Citometría de Flujo y oncohematología · Ontogenia Linfoide B ... La diferenciación de los linfocitos T ocurre parte en MO y parte en el timo. Precursor linfoide Protimocito Timocito

Aplicaciones de la Aplicaciones de la Citometría de Flujo en la Citometría de Flujo en la

práctica clínica: práctica clínica:

Leucemias agudasLeucemias agudas

Buenos Aires, 9 de Septiembre de 2013

TemarioTemario Hematopoyesis, ontogenia.Hematopoyesis, ontogenia. Marcadores de maduración.Marcadores de maduración. Leucemias agudasLeucemias agudas

ClínicaClínica ClasificaciónClasificación Fenotipo y genotipoFenotipo y genotipo características de cada entidadcaracterísticas de cada entidad

Enfermedad Mínina ResidualEnfermedad Mínina Residual

Hematopoyesis IHematopoyesis I Proceso de producción de células sanguíneas en la MO y en los órganos linfáticos primarios. La vida ½ de las distintas células es muy variable (PMN horas y GR 120 días). La regeneración de los elementos de la sangre se halla regulada fisiológicamente generando la homeostasis del sistema. La producción de células de cada linaje se halla regulada por un complejo número de factores humorales, de contacto e interacción celular.

Hematopoyesis IIHematopoyesis II

El sistema comprende 3 compartimientos El más primitivo se halla constituído por las células pluripotenciales hematopoyéticas o Stem cells. (mínima proporción del total). En el adulto están en MO. El 2° se halla compuesto por células pluripotenciales con capacidad de diferenciación hacia los distintos linajes y con capacidad de respuesta a distintos factores como EPO, G-CSF, GM-CSF.En el 3° están las células maduras con funciones especializadas y capacidad proliferativa.

Hematopoyesis IIIHematopoyesis III

El microambiente de la MO es fundamental para la hematopoyesis, pues sin el contacto célula-célula ni las citoquinas hematopoyéticas no habría diferenciación. (las células pluripotenciales no proliferan en SP). La hematopoyesis definitiva se produce en MO después de la semana 22. Hasta que no se forman la stem cell linfoide y la stem cell mieloide no hay compromiso de linaje. De la stem cell linfoide surgen los linfocitos, NK y dendríticas de estirpe linfoide. De la stem cell mieloide los GR, las plaquetas, el linaje mielomonocítico y dendríticas mieloides,

Ontogenia de células Ontogenia de células sanguíneas.sanguíneas.

•HEMATOPOYESIS NORMALHEMATOPOYESIS NORMAL

•Stem CellStem Cell

•Linfocito BLinfocito B

• maduromaduro

•Sangre PeriféricaSangre Periférica •TejidosTejidos

•CFU-LCFU-L

•CFU-BCFU-B

•CFU-TCFU-T

•Médula OseaMédula Osea

•IL-7IL-7

•CFU-NKCFU-NK

•CFU-CDCFU-CD•IL-3IL-3

•IL-5IL-5

•IL-4IL-4

•GM-CSFGM-CSF

•CFU-GEMMCFU-GEMM

•CFU-GMCFU-GM

•BFU-MkBFU-Mk

•BFU-EBFU-E• HematiesHematies

•PlaquetasPlaquetas

•LinfocitoTLinfocitoT

•maduromaduro

•BasófiloBasófilo

•EosinófiloEosinófilo

•MonocitoMonocito

•NeutrófiloNeutrófilo

•MastocitoMastocito

•MacrófagoMacrófago

•SCFSCF

•IL-3IL-3

•IL-7IL-7

•M-CSFM-CSF

•G-CSFG-CSF

•GM-CSFGM-CSF

•EPOEPO

•TPOTPO

•Célula NK maduraCélula NK madura

•Célula Dendritica deCélula Dendritica de

• estirpe linfoideestirpe linfoide

•CFU-MCFU-M

•CFU-GCFU-G

•CFU-EoCFU-Eo

•CFU-BaCFU-Ba

•CFU-CDCFU-CD• Célula Dendritica deCélula Dendritica de

• estirpe mielomonocíticaestirpe mielomonocítica

•GM-CSF+ IL-4GM-CSF+ IL-4

•CFU-MastCFU-Mast

Ontogenia Linfoide BOntogenia Linfoide B

• El linfocito B puede diferenciarse hasta CP para El linfocito B puede diferenciarse hasta CP para secretar Ig. Este proceso se divide en estadíos de secretar Ig. Este proceso se divide en estadíos de acuerdo a la expresión de Ag y Rc de MB.acuerdo a la expresión de Ag y Rc de MB.

• Célula B progenitoraCélula B progenitora

• Célula pre-preBCélula pre-preB

• Célula preBCélula preB

• Célula B inmadura.Célula B inmadura.

• Célula B en reposo.Célula B en reposo.

• Célula B diferenciadaCélula B diferenciada

• Célula PlasmáticaCélula Plasmática

Maduración Linfoide BMaduración Linfoide B

DRDRCD34CD34CD117CD117(CD22)(CD22)

DRDRCD34CD34CD19CD19(CD22)(CD22)

TdTTdTTdTTdT TdTTdT

DRDR(CD34)(CD34)CD19CD19CD10CD10CD22CD22(CD20)(CD20)

TdTTdT

CC

DRDR(CD34)(CD34)CD19CD19CD10CD10CD20CD20CD22CD22

DRDRCD19CD19CD20CD20CD22CD22CD21CD21IgMsIgMsCD79CD79

DRDRCD19CD19CD20CD20CD22CD22CD21CD21IgMsIgMsIg DsIg DsCD79CD79

DRDRCD19CD19CD20CD20CD22CD22IgMsIgMsIg GsIg GsCD79CD79

(DR)(DR)CD38CD38PCA-1PCA-1B-B4B-B4B-B2B-B2

Célula B Célula B célula pre-preB Célula preB Célula B célula pre-preB Célula preB Célula B Célula B Célula B célulaCélula B Célula B célula progenitoraprogenitora inmadura inmadura reposo diferenciada plasmáticareposo diferenciada plasmática

CD79CD79CD79CD79 CD79CD79


Van Lochem, et al; Clinical Cytometry (2004)

(Médula ösea: niño de 4 años: Se seleccionó la población CD19 positiva



Médula ösea de adulto de 69 alños, se observa un neto predominio de la población más madura.


Relación con la Relación con la edadedad

Médula regenerativa de un niño de 3 años post quimioterapia. Se observa un neto predominio de la población más inmadura con muy escasa población CD20 (+)

Relación con Relación con tratamientostratamientos


Marcación de cadenas de Ig. Se observa que la célula preB (verde) presenta cadenas citoplasmáticas pero no de superficie. Las poblaciones B inmadura (amarilla) y B madura violeta presentan una distribución similar de cadenas Kappa y Lambda



Ontogenia Linfoide BOntogenia Linfoide B La aparición de la cadena La aparición de la cadena citoplasmática define el citoplasmática define el

estadío preB.estadío preB.

Tanto el CD19 como el CD79a son considerados Tanto el CD19 como el CD79a son considerados pan-B, por encontrarse durante toda la ontogenia.pan-B, por encontrarse durante toda la ontogenia.

El CD23 sólo aparece cuando el linfocito B se activa.El CD23 sólo aparece cuando el linfocito B se activa.

En el adulto la diferenciación desde la célula En el adulto la diferenciación desde la célula progenitora B hasta la célula B en reposo ocurre en progenitora B hasta la célula B en reposo ocurre en MO y la diferenciación posterior hasta CP ocurre en MO y la diferenciación posterior hasta CP ocurre en SP o en tejidos linfoides.SP o en tejidos linfoides.

El CD22 sigue siendo un marcador específico El CD22 sigue siendo un marcador específico importante para asignar linaje. importante para asignar linaje.

Ontogenia linfoide TOntogenia linfoide T

La diferenciación de los linfocitos T ocurre parte en MO La diferenciación de los linfocitos T ocurre parte en MO y parte en el timo. y parte en el timo.

