độ càng tăng. Do vậy, mặc dù hiệu suất xà phòng hóa ở 800C cao hơn ở 700C nhưng ở 800C tỷ lệ đồng phân cis trong hỗn hợp sản phẩm lutein tự do (khoảng 20%) cao hơn đáng kể so với tỷ lệ này ở 700C (khoảng 13,9%). Do vậy, để hiệu suất xà phòng hóa cao đồng thời bảo đảm hoạt tính sinh học của sản phẩm tương đối tốt, nên tiến hành xà phòng hóa ở 700C. Kết luận này cũng phù hợp với điều kiện về nhiệt độ xà phòng hóa lutein ester đã được đề nghị bởi Swaminathan (2009).

90

a) Ở 400C

b) Ở 500C

c) Ở 600C

91

d) Ở 700C

e) Ở 800C

Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau.

92

3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa

Kết quả theo dõi ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hoá khi cố định nồng độ oleoresin là 0,3g/ml; nồng độ KOH là 15% w/v; nhiệt độ 700C được thể hiện ở Bảng 3.12 và Hình 3.20.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.

Thờigian

(min)

Hiệu suất thu nhận

trans-lutein (%)

Hiệu suất thu nhận

cis-lutein (%)

Hiệu suất xà phòng hóa

tổng cộng (%)

0 0,00 0,00 0,00

20 54,98 11,10 66,07

40 57,70 10,55 68,25

60 61,54 13,20 74,74

80 67,65 14,30 81,95

100 57,93 14,08 72,01

120 55,12 15,56 70,68

180 41,70 10,60 52,29

Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Thời gian (phút)

Hiệu

suất

thu

nhận

lutei

n (%

)

Trans-LuteinCis-LuteinTổng-Lutein

93

Từ kết quả khảo sát trên, cho thấy:

- Trong thời gian 20 phút đầu tiên hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do ở các dạng đồng phân trans, cis và tổng số đều tăng rất mạnh (từ 0% lên đến 66,07%). Các sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin ban đầu và sau khi xà phòng hóa (Hình 3.21a và Hình3.21b) cũng cho thấy chỉ sau 20 phút các peak lutein ester hầu như biến mất; ngược lại xuất hiện các peak trans-lutein (RT ~ 9,3 phút) và cis-lutein (RT ~ 10,9 phút).

- Tiếp tục đun nóng từ 20 - 80 phút thì hiệu suất thu nhận lutein tự do dạng trans và lutein tổng số tăng lên nhưng với tốc độ chậm hơn và sau đó lại giảm đi nếu kéo dài thời gian phản ứng. Trong khi đó, hiệu suất hình thành dạng cis-lutein hầu như không thay đổi khi thời gian phản ứng tăng từ 20 – 180 phút. Điều này chứng tỏ ở 700C đồng phân cis-lutein tương đối bền, còn đồng phân trans kém bền hơn. Nguyên nhân của việc giảm hiệu suất thu nhận lutein dạng trans- nếu kéo dài thời gian xà phòng hoá (trên 80 phút) là do sự chuyển hoá dạng đồng phân này sang dạng đồng phân cis- của lutein hoặc các dạng sản phẩm phân huỷ khác.

Theo kết quả nghiên cứu trên cho thấy thời gian thích hợp nhất để xà phòng hóa lutein ester được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ ở 700C là 80 phút. Thời gian phản ứng này so với thời gian đề nghị bởi Swaminathan (2009) dài hơn 50 phút. Nguyên nhân của sự khác biệt này là do trong quy trình của Swaminathan phản ứng xà phòng hóa được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn (từ 70-800C). Như đã nhận xét ở phần 3.5.3, việc tăng nhiệt độ phản ứng từ 70-800C tuy có tác dụng làm tăng hiệu suất xà phòng hóa (nhờ vậy rút ngắn thời gian phản ứng) nhưng sẽ làm tăng tỷ lệ đồng phân cis- trong sản phẩm phản ứng, do đó làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm lutein thu nhận được. Do vậy, chúng tôi vẫn chọn nhiệt độ xà phòng hóa là 700C, ứng với thời gian xà phòng hóa 80 phút.

94

a) Mẫu chưa xà phòng hóa

b) Mẫu xà phòng hóa 20 phút

c) Mẫu xà phòng hoá 40 phút

95

d) Mẫu xà phòng hoá 60 phút

e) Mẫu xà phòng hoá 80 phút

f) Mẫu xà phòng hoá 100 phút

g) Mẫu xà phòng hoá 120 phút

h) Mẫu xà phòng hoá 180 phút

Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời gian khác nhau.

