EXPLICACIÓN DE TRABAJOS PRÁCTICOS

COLORACIONES

Microbiología General

Carrera: Lic. en Biología Molecular

2012

DIFERENCIA ENTRE CÉLULA PROCARIOTA Y CÉLULA EUCARIOTA

Morfología bacteriana

Agrupaciones de cocos según el plano de división

estreptococos

sarcinas

estafilococos

diplococos

Diferentes morfologías en bacterias bacilares

Espirilo: espiral rígida

Espiroqueta: flexible, enrollada como sacacorcho

Observación de microorganismos

Microscopio óptico

OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

La observación de los microorganismos se puede realizar:

Examen en fresco (vivos sin teñir)

Técnicas de coloración (teñidos con colorantes)

Ventajas que presentan los microorganismos coloreados:

Proporciona el contraste suficiente entre la célula y el medio que la rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.

Permite el estudio de estructuras propias de la célula.

Se pueden obtener mayores amplificaciones con el empleo del objetivo de inmersión del microscopio.

COLORANTES

- Son compuestos orgánicos y cada tipo de colorante suele tener afinidad por determinadas estructuras celulares.

- Muchos de los colorantes usados en microbiología están cargados positivamente (catiónicos) y se combinan con compuestos celulares cargados negativamente, como ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos.

- Colorantes catiónicos: azul de metileno, cristal violeta, zafranina.

- Son sales que en medio acuoso:

CLAM CL- + AM+

Coloraciones

Las coloraciones se pueden clasificar en:

► Examen en fresco

► Coloración simple

► Coloraciones diferenciales: Coloración de Gram Coloración de Ziehl-Neelsen

► Coloraciones especiales: Técnica de Moeller Técnica de Wirtz-Conklin Impregnación argéntica de flagelos Técnica de Burri Impregnación argéntica de Fontana Tribondeau

1.Preparación del frotis

2.Secado

3.Fijación Métodos físicos: calor

Métodos químicos:

alcohol metílico o etílico

4. Enfriado

5. Coloración (simple o compuesta)

6. Lavado

7. Secado

8. Observación al microscopio con objetivo de inmersión 100 x

Cultivos bacterianos: 18 - 24 h

Fijación: preserva las estructuras y las hace más visibles

Calor: coagula las proteínas y las adhiere sobre el portaobjetos, deforma levemente pero no altera la afinidad

MORDIENTEMORDIENTE

Sustancia química que unida a los colorantes forma una laca que se adhiere fuertemente a la estructura

Se utiliza para estructuras muy difíciles de teñir.

Se puede agregar antes o después de la adición del colorante con el que formará la laca

Ejemplos: lugol coloración de Gram ácido tánico impregnación argéntica

COLORACIÓN SIMPLE

1.- Hacer el frotis

2.- Secar la preparación en la parte alta del mechero

3.- Fijar tomando el preparado desde un extremo, pasándolo

3 veces por la llama del mechero.

4.- Una vez frío, colorear con un solo colorante.

5.- Lavar, secar y observar.

Permite visualizar forma, tamaño y disposición de los microorganismos

Estructura del peptidoglicanoEstructura del peptidoglicano

Esquema de la pared

Unidad repetitiva

Gram negativas

Gram positivas

PARED CELULAR DE BACTERIAS

GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

Ácidos teicoico: polímeros de fosfato de ribitol o fosfatos de glicerol

Esquema de pared celular

Gram (+)Gram (-)

Membrana externa

Capa lipoproteica

Peptidoglicano

Membrana citoplasmática

Ácidos teicoicos

Ác. Teicoicos entrelazados con el peptidoglicano

Membrana citoplamática

ETAPAS EN LA TINCIÓN DE GRAM____________________________________________________

PASOS METODO GRAM (+) GRAM (-)

Colorante Cristal violeta violeta violeta

Mordiente Lugol violeta violeta

Decoloración Alcohol 95% violeta se decolora

o alcohol-acet.

Contraste Fuscina o violeta rojo

zafranina

____________________________________________________

Coloración de Gram

Alcohol disuelve los lípidos de la pared bacteriana deshidratación del peptidoglicano

Levaduras

¿Cómo se observan las bacterias y esporas según la coloración de Gram?