Precursor linfoidePrecursor linfoide ProtimocitoProtimocito Timocito inmaduroTimocito inmaduro Timocito comúnTimocito común Timocito maduroTimocito maduro Célula T maduraCélula T madura


TdTTdT TdTTdT TdTTdT TdTTdT

(CD3)(CD3) CD3CD3 CD3CD3

(CD3)(CD3)

(CD3)(CD3)

Extra-tímicoExtra-tímico

CD34CD34DRDR

CD34CD34DRDRCD7CD7(CD2)(CD2)

CD7CD7CD2CD2CD5CD5

CD7CD7CD2CD2CD5CD5CD1aCD1aCD4 y/oCD4 y/oCD8CD8

CD7 CD7 CD2CD2CD5CD5CD3CD3TCR TCR CD4CD4

CD7CD7CD2CD2CD5CD5CD8CD8CD3CD3TCR TCR

Precursor Protimocito Timocito Timocito Timocito célula Precursor Protimocito Timocito Timocito Timocito célula T T Linfoide inmaduro común maduro maduraLinfoide inmaduro común maduro madura

Timo corticalTimo cortical

TimoTimo medularmedular SPSP

(CD7) (CD7) CD2CD2CD5CD5CD3CD3CD4 CD4 TCR TCR

CD7CD7CD2CD2CD5CD5CD8CD8CD3CD3TCR TCR


El CD2, CD5, CD7 y el CD3c son considerados El CD2, CD5, CD7 y el CD3c son considerados pan-T.pan-T.

Durante la ontogenia se produce el rearreglo Durante la ontogenia se produce el rearreglo del TCR. Existen 2 tipos de TCR el clásico del TCR. Existen 2 tipos de TCR el clásico TCRTCR que se encuentra en la mayoria de los que se encuentra en la mayoria de los linfocitos T (>90.0%) y un alternativo TCRlinfocitos T (>90.0%) y un alternativo TCR (aprox 5.0%) .(aprox 5.0%) .

La maduración en los T ocurre en MO y timo y La maduración en los T ocurre en MO y timo y a su vez en el timo en distintos compartimientos a su vez en el timo en distintos compartimientos (corteza y médula).(corteza y médula).

Células Dendríticas:

DR+, DR+, CD19,CD20(CD19,CD20(BB); CD3(); CD3(TT); CD56,CD16 ); CD56,CD16 ((NKNK); CD14(); CD14(MoMo) Negativos) Negativos

DC mieloides CD11c+CD123- BDCA-1,BDCA-3

DC Linfoides CD11c-CD123+BDCA-2,BDCA-4

103

102

101

Cambios fenotípicos de la diferenciación de células dendríticas linfoides

STAGE I STAGE IVSTAGE IIISTAGE II

CD 123 PE

HLA DR PERCP

CD 34 APC

CD 117 APC

CD 33 APC

CD 36 FITC

BDCA 2 PE

BDCA4 PE

Orfao et al, Universidad de Salamanca

Ontogenia mieloideOntogenia mieloideLa serie mieloide comparte con la monocitoide La serie mieloide comparte con la monocitoide

ciertos Ag comunes pero a medida que va ocurriendo ciertos Ag comunes pero a medida que va ocurriendo la maduración van apareciendo características la maduración van apareciendo características particulares de cada grupo. Los distintos estadíos son: particulares de cada grupo. Los distintos estadíos son:

• CFU-GMCFU-GM• MieloblastoMieloblasto• PromielocitoPromielocito• MielocitoMielocito• MetamielocitoMetamielocito• NeutrófiloNeutrófilo

MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE METAMYELOCYT BAND/NEUTROPHIL

103

102

101

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33CD11b

CD15

CD64

CD65

CD54

CD10

CD16

CD35

CD13

Cambios fenotípicos diferenciación mieloideCambios fenotípicos diferenciación mieloide


Diferenciación mieloideDiferenciación mieloide

CFU-GM Mieloblasto promielocito mielocito metamielocito neutrófilo

CD34

CD33CD65

CD15

CD13

MPO

CD64


Ontogenia Ontogenia mieloidemieloide

Maduración normal de la serie granulocítica considerando la complejidad celular SSC, CD13, Cd16 y CD11b.

Ontogenia mieloide: Ontogenia mieloide: eosinófilos y Basófiloseosinófilos y Basófilos

Para poder observar los granulocitos eosinófilos y basófilos se muestra la MO de un paciente con LMC en fase acelerada. Si bien los basófilos no son fáciles de separar de los lnfocitos usando FSC y SSC, si es posible al usar CD45 vs SSC y CD13 vs Cd11b.


Ontogenia mieloideOntogenia mieloide El CD 34 y el DR se pierden en el estadío promielocito.El CD 34 y el DR se pierden en el estadío promielocito. La expresión de CD33 es variable durante la La expresión de CD33 es variable durante la maduración.maduración. El CD65 generalmente aparece en la maduración El CD65 generalmente aparece en la maduración luego de la desaparición de CD34.luego de la desaparición de CD34. La MPO junto con la lactoferrina son 2 útiles La MPO junto con la lactoferrina son 2 útiles marcadores de diferenciación mieloide.marcadores de diferenciación mieloide. La MPO (componente de los gránulos azurófilos o 1°) La MPO (componente de los gránulos azurófilos o 1°) aparece desde el estadío mieloblasto.aparece desde el estadío mieloblasto. La lactoferrina (gránulos 2° o específicos) aparece La lactoferrina (gránulos 2° o específicos) aparece posteriormente en el estadío de mielocito.posteriormente en el estadío de mielocito.

Ontogenia monocitoideOntogenia monocitoideLa serie monocitoide presenta los siguientes La serie monocitoide presenta los siguientes

estadíos en su maduración: estadíos en su maduración:

• CFU-GMCFU-GM• MonoblastoMonoblasto• PromonocitooPromonocitoo• MonocitoMonocito

MONOBLAST PROMONOCYTE MONOCYTE

CD34

CD117

CD64

CD45

CD11b

CD14

HLA-DR

CD36

CD11c

Cambios fenotípicos diferenciación monocitoideCambios fenotípicos diferenciación monocitoide


Maduración monocíticaMaduración monocítica CFU-GM Monoblasto Promonocito Monocito

CD34CD33

CD64CD15

CD13

CD14CD4

HLA-DR


Maduración monocíticaMaduración monocíticaMaduración monocítica normal, Los colores corresponden a los dibujos superiores. La combinación de bajo CD45 expression y bajo SSC es usada para identificar precursores, Los mielo/monoblastos (puntos rojos), los puntos azules representan precursores B. los puntos verdes representan los promyelocytes, Tres estadios pueden diferenciarse incluyendo el myelo/monoblast stage: CD34 CD33CD14 myelo/monoblasts, CD34/CD33highCD14 pro-monocytes y CD34CD33highCD14monocytes (F and G).

Ontogenia monocitoideOntogenia monocitoide

Como características distintivas respecto a la serie Como características distintivas respecto a la serie mieloide, tanto el HLA-DR como el CD33 se mantienen mieloide, tanto el HLA-DR como el CD33 se mantienen hasta la etapa final.hasta la etapa final.

Presenta en toda la diferenciación la presencia de Presenta en toda la diferenciación la presencia de CD4 .CD4 .

Aparece en las etapas finales el CD14.Aparece en las etapas finales el CD14.

El CD13 desaparece en las etapas finales de la El CD13 desaparece en las etapas finales de la maduraciónmaduración

Diferenciación Diferenciación megacariocíticamegacariocítica

La serie megacariocítica presenta características La serie megacariocítica presenta características particulares, expresando un gran número de Ag en su particulares, expresando un gran número de Ag en su etapa madura (CD36, CD41a, CD42b, CD61). La serie etapa madura (CD36, CD41a, CD42b, CD61). La serie presenta los siguientes estadíos en su maduración: presenta los siguientes estadíos en su maduración:

• CFU-EMCFU-EM• MegacarioblastoMegacarioblasto• MicromegacariocitoMicromegacariocito• MegacariocitoMegacariocito•PlaquetasPlaquetas

INMATURE MATURE

CD34HLA-DRCD13CD33CD45

CD117

CD36CD41CD42CD61

Cambios fenotípicos Cambios fenotípicos diferenciación megacariocíticadiferenciación megacariocítica



CFU-EM Megacarioblasto Micromega Megacariocito Plaquetas cariocito

CD34

CD33CD41aCD61

CD42b

CD36


Los marcadores CD41a (complejo GP IIb/IIIa), Los marcadores CD41a (complejo GP IIb/IIIa), CD42b (GP Ib) y CD61 (GP IIIa) son útiles en el CD42b (GP Ib) y CD61 (GP IIIa) son útiles en el diagnóstico de neoplasias megacariocíticas. (LMA M7 diagnóstico de neoplasias megacariocíticas. (LMA M7 clasificación FAB)clasificación FAB)

