Coltivazione dei batteri

Fattori influenzanti la crescita

Identificazione dei microrganismi

Giovanni Di Bonaventura

B.Sc., Ph.D.

Terreni di coltura

Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitrodi un microrganismo

Caratteristiche:

concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica

adeguato grado di umidità

reazione (pH) adatta

sterili e protetti da qualsiasi inquinamento

Terreni di coltura

Contenuto qualitativo (1 di 2)

Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.)

NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti

Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti per scopi specifici in terreni particolari

Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici

Terreni di coltura

Contenuto qualitativo (2 di 2)

Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine. Necessari per la crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale

Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)

Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del terreno a valori critici di pH

Terreni di coltura

Classificazione (1 di 3)

In base allo stato fisico:

Terreni LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e sterilizzati.

Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)

Terreni di coltura

Classificazione (2 di 3)

In base alla costituzione chimica:

Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note.

Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.

Terreni COMPLESSI: ignota l’esatta composizione chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio.

Terreni di coltura

Classificazione (3 di 3)

In base alla funzione: Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie

microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.

Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati.

Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.

Terreni di coltura

Tecniche di semina per isolamento

Semina per isolamento

Principali terreni di coltura usati

in microbiologia diagnostica (1 di 3)

Cetrimide Agar:

Terreno selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide, verso cui P. aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.

Columbia Blood Agar Base:

Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella).

Hektoen Enteric Agar:

Terreno differenziale e selettivo per l’isolamento di Salmonella eShigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella)

Cetrimide Agar

Columbia Blood Agar Base

Salmonella: colonie nerastre

Shigella: colonie incolori

Hektoen Enteric Agar

Principali terreni di coltura usati

in microbiologia diagnostica (2 di 3)

MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli

Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacità fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).

Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar: non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi.

Urea broth base (terreno di Christensen): evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae

mediante viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).

MacConkey agar

A: colonie lac- di P. aeruginosa; B: colonie lac+ di E. coli

A B

Urea broth base

Principali terreni di coltura usati

in microbiologia diagnostica (3 di 3)

Mannitol Salt Agar: Terreno selettivo per l’isolamento di stafilococchi presunti

patogeni. Azione selettiva dell’elevata [NaCl]. S. aureusproduce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.

Mueller-Hinton agar: per la determinazione dei saggi di antibiotico-sensibilità.

Saboraud Dextrose Agar: terreno acido indicato per l’isolamento di diversi funghi e

lieviti. Candida albicans (colonie incolori/rosa); Candida non-albicans (colonie rosa scuro/rosse).

Salmonella-Shigella Agar (Agar SS): terreno selettivo e differenziale per l’isolamento di

Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.

Mannitol Salt Agar

Sabouraud Agar

Salmonella Shigella Agar (SS-agar)

Salmonella typhimurium

Salmonella dublin

Fattori influenzanti la crescita

(1 di 6)

Crescita vs Tolleranza “Crescita” generalmente indica l’acquisizione di

biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione).

Alcuni microrganismi possono sopravvivere a condizioni non permissive per la loro crescita.

Il suffisso “-fili” viene spesso usato per descrivere le condizioni permissive per la crescita, mentre il termine “tollerante” descrive le condizioni in cui il microrganismo sopravvive, ma non necessariamente cresce.

Ad esempio, un “batterio termofilo” cresce in presenza di elevate temperature, mentre un “batterio termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori.

Fattori influenzanti la crescita

(2 di 6)

Obbligato (stretto) vs facoltativo “Obbligato” (o “stretto”) indica che una data condizione

è necessaria per la crescita batterica.

“Facoltativo” indica che il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria.

Il termine “facoltativo” viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali.

Ad esempio, un “termofilo obbligato” necessita di elevate temperature per la sua crescita, mentre un “termofilo facoltativo” può crescere ad alte temperature ma anche a temperature più basse.

Fattori influenzanti la crescita

(3 di 6)

Temperatura La maggior parte dei batteri cresce in un

intervallo termico di circa 20°C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum termico”

Psicrofili: ~0 – 20ºC

Mesofili: ~10 – 50ºC

Termofili: ~40 – 75 ºC

Ipertermofili: ~70 – 110 ºC

Fattori influenzanti la crescita

Temperatura

Fattori influenzanti la crescita

(4 di 6)

pH

Acidofili:

crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente)

funghi e lieviti (pH 5 - 6)

Neutrofili:

crescono tra pH 6 – 8

maggior parte dei batteri

Alcalofili:

crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente)

Fattori influenzanti la crescita

(5 di 6)

Concentrazione salina (pressione osmotica)

Alofili:

crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche;

stafilococchi

Ossigeno (O2)

Aerobiobbligati

Aerobi facoltativi

Anaerobi obbligati

Anaerobi facoltativi

Microaerofili

Fattori influenzanti la crescita

(6 di 6)

Batteri AEROBI OBBLIGATI vivono solo in presenza di O2

Batteri AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI vivono in presenza/assenza di O2

Batteri ANAEROBI OBBLIGATI vivono in assenza di O2

Batteri MICROAEROFILI vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)

