CITOMETRÍA DE FLUJO

CITOMETRÍA DE FLUJO

Técnica de análisis celular multiparametrico

Se basa en hacer pasar una suspensión celular de forma alineada y de a una celular por vez delante de un rayo laser focalizado

1) SISTEMA OPTICO

3) ELECTRONICA E

INTEGRACION DE LA SEñAL

FUENTE DE ILUMINACION: Lasers CONJUNTO DE LENTES, ESPEJOS Y FILTROS DETECTORES

2) FLUIDICA

GARANTIZA FLUJO LAMINAR

E HIDROENFOCADO DE LA

MTRA

4) SOFTWARE Y ANALISIS DE

DATOS

COMPONENTES DE UN CITOMETRO DE FLUJO

* FSC (Forward Scatter)luz dispersada a bajo ángulo (0-10º)proporcional al tamaño celular

* SSC (Side Scatter)luz dispersada a ángulo recto proporcional a la complejidad de la estructura interna

* Permite detectar señales de fluorescencia, utilizando Ac marcados con fluorocromos.

Señales

FluorescenciaDispersión

SEÑALES DETECTADAS

SEÑALES DETECTADAS

* SSC (Side Scatter)luz dispersada a ángulo recto 90 proporcional a la complejidad de la estructura interna

* FSC (Forward Scatter)luz dispersada a bajo ángulo (0-10º)proporcional al tamaño celular

SISTEMA OPTICO

SISTEMA OPTICO

CUANTIFICACIÓN DE UN PULSO DE VOLTAJE

VIDEO

FLUORESCENCIA

FLUORESCENCIA

DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA

PerCP Cy5APC

FL-1 FL-2 FL-3 FL-4Detectores

Fluorocromos

MARCADORES Y SUBPOBLACIONES• CD3: linfocitos T

• CD4: linf. T helper, monocitos (tenue)

• CD8: linf. T supr./citotox., NK

• CD3/CD4: linfocitos T helper (Clase II)

• CD3/CD8: linfocitos T supr./citotox. (Clase I)

• CD56: NK (CD3-)

• CD19: linfocitos B

• CD14: monocitos, granulocitos (tenue)

• CD45: leucocitos

PRESENTACIÓN DE DATOS: HISTOGRAMAS

HISTOGRAMA:

Se representa:X: intensidad de fluorescenciaY: número de células que emiten a cada intensidad

HISTOGRAMASIntensidad de fluorescencia y sitios de unión

Intensidad de fluorescencia FITC

Número de eventos

FITC

FITC

FITC

FITC FITC

FITC

FITC

FITC FITC

Marcación con un solo Ac

Cada punto representa una célula

Posiciones de los puntos: intensidades relativas de los dos parámetros (tamaño y granularidad) medidos para tal evento.

DOT PLOT

DOT PLOT

++--

++--

FL-1

FL-2

Doble marcación:Se utilizan 2 fluorocromos con diferentes λ de emisiónEj: FITC (verde)

PE (naranja)

NK en sangre periferica: CD56lo-CD16hi

NK predominante en ganglios: CD56hi-CD16lo

Marcación con dos Ac

INMUNOFENOTIPIFICACIÓN

Persona Normal Paciente leucémico

* Células suspendidas en un medio líquido– Sangre– Cultivos celulares– Tejidos– Tumores sólidos– Alimentos (para estudio de contaminación

bacteriana)

* Las muestras sólidas se disgregan por digestión mecánica o enzimática

MUESTRASDebe encontrarse en forma de suspensión monodipersa

Citometría de flujo: protocolo de marcación

+ Ac control/es de isotipo*

+ Ac contra Ag a analizar

Incubar, lavar, resuspender

Incubar, lavar, resuspender

* ¿Qué es un “control de isotipo”? Es una inmunoglobulina de la misma especie y del mismo isotipo que el Ac que se está empleando para el análisis pero que carece de reactividad contra las células que se están empleando. De esta manera, la “marcación” con este Ac control de isotipo permite establecer cuál es el nivel basal “background” de fluorescencia que produce cualquier Ig en las células a estudiar y descontar esa fluorescencia basal de la fluorescencia producida por el Ac que se está empleando para el análisis.

Muestra

Muestra

•Autoflorescencia •Control de Isotipo •Control positivo •Bloqueo de receptores Fc

CITOMETRIA DE FLUJO CONTROLES:

Determinación de citoquinas por citometría

Determinación de citoquinas por citometría

FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTER)

Separación de poblaciones se rompe la corriente que contiene las células en pequeñas gotas que se cargan eléctricamente. Con la aplicación de un campo eléctrico se desvía su trayectoria y se recogen las células en diversos recipientes.

APLICACIONES

Análisis y separación de subpoblaciones celularesMarcadores de superficieProteínas intracelularesCuantificación

Inmunotipificación

Experimental

1. Análisis de apoptosis2. Evaluación de la capacidad endocítica3. Evaluación de funcionalidad de bombas de

eflujo ATP-dependientes (Pgp)4. Determinación de citoquinas (CBA)

Ventajas

Marcaciones simultaneasAnaliza un alto número de células por segundo (5000

células/segundo)Cuantifica intensidad antigénicaMayor sensibilidad y objetividad que IFPosibilidad de analizar poblaciones minoritariasPermite almacenar la información

Desventajas

No se obtiene información sobre arquitectura de tejido