Diferenciación eritroideDiferenciación eritroideLa serie eritoride posee un considerable número La serie eritoride posee un considerable número

de etapas en su maduración. La característica principal de etapas en su maduración. La característica principal es la pérdida del CD45 (pan-leucocitario) durante la es la pérdida del CD45 (pan-leucocitario) durante la etapa del normoblasto basófilo. La serie presenta los etapa del normoblasto basófilo. La serie presenta los siguientes estadíos en su maduración: siguientes estadíos en su maduración: • CFU-ECFU-E• ProeritroblastoProeritroblasto• Normoblasto basófiloNormoblasto basófilo• Normoblasto policromáticoNormoblasto policromático• Normoblasto ortocromáticoNormoblasto ortocromático• ReticulocitosReticulocitos• GR madurosGR maduros

INMATURE MATURE

CD34CD117HLA-DRCD45CD13CD33

GphA

CD36

CD71

Cambios fenotípicos Cambios fenotípicos diferenciación eritroidediferenciación eritroide


Diferenciación eritroideDiferenciación eritroideCFU-E Proeritroblasto Normoblastos Reticulocito GR

Basófilo Policromático Ortocromático

CD34

CD45GPA

CD71

CD36

Diferenciación eritroideDiferenciación eritroideDesarrolo eritroide normal en MO . En una muestra normal sólo pueden apreciarse los eritroblastos ya que los pro eritroblastos se encuentran en muy pequeña proporción y los eritrocitos son lisados en el procedimiento


Diferenciación eritroideDiferenciación eritroide

Paciente con MO en regeneración donde se pueden apreciar las 3 subpoblaciones los puntos celestes son GR no lisados


Diferenciación eritroideDiferenciación eritroide El CD71 esta presente en todas las etapas de El CD71 esta presente en todas las etapas de

maduración del GR hasta la etapa de reticulocitos.maduración del GR hasta la etapa de reticulocitos.

La glicoforina A (GPA) (CD235a) aparece en la La glicoforina A (GPA) (CD235a) aparece en la etapa proeritroblasto y permanece en el GR maduro etapa proeritroblasto y permanece en el GR maduro adquiriendo una gran intensidad. adquiriendo una gran intensidad.

El CD 45 desaparece a partir de la etapa El CD 45 desaparece a partir de la etapa normoblasto.normoblasto.

Los 2 primeros marcadores son importantes en el Los 2 primeros marcadores son importantes en el diagnóstico de neoplasias eritorides (LMA M6)diagnóstico de neoplasias eritorides (LMA M6)

Marcadores de LinajeMarcadores de Linaje

Linaje B: CD22 , CD 79a (c), Ig sup, C y CD19. Linaje T: CD3 m/c, TCR m/c, CD2 y CD5. Linaje dendrítico: CD123, CD11c, BDCA 1 -4 Linaje mieloide: MPO, CD13 c/m, CD33, CD65. Linaje monocitoide: CD14, CD64, CD33,DR, CD4 Linaje megacarioblastico: CD41a, CD42b y CD61. Linaje eritroide: GPA, CD71, CD36 (int)

Los principales marcadores de linaje de las distintas series son:

Leucemias Agudas Leucemias Agudas

Las LA son proliferaciones clonales de células Las LA son proliferaciones clonales de células hematopoyéticas que determinan una disminución hematopoyéticas que determinan una disminución en la producción de las células normales por parte en la producción de las células normales por parte de la MO. de la MO. La incidencia anual se estima en 3 a 5 por cada La incidencia anual se estima en 3 a 5 por cada 100.000 habitantes y existen importantes variaciones 100.000 habitantes y existen importantes variaciones étnicas y regionales.étnicas y regionales.En niños es la principal causa de muerte por En niños es la principal causa de muerte por neoplasias siendo las LLA las que ocurren con neoplasias siendo las LLA las que ocurren con mayor frecuencia (más del 80.0% de los casos).mayor frecuencia (más del 80.0% de los casos).

Presentación Clínica en LA Presentación Clínica en LA Generalmente no hay síntomas específicos Generalmente no hay síntomas específicos

siendo los principales:siendo los principales:• Anemia, transtornos hemorragíparos, fiebre sin Anemia, transtornos hemorragíparos, fiebre sin causa aparente, infecciones y dolor óseo.causa aparente, infecciones y dolor óseo.• La adenopatía y la hepatoesplenomegalia son más La adenopatía y la hepatoesplenomegalia son más frecuentes en niños.frecuentes en niños.• Lesiones en piel máculo-papulosas o nodulares Lesiones en piel máculo-papulosas o nodulares por infiltración de la dermis de células neoplásicas.por infiltración de la dermis de células neoplásicas.• Puede existir compromiso de SNC, ya sea por Puede existir compromiso de SNC, ya sea por meningiosis leucémica o por presencia de masa meningiosis leucémica o por presencia de masa intracerebral. intracerebral.

Diagnóstico de la LA Diagnóstico de la LA

La confirmación diagnóstica se realiza por la La confirmación diagnóstica se realiza por la clínica, la morfología tanto de SP como MO, la clínica, la morfología tanto de SP como MO, la citoquímica, inmunofenotipo, citogenética y BM de citoquímica, inmunofenotipo, citogenética y BM de la M.O.la M.O.

En general en el momento del diagnóstico la En general en el momento del diagnóstico la infiltración blástica en MO suele estar entre el 50 y el infiltración blástica en MO suele estar entre el 50 y el 100 %, variando según el subtipo de LA involucrado 100 %, variando según el subtipo de LA involucrado y la edad del paciente. En pediatría generalmente la y la edad del paciente. En pediatría generalmente la infiltración es mayor.infiltración es mayor.

Diagnóstico de LADiagnóstico de LA

Es preferible realizar el diagnóstico en MO Es preferible realizar el diagnóstico en MO ( 10 % de las LLA no tienen blastos en SP). ( 10 % de las LLA no tienen blastos en SP).

Problema en la punción : Fibrosis o Problema en la punción : Fibrosis o empaquetamiento.empaquetamiento.

A veces es necesaria la biopsia medular o A veces es necesaria la biopsia medular o punciones en distintas zonas .punciones en distintas zonas .

Clasificación de LA (FAB)Clasificación de LA (FAB) FABFAB: (1976 y rev en 1985) basada en criterios : (1976 y rev en 1985) basada en criterios

morfológicos y citoquímicos de los elementos morfológicos y citoquímicos de los elementos inmaduros. inmaduros.

Clasifica las LA en linfoblásticas y no linfoblásticas.Clasifica las LA en linfoblásticas y no linfoblásticas.Las primeras se clasifican de acuerdo a su Las primeras se clasifican de acuerdo a su

morfología en morfología en • L1: cromatina nuclear fina, nucleólos y alta L1: cromatina nuclear fina, nucleólos y alta

relación Núcleo/Citoplasma.relación Núcleo/Citoplasma.• L2: De mayor tamaño y con morfología variada.L2: De mayor tamaño y con morfología variada.• L3: Semejantes al linfoma de Burkitt (con vacuolas L3: Semejantes al linfoma de Burkitt (con vacuolas

y más grandes).y más grandes).

De acuerdo a morfología y citoquímica se De acuerdo a morfología y citoquímica se dividen en 8 grupos: dividen en 8 grupos: M1(mieloblástica), M2 mieloblástica con M1(mieloblástica), M2 mieloblástica con diferenciación), M3 (promielocítica), M4 diferenciación), M3 (promielocítica), M4 (mielomonocítica), M5a (monoblástica), M5b (mielomonocítica), M5a (monoblástica), M5b (monocítica), M6 (eritroide) y M7 (monocítica), M6 (eritroide) y M7 (megacarioblástica).(megacarioblástica).

LA no linfoblásticasLA no linfoblásticas

Clasificación de LA (FAB)Clasificación de LA (FAB)

• LA con menos del 30.0 % de Blastos.LA con menos del 30.0 % de Blastos.• Arbitraria, hay mejores criterio para diferenciar. Arbitraria, hay mejores criterio para diferenciar. linaje.linaje.• No toda LA se puede asignar a un subtipo FAB.No toda LA se puede asignar a un subtipo FAB.• Categorias no fácilmente reproducibles. Ej M1 y Categorias no fácilmente reproducibles. Ej M1 y M2.M2.• No tiene en cuenta Leucemias bifenotípicas ni No tiene en cuenta Leucemias bifenotípicas ni indiferenciadas,indiferenciadas,• Excluye información importante como IMF, BM Excluye información importante como IMF, BM y citogenética.y citogenética.