96

3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá

Qua kết quả khảo sát điều kiện xà phòng hoá trên để đạt để hiệu suất xà phòng hoá cao, có thể rút ra một số kết luận sau:

- Nồng độ oleoresin là 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu là 14,4% w/v tức tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,18 w/w.

- Nhiệt độ xà phòng hoá để đạt hiệu suất cao là 700C

- Thời gian xà phòng hoá là 80 phút

3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ

3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn

Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá cao chiết lutein ester trên mẫu lớn được thể hiện ở bảng 3.13.

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn.

Từ kết quả trên cho thấy, %RSD của 2 mẫu lớn cao 15,41% vượt so với yêu cầu là 7,3%. Từ đó cho thấy khả năng ứng dụng điều kiện xà phòng hoá trong nghiên cứu này.

Mẫu đo Strans- Scis- Stổng CLutein tìm

thấy(ppm) CLutein tổng

(ppm) mLutein (g)

Mẫu 1 Lần 1 4695346 2202866 6898212 48,64 59,75 0,60 Lần 2 4604332 2005289 6609621 46,65 57,30 0,57 Lần 3 5351572 2196035 7547607 53,13 65,25 0,65 TB 49,47 60,77 0,61 %RSD 6,70 6,70 6,70

Mẫu 2 Lần 1 3915929 1608596 5524525 39,16 48,10 0,48 Lần 2 4131982 1515102 5647084 40,01 49,14 0,49 Lần 3 4387990 1269674 5657664 40,08 49,23 0,49 Trung

bình 39,75 48,82 0,49 %RSD 1,29 1,29 1,29 Trung

bình 0,55 %RSD 15,41

97

3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn

Kết quả đo được thể hiện trong bảng 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn

Mẫu Lần Strans- Scis- Stổng CLutein tìm thấy

(ppm) CLutein tổng

(ppm mLutein

(g)

1 1 9344453 3041293 12385746 86,53 106,27 1,06 2 7852670 2433703 10286373 72,03 88,47 0,88 3 8604178 3540186 12144364 84,86 104,23 1,04

TB 81,14 99,66 1,00 %RSD 9,77 9,77 9,77

2 1 9153751 3257149 12410900 86,70 106,49 1,06 2 8230904 2869124 11100028 77,65 95,37 0,95 3 10981777 3783456 14765233 102,95 126,45 1,26

TB 89,10 109,43 1,09 %RSD 14,39 14,39 14,39 TB(1+2) TB(1+2) 1,05 %RSD 6,61

Từ kết quả bảng 3.17 và 3.18, ta có thể tính được hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá như sau:

%Rxà phòng hoá = (mlutein (mẫu thêm chuẩn) – mlutein (mẫu lớn)) *100/mlutein (đã thêm vào) = (1,05 – 0,55)*100/0,6 = 83,3%

Vậy hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá trong nghiên cứu trên là 83,3%. Kết quả này là đạt yêu cầu so với quy định (80% – 110%).

Từ kết quả tính hiệu suất thu hồi của quá trình xà phòng hoá, ta có thể tính được hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích, bao gồm quá trình xà phòng hoá và quá trình phân tích trên HPLC, cụ thể như sau:

%Rquá trình = (%Rxà phòng hoá * %RHPLC) * 100/1 = (81,52/100 * 83,3/100)*100/1 = 67,9%

Với kết quả hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích trên, ta hoàn toàn có thể ứng dụng phương pháp nghiên cứu này vào việc phân tích lutein hoặc các carotenoid khác.

98

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu được qua nghiên cứu trên có thể đi đến các kết luận sau:

1. Đã xây dựng được phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp chứa lutein ester chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. sử dụng cột pha ngược C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) như sau:

- Pha động: gồm hệ 2 dung môi

A = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:40:10:5 (v/v/v/v)

B = MeCN:MeOH:CH2Cl2:H2O 45:14:40:1 (v/v/v/v)

Rửa giải gradient theo chương trình như sau:

0 - 10 phút: 0% B (100% A)

10 – 25 phút: 0% B đến 100% B (100% A về 0% A) (gradient tuyến tính)

25 - 60 phút: 100% B

60 – 70 phút: 100% B về 0% B

70 – 75 phút: 0% B (Cân bằng cột)

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Thể tích bơm mẫu: 20 µl

- Nhiệt độ cột 250C

- Detector DAD quét phổ từ 190-840 nm và ghi nhận tín hiệu ở 450 nm

2. Phương pháp HPLC đã xây dựng có

-Tính đặc hiệu cao, phân biệt được rõ các peak lutein và lutein ester.