Esporas: Bacillus subtilis

Gram (+) Gram (-)

Pared de bacterias ácido alcohol resistentes (BAAR)

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR)

Hacer el frotis-Secarlo-Fijarlo

Cubrir con Fucsina Ziehl concentrada, calentar con hisopo encendido hasta emisión de vapores durante 10 min. El fenol y el calor facilitan la penetración del colorante

Decolorar con alcohol-ácido

Lavar-cubrir con Azul de metileno

Lavar-Secar

Observar

Cápsula bacteriana

Composición químicaComposición química

-PolisacáridosPolisacáridos

-ProteínasProteínas

Cápsula: estructura rígidaCapa mucosa: se deforma con facilidad y no excluye partículas

ETAPAS EN LA COLORACIÓN DE CAPSULA (TECNICA DE BURRI)

1.- Preparar extendido (colocar en el extremo de un portaobjeto una gota de tinta china comercial)

2.- Emulsionar sobre esa gota una suspensión de gérmenes cápsulados

3.- Con otro portaobjeto, efectuar un extendido fino. Secar y fijar a la llama.

4.-Cubrir con solución de cristal violeta 2 min.

5.- Lavar cuidadosamente con agua corriente. Secar y observar.

CAPSULAS: REFRINGENTES SOBRE FONDO OSCURO Y EL CUERPO BACTERIANO TEÑIDO DE VIOLETA.

DIFERENTES ASPECTOS DE LA CAPSULA BACTERIANA

Klebsiella pneuminiae Bacillus antrhacis Streptococcus

pneumoniae

ESPORAS Y ENDOSPORAS ESPORAS Y ENDOSPORAS BACTERIANASBACTERIANAS

ENDOSPORAS:ENDOSPORAS:

No es un método de multiplicación bacteriana sino una forma de reposo latente dentro del ciclo vital.

Permanecen latentes por largos periodos de tiempo.

La formación de la endospora se da por la falta de los nutrientes esenciales

No se presenta en la etapa exponencial del crecimiento bacteriano

ESPORAS Y ENDOSPORAS ESPORAS Y ENDOSPORAS BACTERIANASBACTERIANAS

Órganos refringentes, esféricos u ovales, constituyen la forma de resistencia bacteriana ante deficiencia nutricional, radiación, calor, ácidos, altas temperaturas, etc.Son muy impermeables a los colorantes

ESPORAS Y ENDOSPORAS ESPORAS Y ENDOSPORAS BACTERIANASBACTERIANAS

TIPOS DE ENDOSPORAS:TIPOS DE ENDOSPORAS:

A. CentralC. SubterminalD. Terminal

TIEMPO DE VIDA DE UNA ESPORA:TIEMPO DE VIDA DE UNA ESPORA: Indefinido, hasta que las condiciones del medio sean

favorables (Clostridium aceticum --- 30 años)

COLORACION PARA ENDOSPORA: Moeller – Wirtz Conklin

ETAPAS EN LA COLORACIÓN DE ESPORAS (TECNICA DE MOELLER)

1.- Frotis. Secar

2.- Fijar con alcohol absoluto, escurrir el alcohol y arder el resto.

3.- Lavar. Tratar con ác. Crómico 5 min. Lavar.

4.- Cubrir con fuscina fenicada de Ziehl. Calentar 10 min.

5.- Decolorar con ác. Sulfúrico 5%. Descartar reactivo. Completar con alcohol.

6.- Lavar. Colorear con azul de metileno dil. 1 min.

7.- Lavar. Secar y observar.

ESPORAS: ROJAS OTRAS ESTRUCTURAS: AZULES.

COLORACIÓN DE ESPORAS

Tinción de Wirtz Conklin

Tinción de Moeller

Estructura de un flagelo bacteriano

Diferentes disposiciones de flagelos bacterianos

Monotrica Monotrica

Lofotrica Lofotrica

AnfitricaAnfitrica

Peritrica Peritrica

IMPREGNACIÓN ARGENTICA PARA FLAGELOS

MORDIENTE: ácido tánico

REACTIVO PRECIPITANTE: Ag2O

LAVAR: agua destilada

FLAGELOS SE VEN DE COLOR MARRÓN CLARO

Impregnación argéntica de Fontana Tribondeau: espiroquetas y espirilos

MORDIENTE: ácido tánico

REACTIVO PRECIPITANTE: Ag2O

LAVAR: agua destilada

ESPIROQUETAS Y ESPIRILOS SE VEN DE COLOR MARRÓN OSCURO SOBRE FONDO PARDO CLARO.