Problemas con la FABProblemas con la FAB

Clasificación EGIL (1995)Clasificación EGIL (1995) EGIL (grupo europeo para la inmunotipificación EGIL (grupo europeo para la inmunotipificación de Leucemias agudas)de Leucemias agudas)

1995 en Holanda trato de unificar criterios en la 1995 en Holanda trato de unificar criterios en la clasificación considerando como base la clasificación considerando como base la inmunología.inmunología.

Actualmente es mucho más útil para las LLA que Actualmente es mucho más útil para las LLA que para las LMA. para las LMA.

Clasificación (EGIL)Clasificación (EGIL)

Linaje BLinaje B..1- LLA B-I (proB), 2- B-II (común), 3- B-III (preB) y 4-1- LLA B-I (proB), 2- B-II (común), 3- B-III (preB) y 4-B-IV (madura).B-IV (madura).Linaje T.Linaje T.1-LLA T-I (pro-T), 2- T-II (preT), 3- T-III (cortical), 4- 1-LLA T-I (pro-T), 2- T-II (preT), 3- T-III (cortical), 4- T-IV (madura), 5- TCRT-IV (madura), 5- TCR y TCR y TCR.. LLA My.LLA My.LLA con expresión de 1 o más Ag mieloides.LLA con expresión de 1 o más Ag mieloides.

LLA

Clasificación (EGIL)Clasificación (EGIL)

Mielomonocítica.Mielomonocítica. EritorideEritoride MegacariocíticaMegacariocítica LMA poco diferenciada (Mo)LMA poco diferenciada (Mo) LMA Ly LMA Ly

LMA

Leucemias bifenotípicas

Leucemias indiferenciadas

Puntuación EGIL (1996)Puntuación EGIL (1996) Puntos Linaje B Linaje T Mieloide MK EritroidePuntos Linaje B Linaje T Mieloide MK Eritroide

m/c CD22, m/c CD22, Ig Sup, CuIg Sup, Cu

m/c CD3m/c CD3m/c TCRm/c TCR

MPO, MPO, CD13cCD13c

CD41a, CD41a, CD42bCD42bCD61CD61

GPA, CD71GPA, CD7122

11

0.50.5

CD19, CD20,CD19, CD20,CD79aCD79a

CD2, CD5, CD2, CD5, CD8CD8

mCD13,CD33mCD13,CD33CD36, CD65,CD36, CD65,

CD68CD68

CD36 (i)CD36 (i) CD36 (i)CD36 (i)

CD10, CD24CD10, CD24TdTTdT

CD7, CD1aCD7, CD1aCD4CD4

CD11b/cCD11b/cCD14, CD15CD14, CD15

CD117CD117

Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2Una LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linajeUna LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linaje

Clasificación de LA (MIC)Clasificación de LA (MIC)MIC (MIC (1990). Posteriormente MIC-M1990). Posteriormente MIC-MAl cobrar relevancia la inmunotipificación y la Al cobrar relevancia la inmunotipificación y la citogenética (FISH) se trato de ampliar la base de la citogenética (FISH) se trato de ampliar la base de la clasificación más allá de los criterios morfológicos y clasificación más allá de los criterios morfológicos y citoquímicos de los elementos inmaduros, citoquímicos de los elementos inmaduros, incorporando la inmunología, la citogenética y la BM.incorporando la inmunología, la citogenética y la BM.

M1/t(9;22) (q34;q11)/BCR-ABL FusionM1/t(9;22) (q34;q11)/BCR-ABL FusionM2/t (8;21) (q22;q22)/AML1-ETO FusiónM2/t (8;21) (q22;q22)/AML1-ETO FusiónM3 o M3v/t(15;17)(q22;q21)/PML-Rara FusionM3 o M3v/t(15;17)(q22;q21)/PML-Rara FusionM7/t(1;22) (p13;q13)M7/t(1;22) (p13;q13)

Clasificación OMS (2008)Clasificación OMS (2008)Divide las neoplasias linfoides en neoplasias de Divide las neoplasias linfoides en neoplasias de

precursores y de componentes maduros precursores y de componentes maduros linfoides para ambos linajes B,T e incluyen las linfoides para ambos linajes B,T e incluyen las leucemias y linfomas de precursores B o T y las leucemias y linfomas de precursores B o T y las leucemias y linfomas de componentes maduro B leucemias y linfomas de componentes maduro B o T. o T.

Además subdivide las neoplasias de precursores B Además subdivide las neoplasias de precursores B según las anormalidades moleculares o según las anormalidades moleculares o citogenéticas que presentan las cuales son citogenéticas que presentan las cuales son importantes factores pronósticos.importantes factores pronósticos.

Clasificación OMS (2008)Clasificación OMS (2008)Leucemias de linaje ambiguoLeucemias de linaje ambiguo LA indiferenciadaLA indiferenciada LA de fenotipo mixto con alteración del BCR-ABL1.LA de fenotipo mixto con alteración del BCR-ABL1. LA de fenotipo mixto con alteración del MLL.LA de fenotipo mixto con alteración del MLL. LA de fenotipo mixto B-mieloide.LA de fenotipo mixto B-mieloide. LA de fenotipo mixto T-mieloide.LA de fenotipo mixto T-mieloide. LA, linfoma de células NK (entidad provisional) LA, linfoma de células NK (entidad provisional)

Clasificación LMA OMS (2008)Clasificación LMA OMS (2008)•LMA con anomalías genéticas recurrentes

-LMA con t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO)-LMA con eosinófilos anormales en médula e

inv(16)(p13q22) ó t(16;16)(p13;q22), (CBFb/MYH11)-LPA con t(15;17)(q22;q12), (PML/RARa) y variantes-LMA con anomalías en el 11q23 (MLL)

•LMA y Sindromes Mielodisplásicos, relacionados a la terapia

•LMA, sin otra categorización-LMA, mínimamente diferenciada-LMA sin maduración-LMA con maduración-Leucemia Mielomonocítica Aguda-Leucemia monoblástica/leucemia monocítica aguda-Leucemia eritroide aguda (Eritroide/Mieloide y Eritroleucemia Pura)-Leucemia megacarioblástica aguda-Leucemia aguda basófila-Panmielosis aguda con mielofibrosis-Sarcoma mieloide

Diagnóstico de LLADiagnóstico de LLA

Consiste en la determinación de los antígenos de membrana o citoplasmáticos realizados mediante el uso de Ac Mo específicos.

InmunofenotipoInmunofenotipo

Conceptos importantes en Conceptos importantes en inmunotipificación de LAinmunotipificación de LA

Infidelidad de linaje: Coexpresión en la misma Infidelidad de linaje: Coexpresión en la misma célula de un Ag de linaje distinto al linaje de origen célula de un Ag de linaje distinto al linaje de origen de los blastos. Ej la expresión de CD 19 o CD7 en de los blastos. Ej la expresión de CD 19 o CD7 en algunas LMA algunas LMA Asincronismo madurativo: Coexpresión de 2 Ag Asincronismo madurativo: Coexpresión de 2 Ag que en la ontogenia normal corresponden a estadíos que en la ontogenia normal corresponden a estadíos madurativos diferentes.madurativos diferentes. Sobre o sub expresión antigénica: o en la Sobre o sub expresión antigénica: o en la intensidad de fluorescencia de un Ag por encima de intensidad de fluorescencia de un Ag por encima de la intensidad observada en la ontogenia normal. la intensidad observada en la ontogenia normal.

LLA- B LLA-T

AAsincroníasincroníaMMadurativaadurativa

CD34+CD34+//CD10+d CD10+d

CD34+ CD20+CD34+ CD20+CDCD7+7+/CD/CD34+ 34+ (ectópico)(ectópico)

SobreexpresSobreexpresiónión CD10CD10; CD58; ; CD58; CD34; CD11a;CD34; CD11a; CD19 etc.CD19 etc.

CD7CD7; CD99; CD99

Disminución de Disminución de la expresiónla expresión

CD45CD45; CD38; ; CD38; CD20; CD11a; CD20; CD11a; CD19 etc.CD19 etc.

