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rosalba-alfonso
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Citometría de Citometría de FlujoFlujo
Citometría de FlujoCitometría de FlujoCitometría de FlujoCitometría de FlujoAnálisis celular multiparamétricoAnálisis celular multiparamétrico
Láser focalizado = señales celulares Láser focalizado = señales celulares recogidas por diferentes detectores.recogidas por diferentes detectores.
Tamaño y complejidadTamaño y complejidad
Inmunofenotipo.Inmunofenotipo.
Señales de dispersión.Señales de dispersión.
Señales de fluorescencia.Señales de fluorescencia.
ParámetrosParámetros
Dispersión:Dispersión:
*FSC: Tamaño*FSC: Tamaño
*SSC: Complejidad.*SSC: Complejidad.
Fluorescencia:Fluorescencia:
Uniones AG-ACUniones AG-AC
Marcaje con Marcaje con fluorocromos.fluorocromos.
Poblaciones celulares Poblaciones celulares
detectadas detectadas simultáneamente.simultáneamente.
VentajasVentajas
Múltiples marcajes.Múltiples marcajes.
Analizar un elevado Analizar un elevado numero de partículas numero de partículas en un corto periodo en un corto periodo de tiempo.de tiempo.
Cuantificación de la Cuantificación de la actividad antigénica.actividad antigénica.
Mayor sensibilidad y Mayor sensibilidad y objetividad.objetividad.
Análisis de Análisis de poblaciones celulares poblaciones celulares
Almacenamiento de Almacenamiento de la información para la información para análisis posteriores.análisis posteriores.
FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS
Absorben luz a una Absorben luz a una Emiten a otra.Emiten a otra.
Espectros de excitación y de emisión.Espectros de excitación y de emisión.
Uso Uso Tipo de láser y su long.de onda.Tipo de láser y su long.de onda.
Corto estado de excitación.Corto estado de excitación.
Fotoestables.Fotoestables.
Alto rendimiento cuántico.Alto rendimiento cuántico.
FLUOROCROMO
DESCRIPCION
FITC Isotiocianato de Fluoresceína
PE Ficoeritrina
PerCP Proteína Clorofila Peridinina
TRITC Isotiocianato de tetrametil rodamina 540---570
PEC Ficoeritrina cianina
RT Rojo Texas 596----615nm
PC Ficocianina 620---650nm
APC Aloficocianina 650-----660nm
TRICOLOR TRICOLOR 540--------570nm
ALEXA-FLUOR FLUOROCROMO : Molecular Probes
CITOMETROCITOMETRO
SISTEMAS OPTICOSSISTEMAS OPTICOS
Como se preparan las Como se preparan las muestras??muestras??
TIPO de MX.TIPO de MX.
Médula ósea.Médula ósea.- Sangre periférica. - Sangre periférica. - Exudados y trasudados - Exudados y trasudados
- LCR.- LCR.- BAL.- BAL.- Tejidos sólidos como ganglios. - Tejidos sólidos como ganglios. - Células procedentes de cultivos celulares.- Células procedentes de cultivos celulares.- Productos de aféresis. - Productos de aféresis.
CITOGRAMASCITOGRAMAS
Línea BlancaLínea Blanca
LoLoRojoRojo
NoNoAzulAzul
EoEoAmarilloAmarillo
MoMoVerdeVerde
PQ y Rcel.PQ y Rcel.NegroNegro
CITOGRAMASCITOGRAMAS
Línea Roja:Línea Roja:
HH Rojo Rojo
PQPQVerdeVerde
ResiduosResiduosAzulAzul
FUNDAMENTOS DE LAFUNDAMENTOS DE LA
CITOMETRÍA DE FLUJO CITOMETRÍA DE FLUJO
¿Qué es la citometría de flujo?¿Qué es la citometría de flujo?
FSC
90º90º2- 4º
Columna de muestra
Meeting pointMeeting pointLáserLáser
Detecto
res de lu
z
Detecto
res de lu
z
AmplificaciónAmplificacióndigitalizacióndigitalización
RepresentaciónRepresentación y Analisis y Analisis
FlujoFlujo
¿Cómo funciona un citómetro?¿Cómo funciona un citómetro?
1.1. Sistema de flujoSistema de flujo
2.2. Dispersión de la luzDispersión de la luz
3.3. FluorescenciaFluorescencia
4.4. Separación y detección de la luzSeparación y detección de la luz
5.5. AmplificaciónAmplificación
6.6. Corrección de errores: solapamiento Corrección de errores: solapamiento espectral y formación de dobletesespectral y formación de dobletes
7.7. Digitalización y almacenamiento de la Digitalización y almacenamiento de la informacióninformación
1.1. SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA1.1. SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA
MUESTRAMUESTRA
AIREAIRE
FLUJOFLUJOMUESTRAMUESTRA
1.2. Cámara1.2. Cámara de flujo de flujo
FSC
90º90º
Fluido envolvente
Columna de muestra
Luz dispersada lateralmente Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, y luz fluorescente, = 90= 90º
Luz incidenteLuz incidente
Luz dispersada hacia delante, Luz dispersada hacia delante, ==2- 4º
Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light )
Detector FSC
Detector de 90º SSC
Laser
DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)
FSCFSC
SSCSSC
El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particulapulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula
DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC)SCATTERED LIGHT, SSC)
FSCFSC
SSCSSC
El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad)(granularidad)
0 256 512 768 1024
4C5144001 FSC-Height ->
GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+
MonocitosMonocitosCD14+CD14+
LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+
T2abT2abT1gdT1gdCD4+CD4+CD8+CD8+
CD56+CD56+CD19+CD19+
CD5+CD5+CD5-CD5-
Morfología y antígenos de diferenciación en el Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celularanálisis de la heterogeneidad celular
Laser
Detectores de fluorescencia
Freq
Fluorescencia
Detector
Detector de fluorescencia(PMT3, PMT4 etc.)