- Độ lặp lại của phương pháp tốt với %RSD là 7.01%

- Độ tuyến tính của đường chuẩn nằm trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm với độ lệch chuẩn R2 là 0,9791.

99

- Giới hạn phát hiện LOD = 0,84ppm và giới hạn định lượng LOQ = 2,55ppm.

- Hiệu suất hồi đạt yêu cầu với %R trung bình 81,52%.

3. Dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC nói trên, đã xác định được điều kiện thích hợp để xà phòng hoá lutein ester từ hoa cúc vạn thọ như sau:

- Nồng độ oleoresin là 0,8g/ml ứng với nồng độ KOH tối ưu là 14,4% w/v tức tỷ lệ giữa KOH/oleoresin là 0,18 w/w.

- Nhiệt độ xà phòng hoá để đạt hiệu suất cao là 700C.

- Thời gian xà phòng hoá là 80 phút.

Với hiệu suất thu hồi lutein của quá trình xà phòng hoá 83,3% và hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình phân tích đạt 67,9%, ta hoàn toàn có thể ứng dụng phương pháp trong nghiên cứu này vào các nghiên cứu tiếp theo về lutein hoặc các carotenoid khác.

4.2. KIẾN NGHỊ

Để có những cơ sở chắc chắn hơn về phương pháp HPLC đã xây dựng, cần có những nghiên cứu thêm về ứng dụng của phương pháp lên các mẫu thực như hoa tươi, hoặc các sản phẩm về lutein được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ.

100

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Miroslav ŠIVEL, Stanislav KRÁČMAR, Miroslav FIŠERA, Bořivoj

KLEJDUS, Vlastimil KUBÁŇ, 2014, Lutein Content in Marigold Flower

(Tagetes erecta L.) Concentrates used for Production of Food

Supplements, Czech J. Food Sci., 32(6): 521–525.

[2] Johnson, E. J. (2002). The role of carotenoids in human

health. Nutrition in clinical care, 5(2), 56-65.

[3]. Koushan, K., Rusovici, R., Li, W., Ferguson, L. R., & Chalam, K. V.

(2013). The role of lutein in eye-related disease. Nutrients, 5(5), 1823-

1839.

[4]. Bộ Y Tế, 2012, Thông tư Hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm,

Số: 27/2012/TT-BYT (20/11/2012).

[5]. Gregory, G. K., CHEN, T. S., & PHILIP, T., 1986, Quantitative

analysis of lutein esters in marigold flowers (Tagetes erecta) by high

performance liquid chromatography. Journal of Food Science, 51(4),

1093-1094.

[6]. Ausich, R.L., Sanders, D. J., 1997), Process for the formation,

isolation and purification of comestible xanthophyll crystals from plants,

US Patent: 5,648,564.

[7]. Kumar, S. T. K., Abdnlkadir; S. P., Sebastian, S., 2004, Process for

the preparation of xanthophyll crystals, US Patent, 6,743,953 B2.

[8]. Swaminathan, S., Madavalapil, K.P., 2009, Isolation and purification

of carotenoids from Marigold flowers, US. Patent, 7,622,599 B2.

101

[9]. Sarkar, C.R., Bhagawati, B., Das, L., Goswami, B.C., 2012, An

efficient condition of Saponification of Lutein ester from marigold flower,

J. Annals of Biological Research, 3 (3):1461-1466.

[10]. Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A.,

2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to

the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed

vegetables, J. Food Chem., 92: 753-763.

[11]. Cantrill, R., 2004, Lutein from Tagetes erecta: Chemical and

Technical Assessment, 63rd, JECFA.

[12]. JECFA 2004, Lutein from Tagetes erecta, Vol 4: 1–4.

[13]. Hoàng Thị Huệ An, 2009, Nghiên cứu định lượng astaxanthin và

carotenoid đi kèm trong đối tượng thủy sản bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao (HPLC), Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Hóa Phân

tích, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

[14]. Trương Ngọc Bảo Hiếu, Ngô Văn Tứ, 2017, Phân tích hàm lượng b-

caroten trong một số loại ngũ cốc có màu ở Thừa Thiên Huế bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Hue University J. Science: Natural

Science, 126 (1D)

[15]. Ranjita Shegokar, Khalil Mitri, 2012, Carotenoid Lutein: A

Promising Candidate for Pharmaceutical and Nutraceutical Applications,

Journal of Dietary Supplements, 9(3):183–210.

[16]. Updike, A. A., & Schwartz, S. J., 2003, Thermal processing of

vegetables increases cis isomers of lutein and zeaxanthin. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 51(21), 6184-6190.

102

[17]. Philip, T., 1977, Purification of lutein-fatty acid esters from plant

materials, US. Patent, 4,048,203.