CD3 superfCD3 superf; CD45; ; CD45;

Infidelidad de Infidelidad de linajeslinajes

LLA-My+LLA-My+

CD13 CD13

CD33 CD33

LLA-My+LLA-My+

CD13 CD13

CD33 CD33

CF: LLA Fenotipos aberrantesCF: LLA Fenotipos aberrantes

LLA Frecuencia de alteraciones LLA Frecuencia de alteraciones genéticas (%)genéticas (%)

C myc t (12;21) Hiperdiploidia t (1;19) t (9;22)

BCR-ABL1 fusion BCR-ABL1 like IKFZ1

t (4;11) Hipodiploidía

Adulto Niños 5 2 0-3 20-25 6-7 23-29 2-3 4-5

25-30 2-3 Desconocido 15-20 3-7 2 2 1

LA correlación fenotipo-genotipoLA correlación fenotipo-genotipo

A medida que se ha ido adquiriendo conocimiento de las distintas alteraciones genéticas que ocurren en la LA, se ha observado que cada una de ellas presenta un inmunofenotipo característico, de tal forma que al realizar la CF nos da una idea de la posible alteración genética que presenta el paciente

Hrusak et al,

Leukemia (2002)

cCD22+, cCD79a+, CD19+, HLA-DR+

Clasificación LLA de Clasificación LLA de precursores Bprecursores B

Pro B: CD10 -

Común: CD10+, cad -

Pre B: CD10+/-, cad +, Ig Sup -

B madura: CD10+/-, Ig Sup+ ( ó )

Clasificación EGIL Clasificación EGIL

CD10

Diferenciación normal

Blastos B Blastos B

Blastos B

Blastos B

CD20

Caminos madurativos y blastos en LLA BCaminos madurativos y blastos en LLA B

Gentileza Dr.Jorge Rossi

LLA B. Características LLA B. Características • Mucho más frecuente en niños entre 2 y 6 años.• Curso clínico agudo agresivo.• Inmunofenotipo: CD79a+,TdT+, CD34+/-, CD45 débil o negativo, CD19+, CD22+, CD10+, CD20-/+, cad-/+, HLA-DR+, CD38+, (CD15, CD13, CD33 aparecen en alteraciones citogenéticas específicas)• Frecuente la hiperdiploidía. (BP)• B-III se asocia a t(1;19). (PP)• B-IV (L3) se trata con protocolo de Burkitt.• CD34 BP en pediatría y MP en adultos• Asincronía de Ag: CD34 y CD20. (EMR)• B-I puede tener asociado CD15/CD65 (no se

considera LLA My) ( alteraciones del gen MLL).

LLA B. Características LLA B. Características

cCD3+, CD7+, TCR+/-, HLA-DR-

Clasificación LLA de Clasificación LLA de precursores Tprecursores T

Pro T: CD2 -, CD5 - , CD8 -

Pre T: CD2+,y/o CD5+ y/o CD8+

Intermedia: CD1a+,CD4+/CD8+,CD3+/-

T madura: CD1a-, CD3+ , TCR

Clasificación EGIL Clasificación EGIL

LLA T CaracterísticasLLA T Características Se presentan en niños mayores. Alto recuento,

masa mediastinal y compromiso del SNC. En general son de peor pronóstico que las B.

• Early T cell con ausencia de CD1a y CD8, débil expresión de CD5 y presencia de marcadores stem (CD34 o CD117) o mieloide (DR, CD13,CD33, CD11b, o CD65), se asocia a grupo de alto riesgo y PP (Coustan Smith et al 2009).•CD 1a en algunos estudios se asocia a BP.•CD7 sin especificidad de linaje.

LLA T CaracterísticasLLA T Características

Cortical tardío: CD3c+,TdT+/-, CD1a+, CD2+, CD5+, CD4+, CD8+, CD10-/+

Cortical temprano: CD3c+, TdT+, CD2+, CD5+, CD7+, CD4(-), CD8(-), CD10+/-

Fenotipos más precoces: CD34+, cCD3+, CD7+, CD10+

LLA T cortical tempranaLLA T cortical temprana

10 10 10 10 100 1 2 3 4

8301.006CD45 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

8301.013CD38 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

8301.008CD7 ->

0 256 512 768 1024

8301.011FSC-Height ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

8301.008CD3 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

8301.005CD4 ->

LLA B MyLLA B My Es más frecuente en adultos que en niños.

Los Ag mieloides más comúnmente involucrados son CD11b (8.9% ) y CD13 (6.5 %)

Los blastos son generalmente tipo L2 y son positivos para la ANAE.

En adultos: presentan menor sobrevida.

LMA LMA 90 % de las LA del adulto.

Incidencia anual 3,5 por 100000 habitantes y se incrementa con la edad .(1 caso cada 100000 a los 30 años hasta 1 caso cada 10000 a los 60 años).

Edad media de diagnóstico 67 años con 6 % de los pacientes menores de 20 años y 34 % mayores de 75 años.

La clasificación FAB ha sido reemplazada por la de la OMS.

LMA LMA La LMA se define por la presencia de blastos de las distintas estirpes en un porcentaje superior al 20 % en MO.

Ciertas alteraciones genéticas son clasificadas como LMA independientemente del conteo de blastos.

I-LMA CON TRANSLOCACIONES CITOGENETICAS RECURRENTES:• LMA con t(8:21)(q22;q22). LMA1 (CBF)/ETO• LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA (LMA con t(15;17)(q22:q11-12) y variantes . PML/RAR • LMA con EOSINOFILOS MEDULARES ANORMALES (inv(16)(p13q22) ó t(16;16)(p13:q11). CBF/MYH11)• LMA con ANOMALIAS 11q23 (MLL)

LMA LMA

II-LMA CON DISPLASIA MULTILINEAL• con sindrome mielodisplásico previo• sin sindrome mielodisplásico previo

LMA LMA III-LMA Y SMD RELACIONADOS CON TERAPIA PREVIA• agentes alquilantes• epipodofilotoxina (algunas pueden ser linfoides)• otros tipos

IV- LMA SIN OTRA CARACTERIZACION (NOS)• LMA mínimamente diferenciada• LMA sin maduración• LMA con maduración• leucemia mielomonocítica aguda• leucemia monocítica aguda• leucemia aguda eritroide• leucemia aguda megacariocítica• leucemia aguda basofílica• panmielosis aguda con mielofbrosis• sarcoma mieloide

INCIDENCIA DE FENOTIPOS ABERANTES EN LMA

• Asincronismo en la expresión antigénica 80%

• Expresión de antígenos de otro linaje 26%

• Sobreexpresión antigénica 20%

• FSC/SSC anormal 17%

Patrones inmunofenotípicos aberrantes

85 a 95 %

asincronismo en la expresión antigenica 80%CD34+ HLA-DR - CD33+ 9% CD117+ CD11b+ 5.5%

CD34+ CD56+ 8% CD117+ CD33- CD34- CD15+ 4%

CD34+ CD11b+ 5% CD117+ HLA-DR - CD15+ 2.3%

CD34+ CD33++ 3% CD117- HLA-DR - CD15- 2.3%

CD34+ CD14+ 3% CD117- HLA-DR + CD33+ CD34- 0.8%

CD34+ CD117+ HLA-DR - 2.3% CD33++ HLA-DR - CD34- CD15- CD14- 17%

CD34+ CD117- CD15 + 2.3% CD33- CD13- 14%

CD34+ CD33- CD13+ HLA-DR + 1.5% CD33+ CD13- 7%

CD34+ CD33- CD13+ HLA-DR - 0.8% CD33+ HLA-DR -+CD4+ CD45dim 0.8%

CD34+ CD33- CD117+ HLA-DR + 0.8% CD33++ HLA-DR -+CD15- CD14- 0.8%

CD117+ CD33+ HLA-DR – 11% CD33+ CD45dim CD34- CD15- 0.8%

CD117+ CD34- CD15- 6% CD33+ HLA-DR+ CD56- CD13- 0.8%

LMA: FENOTIPOS ABERRANTES

Expresión de Expresión de antígenos de otro antígenos de otro linajelinaje

CD2CD2 20 ± 2%20 ± 2%CD7CD7 8 ± 1 % 8 ± 1 %

CD19CD19 2 ± 0,3 % 2 ± 0,3 % CD20 0.8 ±0,1 %CD20 0.8 ±0,1 % CD5CD5 0.8 ±0,1 % 0.8 ±0,1 %

Sobreexpresión antigénicaSobreexpresión antigénica

CD33++ 11 %CD33++ 11 % CD34 10 %CD34 10 % CD13 3%CD13 3% CD117 1,%CD117 1,% CD15CD15 0.7%0.7% HLA-DR 0.7%HLA-DR 0.7%

LMA: FENOTIPOS ABERRANTESLMA: FENOTIPOS ABERRANTES

LMA con t(8:21)(q22;q22). LMA1 (CBF)/ETO. (ex M2)

LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA (LPA) (ex M3)