FluorescenciaFluorescencia
FSCFSC
FL-1FL-1
FL-2FL-2
FluorescenciaFluorescencia
Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.
Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.(mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.
t (t (s)s)
EE
11<<22
11
22
Citómetros con 1 láser: 2 D (dispersión) y 3 Fl Citómetros con 1 láser: 2 D (dispersión) y 3 Fl (fluorescencia)(fluorescencia)Citómetros de 2 láser: 2D y 4 FlCitómetros de 2 láser: 2D y 4 Fl
TIPOS DE LASERTIPOS DE LASERLáser Violeta 405 nmLáser Violeta 405 nmLáser Azul 488 nm (Argón)Láser Azul 488 nm (Argón)Láser Verde 543 nmLáser Verde 543 nmLáser Rojo 633-635 nm (He-Ne)Láser Rojo 633-635 nm (He-Ne)
Citometros FlujoCitometros FlujoCitometros FlujoCitometros Flujo
EspectrosEspectros
Espectro de AbsorciónEspectro de Absorción Representación de la intensidad de absorción de luz Representación de la intensidad de absorción de luz
de distintas longitudes de onda por una sustanciade distintas longitudes de onda por una sustancia
Espectro de EmisiónEspectro de Emisión Representación de la intensidad de emisión de una Representación de la intensidad de emisión de una
sustancia excitada con luz de una determinada sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda.longitud de onda.
nm
excitaciónexcitación medidamedida
Inte
nsi
dad
de
I nt e
ns i
da d
de
flu
ore s
c en
c ia
flu
ore s
c en
c ia
DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIA
TCPerCP
QR
Cy5APC
FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores
FluorocromosFluorocromos
EscalasEscalas
FSC Ej: LinealFSC Ej: Lineal FL-1 Ej: LogarítmicaFL-1 Ej: Logarítmica
Compensación de señalesCompensación de señales
Fundamento Fundamento Superposición de Superposición de espectros de emisión. espectros de emisión. Parte de la señal de Parte de la señal de emitida por un emitida por un fluorocromo es leída por fluorocromo es leída por el detector de otro colorel detector de otro colorConcepto Concepto sustracción de sustracción de una parte de la señal una parte de la señal medida en un color a la medida en un color a la señal medida en otro colorseñal medida en otro color
FL-2FL-2 - %FL1- %FL1
ll
excitaciónexcitación
medidamedida
Inte
nsi
dad
de
flu
or e
scen
cia
Int e
nsi
dad
de
flu
ore
scen
cia
FL-1FL-1 FL-2FL-2
Representación monoparamétrica de datos.Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.
M1
HistogramasHistogramas
SSCSSC
FSCFSC
FL-1FL-1
FL-2FL-2
FL-3FL-3
Representación biparamétrica en 2DRepresentación biparamétrica en 2DDiagrama de puntos / dot plot
+
+--
++-
-FL-1FL-1
FL
-2F
L-2
Representación 3D Representación 3D Countour plotCountour plot / / Diagramas de
contornosX, Y más una tercera dimensión. X, Y más una tercera dimensión.
La altura representa el número de células La altura representa el número de células con una determinada combinación de con una determinada combinación de ambos parámetros.ambos parámetros.Densidad=alturaDensidad=altura
Diagrama de dot plot density
Usa colores para representarUsa colores para representardensidaddensidad
Selección de subpoblaciones Selección de subpoblaciones definidas en diagramas definidas en diagramas monoparamétricos monoparamétricos Sitúan los valores límite Sitúan los valores límite superior e inferior de un superior e inferior de un parámetro que definen a las parámetro que definen a las células de interés.células de interés.
Selección de la informaciónSelección de la informaciónGates (Puertas) / ventanas (windows)Gates (Puertas) / ventanas (windows)
M1
M2
Estadisticas biparamétricasEstadisticas biparamétricas
Cuadrantes Cuadrantes Combinación de dos Combinación de dos
umbrales de positividad para dos umbrales de positividad para dos
parámetrosparámetros
Número de célulasNúmero de células
% de células% de células
MFI mean, geo meanMFI mean, geo mean
+--
++
-
+-
Quadrant Statistics
File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values
Sample ID: Patient ID:
Tube: tube #7 Panel: Bronquiris
Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate
Gated Events: 5000 Total Events: 5000
X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)
Quad Location: 15, 17
Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean
UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92
UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05
LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17
LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43
UULL UURR
LLLLLLRR