[18]. S. Madavalapil, K. P., 2009, Isolation and purification of carotenoids

from Marigold flowers, US. Patent, 7,622,599 B2.

[19]. Britton, G., 1995, Structure and properties of carotenoids in relation

to function, The FASEB Journal, 9, 1551-1558.

[20]. Craft, N. E., Soares, J. H., 1992, Relative Solubility, Stability, and Absorptivity of Lutein and b-Carotene in Organic Solvents, J. Agric. Food Chem., 40(431-434).

[21]. Aman, R., Biehl, J., Carle, R., Conrad, J., Beifuss, U., Schieber, A., 2005, Application of HPLC coupled with DAD, APCI-MS and NMR to the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed vegetables, J. Food Chem., 92, 753-763.

[22]. Karawya, M.S., Hammouda, F.M., S.I. Ismail, A.K. Zaki, N.M. Nazif, 1996, HPLC and MS analyses of lutein – ester from Tagetes Patuia L., Quatar Univ. Sci. J., 16(2), 251 – 255.

[23]. Khachik, F., 1995, Process for isolation, purification and recrystallization of lutein from saponified marigold oleoresin and uses thereof, US. Patent, 5,382,714

[24]. Ribaya, J. D., Jeffrey, B. B., 2004, Lutein and Zeaxanthin and Their Potential Roles in Disease Prevention, J. Amer. College of Nutri., 23 (6), 567- 587.

[25]. Shao, A., 2001, The role of Lutein in Human Health, American Nutraceutical Association (JANA), 4(2), 8-19.

[26]. Thorne Research, Inc., 2005, Lutein and Zeaxanthin, Alt. Med. Review, 10(2), 128-135.

[27]. Wang, M., Tsao, R., Zhang, S., Dong, Z., Yang. R., Gong, J., Pei, Y., 2006, Antioxidant activity, mutagenicity/anti-mutagenicity, and

103

clastogenicity /anti-clastogenicity of lutein from marigold flowers, Food & Chem. Toxic., 44: 1522–1529.

[28]. Deutsch, M.J., 1984, Vitamins and other nutrients. Williams, S. (Ed.). Official methods of analysis of the AOAC, 14th ed. Virginia, Association of Official Analytical Chemists, 1984, 834-835.

[29]. EFSA, 2010, Scientific Opinion on the re-evaluation of lutein (E 161b) as a food additive, EFSA Journal, 8(7):1678.

[30]. John, T.L., Richard, A.B., 2001, Lutein, Zeaxanthin, and the Macular Pigment, Archives of Biochem. & Biophys., 385(1), 28 - 40.

[31]. Tso, M. O. M, Lam, T. T., Method of retarding and ameliorating central nervous system and eye damage, US. Patent, 5527533.

[32]. http://vietnamnet.vn/vn/doi-song/suc-khoe/99497/phat-hien-moi-ve-kha-nang-ho-tro-tri-nao-cua-lutein.html

[33]. Johnson, E.J., 2012, A possible role for lutein and zeaxanthin in cognitive function in the elderly, Am. J. Clin. Nutr., doi: 10.3945/ajcn.112.034611, USA, 1S-5S.

[34]. WHO, 2006, Safety evaluation of certain food additives, WHO Food Additives, Series: 54, WHO Press, Geneva.

[35]. Kale, S, Gaikwad, M, Bhandare, S., 2011, Determination and comparison of in vitro SPF of topical formulation containing Lutein ester from Tagetes erecta L. flowers, Moringa oleifera Lam seed oil containing Lutein ester, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, Vol 2 (3):1220–1223.

[36]. Roberts, R. L., Green, J., & Lewis, B. (2009). Lutein and zeaxanthin in eye and skin health. Clinics in Dermatology, 27(2), 195-201.

[37]. Sunita, T., D’mello, P.M., 2010, Enzyme assisted extraction of lutein from marigold flowers and its evaluation by HPLC, Inter. J. Adv. in Pharm. Sci., 2, 381-386.

104

[38]. Nguyễn Thành Lộc, 2013, Xác định đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong các dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC, Khoá luận tốt nghiệp Hoá học, Trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh.

[39]. Dr. Phạm Luận, 1999, Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

[40]. Veronika R. Meyer, Practical High – Performance Liquid Chromatography, New York, USA.

[41]. DS. Trần Cao Sơn, PGS.TS. Phạm Xuân Đà, TS. Lê Thị Hồng Hảo, CN. Nguyễn Thành Trung, Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh Thực phẩm quốc gia.

[42]. Tee E. Siong, Lim Chin Lam, 1992, Analysis of Carotenoids in Vegetables by HPLC, J. ASEAN Food, 7 (2).