(LMA con t(15;17) (q22:q11-12) y variantes . PML/RAR

LMA con EOSINOFILOS MEDULARES ANORMALES

inv(16) (p13q22) ó t(16;16)(p13:q11). CBF/MYH11) (ex

M4Eo)

LMA con ANOMALIAS 11q23 (MLL). (ex M5a)

I-LMA CON TRANSLOCACIONES CITOGENETICAS RECURRENTES

LMA con t(8:21)(q22;q22)

• 5-12% de las LMA , pacientes jóvenes y con pronóstico favorable. En la clasificación FAB M2

• Posible presencia de tumores mieloides extramedulares (sarcomas granulocíticos)

• Perfil inmunofenotípico: - Antígenos mieloides (Mieloperoxidasa, CD13 y CD33 heterogéneo), CD34- Antígenos no habituales en serie mieloide: CD19 y CD56

LMA con t(8:21)(q22;q22)

0 256 512 768 1024

DER 158583.002FSC-Height ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.002CD38 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.002CD38 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.003CD45 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.003CD45 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.010MPO FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.006CD11b FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.007CD36 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.008CD2 FIT C ->

LMA con t(8:21)(q22;q22)

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 158583.004Anti -HLA-DR FIT C ->

LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA LMA con t(15;17) (q22:q11-12) y variantes.

• Entre 5 a 15% de las LMA, más frecuente en latinos. Clasificación FAB M3 conocida como LAP.

• Variedad hipergranular (alto FSC/SSC) y otra variante hipoganular con alto recuento celular y bajo FSC/SSC,

• Los promielocitos anormales liberan sustancias procoagulantes que activan la cascada de la coagulación CID siendo la principal causa de muerte en el diagnóstico agudo.

• La translocación t(15;17) genera la proteina de fusión PML - RAR-. que bloquea el proceso de diferenciación inducido por Acido Retinoico

Otras translocaciones: t(11,17)(q23,q21), t(5,17)(q32,q12);t(11,17)(q13,q21)

LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA

LMA con t(15;17) (q22:q11-12) y variantes .PML/RAR

• De todas la LMA es la forma más curable. Tiene un pronóstico favorable y es sensible al tratamiento con acido transretinoico.

• Perfil inmunofenotípico:- HLADR y CD34 negativos o positivos en una subpoblación de los blastos.- CD13 + homogéneo- CD33 + heterogéneo- CD15 -/+d (patrón CD34/CD15)- CD2-/+d- autofloresencia

0 256 512 768 1024

DER 159557.002Forward Scatter ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 159557.002CD38 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 159557.002CD34 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 159557.003CD33 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 159557.006CD45 PerCP ->

LMA con t(15;17) (q22:q11-12) PML/RAR

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 159557.005CD11b FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 159557.006CD15 FIT C ->

LMA con t(15;17) (q22:q11-12) PML/RAR

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 159557.007CD64 FIT C ->

DER 159557.100MPO FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LMA con EOSINOFILOS MEDULARES ANORMALES

inv(16) (p13q22) ó t(16;16)(p13:q11). CBF/MYH11

• Presentan más del 5% de eosinófilos atípicos y monocitos anormales, representan entre el 6 y el 10 % de las LMA. •Es más frecuente en adultos y en la clasificación FAB se la conocía como M4 Eo. • Suelen tener compromiso del sistema nervioso central y su pronóstico es favorable

•Inmunofenotipo:

blastos mieloides + monocitos anormales + eosinófilos anormales (MPO+ fuerte), CD2-/+ débil

LMA con anomalías del 11q23 (MLL)

• Presenta diferenciación monocítica, corresponde al 5 a 7 % de las LMA y es probable hallarlas en pediatría. Clasificación FAB M5a

•Pueden presentar infiltración de tejidos (gingival, piel) (sarcomas extramedulares,

• El gen afectado es el gen MLL

• Pronóstico adverso

•Perfil inmunofenotípico: antígenos mieloides (CD13,CD33) de stem cell (CD117,DR y a veces CD34) y de diferenciación monocítica (CD14 a veces, CD64, CD4, CD36, CD11b y lisozima). Suelen marcar CD7 y CD56. El Ac 7.1 (NG2) es un marcador de esta patología

0 256 512 768 1024

LCV8253.012FSC-Height ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LCV8253.013CD15 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LCV8253.014CD34 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LCV8253.015CD34 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LCV8253.016CD34 FIT C ->

LMA con ANOMALIAS 11q23 (MLL)

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LCV8253.0227.1 PE ->

t(15; 17)t(15; 17) MLL 11q23 MLL 11q23 t(8; 21) t(8; 21) Inv/del(16) Inv/del(16) APL/M3APL/M3 M4, M5 >M1, M2M4, M5 >M1, M2 M2 M2 M4 Eo M4 Eo

FSC/SSCFSC/SSC ++ -- -- --cMPOcMPO ++ ++ ++++ ++++CD34CD34 - (+subpoblación)- (+subpoblación) -- ++ ++DRDR -- ++ ++ ++CD13CD13 heterogénoheterogéno -/débil-/débil ++ ++CD33CD33 ++ homogéneo++ homogéneo homogéneohomogéneo ++ ++CD15CD15 -/-/dd ++ ++ ++CD11bCD11b -/+-/+ ++ -/+-/+ ++CD11cCD11c -- ++ -- ++CD14CD14 -- +/-+/- -- -/+-/+CD4CD4 -- ++ -- ++CD64CD64 -- ++ -- -/+-/+7.1 7.1 -- ++ -- --CD56*CD56* -/+-/+ ++ -/+-/+ --CD19CD19 -- -/-/dd -/+-/+ --CD7CD7 -- -- -/+-/+ --CD2CD2 -/+-/+ -/-/dd -- -/+-/+* Pronóstico* Pronóstico

PATRONES INMUNOFENOTIPICOS DE LMA CON PATRONES INMUNOFENOTIPICOS DE LMA CON ALTERACIONES GENETICAS RECURRENTESALTERACIONES GENETICAS RECURRENTES

Orfao et al

II-LMA CON DISPLASIA MULTILINEAL• con sindrome mielodisplásico previo• sin sindrome mielodisplásico previo

III- LMA Y SMD RELACIONADOS CON TERAPIA PREVIA• agentes alquilantes• epipodofilotoxina (algunas pueden ser linfoides)• otros tipos

• LMA mínimamente diferenciada• LMA sin maduración• LMA con maduración• leucemia mielomonocítica aguda• leucemia monoblástica y monocítica aguda• leucemia aguda eritroide• leucemia aguda megacariocítica• leucemia aguda basofílica• panmielosis aguda con mielofbrosis

IV-LMA SIN OTRA CARACTERIZACION

LMA mínimamente diferenciada

• Morfológicamente los blastos son tipo L2 de la antigua clasificación FAB, es equiparable a la FAB M0 de LMA.

• Es importante el diagnóstico diferencial con LLA, leucemia megacarioblástica, leucemia de linaje ambiguo.

• Aproximadamente el 5 % de las LMA, Es de pronóstico adverso (menos tiempo de sobrevida y recaída en corto plazo).

•Perfil inmunofenotípico:

CD45débil, CD13, CD33, CD117, CD34, HLA-DR, CD38 y pocas evidencias de maduración. MPO generalmene negativa. Por ultracitoquímica la MPO es positiva es aprox 3 % de los blastos.


0 256 512 768 1024


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 156037.002CD45 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 156037.004CD38 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 156037.005CD2 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 156037.103M PO FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 156037.105T dT FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 156037.103M PO FIT C ->


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 156037.007CD15 FIT C ->

LMA sin maduración• Su contrapartida FAB es la M1, ocurre entre el 6 y 10 % de las LMA

• Al diagnóstico la mayoría de los elementos medulares no eritroides son blastos mieloides (gral más del 90 %)

• Pronóstico adverso. Curso agresivo especialmente en pacientes que se presentan con hiperleucocitosis.

• Inmunofenotipo:

CD45débil, CD13, CD33, CD117, CD34, HLA-DR, MPO positiva, CD4 y CD15 positivo débil en hasta un 25% de los casos

LMA sin maduración

0 256 512 768 1024


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162758.002CD38 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162758.004CD11b FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162758.004CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162758.006CD64 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162758.150M PO PE ->

LMA con maduración

• Su contrapartida FAB es la M2, ocurre entre el 3 y 5 % de las LMA, si les adicionamos las LMA con t (8;21) también M2 de la antigua clasificación representan aproximadamente el 35 % del total de las LMA.