Terreni particolari per l’isolamento

di agenti eziologici poco frequenti

Origine

prelievo

Diagnosi

presuntiva

Batteri patogeni Terreni per

l'isolamento

Feci Colera Vibrio cholerae Vibrio

parahaemolyticus

Acqua peptonata

alcalina

TCBS

Faringe Infiammazione

ostruttiva epiglottide e

faringe

Faringite membranosa

Haemophilus influenzae

Corynebacterium diphteriae

Agar sangue

cioccolato o agar Casman

Agar Loeffler

Agar Tinsdale

Terreno al tellurito di

sodio

Terreni particolari per l’isolamento

di agenti eziologici poco frequenti

Origine prelievo Diagnosi

presuntiva

Batteri patogeni Terreni per

l'isolamento

Tampone rinofaringeo

Pertosse Bordetella pertussis

Bordet-Gengou alla patata

Escreato Tubercolosi

Micosi polmonare

Mycobacterium tuberculosis

Blastomyces dermatitidis

Lowenstein-

Jensen Middlebrook 7H-

11

Brain-heart Infusion agar

Urina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di Fletcher

Sangue, midollo osseo o biopsia

Brucellosi Brucella spp. Agar brucella

Terreni per l’isolamento degli

anaerobi da campioni patologici (1 di 2)

Terreno Scopo

Agar sangue (AS) Terreno in piastra non selettivo di uso

generale

Agar cioccolato (AC) Utilizzato principalmente per

l'isolamento di Haemophilus eNeisseria; usato anche per l'isolamento

di anaerobi esigenti

Agar MacConkey (MAC) Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed

anaerobi facoltativi

Agar sangue feniletilalcool (PEA)

Isolamento cocchi Gram+ anerobifacoltativi ed anaerobi obbligati Gram+

e Gram-

Terreni per l’isolamento degli

anaerobi da campioni patologici (2 di 2)

Terreno Scopo

Agar sangue kanamicina-

vancomicina (KV)

Isolamento selettivo di bacilli anaerobi

Gram-

Terreno al tioglicolato

(BBL-0135C) + emina +

vitamina K1 (THIO)

Brodo di arricchimento utilizzato per

arricchire i terreni in piastra

particolarmente se il campione è scarso

Terreno di Thayer-Martin

modificato (MT)

Impiegato per arricchire i terreni per

anaerobi quando si sopetta nel

campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis

Giara per anaerobiosi

Anaerobiosi

Figure 6.5

Cappa (camera) per anaerobiosi

Giara con “candela”

Sistemi per generazione di carbossifilia (CO2-packet)

Carbossifilia

(5% O2, 10% CO

2, 85% N

2)

Figure 6.7

Identificazione dei

microrganismi

1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione) Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc. crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)5. Tipizzazione fagica6. Identificazione genotipica

ID dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie

(1 di 2)

Forma Rilievo

piatto

sopraelevato

convesso

umbonato

sottile, allungatoeffusopuntiforme

circolare

filamentosa

rizoide

irregolare

d < 1 mm

irregolare, a filo intrecciato

irregolare, ramificata

ID dei microrganismi

Aspetto macroscopico delle colonie

(2 di 2)

Superficie Margine

intero

ondulato

eroso

filamentoso

arricciato

liscia

radiata

rugosa

concentrica

rilevata ondulata

anelli concentrici

raggrinzita

ID dei microrganismi

Aspetti macroscopici (emolisi)

Streptococcus spp

Staphylococcus spp

ID dei microrganismi

Aspetti macroscopici (fermentazione)

Staphylococcus spp

ID dei microrganismi

Aspetti macroscopici (sciamaggio)

Proteus mirabilis

ID dei microrganismi

Caratteristiche biochimiche

Enterobacteriaceae, in particolare: capacità di utilizzare determinati substrati come

unica fonte di carbonio acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) +

indicatore pH (blu di bromotimolo: vira al blu a pH basico)

presenza di particolari enzimi ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi,

beta-galattosidasi, ureasi

produzione di specifici prodotti metabolici terminali H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)

capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test) 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan

(produzione di gas)

ID dei microrganismi

Caratteristiche biochimiche

API (bioMérieux) Identification System

ID dei microrganismi

Caratteristiche antigeniche

Produzione di antisieri (Ab specifici) mediante inoculazione di microrganismi nella cavia

Utilizzo di antisieri per reazione di agglutinazione colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico

reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi

Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi)

Agglutinazione

AgAg

Ag

AgAg

Ab

ID dei microrganismi

Tipizzazione fagica

Una singola specie può comprendere ceppi diversi (sottospecie o tipi)

Impiego di batteriofagi a fini identificativi esempio: tipizzazione di S. aureus

estremamente sensibile a numerosi (20) batteriofagi virulenti (litici)

sensibilità non uniforme (stipite-specifica)

individuazione di “tipi fagici”

Utile ai fini epidemiologici (studio delle modalità di diffusione dell’infezione)

Tipizzazione fagica

ID dei microrganismi

Identificazione molecolare

Polymerase Chain Reaction

amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie o lo stipite batterico

elevata sensibilità (necessità di poche copie del target di partenza) e specificità.

sequenziamento genico (genotipizzazione)

RNA ribosomale

grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti;

presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. L’amplitudo della differenza nell’rRNA di due batteri rivela quanto filogeneticamente “vicini” essi siano: piccole differenze in rRNA sono suggestive per una “vicinanza” tra le specie, mentre grandi differenze indicano che le specie sono più “distanti” tra loro.

L’individuazione di un pattern in rRNA che non trova riscontro in nessun altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.

ID dei microrganismi

Identificazione molecolare