[43]. Ausich, R. L., Sanders, D. J., 1997, Process for the formation, isolation and purification of comestible xanthophyll crystals from plants, US. Patent, 5,648,564.

[44]. Domenico Montesano & Oriella Gennari & Serenella Seccia & Stefania Albrizio, 2012, A Simple and Selective Analytical Procedure for the Extraction and Quantification of Lutein from Tomato By-Products by HPLC–DAD, Food Anal. Methods, 5:710–715.

[45]. Prateek Gupta, Yellamaraju Sreelakshmi, Rameshwar Sharma, 2015 A rapid and sensitive method for determination of carotenoids in plant tissues by high performance liquid chromatography, Plant Methods, 11:5

[46]. Md. Habib Ullah Bhuyian, A.F.M. Ariful Islam, Md. Isha Tareque, 2015, Development and validation of method for determination of lutein by HPLC, World J. Pharm. Res., 4(04): 145-156.

105

[47]. Rodriguez-Amaya, D. B., 2001, A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, ILSI Press, USA.

[48]. Barzana, E., Rubio, D., Santamaria, R.I, Garcia-Correa, O., Garcia, F., Ridaura Sanz, V.E, Loa pez-Munguiaa, A., 2002, Enzyme-mediated solvent extraction of carotenoids from marigold flower (Tagetes erecta), Agric.& Food Chem., 50, 4491–4495.

[49]. Khachik, F., 2001, Process for extraction and purification of lutein, zeaxanthin and rare carotenoids from Marigold flowers and plants, US Patent, 6,262,284 B1.

[50]. Madhavi, D. L., 2002, Process for isolation of mixed carotenoid from plants, US Patent, 6380442 B1.

[51]. Joseph, S., Nadu, T., Anandane, A., Nagar, R. R., 2013, Process for isolation and purification of carotenoids, US Patent 2013/00661.

[52]. Jing Tan, Jason Gek Leong Neo, Tania Setiawati, Chunyan Zhang, 2017, Determination of Carotenoids in Human Serum and Breast Milk Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with a Diode Array, Separations, 4: 19.

Phụ lục

Phụ lục 1. Phương pháp định lượng carotenoit tổng số và % lutein, % zeaxanthin trong sản phẩm lutein tinh chế

Cân chính xác khoảng 20 - 30 mg mẫu sản phẩm lutein cho vào bình định mức 100 ml, thêm vài giọt diclorometan cho tan rồi pha loãng và định mức đến vạch bằng etanol (có chứa 0,1% BHT), lắc trong 10 phút, thu được dung dịch A.

a) Định lượng % catotenoid tổng số

Lấy 1 ml dung dịch A cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng bằng etanol (chứa 0,1% BHT), đảo trộn trong 20 giây. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở 446 nm, cuvet 1 cm (dùng etanol 0,1% BHT làm dung dịch nền).

Tính kết quả:

trong đó :

- 1000: hệ số pha loãng;

- 2550: độ hấp thụ của dung dịch carotenoit 1% đo trong etanol với cuvet 1 cm.

b) Định lượng %lutein và %zeaxanthin

Hút 1 ml dung dịch A cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng bằng hexan: axetat 70:30 v/v, đảo trộn trong 20 sec, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µum rồi bơm vào máy HPLC với detector PDA.

Điều kiện chạy HPLC:

- Cột bảo vệ: C18;

- Cột phân tích: C18 (3 µm, 4,6 mm x 250 mm)

- Nhiệt độ cột: 300C

- Pha động: hexan/axetat etyl 70:30 (v/v)

25501000(%)% 446

xGxAscarotenoidToal nm=

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 5 µl

- Bước sóng phát hiện: 445 nm

- Thời gian phân tích: 40 phút

Phát hiện các peak lutein và zeaxanthin dựa vào các phổ hấp thụ đặc trưng của chúng cho bởi detector DAD.

% Lutein = % Carotenoit tổng số x %Diện tích peak lutein

% Zeaxanthin = % Carotenoit tổng số x %Diện tích peak zeaxanthin

Phụ lục 2.Phổ UV-Vis của lutein tinh chế

Hình PL2. Phổ hấp thụ UV-Vis của lutein tinh chế trong hexan

Phụ lục 3. Một số hình ảnh thí nghiệm

Hình PL3.1 Xà phòng hoá lutein

ester

Hình PL3.2. Mẫu lutein ester sau khi

xà phòng hoá

Hình PL3.3. Chiết lutein tự do sau

khi xà phòng hoá

Hình PL 3.4. Mẫu lutein tự do trong

acetone (HPLC)