•Pronóstico variable, dependiendo de si presentan o no alteración citogenética las que tienen t(8,21) son de mejor pronóstico que el resto.

• Inmunofenotipo: CD45débil, CD13, CD33, CD15 positivos, con CD34, HLA-DR y CD117 variables, MPO positiva.

LMA con maduración

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161009.012CD15 FIT C ->

0 256 512 768 1024


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161009.005CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161009.007CD22 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161009.015M PO PE ->

Leucemia mielomonocitica aguda

• Su contrapartida FAB es la M4, ocurre entre el 3 y 5 % de las LMA, si les adicionamos las LMA con inv16 también M4 de la antigua clasificación representan aproximadamente el 20 % del total de las LMA.

• Pronóstico variable, dependiendo de si presentan o no alteración citogenética las que tienen inv16 son de mejor pronóstico que el resto.

• Inmunofenotipo: - Dos grupos de células unas que se diferencian a linaje neutrófilo (CD45débil, CD13, CD33, CD15, CD64) y otras que se diferencian al monocítico CD33fuerte, HLA-DR, CD11b, CD14, CD36, CD4

0 256 512 768 1024


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.004CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.004CD11b FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.002CD34 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.002CD38 FIT C ->

Leucemia mielomonocítica aguda

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.007CD64 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.008CD15 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.009CD16 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.010CD45 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 162697.010MPO PE ->

Leucemia mielomonocítica aguda

Leucemia monoblástica y monocítica aguda

• Incluye dos entidades distintas las monoblásticas (antiguas M5a de la FAB) tienen una prevalencia del 5 al 8% del total y se observan principalmente en niños. Las monocíticas antiguas M5b de la FAB, tiene una prevalencia del 3 al 6% del total y se observan en adultos (muy raras en pediatría).

• Suelen tener recuento elevado de blancos, incremento de lisozima y tendencia al compromiso extramedular principalmente los cloromas en pediatría (piel, SNC),

• Son de mal pronóstico y presentan curso agresivo.

• Inmunofenotipo: Las M5a presentan más marcadores de inmadurez y las M5b más relacionado a estadios más maduros del linaje.CD14, CD64, CD36, CD13, CD11b, CD15, CD33. CD45, CD34 variables

Leucemia monoblástica aguda

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.007CD45 PerCP ->

0 256 512 768 1024


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.002CD34 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.002CD38 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.003HLADR FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.005CD11b FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.006CD36 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.010CD4 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.011M PO FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 152779.007CD15 FIT C ->

Leucemia monoblástica aguda

Leucemia monocítica aguda

0 256 512 768 1024


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161144.006CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161144.006CD11b FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161144.002CD34 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161144.002CD38 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161144.008CD4 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161144.102CD15 FIT C ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

DER 161144.101CD64 FIT C ->

Leucemia monocítica aguda

Leucemias agudas eritroides• Son raras representan menos del 5% de las LMA. En adultos hay un subgrupo inducidas por terapia cancerígena

• Se la conoce como eritroleucemia ( antigua FAB M6) y en ella más del 50% de los elementos deben ser blastos eritroides y más del 20% de las células no eritroides deben ser blastos mieloides,

• Son de mal pronóstico, muy agresiva y de inicio abrupto.

•Inmunofenotipo:

CD71, CD36, Glicoforina, HLA-DR(-), CD45(-). Blastos mieloides marcan como tales

Leucemia aguda megacariocítica•Representan entre el 3 y 6% de las LMA de novo.

• Más del 20% de los componentes de la Mo deben ser megacarioblastos.

• Suelen tener dry tap (punciones secas) por la fibrosis que es típica de esta variedad.

• Son de mal pronóstico,

• Inmunofenotípico

CD41, CD61, CD42 (tardío), HLADR y CD45 negativos, CD36+

• Variedades infantiles:-t(1;22) (p13,q13): niños menores de 2 años, masa abdominal, mal pronóstico.-asociada a Sme. de Down / SMT

Leucemia aguda megacariocítica

0 256 512 768 1024

QOM M O.001FSC-H ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

QOM M O.001CD34 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

QOM M O.001CD45PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4


Leucemias de Leucemias de clasificación complejaclasificación compleja

Bifenotípica: los blastos se expresan Ag de dos linajes distintos, no pudiendo asociarse la leucemia a ninguno de ellos en particular. Existe un sistema de puntuación creado por EGIL para la determinación de este tipo de Leucemias. Biclonales: 2 poblaciones de blastos distinguibles por morfológica e inmunofenotipo. También se la llama bilineal. Indiferenciadas: son leucemias que carecen de marcadores específicos de linaje. Normalmente son CD34, CD38, DR, CD7 y TdT positivos.

LeucemiasLeucemias Bifenotípicas Bifenotípicas

Blastos con Ag de dos linajes distintos, no Blastos con Ag de dos linajes distintos, no pudiendo asociarse la leucemia a ninguno de ellos en pudiendo asociarse la leucemia a ninguno de ellos en particular, ya que los blastos coexpresan ambos Ag particular, ya que los blastos coexpresan ambos Ag haciendo que el fenotipo parezca una hibridización haciendo que el fenotipo parezca una hibridización entre ambos . Se utiliza el score de EGIL para entre ambos . Se utiliza el score de EGIL para realizar los cálculos.realizar los cálculos.

Pueden representar hasta el 5 % del total de Pueden representar hasta el 5 % del total de las LA. las LA.

Leucemias Bifenotípicas Leucemias Bifenotípicas

4 tipos distintos los más frecuentes:

Blastos que coexpresan Ag Mieloides y B. Blastos que coexpresan Ag Mieloides y T.

los más infrecuentes Blastos que coexpresan Ag B y T. Blastos que coexpresan Ag B, T y Mieloides.

Leucemias Bifenotípicas Leucemias Bifenotípicas

Hallazgos citogenéticos más importantes:Hallazgos citogenéticos más importantes:

Alta prevalencia de Ph t (9;22) (q34;q11) y Alta prevalencia de Ph t (9;22) (q34;q11) y alteraciones del 11q23.alteraciones del 11q23.

Muchos casos sin anormalidades aparentes. (hasta Muchos casos sin anormalidades aparentes. (hasta 35%).35%).

LeucemiasLeucemias Biclonales Biclonales

En estos casos existen 2 clones leucémicos En estos casos existen 2 clones leucémicos distintos. Son más infrecuentes que las Bifenotípicas. distintos. Son más infrecuentes que las Bifenotípicas.

Generalmente se combina un clon mieloide con Generalmente se combina un clon mieloide con un Linfoblástico B. Si el diagnóstico original no esta un Linfoblástico B. Si el diagnóstico original no esta bien hecho puede parecer que hubo un cambio en los bien hecho puede parecer que hubo un cambio en los blastos. blastos.

Problemas con el tratamientoProblemas con el tratamiento

Leucemias Leucemias IndiferenciadasIndiferenciadas

Son extremadamente raras en pediatría ( 1 en Son extremadamente raras en pediatría ( 1 en 1500).1500).

Carecen de Ag específicos de linajes como Carecen de Ag específicos de linajes como 19,79a,22, 3,5,13, MPO,61,41,42,33,15,65, TCR, etc. 19,79a,22, 3,5,13, MPO,61,41,42,33,15,65, TCR, etc.

Los Ag que pueden expresar son 34,38,DR, 45, 7, Los Ag que pueden expresar son 34,38,DR, 45, 7, 9, 71, TdT. (todos inespecíficos de linaje y Ag típicos 9, 71, TdT. (todos inespecíficos de linaje y Ag típicos de stem cell.de stem cell.

Factores pronósticosFactores pronósticos

Sobrevida libre de Sobrevida libre de eventos (%) en LLAeventos (%) en LLA

C myc t (12;21) Hiperdipliodia t (1;19) t (9;22)

BCR-ABL1 fusion BCR-ABL1 like IKFZ1

t (4;11) Hipodiploidía

Adulto Niños 50 a 80 a 3 a 75 a 85 a 3 a desconocida 85 a 95 a 5 a 30 a 50 a 5 a 80 a 90 a 5 a 40 a 70 a 3 a 85 a 95 a 5 a 40 a 60 a 2 a 80 a 90 a 3 a desconocida 40 a 50 a 5 a10 a 20 a 3 a 30 a 40 a 5 a10 a 20 a 3 a 30 a 40 a 3 a

Favorable AdversosFavorable AdversosEdad (a) < 35 > 60Edad (a) < 35 > 60GB (x10GB (x1099) < 30 > 100) < 30 > 100IF LLA tímico LLA T earlyIF LLA tímico LLA T earlyGenotipo -- Genotipo -- BCR-ABL1BCR-ABL1; ; MML-MML-

AF4AF4EMR < 0,01 % > 0,01 % EMR < 0,01 % > 0,01 %

Factores pronósticos: AdultosFactores pronósticos: AdultosLLALLA

Favorable AdversosFavorable AdversosEdad (a) 1 a 9 < 1 o > o = 10Edad (a) 1 a 9 < 1 o > o = 10GB (x10GB (x1099) < 50 > 50) < 50 > 50IF precursor B LLA T earlyIF precursor B LLA T earlyGenotipo Hiper, ETV6 Hipo Genotipo Hiper, ETV6 Hipo BCR-ABL1BCR-ABL1; ;

MML-AF4MML-AF4EMR < 0,01 % > 0,1 % EMR < 0,01 % > 0,1 %

Factores pronósticos: PediatriaFactores pronósticos: PediatriaLLALLA

LMALMA

Entidad clínicamente heterogénea

Factores adversos edad avanzada enfermedad extramedular. enfermedad hematológica preexistente (SMD). pacientes > 60 años y especialmente > 75 años Conteo de blanco > de 50000/mm3


LMALMA

las alteraciones genéticas son claves al diagnóstico

50 % tienen alguna alteración 10 a 20 % tienen cariotipos complejos. (3 o + alt) Son favorables t (15;17), t (8;21) e inv 16 son intermedias citogenético normal y otros no complejos Son desfavorables: del 5, del 7 , cariotipos complejos


LMALMA

Entre los que tienen citogenético normal los que presentan duplicación en tandem de FLT3-ITD, tienen peor pronóstico ( 20 a 30 % con CG normal los que presentan mutaciones de NPM1 (nucleofosmina) con fenotipo salvaje de FLT3 (40 a 60 % del total de los CG normales) tienen pronóstico más favorable.


CASOS CLINICOS

M.O. normalM.O. normal

LinfocitosLinfocitos MonocitosMonocitos

Mieloide madura Mieloide madura Mieloide inmadura Mieloide inmadura

Eritroide Eritroide

Caso 1. Caso 1.

Caso 1. (2)Caso 1. (2)

Caso 1 (3)Caso 1 (3)

Otros Resultados. Caso 1 (4)Otros Resultados. Caso 1 (4)

PAS positivo, POX negativo.PAS positivo, POX negativo.

Se encontró por BM la t (12;21) Se encontró por BM la t (12;21) expresando la oncoproteína anómala expresando la oncoproteína anómala ETV6/ AML1.ETV6/ AML1.


PAS positivo, POX negativo.PAS positivo, POX negativo.

Se encontró por BM la t (12;21) Se encontró por BM la t (12;21) expresando la oncoproteína anómala expresando la oncoproteína anómala ETV6/ AML1.ETV6/ AML1.

Es una LLA estirpe B común según Es una LLA estirpe B común según clasificación EGIL de buen pronóstico o clasificación EGIL de buen pronóstico o LLA de precursores B.LLA de precursores B.

Caso 2. Caso 2.

Caso 2. (2) Caso 2. (2)

Caso 2. (2) Caso 2. (2)

No se encontró alteración por No se encontró alteración por citogenética ni por BM.citogenética ni por BM.

PAS negativa. Pox positiva. ANAE PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. CAE positiva.negativa. CAE positiva.

Caso 2. Otros resultados Caso 2. Otros resultados

No se encontró alteración por No se encontró alteración por citogenética ni por BM.citogenética ni por BM.


Caso 2. Otros resultados Caso 2. Otros resultados

Es una LMA sin maduración o LMA M1 de la clasificación FAB

Caso 3.Caso 3.

Caso 3 (2).Caso 3 (2).

Otros Resultados. Caso 3 (3).Otros Resultados. Caso 3 (3).

Se encontró la t (8;21) por citogenética Se encontró la t (8;21) por citogenética y la proteína anómala y la proteína anómala AML1/ETO por AML1/ETO por BM.BM.


Otros Resultados. Caso 3 (3).Otros Resultados. Caso 3 (3).

Se encontró la t (8;21) por citogenética y la Se encontró la t (8;21) por citogenética y la proteína anómala proteína anómala AML1/ETO por AML1/ETO por BM.BM.

PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa. CAE positiva.CAE positiva.

Es una LMA M2 de la antigua clasificación Es una LMA M2 de la antigua clasificación FAB o LMA con t (8;21).FAB o LMA con t (8;21).





No se encontró alteración citogenética No se encontró alteración citogenética ni por BM,ni por BM,

PAS positiva. Pox negativa. Fac PAS positiva. Pox negativa. Fac negativa.negativa.

Otros marcadores positivos CD22 y Otros marcadores positivos CD22 y CD24.CD24.


No se encontró alteración citogenética No se encontró alteración citogenética ni por BM,ni por BM,

PAS positiva. Pox negativa. Fac PAS positiva. Pox negativa. Fac negativa.negativa.

Otros marcadores positivos CD22 y Otros marcadores positivos CD22 y CD24.CD24.

LLA de precursores B o LLA común de LLA de precursores B o LLA común de EGILEGIL




Otros resultadosPas positiva, Pox negativa, Fac positivaCG y BM negativos.


Otros resultadosPas positiva, Pox negativa, Fac positivaCG y BM negativos.

LLA de precursores T




CG convencional t (15;17). FISH CG convencional t (15;17). FISH positivo para (15;17). BM positivo para positivo para (15;17). BM positivo para PML/RARPML/RARαα..

PAS negativa. Pox negativa. ANAE PAS negativa. Pox negativa. ANAE negativa.negativa.

Otros marcadores positivos CD65, Otros marcadores positivos CD65, CD117, y negativos para CD34 y DR.CD117, y negativos para CD34 y DR.


CG convencional t (15;17). FISH CG convencional t (15;17). FISH positivo para (15;17). BM positivo para positivo para (15;17). BM positivo para PML/RARPML/RARαα..

PAS negativa. Pox positiva. ANAE PAS negativa. Pox positiva. ANAE negativa.negativa.

Otros marcadores positivos CD65, Otros marcadores positivos CD65, CD117, y negativos para CD34 y DR.CD117, y negativos para CD34 y DR.

Es una LPA (M3 de la clasificación Es una LPA (M3 de la clasificación FAB). (BP) o LMA con t (15;17)FAB). (BP) o LMA con t (15;17)

Enfermedad mínima Enfermedad mínima residual (EMR) (MRD) residual (EMR) (MRD)

Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, que puede expandirse en cualquier momento, que puede expandirse en cualquier momento, haciéndose evidente como una recaída de la haciéndose evidente como una recaída de la enfermedad. (enfermedad. (Foroni et al. 2002).Foroni et al. 2002).

Consiste en la permanencia de un clon anormal, en Consiste en la permanencia de un clon anormal, en cantidades indetectables para la microscopía cantidades indetectables para la microscopía óptica, durante o al finalizar el tratamiento.óptica, durante o al finalizar el tratamiento.

Importancia de la EMRImportancia de la EMRActualmente es un pilar básico para:Actualmente es un pilar básico para:

Seguimiento de la enfermedad.Seguimiento de la enfermedad.

Diagnóstico precoz de recaída.Diagnóstico precoz de recaída.

Conducta pretransplante. Conducta pretransplante.

ALLIC BFM 20ALLIC BFM 201010: C: ClasificaciónlasificaciónDIAGNÓSTICO

DIA 8

DÍA 15

DÍA 33

GRUPOS DE RE RI RA

RIESGO 13% 66% 21%

RECAÍDAS 5% 22% 40%

EDAD 1-5aGB <20 x 109/L

BLASTOS D8 <1000

EDAD <1 ≥6aGB ≥20 x 109/L

BLASTOS D8 <1000

t(9;22) t(4;11)BLASTOS D8 ≥1000

HIPODIPLOIDIA

M1/M2 M3 M1/M2 M3 M1/M2/M3

M1 M2/M3 M1 M2/M3 M1/M2/M3

<0.1% >01- <10% >10%ERM Día 15 >01- <10% >10% TODAS

Muchas gracias por su atención.Muchas gracias por su atención.

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Citometría de Flujo y oncohematología · Ontogenia Linfoide B ... La diferenciación de los linfocitos T ocurre parte en MO y parte en el timo. Precursor linfoide Protimocito Timocito